СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ЛАКСУБТИЛ

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к биотехнологии и может быть использовано в качестве продукта лечебно-профилактического назначения.
Способ включает засевание живых микробных клеток и спор бактерий (биомассу Bacillus subtilis)
с полужидкого агара культуры производственного штамма B. Subtilis в пробирку с бульоном СБД (растительно-минерального состава) и выращива-ние в течение 18-24 часов при температуре 37оС. Также предусмотрена проверка на чистоту, засевание в питательную среду и хранение в течение 18-24 часов при температуре 37оС. В качестве питательной среды используют 1 л пастеризованного и охлажденного до температуры 37оС коровьего молока, которое перемешивают в течение 5-10 мин, растворяют и получают однородную бактериальную массу с концентрацией 100–200 х 108 м.к./мл.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к биотехнологии и может быть использовано в в качестве продукта лечебно-профилактического назначения.
Аналогами являются известные препараты, изготовленные на основе «Bacillus species» - бактисубтил (1), «Bacillus licheniformis» - биоспорин (2) содержащие живые бактерии и наполнитель, высушенные лиофильным способом и расфасованные во флаконы или ампулы. Недостатком этих способов является отсутствие в их составе минеральных и растительных адсорбентов, способствующих сохранению жизнедеятельности бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды и усиливающих их антимикр обную активность, слабая бактерицидная активность препарата при смешанных инфекциях желудочно-кишечного тракта.
Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления препарата, изготовленный на основе «Bacillus subtilis» - субтилбен в форме порошка (3,4). Для приготовления препарата осуществляют следующие действия: живые микробные клетки и споры бактерий (биомассу Bacillus subtilis) с полужидкого агара культуру производственных штаммов B. subtilis засевают в пробирку с питательным бульоном СБД и выращивают в течение 18–24 ч при 37оС. После этого культуры проверяют на чистоту и вновь засевают в матрасы, наполненные питательной средой. Через 18–24 ч при температуре 37оС инкубирования культуры B. subtilis проверяют на чистоту и используют для изготовления производственной серии биомассы.
Недостатком этого способа является то, что препарат "Субтилбен" в форме порошка требует разведения жидкостью перед применением, что не удобен при употреблении, снижается концентрация жизнеспособных микробов до 50% в процессе высушивания. Биомасса «Bacillus subtilis» находится в споровой форме и следовательно лечебное действие начинается после преобразования в вегетативную форму.
Цель изобретения – изготовление пробиотика в форме суспензии и улучшение лечебно-профилактических свойств биопрепарата.
Поставленная цель достигается тем, что живые микробные клетки и споры бактерий (биомассу Bacillus subtilis) с полужидкого агара культуры производственных штаммов B.Subtilis BS TJ Д 26 и BS TJ 09 засевают в пробирку с питательным бульоном СБД (растительноминерального состава) и выращивают в течение 18-24 часов при температуре 37оС. Проверяют на чистоту и вновь засевают на 1 л пастеризованного и охлажденного до температуры 37оС коровьего молока и перемешивают в течение 5-10 мин, растворяют и ставят в термостат в течение 18-24 часов при температуре 37оС. В результате получают однородную бактериальную массу с концентрацией 100–200 х 108 м.к./мл.
Было приготовлено препарата с различимыми штаммами Bacillus subtilis: из штамма BS TJ Д 26 и BS TJ 09
Полученный препарат проверяли на безвредность для животных, бактерицидную активность в отношении тест-культур возбудителей болезней животных (Escherichia coli, Salmonella Dublin, Pas-terella multosida, Proteus vulgaris) и лечебно-профилактическую эффективность при пневмоэнтеритах телят.
Пример 1. Безвредность Лаксубтила проверяли двумя способами. Первый, который используют для проверки продуктов микробиологического синтеза [ГОСТ Р 52337-2005 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения об-щей токсичности.], а второй – для установления острой токсичности лекарственных средств на лабораторных животных. [Методические указания по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве. – М.,1988.].
В процессе проведения исследований первым методом определение степени токсичности экспериментального пробиотика, проводили с использованием сухой культуры инфузорий колподы согласно требованиям ГОСТа Р 52337-2005. Примененный метод базируется на экстрагировании с исследуемых продуктов различных фракций токсических веществ дистиллированной водой и впоследствии воздействием полученных экстрактов на культуру инфузории Colpoda steinii. Оценку результатов данного биотеста проводят по результатам гибели стилохоний.
Выживаемость стилохоний кожного ряда (N,%) вычисляли по следующей формуле
N = N2 : N1 х 100
где:
N1 – среднеарифметическое (из пяти) значение количества активных стилохоний в начале опыта, шт;
N2 – среднеарифметическое (из пяти) значение количества активных стилохоний в конце опыта, шт. (Табл. № 1)
Изучение острой токсичности нового пробиотика на лабораторных животных проводили в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве». Опыты провели на 40 белых мышах двухмесячного возраста, массой 18-21 г. Перед началом исследований их содержали в обычных условиях и наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали накануне опыта вечером, прием воды не ограничивали.
Из белых мышей по принципу парных аналогов сформировали 5 групп (n=8). Из них 4 опытных и одна – контрольная.
Исходя из результатов предыдущего опыта о нетоксичности препарата Лаксубтил на культуре колпод, в этой серии наблюдений сразу применили высшие дозы исследуемого препарата. Для этого, мышам 4-х опытных групп, пробиотик в виде суспензии вводили однократно перорально в дозе – 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я группа), 0,3 мл (3-я группа) и 0,5 мл (4-я группа), что в пересчете на 1 кг массы тела составляло соответственно: 5 мл; 10мл; 15 мл и 25 мл.
Контрольным животным (5-я группа) в таком же объеме ввели только физиологический раствор.
Руководствуясь требованием ГОСТ-а Р 52337-2005 до не токсичных препаратов микробиологического синтеза относят средства, под действием которых за установленное время остаются активными свыше 80% стилохоний. Исходя из этого, пробиотик Лаксубтил, является нетоксичным препаратом.
Результаты опытов показали, что все варианты Лаксубтила безвредны. Все животные остались живыми в течение всего периода наблюдения, ни у одного из них не выявлены признаки заболеваний и других нарушений функций организма. Опыты на белых мышах свидетельствуют о том, что биомасса пробиотика Лаксубтил при энтеральном введении в максимальных дозах до 25000 мг/кг не вызвала гибели экспериментальных животных (Табл. 2).
Следовательно, экспериментальный пробиотик Лаксубтил в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 можно отнести к VI классу токсичности, т.е. к веществу относительно безопасному.
Пример 2. Антибактериальную активность препарата Лаксубтил изучали по отношению к тест культурам, в жидкой питательной среде методом серийных разведений.
По минимальному количеству препарата, со-ответствовавшему наименьшей его концентрации, дающему полную задержку роста тесткультуры, определяли чувствительность тестмикробов к препарату, результаты опытов оценивали микроскопически, путем исследования мазков культуральной жидкости, окрашенных по Граму.
Опыты проводили в трех повторах. Результаты представлены в таблице 3.
Установлено, что препарат обладает высокой бактерицидной активностью по отношению к тест-микробам. Результаты бактериологического исследования показали, что минимальная подавляющая концентрация (МПК) культур B. subtilis (BS TJ 09) составляет 0,06 – 0,12 мл/мл и B. subtilis (BS TJ Д 26) составляли 0,03 – 0,06 мл/мл, которые проявили высокую бактерицидную активность (0,06 – 0,12 мл/мл).
Пример 3. Эффективность штаммов Лаксубтила в различных дозах при профилактике желудочнокишечных болезней телят испытали на 180 телятах (1-4 дневного возраста) неблагополучных по инфекционным пневмоэнтеритам хозяйствам. Схема проведения опытов и результаты применения Лаксубтила представлены в таблице 4.
Результаты исследований свидетельствуют, что препарат Лаксубтил в дозах 5, 10 мл на кг массы тела при содержании биомассы (100 - 200x106 м.к./мл), имеет высокий эффект в профилактике желудочно-кишечных болезней телят.
Пример 4. Исходя из полученных результатов профилактической эффективности, препарат Лаксубтил испытан в сравнительном аспекте с препаратом субтилбен на 40 новорожденных телятах.
Животных по принципу аналогов, разделили на 2 группы по 20 голов в каждой. Телятам первой группы до кормления молоком выпаивали Лаксубтил, содержащий биомассу В.subtilis (100-200x106 м.к./мл) в дозе 5 мл на кг массы тела один раз в день, в течение 10 дней.
Телятам второй группы вводили субтилбен в соответствии с наставлением по применению препарата.
Результаты опытов представлены в таблице 5.
Из данных таблицы видно, что профилактическая экономическая эффективность препарата Лаксубтил по сравнению с препаратом субтилбен выше.
Пример 5. Лечебную эффективность препараnа Лаксубтил изучали на 4 группах больных диареей телят 4-7-дневного возраста. При бактериологическом исследовании у больных телят были выявлены ассоциации бактериальных агентов (эшерихии коли, протей и сальмонелл).
Телятам первой группы (16 гол.) препарат Лаксубтил в дозе 3 мл на кг массы тела выпаивали дважды в сутки. Телятам второй группы (16 гол.) препарат Лаксубтил в дозе 5 мл на кг массы тела выпаивали дважды в сутки. Телятам третьей группы (16 гол.) препарат Лаксубтил в дозе 10 мл на кг массы тела выпаивали дважды в сутки.
Контрольную группу больных телят (16 гол.) лечили субтилбеном согласно наставлению по его применению.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что Лаксубтил обладает высоким терапевтическим эффектом, Пероральное введение его подавляло в желудочнокишечном тракте развитие патогенных возбудителей и лечебная эффективность не уступала известному препарату субтилбен. Испытание разных доз Лаксубтила при лечении диареи показало, что разовая дача препарата в количество 5 и 10 мл на кг массы тела дважды в день до выздоровления обеспечивает хороший терапевтический эффект, затраты на лечение больных телят в 2 раза сокращаются по сравнению с субтилбеном.
Результаты опытов представлены в таблице 6.
Пробиотик Лаксубтил обладает антагонистическим действием, способен повысить иммунный статус организма животных и птиц, восстановить их нормальную микрофлору, а также используется для лечения и профилактики бактериозов и микоплазмозов.

Препарат вводят перорально в дозах 5; 10
мл/кг массы тела для лечения и профилактики инфекционных энтеритов телят. Лечебно-профилактическая эффективность составляет 87,5 -97,5%.

1.Панин А. Н. Пробиотики в ветеринарии как средство экологической реабилитации животных. – М., 1998.
2. Малик Н. И. Ветеринарные пробиотические препараты. Ветеринария. – 2001. – №1. – С. 46–51.
3.Патент Республики Таджикистан TJ № 391, Бюл. № 35.
4.Патент Республики Таджикистан TJ № 390, Бюл. №38.