СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛИМФОМЫ В-КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНЫХ И МЕЧЕНЫХ РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТОПАМИ АНТИТЕЛ В В-ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА С ОГРАНИЧЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЕЙ АНТИГЕНА

Описываются протоколы терапевтического лечения лимфомы В-клеток. Эти протоколы основаны на терапевтических стратегиях, которые включают введение иммунологически активных химерных антител анти-CD20 мыши/человека, меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20, а также на комбинированных стратегиях, включающих применение химерных антител анти-CD20 и меченных радиоактивными изотопами антител анти-CD20.

Часть описания этого патентного документа содержит материал, который подлежит защите авторского права. Владелец авторского права не возражает против воспроизведения любым лицом патентного документа или патентного описания, в том виде, в котором они существуют в делах или материалах заявки в Ведомстве по патентам и то-варным знакам, однако сохраняет при этом все права авторского права.
Настоящая заявка - это частично продолжа-ющаяся заявка США под серийным номером 07/978,891 от 13 ноября 1992, которая находится на рассмотрении. Настоящий патентный документ является родственным заявке США под серийным номером 07/977,691 и под названием НЕПАРНАЯ ДОМИНАНТНАЯ СЕЛЕКТИВНАЯ ПОСЛЕДОВА-ТЕЛЬНОСТЬ МАРКЕРНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ УСИЛЕ-НИЯ ЭКСПРЕССИИ ВЗАИМОСВЯЗАННОГО ГЕННОГО ПРОДУКТА И СОДЕРЖАЩИЕ ЕГО СИСТЕМЫ ВЕКТОРА ЭКСПРЕССИИ и одновре-менно поданной заявке США No -под названием “НЕПАРНАЯ ДОМИНАНТНАЯ СЕЛЕКТИВНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МАРКЕРНЫХ ГЕНОВ И СТРАТЕГИИ ИНСЕРЦИИ НИТРОНОВ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕННОГО ПРОДУК-ТА И СОДЕРЖАЩИЕ ЕГО СИСТЕМЫ ВЕКТОРА ЭКСПРЕССИИ”. Родственные патентные докумен-ты включены здесь в качестве ссылки.

I. МЕЧЕННОЕ РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТО-ПАМИ АНТИТЕЛО 2B8 АНТИ-CD20 А. Получение моноклонального антитела анти-CD20 (мышиного) (“2В8”).
В. Подготовка конъюгата 2B8-MX-DTPA.
i. MX-DTPA
ii. Подготовка 2BS
ii. Конъюгация 2BS с MX-DTPA
iv. Определение включения MX-DTPA.
v. Иммунореактивность 2BS-MX-DTPA
vi. Подготовка меченного индием [111] 2BS-MX-DTPA (“I2В8”)
vii. Подготовка меченного иттрием [90] 2BS-MX-DTPA (“Y2B8”)
C. Исследования животных кроме человека.
i. Распределение меченного радиоактивными изотопами 2BS-MX-DTPA
ii. Локализация опухоли с помощью I2В8
iii. Исследования биораспределения и локали-зации опухоли при помощи меченного радиоактив-ными изотопами 2BS-MX-DTPA
D. Исследования человека.
i. 2В8 и 2B8-MX-DTPA: Иммуногистологиче-ские исследования тканей человека.
ii. Клинический анализ I2B8 (томография) и Y2B8 (терапия).
а. Клиническое испытание в фазе I/II: иссле-дование терапии однократной дозой.
б. Клиническое испытание в фазе I/II: иссле-дование терапии многократной дозой.
II. ПОЛУЧЕНИЕ ХИМЕРНОГО АНТИ-CD20.
А. Конструкция векторов экспрессии ДНК хи-мерного анти-CD20 иммуноглобулина.
В. Создание химерных анти-CD20 трансфек-том, полученных из СНО и SP2/0.
С. Определение иммунологической активности химерных антител анти-CD20.
i. Анализ C1q человека.
ii. Зависимый от комплемента лизис клеток.
iii. Анализ клеточной цитотоксичности эффек-тора в зависимости от антител.
III. ИСТОЩЕНИЕ В-КЛЕТОК IN VIVO ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ХИМЕРНОГО АНТИ-CD20.
А. Исследование приматов кроме человека.
В. Клинический Анализ С2В8.
i. Клиническое испытание в фазе I/II: исследо-вание терапии однократной дозой.
ii. Клиническое испытание в фазе I/II: иссле-дование терапии многократной дозой.
IV. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ: С2В8 И Y2B8
А. Приготовление Y2B8
В. Приготовление С2В8
С. Результаты
V. СТРАТЕГИИ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ТЕРА-ПИИ
VI. ИНФОРМАЦИЯ О ДЕПОЗИТАХ
G. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ-НОСТЕЙ
H. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ссылки, которые расматриваются в настоя-щем документе, приведены, поскольку информация описана там до даты подачи настоящего докумен-та, и не должна здесь рассматриваться как явное или неявное признание того, что приведенные для ссылки документы представляют собой “предше-ствующий уровень техники” или что изобретатели не имеют права датировать задним числом такие описания на основании предшествующих изобре-тений или приоритета, основанного на ранее по-данных заявках.
Настоящее изобретение касается лечения лимфомы В-клеток путем применения химерных и меченных радиоактивными изотопами антител для связывания с поверхностным антигеном Вр35 (“CD20”) В-клетки.

Иммунная система позвоночных (например приматов, включая человека, обезьян, и т.д.) состо-ит из ряда органов и типов клеток, которые эволю-ционировали для точного и специфического распо-знавания чужеродных микроорганизмов (“антиге-нов”), которые проникают в позвоночное животное-хозяина; специфического связывания таких чуже-родных микроорганизмов; и уничтоже-ния/разрушения таких чужеродных микроорганиз-мов. Лимфоциты, прежде всего, являются значимы-ми для иммунной системы. Лимфоциты образуются в тимусе, селезенке и костном мозге у взрослых и составляют приблизительно 30% всех лейкоцитов крови, находящихся в кровеносной системе челове-ка (взрослого). Существуют две основных субпо-пуляции лимфоцитов: Т-клетки и В-клетки. Т-клетки отвечают за промежуточный иммунитет клетки, в то время как В-клетки отвечают за про-дукцию антител (гуморальный иммунитет). Однако, Т-клетки и В-клетки можно рассматривать как вза-имосвязанные в типичном иммунном ответе, Т-клетки активизируются, когда рецептор Т-клетки связан с фрагментами антигена, которые связаны с главным комплексом гистосовместимости (“МНС”) из гликопротеинов на поверхности клетки, пред-ставляющей антиген; причем такая активация вы-зывает высвобождение биологических медиаторов (“интерлейкинов”), который, в сущности, стимули-руют дифференциацию и продукцию В-клетками антител (“иммуноглобулинов”) против антигена.
Каждая В-клетка внутри хозяина экспресси-рует различное антитело на своей поверхности. Таким образом одна В-клетка экспрессирует спе-цифическое для одного антигена антитело, в то время как другая В-клетка экспрессирует антитело, специфическое для другого антигена. Таким обра-зом, В-клетки являются совершенно разными, и это многообразие имеет важное значение для иммун-ной системы. У человека каждая В-клетка может производить огромное количество молекул антител (то есть приблизительно от 107 до 108). Как прави-ло, такая продукция антител обычно прекращается (или значительно снижается) после нейтрализации чужеродного антигена. Иногда, однако, пролифе-рация определенных В-клеток продолжается непрерывно; причем такая пролиферация может вызвать рак, называемый “лимфомой В-клеток”.
Как Т-клетки, так и В-клетки содержат по-верхностные протеины, который используют как “маркеры” для дифференциации и идентификации. Одним из таких маркеров В-клеток человека явля-ется антиген Вр35 человека с ограниченной диф-ференциацией В-лимфоцитов, обозначаемый как “СD20”. CD20 экспрессируется во время раннего развития пре-В-клеток и сохраняется до дифферен-циации клеток плазмы. В частности, молекула CD20 может регулировать этап в процессе актива-ции, который необходим для инициации и диффе-ренциации клеточного цикла и обычно экспресси-руется на сверхвысоких уровнях неопластических (“опухолевых”) В-клеток. CD20, при определении, присутствует как на “здоровых” В-клетках, так и на “злокачественных” В-клетках, то есть на тех В-клетках, непрерывная пролиферация которых мо-жет привести к лимфоме В-клеток. Таким образом, у поверхностного антигена CD20 имеется возмож-ность быть “пораженным” лимфомой В-клеток.
В сущности, такое поражение выглядит сле-дующим образом: пациенту, к примеру, вводят антитела, специфические к поверхностному анти-гену CD20 В-клеток. Эти анти-CD20 антитела спе-цифически связываются с поверхностным антиге-ном CD20 клетки, очевидно, как с нормальными, так и со злокачественными В-клетками. Анти-CD20 антитело, связанное с поверхностным антигеном CD20, может вызвать разрушение и истощение неопластических В-клеток. Кроме того, химические вещества или радиоактивные метки, имеющие воз-можность разрушать опухоль, могут быть конъ-югированы с анти-CD20 антителом так, что веще-ство специально “доставляется”, например в нео-пластические В-клетки. Независимо от способа, основная цель состоит в разрушении опухоли. Специфический способ детерминируется опреде-ленным используемым анти-CD20 антителом, и, таким образом, позволяет значительно варьировать способы поражения антигена CD20.
Например, известны попытки поражения по-верхностного антигена CD20. По сообщениям, мы-шиное моноклональное антитело 1F5 (анти-СD20 антитело) вводили пациентам с лимфомой В-клеток путем непрерывной внутривенной инфузии. Со-гласно сообщениям, для истощения циркулирую-щих опухолевых клеток требовались чрезвычайно высокие уровни (>2 граммов) 1F5, а результаты описывали как “неустойчивые”. Press et al., “Mono-clonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Hu-man В-Cell Lymphomas”. Blood 69/2:584-591 (1987). Возможной проблемой при настоящем под-ходе является то, что моноклональные антитела кроме человеческих (например, мышиные мо-ноклональные антитела) обычно не обладают функциональностью эффекторов человека, то есть они неспособны при этом дополнять зависимый от комплемента лизис или лизировать клетки-мишени человека посредством клеточной токсичности, зависящей от антител, или дополненным Fc-рецепторами фагоцитозом. Кроме того, монокло-нальные антитела кроме человеческих могут быть распознаны человеком-хозяином как чужеродные белки. Следовательно, повторные инъекции таких чужеродных антител могут привести к индукции иммунного ответа, вызывая опасные реакции ги-перчувствительности. Для моноклональных анти-тел на основе мышиных часто ссылаются на нали-чие ответа анти-мышиных антител человека, или ответ “НАМА”. Кроме того, эти “чужеродные” антитела могут быть подвергнуты воздействию иммунной системы хозяина так, что они в действи-тельности нейтрализуются прежде, чем достигнут своей мишени.
Лимфоциты и клетки лимфомы наследственно чувствительны к радиотерапии по нескольким при-чинам: локальная эмиссия ионизирующей радиа-ции меченных радиоактивными изотопами антител может уничтожать клетки, имеющие или не имею-щие целевой антиген (например, CD20) в непосред-ственной близости с антителами, связанными с антигеном; проникающее излучение может устра-нять проблему ограниченного доступа к антителу в обширной или слабо васкуляризированных опухо-лях; общее количество необходимого антитела может быть снижено. Радионуклид испускает ра-диоактивные частицы, которые могут повреждать клеточную ДНК до стадии, при которой клеточные механизмы репарации неспособны обеспечить жизнедеятельность клетки; следовательно, если целевые клетки являются опухолевыми, то радио-активная метка преимущественно уничтожает опу-холевые ячейки. Использование меченных радио-активными изотопами антител, по определению, включают применение радиоактивного вещества, которое требует соблюдения предосторожностей, как для пациента (например, при возможной транс-плантации костного мозга), так и для обслужива-ющего персонала (то есть необходимость обеспе-чить высокую степень безопасности при работе с радиоактивными веществами).
Следовательно, для улучшения способности мышиных моноклональных антител осуществлять эффективное лечение нарушений В-клеток требует-ся конъюгировать радиоактивную метку или ток-син с антителом так, чтобы метка или токсин лока-лизировались в месте расположения опухоли. Например, вышеупомянутое антитело IF5 “поме-чали йодом -131 (“ 131 I”) и оценивали по биорас-пределению у двух пациентов. Cм. Еаrу, J.F. et at., Imaging and Treatment of В-Сеll Lymphoma” J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 (1990); см. также, Press, O.W. et al., “Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-l (Anti-CD37) Antibody” J; Clin. Onc. 7/8:1027-1038 (1989) (указа-но, что у одного пациента, которого лечили IF-5, маркируемым 131l, получен “частичный ответ”); Goldenberg, D.M. et al., “Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of В-Cell Lymphomas with lodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody” J. Clin. Onc. 9/4:548-564 (1991) (у трех из восьми па-циентов, получавших многократные инъекции, зафиксировано развитие ответа НАМА); Appelbaum, F.R. “Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma” Hem. /Onc. Clinics of N.A. 5/5:1013-1025, (1991) (обзорная статья); Press, O.W. et al Ra-diolabeled-Antibody Therapy of В-Cells Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. “New England Journal of Medicine 329/17: 1219-12223 (1993) (анти-CD20 антитело IF5, маркированное подом-131 и B1); и Kaminski, М. G. et al. Radioimmunother-apy of В-cells Lymphoma with Radiolabeled [131l] Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody”. NEJM 329/7 (1993) (анти-CD20 антитело B1, маркированное подом-131; в дальнейшем “Kaminski”).
Токсины (то есть химиотерапевтические аген-ты, например доксорубицин или митомицин С) также были сконъюгированы с антителами. См., например, публикацию международной заявки WO 92/07466 (опубл. 14 мая 1992).
“Химерные” антитела, то есть антитела, кото-рые включают участки из двух или более различ-ных видов (например, мыши и человека) были раз-работаны как альтернатива “конъюгированным” антителам. Например, Liu, A.Y. et al., “Production of a Mouse - Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity” J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), описывает хи-мерное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20. Cм. также, публикацию № WO 88/04936. Однако, в ссылке нет сообщения, касающегося возможности, эффективности или практичности использования таких химерных ан-тител для лечения нарушений В-клеток. Следует отметить, что функциональные анализы in vitro (например опосредованный комплементом лизис (“СDC”); опосредованная антителами клеточная цитотоксичность (“ADCC”), и т.д.) не могут пред-сказывать in vivo способность химерных антител разрушать или истощать целевые клетки, экспрес-сирующие специфический антиген. См., например, Robinson, R.D. et al., “Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities,” Hum. Antibod. Hybridomas 2:84-93 (1991) (химерное антитело мыши/человека с неопределяемой активностью, опосредованной антителами клеточной цитоток-сичностью (ADCC). Следовательно, потенциальная терапевтическая эффективность химерных антител может быть верно оценена только при эксперимен-тах in vivo.
Таким образом, значительным усовершен-ствованием в данной области техники является разработка терапевтических способов направлен-ного введения антигена CD20 для лечения лимфам В-клеток у приматов, включая человека, но не ограничиваясь им.
Описываются терапевтические способы, раз-работанные для лечения нарушений В-клеток, и в частности лимфомы В-клеток. Настоящие протоко-лы основаны на введении иммунологически актив-ных химерных антител анти-CD20 для истощения В-клеток периферической крови, включая В-клеток лимфомы; введение меченных радиоактивными изотопами антител анти-CD20 для направленного поражения опухолей, связанных с локализованны-ми и периферическими В-клетками; введение хи-мерных антител анти-CD20 и меченных радиоак-тивными изотопами антител анти-CD20 при комби-нированной терапевтической стратегии.

Рисунок 1 - схематическое изображение век-тора экспрессии тандемных химерных антител, используемого при получении иммунологически активных химерных антител анти-CD20 (“ТСАЕ 8”);
Рисунки 2А - 2Е - последовательность нуклеи-новой кислоты вектора на рисунке 1;
Рисунки 3А - 3F - последовательность нуклеи-новой кислоты вектора на рисунке 1, далее вклю-чающие вариабельные участки легких и тяжелых цепочек у мыши (“анти-CD20 в ТСАЕ 8 “);
Рисунок 4 - последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот (включая CDR и констант-ные участки ) вариабельного участка легкой це-почки у мыши, полученные из мышиного монокло-нального антитела 2В8 анти-CD20;
Рисунок 5 - последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот (включая CDR и констант-ные участки) вариабельного участка тяжелой це-почки у мыши, полученные из мышиного монокло-нального антитела 2В8 анти-CD20;
Рисунок 6 результаты проточной цитометрии, подтверждающие связывание флуоресцентно мар-кированного C1q человека с химерным антителом анти-CD20, которое включает в качестве контроль-ного меченный C1q; меченного C1q с мышиным моноклональным антителом 2В8 анти-CD20; и меченного C1q с человеческим IgGI, k;
Рисунок 7 представляет результаты опосредо-ванного комплементом лизиса, сравнивающие хи-мерное антитело анти-CD20 и мышиное монокло-нальное антитело 2В8 анти-CD20;
Рисунок 8 представляет результаты клеточной цитотоксичности, опосредованной антителами с эффекторными клетками человека in viva, сравни-вающие химерное антитело анти-CD20 и 2B8;
На рисунках 9А, 9В и 9С представлены ре-зультаты лимфопении В-клеток периферической крови приматов кроме человека после инфузии 0,4 мг/кг (А); 1,6 мг/кг (В); и 6,4 мг/кг (С) иммунологи-чески активного химерного антитела анти-CD20;
На рисунке 10 представлены результаты лим-фопении В-клеток периферической крови приматов кроме человека после инфузии 0,01 мг/кг иммуно-логически активного химерного антитела анти-CD20;
На рисунке 11 представлены результаты воз-действия Y2B8, который уничтожает опухолевые клетки в ксенографической модели мыши, исполь-зующей лимфобластическую опухоль В-клеток;
На рисунке 12 представлены результаты воз-действия С2В8, который уничтожает опухолевые клетки в ксенографической модели мыши, исполь-зующей лимфобластическую опухоль В-клеток;
На рисунке 13 представлены результаты воз-действия комбинации Y2B8 и С2В8, которые уни-чтожают опухолевые клетки в ксенографической модели мыши, использующей лимфобластическую опухоль В-клеток.
На рисунках 14А и 14В представлены резуль-таты клинического анализа фазы I/II, доказываю-щего истощение популяции В-клеток при воздей-ствии С2В8 через определенное время у пациентов, обнаруживающих частичную ремиссию (14А) и малую ремиссию (14В).
Как правило, антитела состоят из двух легких цепочек и двух тяжелых цепочек молекул. Эти це-почки образуют полную форму “Y”, причем легкая и тяжелые цепочки образуют ветви Y, а тяжелые цепочки образуют основание Y. Тяжелые цепочки разделены на домены структурной и функциональ-ной гомологии. Вариабельные домены легкой (“VL”) и тяжелой (“VH”) цепочек опеспечивают распознавание и специфичность. Константные участки доменов легких (“CL”) и тяжелых (“СH”) цепочек придают важные биологические свойства, например ассоциацию цепочек с антителами, сек-рецию, трансплацентарную подвижность, связыва-ние с Fc-рецептором, связывание комплемента, и т.д. Последовательность явлений, которые приво-дят к генной экспрессии иммуноглобулина в клет-ках, вырабатывающих антитела, является сложной. Вариабельные участки доменов генных последова-тельностей размещаются в отдельных герминаль-ных линиях генных сегментов, обозначаемых как “VH”, “D”, и “JH”, или” VL” и “JL”. Эти генные сегменты соединены перегруппировками ДНК для формирования целых V-участков, экспрессирован-ных в тяжелых и легких цепочках, соответственно. Перегруппированные соединенные V-сегменты (VL-JL и VH -D-JH) кодируют целые вариабельные участки или связывающие антигены домены легких и тяжелых цепочек.
Серотерапия лимфомы В клеток человека с применением моноклонального мышиного (1F5) антитела анти-CD20 описана Press et al., (69 Blood 584, 1987, supra); к сожалению, полученные тера-певтические ответы были неустойчивыми. Кроме того, по сообщениям у 25 % тестированных паци-ентов развивался ответ антимышиных антител человека (НАМА) на серотерапию. Press et al. пред-полагают, что эти антитела, конъюгированные к токсинам или радиоизотопам, могут принести бо-лее продолжительный клинический положитель-ный эффект, чем неконъюгированное антитело.
Вследствие ослабляющего воздействия лим-фомы В-клеток и самой насущной потребности в практическом лечении этой болезни, были разра-ботаны различные способы, использующие специ-фическое антитело 2В8 в качестве общего связую-щего между способами. При одном способе исполь-зуют способность систем млекопитающих легко и эффективно восстанавливать В-клетки перифериче-ской крови. При применении этого способа очища-ют или истощают В- клетки периферической крови и лимфатической ткани для устранения лимфомы В-клеток. Это осуществляют путем применения иммунологически активных, химерных антител анти-CD20. При другом способе делали попытки целенаправленного поражения клетки опухоли радиоактивными метками для их деструкции.
Используемый здесь термин “антитело анти-CD20” обозначает антитело, которое специфически распознает негликозилированный фосфопротеин массой 35000 Дальтон на поверхности клетки, обычно обозначаемый как антиген Вр35 с ограни-ченной дифференциацией В-лимфоцитов человека, упоминаемый как CD20. Используемый в отноше-нии антител анти-CD20 термин “химерный” обо-значает антитела, которые наиболее предпочти-тельно получают при использовании рекомбинант-ных методов дезоксирибонуклеиновой кислоты, которые содержат компоненты человека (включая иммунологически “родственные” виды, например, шимпанзе): константный участок химерного анти-тела, наиболее предпочтительно идентичный кон-стантному участку природного человеческого ан-титела. Вариабельный участок химерного антите-ла предпочтительно получают от животных кроме человека, причем этот участок имеет желательную антигенность и специфичность к антигену CD20 на поверхности клетки. Животным кроме человека может быть любое позвоночное животное, которое используют для получения антител к антигену CD20 человека на поверхности клетки или матери-ал, включающий антиген CD20 человека на по-верхности клетки. Такие животные кроме человека включают (но не ограничены), грызунов: кролик, крыса, мышь; и приматов кроме человека: низшие узконосые обезьяны, человекообразные обезьяны. Компонент кроме человека (вариабельный уча-сток) получают наиболее предпочтительно от мы-ши. Используемая здесь фраза иммунологически активный в отношении химерных антител анти-CD20 означает химерное антитело, которое связы-вает C1q человека и является промежуточным зве-ном опосредованного комплементом лизиса (“CDC”) линий лимфоидных В-клеток человека, и лизиса целевых клеток человека благодаря опо-средованной антителами клеточной цитотоксично-сти (“ADCC”).
Используемые здесь обе фразы “непрямое мо-чение” и принцип непрямого мечения” означают, что хелатный агент ковалентно связан с антителом и по крайней мере один радионуклид встроен в хелатный агент. Предпочтительные хелатные аген-ты и радионуклиды описаны Srivagtava, S.C. and Mease, R.C., “Progress in Research on Ligands, Nuclides and Techniques for Labeling Monoclonal Antibodies”, Nucl. Med. Bio. 18/6: 589-603 (1991) (“Srivagtava”), на который здесь производится ссылка. Наиболее предпочтительным хелатным агентом является 1-изоцисматобензил-3-метилдиотилен триаминпент уксусной кислоты (“МХ-DTPA”); предпочтительные радионуклиды для непрямого мочения включают индий [111] и иттрий [90]. Используемые здесь обе фразы “пря-мое мочение” и принцип прямого мочения” озна-чают, что радионуклид ковалентно присоединен непосредственно к антителу (обычно через амино-кислотный остаток). Предпочтительные радио-нуклиды описаны у Srivagtava; а наиболее предпо-чтительным радионуклидом для прямого мочения является йод; [131], ковалентно присоединенный через остатки тирозина. Наиболее предпочтитель-ным является принцип непрямого мочения.
Терапевтические способы, изложенные здесь, основаны на способности иммунной системы при-матов быстро восстанавливать или омолаживать В-клетки периферической крови. Кроме того, по-скольку основной иммунный ответ у приматов осуществляется Т-клетками, то если иммунная си-стема имеет недостаток В-клеток периферической крови, исключается потребность в “экстраорди-нарных” предосторожностях (то есть в изоляции пациента, и т.д.). В результате этих и других осо-бенностей иммунной системы приматов, предлага-емый принцип терапии нарушения В-клеток преду-сматривает очистку В-клеток периферической кро-ви с помощью иммунологически активных химер-ных антител анти-CD20.
Поскольку нарушения В-клеток перифериче-ской крови, по определению, могут указывать на необходимость осуществления лечения крови, спо-соб введения иммунологически активных химерных антител анти-CD20 и меченных радиоактивными изотопами антител анти-CD20 является предпочти-тельно парентеральным. Используемый здесь тер-мин “парентеральный” включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, ваги-нальное или внутрибрюшинное введение. Среди них наиболее предпочтительно внутривенное вве-дение.
Иммунологически активные химерные антите-ла анти-CD20 и меченные радиоактивными изото-пами антитела анти-CD20, как правило, получают обычными способами с помощью фармацевтически приемлемого буфера, например, стерильного фи-зиологического раствора, стерильной буферной воды, пропиленгликоля, либо их комбинации, и т.д. Способы приготовления агентов для парентераль-ного введения изложены в Pharmaceutical Carriers & Formulations, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed, (Mack Pub. Co., Easton, PA 1975), на который здесь производится ссылка.
Специфическое, терапевтически эффективное количество иммунологически активных химерных антител анти-CD20, необходимых для оказания уникального терапевтического воздействия на лю-бого данного пациента, может быть определено стандартными методами, хорошо известными обычным специалистам в области техники.
Эффективные дозировки (то есть терапевтиче-ски эффективные количества) иммунологически активных химерных антител анти-CD20 распола-гаются в диапазоне приблизительно от 0,001 до 30 мг/кг веса тела, предпочтительно приблизительно от 0,01 до 25 мг/кг веса тела, и наиболее предпо-чтительно приблизительно от 0,4 до 20,0 мг/кг веса. Возможны также другие дозировки. Факторы, вли-яющие на дозировку, включают, но не ограничены, серьезностью заболевания; способами предыдуще-го лечения; общим состоянием здоровья пациента; наличием других заболеваний, и т.д. Опытный спе-циалист может легко произвести оценку состояния пациента и определить необходимую дозу, которая располагается в указанных диапазонах, либо в случае необходимости - вне этих диапазонов.
Введение иммунологически активных химер-ных антител анти-CD20 в этих диапазонах дозы может быть осуществлено в виде однократного введения или ряда последовательных введений. Что касается химерных антител, предпочтительно, чтобы такое введение проводилось путем ряда последовательных введений. Настоящий предпо-чтительный способ выработан на основании мето-дологического лечения настоящего заболевания. Не вдаваясь глубоко в теорию, следует заметить, что поскольку иммунологически активные химер-ные антитела анти-CD20 являются также иммуно-логически активными и связанными с CD20, то уже при начальном введении индивиду иммунологиче-ски активных химерных антител анти-CD20, начи-нается истощение В-клеток периферической крови; причем наблюдается почти полное истощение в течение приблизительно 24 часов после инфузии. Вследствие этого, показанием для последующего введений(я) пациенту иммунологически активных химерных антител анти-CD20 (или меченных ра-диоактивными изотопами антител анти-CD20) яв-ляется: а) чистые остающиеся В-клетки остальной периферической крови; б) начало истощения В-клетки лимфатических узлов; в) начало истощения В-клеток из других тканевых источников, напри-мер, костного мозга, опухоли, и т.д. При повторных введения иммунологически активных химерных антител анти-CD20, происходит ряд явлений, каж-дое из которых рассматривалось как важное для эффективного лечения заболевания. Первое “явле-ние” можно считать преимущественно направлен-ным на истощение в основном В-клеток перифери-ческой крови пациента; последующие “явления” можно рассматривать либо как преимущественно направленные на одновременное или последова-тельное очищение остающихся В-клеток из систе-мы лимфатических узлов, очищающей В-клетки, или очищение В-клеток другой ткани.
В действительности, в то время как одиночная дозировка обеспечивает положительный эффект и может действительно использоваться для лечения и управления ходом заболевания, предпочтительно проводить курс лечения в несколько этапов. Реко-мендуется вводить пациенту раз в неделю в течение от 2 до 10 недель, предпочтительно в течение 4 недель, приблизительно от 0,4 до 20 мг/кг веса им-мунологически активных химерных антител анти-СD20.
Что касается применения меченных радиоак-тивными изотопами антител анти-CD20, то пред-почтительно, чтобы антитело не было химерным. Это предпочтение основано на значительно более длительном циркуляционном периоде полураспада химерных антител по отношению к мышиным ан-тителам (то есть радионуклид с более длинным циркуляционном периодом полураспада присут-ствует в организме пациента более длительное время). Однако, меченные радиоактивными изото-пами химерные антитела могут давать положи-тельный эффект при более низких дозировках в милли-Кюри (“мКи”), при применении вместе с химерным антителом, родственным мышиному антителу. Это позволяет снизить токсичность в костном мозге до приемлемого уровня при сохра-нении терапевтического эффекта.
Согласно настоящему изобретению можно применять множество разных радионуклидов, и специалисты в области техники смогут легко опре-делить, какой радионуклид является соответству-ющим при определенных обстоятельствах. Напри-мер, йод - [131] - хорошо известный радионуклид, используемый для направленной иммунотерапии. Однако, клиническое воздействие йода [131] может быть ограничено несколькими факторами, вклю-чая: восьмидневный физический период полурас-пада; дегалогенизацию иодируемого антитела как в крови, так и в местах расположения опухоли; и характеристики эмиссии (например, большое гам-ма-излучения), которые могут являться сверхопти-мальными для локализованного введения дозы в опухоль. С появлением превосходных хелатных агентов возможность присоединения металличе-ских хелатных групп к протеинам позволила ис-пользовать другие радионуклиды, например, индий [131] и иттрий [90]. Иттрий [90] имеет несколько преимуществ при применении в радиоиммунотера-пии: 64-часовой период полураспада иттрия [90] является достаточно продолжительным для накоп-ления антител в опухоли и, например, в отличие от иода [131], иттрий [90] является чистым эмиттером высокоэнергетического бета-излучения без сопут-ствующего гамма- излучения при его затухании, с диапазоном в ткани от 100 до 1000 диаметров кле-ток. Кроме того, минимальное количество прони-кающего излучения позволяет вводить антитела, помеченные иттрием [90], амбулаторному больно-му. Кроме того, не требуется интерализация мечен-ного антитела для уничтожения клетки, а локаль-ная эмиссия ионизирующей радиации должна быть летальной для прилегающих клеток опухоли, в которых недостает целевого антигена.
Единственное нетерапевтическое ограничение для иттрия [90] основано на отсутствии значитель-ного гамма-излучения, затрудняющего получение изображения. Эту проблему решают, используя такой диагностический “визуализирующий” ради-онуклид как индий [111] для определения местона-хождения и относительного размера опухоли перед введением терапевтических дозировок анти-CD20, маркированных иттрием [90]. Индий [111] является особенно предпочтительным в качестве диагности-ческого радионуклида, так как приблизительно от 1 до 10 мКи индия [111] можно вводить безопасно без наблюдаемой токсичности; и томографические данные обычно прогнозируют с помощью после-дующего распределения антитела, помеченного иттрием [90]. В основном при томографических исследованиях используют антитело, помеченное индием [111] в дозировке 5мКи, поскольку эта до-зировка является безопасной и увеличивает эффек-тивность томографии по сравнению с более низки-ми дозировками, причем оптимальное изображение получают на третий-шестой день после введения антител. См., например, J.L Murray., 26 J. Nuc. Med. 3328 (1985) и Carraguillo, J.A. et at, 26 J; Nuc. Med. 67 (1985).
Эффективные однократные лечебные дозиров-ки (то есть терапевтически эффективные количе-ства) антител анти-CD20, маркированных иттрием [90] располагаются в диапазоне приблизительно от 5 до 75 мКи, более предпочтительно от 10 до 40 мКи. Эффективные однократные лечебные для некостного мозга абляционные дозировки антител анти-CD20, маркированных йодом [131], распола-гаются в диапазоне приблизительно от 5 до 70 мКи, наиболее предпочтительно приблизительно от 5 до 40 мКи. Эффективные однократные лечебные аб-ляционные дозировки антител анти-CD20, марки-рованных йодом [131] (которые могут потребовать аутогенной трансплантации костного мозга) рас-полагаются в диапазоне приблизительно от 30 до 600 мКи, более предпочтительно от 50 до менее 500 мКи. В соединении с химерным антителом анти-CD20 благодаря более длительному циркуля-ционному периоду полураспада по сравнению с мышиными антителами, эффективные однократные лечебные для некостного мозга абляционные дози-ровки химерных антител анти-CD20, маркирован-ных йодом [131], располагаются в диапазоне при-близительно от 5 до 40 мКи, наиболее предпочти-тельно менее 30 мКи. Необходимая дозировка, например метки индия [111] для получения изоб-ражения составляет обычно менее 5 мКи.
Что касается меченных радиоактивными изо-топами антител анти-CD20, то терапию можно осуществлять также путем однократного терапев-тического лечения, либо многократного лечения. Из-за использования радионуклидного компонента предпочтительно перед проведением лечения сде-лать сбор периферических стволовых клеток (“PSC”) или костного мозга (“ВМ”) у пациентов, проявляющих потенциально смертельную токсич-ность костного мозга при действии ионизирующего излучения. Сбор ВМ и/или PSC производили, ис-пользуя стандартные методы, затем очищали и замораживали для возможных повторных инфузий. Кроме того, предпочтительно, чтобы перед прове-дением лечения было проведено диагностическое дозиметрическое исследование пациента с исполь-зованием диагностики меченных антител (напри-мер, при использовании индия [111]), цель которого состоит в том, чтобы удостовериться, что терапев-тически меченное антитело (например, при исполь-зовании иттрия [90]) не будет без надобности “кон-центрироваться” в любом здоровом органе или ткани.
Известны химерные антитела мыши/человека. См., например, Morrison, S.L. et al., PNAS I1:6851-6854 (November 1984); Европейский патент № 172494; Baulianne, G.L, et al. Nature 312:642 (De-cember 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314:268 (March 1985); Европейский патент № 125023; Tan et ai., J. Immunol. 135:8564 (November 1985); Sun, L. К. et. al., 5/1:517 Hybridoma (1986); Sahagan et al., J.Immunol. 137:10661074 (1986). Cм. также, Muron, Nature 312:597 (December 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5/3 (March 1985); Marx, Science 229 455 (August 1985); and Morrison Science 229:1202-1207 (September 1985). Robinson et al., в международной заявке WO 88/04936 описывают химерное антитело, имеющее константный участок человека и вариабельный участок мыши, которое обладает специфичностью к эпитопу CD20; уча-сток мыши химерного антитела согласно Robinson получают из моноклонального антитела 2Н7 мыши (гамма 2b, каппа). Хотя в этих ссылках указано, что описанное химерное антитело является “первым кандидатом” при лечении нарушений В-клеток, это утверждение можно рассматривать не более, чем предложение специалистам в данной области тех-ники установить, является ли предложение кор-ректным для данного специфического антитела, в частности, поскольку в ссылках не приводится данных, подтверждающих терапевтическую эф-фективность, а также важных данных по испытани-ям на высших млекопитающих, например приматах или человеке.
Методологии получения химерных антител известны специалистам в данной области техники. Например, легкие и тяжелые цепочки могут быть экспрессированы по отдельности, в виде, например, легкой цепочки иммуноглобулина и тяжелых цепо-чек иммуноглобулина в отдельных плазмидах. Затем их очищают и собирают in vitro в полные антитела. Известны методологии получения таких структур. См., например, Scharff, М., Harvey Lectures 69:125 (1974). Также известны параметры реакции in vitro для получения антител lgG из уко-роченных изолированных легких и тяжелых цепо-чек. См., например, Beychok, S., Cells of Immuno-globulin Synthsis, Academic Press, New York, p. 69, 1979. Возможна также коэкспрессия легких и тяже-лых цепочек в одних и тех же клетках для достиже-ния внутриклеточной ассоциации и связи тяжелых и легких цепочек в полные антитела H2L2 lgG. Та-кую коэкспрессию можно выполнить, используя те же самые или различные плазмиды в одной и той же клетке хозяина.
Другой способ, наиболее предпочтительный для разработки химерного антитела анти-CD20 кроме человека/человека, основан на использова-нии вектора экспрессии, включающий аb initio ДНК, кодирующую константные участки тяжелых и легких цепочек из источника человека. Такой вектор позволяет вставить ДНК, кодирующую ва-риабельный участок кроме человека таким обра-зом, что можно получать ряд антител анти-CD20 кроме человека. Затем проводят скрининг и анализ для различных характеристик (например, специфи-ка связывания, участки связывания эпитопа, и т.д.). После этого в настоящий вектор можно включать кДНК, кодирующую вариабельные участки легких и тяжелых цепочек предпочтительного или жела-тельного антитела анти-CD20. Предпочтительными являются такие типы векторов как Тандемные Хи-мерные Векторы Экспрессии Антител (“ТСАЕ”). Наиболее предпочтительным вектором ТСАЕ, ко-торый использовали для получения иммунологиче-ски активных химерных антител анти-CD20 для терапевтического лечения лимфам, является вектор ТСАЕ 8. ТСАЕ 8 является производным вектора, принадлежащего владельцу этого патентного до-кумента, упоминаемого под маркировкой ТСАЕ 5.2. Разница однако заключается в том, что в ТСАЕ 5.2 сайтом начала трансляции доминантного селек-тивного маркера (фосфотрансфераза неомицина, “NEO”) является последовательность согласно Kozak, в то время как в ТСАЕ 8, эта область пред-ставляет собой частично ослабленную последова-тельность согласно Kozak. Подробности, касаю-щиеся влияния сайта начала инициации доминант-ного селективного маркера векторов ТСАЕ (также упоминаемых как “вектор ANEX”) по сравнению с экспрессией белка, подробно раскрыты в пара-лелльно рассматриваемой поданной заявке.
ТСАЕ 8 включает: четыре (4) блока тран-скрипции, расположенные в тандемном порядке, легкую цепочку иммуноглобулина человека без вариабельного участка; тяжелую цепочку имму-ноглобулина человека без вариабельного участка; DHFR; и NEO. Каждый блок транскрипции содер-жит собственный эукариотический промотор, и область полиаденирования (см. рисунок 1 - схема-тическое изображение вектора ТСАЕ 8). В частно-сти:
1) Промотор/энхансер CMV перед тяжелой цепочкой иммуноглобулина является укороченным вариантом промотор/энхансер перед легкой цепоч-кой, от сайта Nhe I около -350 до сайта Sst I около -16 (см., 41 Cell 521, 1985).
2) Константный участок легкой цепочки им-муноглобулина человека получали путем ампли-фикации участка PCR в кДНК. В ТСАЕ 8 использо-вали константные участки каппа легких цепочек иммуноглобулина человека (нумерация согласно Kabat, аминокислоты 108-214, аллотип Km 3, (см., Kabat, Е.А. “Sequences of proteins of immunogical interest,” NIH Publication, Fifth Ed. № 91-3242, 1991)), и константный участок гамма 1 тяжелых цепочек иммуноглобулина человека (Kabat, нуме-рация аминокислот 114-478, аллотип Gmla, Gmlz). Легкую цепочку изолировали от крови здорового человека (IDEC Pharmaceuticals Corporation, La Jolla, CA); РНК оттуда использовали для синтеза кДНК, которую затем амплифицировали, используя методы PCR (праймеры получали в точности со-гласно Kabat). Тяжелую цепочку изолировали (ис-пользуя методы PCR) из кДНК, полученной от РНК, которую, в свою очередь, получали из клеток, в которые был трансфектирован вектор человека lgG1 (см., 3 Prot. Eng. 531, 1990; вектор pN(162). Две аминокислоты заменяли в изолированном lgG1 человека для соответствия последовательности аминокислот согласно Kabat, а именно: в положе-нии 225 аминокислоту валин заменяли на аланин (GTT на GCA), а в положении 287 аминокислоту метионин заменяли на лизни (ATG на AAG);
3) Блоки легких и тяжелых цепочек имму-ноглобулина человека содержат искусственные сигнальные последовательности для секреции це-почек иммуноглобулина;
4) Блоки легких и тяжелых цепочек имму-ноглобулина человека содержат специфические рестрикционные сайты ДНК, которые позволяют вводить вариабельные участки легких и тяжелых цепочек иммуноглобулина, которые обеспечивают переход рамки считывания без изменения амино-кислот, обычно присутствующих в цепочках имму-ноглобулина;
5) Блок DHFR содержит собственный эукари-отический промотор (главный промотор на основе глобина мыши, “BЕТА”) и область полиаденирова-ния (полиаденирование бычьего гормона роста, “BGH”); и
6) Блок NEO содержит собственный эукарио-тический промотор (BЕТА) и участок полиадени-рования (раннее полиаденирование SV40, “SV”).
В отношении вектора ТСАЕ 8 и блока NEO участок Kozak был частично ослаблен последова-тельностью согласно Kozak (который включал левый сайт Сlа l):
Cla l -3 + 1
GGGAGCTTGG ATCGAT ccTct ATG Gtt
(В векторе ТСАЕ 5.2 замена между участками Сlа l и ATG, а именно: ссАсс.)
Перечень полной последовательности ТСАЕ 8 (включая специфические компоненты четырех бло-ков транскрипции) представлен на рисунке 2 (SEQ. ID. NO. 1).
Специалисты в данной области техники оце-нят тот факт, что векторы ТСАЕ дают возможность значительно сократить время получения иммуно-логически активных химерных антител анти-CD20. Получение и изоляция константных участков лег-ких и тяжелых цепочек кроме человека, последую-щее их включение в констатные участки блоков транскрипции легких цепочек у человека и в кон-статные участки блоков транскрипции легких це-почек у человека позволяет производить иммуно-логически активные химерные антитела анти-CD20.
Наиболее предпочтительный вариабельный участок кроме человека со специфичностью к анти-гену CD20 получен из мыши по технологии созда-ний гибридом. С помощью методов полимеразной цепной реакции (“PCR”) непосредственно в векторе ТСАЕ 8 клонировали вариабельные участки легких и тяжелых цепочек мыши, что является наиболее предпочтительным путем включения в вектор ТСАЕ вариабельных участков кроме человека. Такое предпочтение главным образом основывает-ся на эффективности реакции PCR и точности включения. Однако существуют другие эквива-лентные способы выполнения этой задачи. Напри-мер, используя ТСАЕ 8 (или эквивалентный вектор) можно получить последовательность вариабель-ных участков антитела анти-CD20 кроме человека с последующим синтезом сегментов последова-тельности или, при необходимости, всей последо-вательности; после этого полную искусственную последовательность включают в соответствующее местоположение внутри вектора. Специалисты в данной области техники могут выполнить эту за-дачу.
Согласно изобретению наиболее предпочти-тельные иммунологически активные химерные антитела анти-CD20 были получены путем исполь-зования вектора ТСАЕ 8, включающего вариабель-ные участки мыши, полученные от моноклонально-го антитела к CD20. Это антитело (описываемое подробно ниже), обозначено как “2В8”. Полная последовательность вариабельных участков, по-лученных от 2B8 в векторе ТСАЕ 8 (“анти-CD20 в ТСАЕ 8”) приведена на рисунке 3 (SEQ. ID. NO 2).
Клеточная линия хозяина, используемая для экспрессии белка, предпочтительно имеет проис-хождение от млекопитающих. Специалисты в дан-ной области техники способны определить пред-почтительные специфические клеточные линии хозяина, которые лучше всего соответствуют же-лательному генному продукту, который необходи-мо в них экспрессировать. Стандартные клеточные линии хозяина включают, но не ограничены, DG44 и DUXBII (линию яичника китайского хомяка (СНО), DHFR минус), HELA (цервикальную карци-ному человека), CVI (линию почек мартышки), COS (производную CVI с Т-антигеном SV40), R1610 (фибробласты китайского хомяка) BALBC/3T3 (фибробласты мыши), НАК (линию почек хомяка), SP2/0 (миелому мыши), P3x63Ag3.653 (миелому мыши), BFA-IcIBPT (клетки бычьего эндотелия), RAJI (лимфоциты человека) и 293 (почки человека). Клеточные линии хозяина обычно получают из коммерческих источников, из Американской Кол-лекции Культур Ткани или выбирают из изданной литературы.
Предпочтительной клеточной линией хозяина является DG44 (СНО) или SP2/O. Cм. Urland, G. et al., Effect of gamma rays and dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions. “Som. Cell & Mol. Gen. 12/6:555-566 (1986), и Shulman, M. et al., “A better cell line for making hybridomas secreting specific anti-bodies.” Nature 276:269 (1978), соответственно. Предпочтительной клеточной линией хозяина яв-ляется DG44. Трансфекцию плазмиды в клетку хо-зяина можно осуществить любым методом, извест-ным в данной области техники. Они включают, но не ограничены, трансфекцию (включая электрофо-рез и электропорацию), слияние клетки с упакован-ной ДНК, микроинъекцию и инфекцию интактным вирусом. См., Ridgway, A.A.G. “Mammalian Expres-sion Vectors.” Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez и Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, MA 1988). Наиболее предпочтительно введение плаз-миды в хозяина производят путем электропорации.

F. ПРИМЕРЫ
Следующие примеры не следует рассматри-вать как ограничивающие изобретение. Примеры иллюстрируют: визуализацию дозы с помощью меченных радиоактивными изотопами антител анти-CD20 (“12B8”); меченное радиоактивными изотопами антитело анти-CD20 (“Y2B8”); и имму-нологически активное химерное антитело анти-CD20 (“С2В8”), полученное с использованием спе-цифического вектора (“ТСАЕ 8”) и вариабельных участков, полученных из мышиного моноклональ-ного антитела анти-CD20 (“2В8”).

1. Меченное радиоактивными изотопами ан-титело 2В8 анти-CD20
А. Получение моноклопального антитела ан-ти-СD20 (мышиного) (“2B8”)
Мышей BALB/C неоднократно иммунизиро-вали клеточной линией SВ лимфобластов человека (см., Adams, R.A. et. al., “Direct implantation and serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in hamsters, SB-2.” Can Res 28:1121-1125 (1968); эта клеточная линия находится в Амери-канской Коллекции Культур Тканей (АТСС), Rockville, MD., под порядковым номером АТСС CCL 120), путем еженедельных инъекций в течение 3-4 месяцев. Идентифицировали мышей, обнаружи-вающих высокие титры антител анти-CD20 в сыво-ротке, что определяли путем ингибирования из-вестных антител специфических для CD20 (исполь-зовали антитела анти-CD20-Leu 16, Beckton Dickinson, San Jose, CA, Cat. № 7670; and BI, Coulter Corp., Hialeah, FL, Cat. № 6602201), у таких мышей удаляли селезенки.
Клетки селезенки сливали с клетками миеломы SP2/0 мыши согласно протоколу, описанному у Einfeld, D.A. et. al., ЕМВО (1988) 7:711 (SP2/0 имеет в АТСС номер АТСС CRL 8006).
Специфичность CD20 анализировали с помо-щью радиоиммуноанализа. Затем очищенное анти-CD20 ВI помечали радиоактивным изотопом I125 способом, описанным Valentine, М. А. et. аl., (1989) J. Biol. Chem. 264:11282. (I125 Sodium lodine, ICN, Irvine, CA, Cat. №. 28665H). Проводили скрининг гибридом при совместной инкубации 0,05 мл среды в каждой лунке для сливания вместе с 0,05 мл анти-СD20 ВI (10 нг), маркированного I125 в 1%-ном бы-чьем сывороточном альбумине (ВSА), физиологи-ческом растворе с фосфатным буфером (PBS, рН 7,4), и 0,5 мл того же самого буфера, содержащего 100000 клеток SB. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре клетки высевали путем переноса в титрационный планшет с 96 лун-ками (V&P Scientific, San Diego, СА), тщательно промывали. Двойные лунки, содержащие немечен-ный анти-CD20 ВI и лунки, не содержащие ингиби-рующего антитела, использовали соответственно как положительный и отрицательный контроль. Лунки, содержащие антитела с более чем 50 %-ным ингибированием увеличивали и клонировали. Ан-титело, проявляющее самое высокое ингибирова-ние, получили от клонируемой клеточной линии, обозначенной здесь как “2В8”.

В. Приготовление конъюгата 2B8-МХ-DТРА.
i. MX-DTPA
1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусную кислоту, меченную углеродом-14, (“MX-DTPA, меченный углеродом-14”) использовали как хелатный агент для конъюгации меченного радиоактивного изото-па с 2B8. Манипулирования с MX-DTPA проводили таким образом, чтобы поддерживать условия от-сутствия металлов, то есть использовали не содер-жащие металлов реагенты и, по возможности, так-же применяли пластмассовые полипропиленовые контейнеры (фляги, мензурки, градуированные цилиндры, наконечники пипеток), которые мыли с Alconox и прополаскивали водой Мilli-Q. MX-DTPA получали в виде сухого твердого вещества у Dr. Otto Gansow (National Institute of Health, Bethesda, MD) и сохраняли в сухом виде при 4°С (в защищен-ном от света месте), с основными растворами, при-готовленными в воде Мilli-Q при концентрации 2-5мМ, которые хранили при -70° С. MX-DTPA был также получали от Immunology Coulter (Hialeah, Флорида) как двунатриевую соль в воде и хранили при -70° С.

ii. Приготовление 2В8
Очищенный 2В8 подготавливали для конъ-югации с MX-DTPA, помещая антитело в не содер-жащий металлов раствор 50mM бицина-NaOff, рН 8,6, содержащий 150 мM NaCl, с использованием повторного буферного обмена с помощью враща-ющихся фильтров CENTRICON 30ТМ (30,000D, MWCO; Amicon). Как правило, в фильтр добавляли 50-200 мкл белка (10 мг/нл), с последующим до-бавлением 2 мл буфера бицина. Фильтр центрифу-гировали при 4°C в роторе Sorval SS-34 (6,000 обо-ротов в минуту, 45 мин). Поддерживаемый объем составлял приблизительно 50-100 мкл; причем этот процесс повторяли дважды, используя тот же са-мый фильтр. Поддерживаемый объем помещали в полипнгропиленовую трубку объемом 1,5 мл с завинчивающимся колпачком, испытывали на бе-лок, разбавляли до 10,0 мг/мл и хранили при 4°С до использования. Аналогично белок помещали в 50 мM цитрата натрия, рН 5.5, содержащий 150 мм NaCl и 0,05 % азида натрия, используя предше-ствующий протокол.

iii. Конъюгация 2В8 с МХ-DТРА
Конъюгацию 2B8 с MX-DTPA выполняли в полипропиленовых трубках при температуре окружающей среды. Замороженные основные рас-творы MX-DTPA оттаивали немедленно перед при-менением. 50-200 мл белка при 10 мг/мл вступали в реакцию с MX-DTPA при молярном соотношении MX-DTPA к 2В8, равном 4:1. Реакции инициирова-ли, добавляя запасной раствор MX-DTPA при осторожном перемешивании; конъюгацию прово-дили накануне вечером (с 14 до 20 часов) при тем-пературе окружающей среды. Нереагировавший MX-DTPA удаляли из конъюгата диализом или повторной ультрафильтрацией, как описано выше в примере l.B.ii, в не содержащем металлов стан-дартном солевом растворе, (0,9 % вес/объем) со-держащем 0,05 % азида натрия. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл и сохраняли при 4°С в полипропиленовой трубке до мочения радиоактив-ными изотопами.

iv. Определение включения МХ-DТРА
Включение МХ-DТРА определяли путем под-счета сцинтилляции и сравнения значения, полу-ченного с очищенным конъюгатом, с удельной активностью МХ-DTPA, меченного углеродом-[14]. Для некоторых исследований, в которых использо-вали нерадиоактивный MX-DTPA (Coulter Immunology), включение МХ-DTPA определяли, инкубируя конъюгат с излишком раствора радио-активного носителя иттрия - [90] известной концен-трации и удельной активности.
Основной раствор хлорида иттрия известной концентрации готовили в не содержащем металлов растворе 0,05 Н НСI, к которому добавляли не содержащий носителя иттрий - [90] (хлорид). Алик-вотные пробы этого раствора анализировали пу-тем подсчета сцинтилляции в жидкости для опре-деления точной удельной активности для этого реагента. Объем реагента хлорида иттрия, равный 3-кратному числу молей хелата, которые жела-тельно присоединить к антителу, (как правило, 2 моль/моль антитела), добавляли в полипропилено-вую трубку и рН доводили до 4,0-4,5 при добавле-нии 2 М натриевого ацетата. Затем добавляли конъюгированное антитело, и смесь инкубировали в течение 15-30 минут при температуре окружаю-щей среды. Реакцию гасили, добавляя 20 мм эти-лендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) к окон-чательной концентрации 1 мМ и рН раствора до-водили приблизительно до 6 при добавлении 2М натриевого ацетата.
После 5 минут инкубации весь объем очищали при помощи высокоразрешающей эксклюзионной хроматографии (описанной ниже). Объединяли элюированные фракции, содержащие белок, опре-деляли концентрацию белка, и анализировали аликвотные пробы на радиоактивность. Включение хелата вычисляли с помощью удельной активности препарата хлорида иттрия-[90] и концентрации белка.

v. Иммунореактивность 2В8-МХ-DТРА
Оценивали иммунореактивность конъюгиро-ванного 2В8, используя для всех клеток твердофаз-ный иммуноферментный анализ (ELISA). Клетки SB в средней лог-фазе фазы высевали из культуры центрифугированием и промывали два раза с IX HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенк-са). Клетки разводили до 1-2 X 106 клеток/мл в HBSS и помещали аликвотные пробы в полисти-рольные микропланшеты с 96 лунками при 50000-100000 клеток на лунку. Микропланшеты высуши-вали под вакуумом в течение 2 часов при 40- 45°С для фиксации клеток на пластмассе. Микроплан-шеты хранили в сухом виде при -20°С до их приме-нения. Для анализа микропланшеты нагревали до температуры окружающей среды непосредственно перед использованием, блокировали 1X PBS (фи-зиологическим раствором с фосфатным буфером), рН 7,2-7,4, содержащим 1 % BSA (бычьего сыворо-точного альбумина (2 часа). Образцы для анализов разбавляли в 1X PBS 1% BSA, наносили на микро-планшеты и последовательно разбавляли (1:2) в том же самом буфере. После инкубации микроп-ланшетов в течение 1 часа при температуре окру-жающей среды микропланшеты промывали три раза IX PBS. Вторичное антитело (козлиный анти-мышиный специфический к lgG1 HRP конъюгат объемом 50 мкл) добавляли в лунки (разбавление 1:1500 в 1X PBS/l% BSA) и инкубировали в течение 1 часа при температуре окружающей среды. Мик-ропланшеты промывали четыре раза в 1X PBS при добавлении раствора субстрата ABTS (раствор 50 мм натриевого цитрата, рН 4,5, содержащий 0,01% ATBS и Н2O2 0,001%). Микропланшеты читали при 405 им после 15-30 минут инкубации. Антиген-отрицательные клетки HSB включали в анализ для мониторинга неудельного связывания. Иммуноре-активность конъюгата вычисляли с помощью гра-фика значений оптической плотности по отноше-нию к соответствующему фактору разбавления и сравнивали их с полученными значениями, исполь-зуя природное антитело (представляющее 100 %-ную иммунореактивность), тестируемое на том же микропланшете; далее несколько значений части линейного титрационного профиля сравнивали и определяли среднее значение (данные не представ-лены).

vi. Подготовка 2B8-MX-DTPA, меченного ин-дием [111] (“I2В8”)
Конъюгаты помечали радиоактивными изото-пами индия - [111], свободными от носителя. Алик-вотную пробу изотопа (0,1-2 мКи/мг антитела) в 0,05 М HСI перемещали в полипропиленовую трубку и добавляли приблизительно одну десятую часть объема 2 М НСI, не содержащего металлов. После инкубации в течение 5 минут добавляли раствор 2 М натриевого ацетата, не содержащего металлов для доведения рН раствора до величины 4,0-4,4. Приблизительно 0,5 мг 2B8-MX-DTPA до-бавляли из основного раствора 10,0 мг/мл DTPA в нормальном физиологическом растворе соли, или в 50 мM натриевого цитрата в 150 мМ NaСl, содер-жащего 0,05 % азида натрия, и сразу же осторожно перемешивали раствор. Раствор проверяли с по-мощью лакмусовой бумаги, получали значение 4,0-4,5 и смесь инкубировали при температуре окру-жающей среды в течение 15-30 минут. Затем реак-цию гасили путем добавления 20 мМ EDTA к окон-чательной концентрации 1 мм, а рН реакционной смеси доводили приблизительно до 6,0, используя 2 М ацетат натрия.
После 5-10 минут инкубации некомплексооб-разующий радиоизотоп удаляли при помощи экс-клюзионной хроматографии. Блок HPLS (жидкост-ной хроматографии высокого давления) включал Waters Model 6000 или систему поставки раствори-теля TosoHaas Model TSK-6110, укомплектованную соответственно инъекционным клапаном Waters U6K или Rheodyne 700. Хроматографические сепа-рирования выполняли, используя гель-проникающую колонну (BioRad SEC-250; 7.5 х 300 мм или сравнительную колонну TosoHaas) и огра-ничивающую колонну SEC-250 (7,5 х 100 мм). Си-стема была оборудована коллектором фракций (Pharmacia Frac200) и монитором UV с фильтром диаметром 280 нм (Pharmacia model UV-1). Образ-цы наносили и равномерно элюировали с помощью 1X PBS, рН 7,4, при скорости потока 1,0 мл/мин. Половину миллилитровых фракций собирали в стеклянные трубки и их аликвотные пробы подсчи-тывали в гамма-счетчике. Нижние и верхние окна устанавливали от 100 до 500 КэВ соответственно.
Включение радиоизотопов вычисляли, сумми-руя радиоактивность, связанную с пиковыми зна-чениями белка при элюации и делили это число на общую радиоактивность, элюированную из колон-ны; затем это значение представляли в процентном соотношении. В некоторых случаях включение радиоизотопов определяли с помощью моменталь-ной тонкослойной хроматографии (“ITLC”). Ме-ченный радиоактивными изотопами конъюгат раз-бавляли в соотношении 1:10 или 1:20 в растворе, содержащем 1X PBS или в растворе 1X PBS/ 1 мM DTPA, затем 1 мкл наносили на расстояние 1, 5 см от одного конца полоски бумаги SG ITLC размером 1 х 5 см. Бумагу обрабатывали с помощью восхо-дящей хроматографии, используя раствор 10 % ацетата аммония в метаноле и воды в объемном соотношении 1:1. Полоску высушивали, разрезали поперек на две половины, и радиоактивность каж-дой части определяли подсчетом гамма-излучения. Радиоактивность нижней части полоски (радиоак-тивность, связанную с белком) представляли в виде процента от суммарной радиоактивности, опреде-ленной путем сложения значений для верхней и нижней половин (данные не приведены).
Определяли удельные активности путем изме-рения радиоактивности соответствующих аликвот-ных проб конъюгата, меченного радиоактивными изотопами. Это значение корректировали для эф-фективности счетчика (обычно 75%) и соотносили с концентрацией белка в конъюгате, предваритель-но определив оптическую плотность при 280 нм. В результате получили значение, выраженное в мКи/мг протеина.
В некоторых экспериментах 2B8-MX-DTPA помечали индием [111] согласно протоколу, опи-санному выше, за исключением очистки жидкост-ной хроматографией высокого давления. Этот про-токол обозначают как "mix-and- shoot".

vii. Приготовление 2B8-MX-DTPA. меченного иттрием (“Y2B8”)
Для приготовления конъюгата 2B8-MX-DTPA, меченного иттрием (“Y2B8”), следовали тому же самому протоколу, описанному для приготовления I2В8, меченного иттрием, за исключением исполь-зования 2 нг НCI. Все препараты конъюгатов, ме-ченных иттрием, очищали эксклюзионной хрома-тографией как описано выше.
С. Исследования животных кроме человека
i. Биораспределение 2B8-МХ-DТРА. меченно-го радиоактивными изотопами
I2В8 оценивали для биораспределения в ткани у мыши линии BALB/c в возрасте шести -восьми недель. Конъюгат, меченный радиоактивными изо-топами, приготавливали, используя клиническую стадию препарата 2B8-MX-DTPA, затем следовали протоколу “mix-and-shoot”, описанному выше. Удельная активность конъюгата составляла 2,3 мКи/мг, и из конъюгата получали препарат в PBS с рН 7,4, содержащим 50 мг/мл HSA (сывороточного альбумина человека). Мышам вводили внутривен-но 100 мл I2B8 (приблизительно 21 мКи). Троих мышей умерщвляли путем цервикальной дислока-ции через О, 24, 48, и 72 часа. После умерщвления хвост, сердце, легкие, печень, почки, селезенку, мышцы и бедренную кость удаляли, промывали и взвешивали. Брали образцы крови для анализа. Определяли радиоактивность каждого образца путем подсчета гамма-излучения, а также соответ-ственно процент введенной дозы на грамм ткани паритета. Также учитывали влияние активности крови отдельных органов.
Согласно отдельному протоколу, аликвотные пробы 268-MX-DTPA, которые инкубировали при 4°С и 30°С в течение 10 недель, помечали радиоак-тивными изотопами индия [111] до удельной ак-тивности 2,1 мКи/мг для обоих препаратов. Затем эти конъюгаты использовали при исследованиях биораспределения в мышах как описано выше.
Для дозиметрических измерений 2В8-MX-DTPA помечали радиоактивным индием [111] до удельной активности 2,3 мКи/мг и вводили прибли-зительно 1,1 Ки каждой из 20 мышей линии BALB/c. Впоследствии пять мышей умерщвляли через 1, 24, 48 и 72 часа, а их органы удаляли и подготавливали для анализа. Кроме того, участки кожи, мышцы и кости удаляли и обрабатывали для анализа; также собирали мочу и фекалии и анали-зировали в течение того же самого времени 24-72 часа.
С помощью аналогичного способа 2B8-MX-DTPA помечали радиоактивным изотопом иттрия [90] и оценивали его биологическое распределение в мышах линии BALB/c с интервалом времени 72 часа. После очищения жидкостной эксклюзионной хроматографией высокого давления четырем груп-пам по пять мышей вводили внутривенно прибли-зительно 1 мКи подготовленного для клинических испытаний конъюгата с удельной активностью 12,2 мКи/мг. Группы впоследствии умерщвляли через 1, 24, 48 и 72 часа, а их органы и ткани анализирова-ли как описано выше. Радиоактивность каждого образца ткани определяли, измеряя энергию тор-мозного излучения счетчиком сцинтилляций гамма-излучения. Значения активности впоследствии выражали как процент вводимой дозировки на грамм ткани или как процент вводимой дозировки на орган. Хотя органы и ткани промывали неодно-кратно для удаления избыточной крови, перфузию органов не проводили. Таким образом учитывали влияние активности внутренней крови на общее значения активности органа.
ii. Локализация опухоли с помощью I2B8
Определяли локализацию меченного радиоак-тивными изотопами 2B8-MX-DTPA в тимусэктоми-рованных мышах, несущих опухоль В-клеток Ramos. Тимусэктомированным мышам в возрасте шести-восьми недель вводили подкожно (в левый бок) 0,1 мл RPMI-1640, содержащего 1,2 х 107 кле-ток опухоли Ramos, которые предварительно адаптировали для роста в тимусэктомированных мышах. Опухоли возникали в течение двух недель и располагались по весу в диапазоне от 0,07 до 1,1 граммов. Мышам вводили внутривенно 100 мкл 2В8-МХ-DTPA (16,7 мКи), помеченного индием [111] и умерщвляли группы из трех мышей путем цервикальной дислокации через 0, 24, 48, и 72 часа. После умерщвления хвост, сердце, легкие, печень, почки, селезенки, мышцы, бедренную кость и опу-холь удаляли, вымывали, взвешивали; брали об-разцы крови для анализа. Определяли радиоактив-ность каждого образца путем подсчета гамма-излучения и процент вводимой дозы на грамм тка-ни.

iii. Биораспределение и изучение локализации опухоли с помощью 2В8-МХ-DТРА. меченного pадиоактивными изотопами.
После предварительного эксперимента по би-ораспределению, описанного выше (Пример I.B.viii.a), конъюгированное 2В8 помечали радио-активным изотопом индия [111] с удельной актив-ностью 2,3 мКи/мг, и непосредственно вводили каждой из двадцати мышей линии BALB/c 1,1 Ки для определения биораспределения меченного радиоактивными изотопами вещества. Впослед-ствии группы из пяти мышей в каждой умерщвляли через 1, 24, 48 и 72 часа, а их органы и часть кожи, мышцы и кости удаляли и обрабатывали для ана-лиза. Кроме того, мочу и фекалии собирали и ана-лизировали в течение интервалов времени 24-72 часа. Уровень радиоактивности крови снижался от 40,3% при инъекции дозы на грамм через 1 час до 18,9 % через 72 часа. ( данные не приведены). Зна-чения для сердца, почек, мышц и селезенки остава-лись в диапазоне от 0,7-9,8 % в течение экспери-мента. Уровни радиоактивности, обнаруженной в легких, снижались от 14,2 % через 1 час до 7,6 % через 72 часа. Аналогично значения на грамм вво-димой дозы для печени составили соответственно 10,3 % и 9,9%. Эти данные использовали для опре-деления поглощенных доз радиации I2В8, описан-ных ниже.
Биораспределение конъюгата, меченного ит-трием [90], с удельной активностью антитела 12,2 мКи/мг определяли в мышах линии BALB/c. Полу-чали включения радионуклидов (90 %), и очищали меченное радиоактивными изотопами антитело HPLC (жидкостной хроматографией высокого дав-ления). Распределение радиоактивности в ткани определяли в главных органах, и коже, мышцах, костях, моче и фекалиях через 72 часа и выражали в процентах вводимой дозы на грамм ткани. Ре-зультаты (не приведены) подтверждали, что хотя уровни радиоактивности крови снижались от при-близительно 39,2 % вводимой дозы на грамм через 1 час до 15,4 % через 72 часа уровни радиоактив-ности в хвосте, сердце, почках, мышцах и селезенке оставались постоянными, равными 10,2 % или ни-же на протяжении эксперимента. Важно то, что радиоактивность кости располагалась в диапазоне от 4,4 % вводимой дозы на грамм кости через 1 час до 3,2 % через 72 часа. В совокупности эти резуль-таты показывают, что малые дозы свободного ит-трия были в конъюгате и что малые дозы свобод-ных радиоактивных металлов высвобождались в ходе эксперимента. Эти данные использовали для определения доз поглощенной радиации для Y2B8, описанного ниже.
Для исследований локализации опухоли при-готавливали 2B8-MX-DTPA и помечали радиоак-тивными изотопами индия [111] до удельной ак-тивности 2,7 мКи/мг. Затем сто микролитров поме-ченного коньюгата (приблизительно 24 Ки) вводи-ли каждой из 12 тимусэктомированных мышей, имеющих опухоль В-клеток Ramos. Опухоли рас-полагались по весу в диапазоне от 0,1 до 1,0 грам-мов. После инъекции через 0, 24, 48, и 72 часов брали образцы крови объемом 50 мл путем пунк-ции глазного дна, затем мышей умерщвляли по-средством цервикальной дислокации и удаляли хвост, сердце, легкие, печень, почки, селезенку, мышцы, бедренную кость и опухоль. После обра-ботки и взвешивания тканей определяли радиоак-тивность каждого образца ткани, используя счет-чик гамма-излучения, а значения выражали как процент вводимой дозы на грамм.
Результаты (не представлены) показали, что концентрации 111 In-2B8-MX-DTPA в опухоли устойчиво возрастали на протяжении хода экспе-римента. Тринадцать процентов вводимой дозы накапливалось в опухоли через 72 часа. Уровни крови, напротив, снижались в течение эксперимен-та от свыше 30% через 0 часов до 13% через 72 часа. Все другие ткани (за исключением мышц) содержали от 1,3 до 6,0 % вводимой дозы на грамм ткани к концу эксперимента; мышечная ткань со-держала приблизительно 13% вводимой дозы на грамм.
D. Исследования человека.
i. 2B8 и 2B8-МХ-DТРА: Иммуногистологиче-ские исследования в тканях человека
Определяли реактивность мышиного мо-ноклонального антитела 2В8 в ткани, используя набор 32 различных тканей человека, фиксирован-ных ацетоном. Антитело 2B8 реагировало с анти-геном анти-CD20, которое имело ограниченную структуру распределения ткани, наблюдаемую только в субпопуляции клеток в лимфоидных тка-нях, имеющих только гематопоэтическое проис-хождение.
В лимфатическом узле наблюдали иммуноре-активность в популяции зрелых корковых В-лимфоцитов, а также в пролиферирующих клетках герминальных центров. Положительную реактив-ность также наблюдали в периферической крови, областях В-клеток миндалин, белой пульпе селе-зенки, и у 40-70 % медуллярных лимфоцитов, обна-руженных в тимусе. Положительная реактивность также наблюдалась в фолликулах собственно тон-ких слоев (пейровых бляшках) толстого кишечника. И наконец, положительные результаты получали при применении антитела 2В8 в популяции или рассеянных лимфоидных клетках стромы различ-ных органов, включая мочевой пузырь, молочные железы, шею, пищевод, легкие, околоушную желе-зу, простату, тонкую кишку и желудок (данные не представлены).
Обнаружено, что все клетки однослойного эпителия, также как и многослойного эпителия и эпителия различных органов, являются нереактив-ными. Аналогично, отсутствие реактивности уста-новлено в нейроэктодермальных ячейках, включая клетки головного, спинного мозга и перифериче-ских нервов. Было обнаружено, что мезенхималь-ные элементы, например клетки скелетных и глад-ких мышц, фибробластов, клетки эндотелия, и по-лиморфоядерные клетки опухоли также являются отрицательными (данные не представлены).
Оценивали реактивность конъюгата 2B8-MX-DTPA в ткани, используя набор из шестнадцати тканей человека, фиксированных в ацетоне. Как было показано ранее в отношении природного антитела (данные не приведены), конъюгат 2В8-MX-DTPA распознавал антиген CD20, который проявил сильно ограниченную структуру распре-деления, поскольку его обнаруживали только в субпопуляции клеток лимфатического происхож-дения. В лимфатическом узле иммунореактивность наблюдали в популяции В-клеток. Высокую реак-тивность наблюдали в белой пульпе селезенки и в медуллярных лимфоцитах тимуса. Иммунореак-тивность также наблюдали в рассеянных лимфоци-тах в мочевом пузыре, сердце, толстом кишечнике, печени, легком и матке, которую объясняли нали-чием опухолевых клеток в этих тканях. Как и у природного антитела, никакой реактивности не наблюдали в нейроэктодермальных клетках или в мезенхимальных элементах (данные не представ-лены).

ii. Клинический анализ I2В8 (томография) и Y2B8 (терапия).
а. Исследование терапии однократной дозой при клиническом испытании в фазе I/II
В настоящее время проводится клинический анализ I2В8 в фазе 1/11 (томография) сопровожда-емый введением однократной терапевтической дозы Y2B8. При исследовании однократной дозы следуют следующей схеме:
1. Сбор периферических стволовых клеток (PSC) или клеток костного мозга (ВМ) с очисткой;
2. Томография I2В8;
3. Терапия Y2B8 (три уровня дозировки); и
4. Трансплантация РSС или аутогенного ВМ (в случае необходимости основанная на абсолютном подсчете нейтрофилов менее 500 в мм3 в течение трех последовательных дней или тромбоцитов менее 20000 в мм3 , если исследование не обнару-живает восстановления костного мозга.)
Уровни дозировки Y2B8 были следующими:
Уровень дозировки Дозировка (мКи)
1. 20
2. 30
3. 40
Необходимо провести лечение троих пациен-тов на каждом из уровней дозировок для определе-ния максимально переносимой дозы (“максимально переносимая доза”).
Томографические исследования (дозимет-рию) проводят следующим образом: каждого пациента включают в два исследования биораспределения in vivo при использовании I2B8. В первом исследова-нии вводят внутривенно 2 мг I2В8 (5мКи) через один час; спустя одну неделю 2В8 (то есть неконъюгирующее антитело) вводят внутривенно со скоростью, не превышающей 250 мг/ч, затем немедленно вводят внутривенно 2 мг I2В8 (5 мКи) через один час. При обоих исследованиях немед-ленно после инфузии I2В8 каждого пациента под-вергают томографии, которую повторяют при вре-мени t = 14-18 часов (если указано), t = 24 часа; t = 72 часа; и t = 96 часа (если указано). Для метки индия [111] определяют среднее время сохранения во всем организме; такие определения также дела-ют для распознаваемых органов или органов, по-врежденных опухолями (“области, представляю-щие интерес”).
Области, представляющие интерес, сравнива-ют с концентрациями метки во всем организме. На основании этого сравнения, используя стандарт-ные протоколы. можно определить локализацию и концентрацию Y2B8. Если определяемая суммар-ная доза Y2B8 в более чем в восемь (8) раз превы-шает расчетную дозу для всего организма, или если расчетная суммарная доза для печени превы-шает 1500 сГр, то лечение Y2B5 не проводят.
Если результаты томографических исследова-ний приемлемы, то на 0,0 или 1,0 мг/кг веса пациен-та вводят внутривенно 2В8 со скоростью не более 250 мг/ч. Затем внутривенно вводят Y2B5 (10, 20 или 40 мКи) со скоростью 20 мКи/ч.
в. Клиническое испытание в фазе I/II: иссле-дование терапии многократной дозой
В настоящее время проводят клинический анализ Y2B5 в фазе I/II: исследование терапии многократной дозой. Для исследования многократ-ной дозы используют следующую схему:
1. Сбор PSC или ВМ;
2. Томография I2B8;
3. Терапия Y2B8 (три уровня дозировки) для четырех дозировок или общей суммарной дозиров-ки 80 мКи и;
4. Трансплантация PSC или аутогенного ВМ (основанная на решение практикующего врача).
Уровни дозировки Y2B8 были следующими:
Уровень дозировки Дозировки (мКи)
1. 10
2. 15
3. 20
Необходимо провести лечение троих пациен-тов на каждом из уровней дозировки для определе-ния максимально переносимой дозы (MTD)
Томографические исследования (дозиметрию) проводят следующим образом: предпочтительную дозу при томографии для немеченного антитела (то есть 2В8) определяют для первых двух пациентов. Эти первые два пациента получают 100 мг неме-ченного 2B8 в 250 см3 обычного физиологического раствора, а через 4 часа им вводят 0,5 мКи I2В8, берут анализ крови для получения данных биорас-пределения по времени t =0, t = 10 минут, t = 120 минут, t = 24 часа, и t = 48 часов. Пациентов скани-руют с получением множества местных изображе-ний с помощью гамма-камеры во время t = 2 часа, t = 24 часа и t = 48 часов. После сканирования при t = 48 часов пациенты получают 250 мг 2B8 как описано, затем им вводят в кровь 4,5 мКи I2B8 - и сканируют как описано. Если 100 мг 2B8 дают хорошую томографию, то следующие два пациента получают 50 мг 2В8 как описано, затем вводят 0,5 мКи I2B8, далее через 48 часов вводят 100 мг 2B8 и затем 4,5 мКи I2B8, Если 250 мг 2В8 дают хоро-шую томографию, то следующие два пациента получают 250 мг 2В8 как описано, затем им вводят 0,5 мКи I2B8, через 48 часов 500 мг 2B8 и затем 4,5 мКи I2В8. Следующим пациентам вводят самое низкое количество 2В8, что обеспечивает опти-мальное отображение. Оптимальное отображение определяют как: (1) наилучшее эффективное отоб-ражение при самом медленном исчезновении анти-тела, (2) наилучшее распределение, минимизиру-ющее компартментализацию в отдельном органе; и (3) наилучшее субъективное разрешение изобра-жения патологического изменения (сравнение опу-холь/фон).
Для первых четырех пациентов первая тера-певтическая дозировка Y2B8 будет начинаться через 14 дней после введения последней дозировки I2В8; для следующих пациентов первая терапевти-ческая дозировка Y2B8 будет начинаться от двух до семи дней после введения I2B8.
До введения Y2B8 пациентам, кроме первых четырех, вводят 2В8 как описано, затем внутривен-но вводят Y2B8 через 5-10 минут. Берут анализ крови для биораспределения по времени t = 0, t = 10 минут, t = 120 минут, t = 24 часа и t = 48 часов. Па-циенты получают повторные дозировки Y2B8 (вво-дят ту же самую дозировку, как и первую) прибли-зительно каждую неделю с шестой по восьмую при максимуме четыре дозировки или общую суммар-ную дозировку 80 мКи. Наиболее предпочтитель-но, чтобы пациенты не получали последующую дозировку Y2B8, пока показатель WBC (формулы крови) у пациентов больше либо равен 3000, и AGC больше либо равен 100000.
После завершения исследования уровня с тре-мя дозировками определяют максимально перено-симую дозу. В исследования вводят дополнитель-ных пациентов будут, которые будут получать максимально переносимую дозу.

II. Получение химерных антител анти-СD20 продукция (“С2В8”)
А. Конструирование вектора экспресии ДНК химерного иммуноглобулина анти-CD20
РНК изолировали из клетки гибридомы мыши 2B8 (как описано Chomczynki, Р. et а1., “Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.” Anal. Biochem. 162:156-159 (1987) и получали из нее кДНК. вариабельные участки ДНК легких цепочек иммуноглобулина мыши изолировали из кДНК цепной реакцией полимеразы с помощью набора праймеров ДНК с гомологией к сигнальным после-довательностям легких цепочек мыши на 5' конце и J-участками легких цепочек мыши на 3' конце. По-следовательности праймеров были следующими:
1. Смысловой VL (SEQ. ID. NO. 3)
5' АТС АС AGATCT СТС АСС ATG GAT ТТТ CAG GTG CAG ATT ATC AGC TTC 3'
(подчеркнутая часть является сайтом Bgl II; весь участок является кодоном начала).
2. Антисмысловой VL (SEQ. ID. NO. 4)
5' ТGС AGC АТС CGTACG TTT GAT TTC CAG CTT 3'
(подчеркнутая часть является сайтом WI Bsi.)
Cм. рисунки 1 и 2 для соответствующих сай-тов Bgl II и WI Bsi в TCAE 8, и рисунок 3 для соот-ветствующих сайтов в анти-CD20 в ТСАЕ 8.
Эти получаемые в результате фрагменты ДНК клонировали непосредственно в векторе ТСАЕ 8 перед константным доменом легких цепочек каппа человека и секвой и секвенировали. Определяемая последовательность ДНК для вариабельных участков легких цепочек мыши изображена на рисунке 4 (SEQ. ID. NO. 5); см. также рисунок 3, нуклеотиды от 978 до 1362. На рисунке 4 также показаны последовательности аминокислот этого вариабельного участка, а также каркасные участки и участки CDR. Вариабельные участки легких це-почек мыши из 2В8 расположены в семействе кап-па VI мыши. См., Kabat, выше.
Вариабельные участки тяжелых цепочек мы-ши аналогично изолировали и клонировали перед константными доменами lgGI человека. Праймеры были следующими:
1. Смысловой VH (SEQ. ID. NO. 6)
5 'GCG GCT CCC ACGCGT GTC CTG TCC CAG 3'
(подчеркнутая часть является сайтом Mlu I)
2. Антисмысловой VH (SEQ. ID. NO. 7)
5’ GG (G/C) TGT TGT GCTAGC TG (А/С) (A/G) GA GAC (G/A) GT GA 3'
(подчеркнутая часть является сайтом Nhe I)
Cм. рисунки 1 и 2 для соответствующих сай-тов Mlu I и Nhe I в ТСАЕ 8, и рисунок 3 для соот-ветствующих сайтов в анти-CD20 в ТСАЕ 8.
Последовательность для этих тяжелых цепо-чек мыши представлена на рисунке 5 (SEQ. ID. NO. 8); см. также рисунок 3, нуклеотиды от 2401 до 2820. На рисунке 5 также показана последователь-ность аминокислот из этих вариабельных участков мыши, а также каркасных участков и участков CDR. Вариабельные участки тяжелых цепочек мыши из 2В8 находятся в семействе VH2B мыши. См., Kabat, выше.

В. Приготовление химерного анти-СD20, вы-работанного трансфектомой яичника китайского хомяка и SР2/0
Клетки DG44 яичника китайского хомяка (“СНО”) выращивали в среде SSFM II минус гипо-ксантина и тимидина (Gibco, Grand Island, NY, Form № 910456PK); клетки миеломы мыши SP2/0 выра-щивали в модифицированной по способу Дульбек-ко среде Игла (“DMEM”) (Irvine Scientific, Santa Ana, Ca, Cat. № 9024) при добавлении 5 % эмбрио-нальной бычьей сывороткой и 20 мл/л глутамина. Четыре миллиона клеток электропорировали с плазмидой ДНК либо из 25 мг яичника китайского хомяка или из 50 мг SP2/0, которую разрезали с помощью Not I, используя систему электропорации ВТХ 600 (ВТХ, San Diego, СА) в 0,4 мл одноразовой кюветы. Применяли 210 вольт для яичника китай-ского хомяка или 180 вольт для SP2/0, 400 микро-фарад, 13 Ом. Каждую электропорацию размещали на шесть планшетов с 96-ячейками (приблизитель-но 7000 клеток в ячейке). На планшеты наносили среду, содержащую G418 (GENETICIN, Gibco, Cat. № 860-1811) в 400 мг/мл активного соединения для яичника китайского хомяка (среда далее включала 50 мкМ гипоксантина и 8 мкМ тимидина) или 800 мг/мл для SP2/0. Электропорации проводили в по-следующие два дня и затем 2 или 3 дня до образо-вания колоний. Супернатант из колоний исследо-вали на наличие химерного иммуноглобулина с помощью ELISA, специфического для антитела человека. Колонии, производящие наибольшее количество иммуноглобулина, размножали и по-мещали в 96-ячеечные планшеты, содержащие среду плюс метотрексат (25 нМ для SP2/0 и 5 нМ для яичника китайского хомяка) и подавали среду каждые два или три дня. Исследовали супернатан-ты, как описано выше, а также колонии, произво-дящие наибольшее количество иммуноглобулина. Химерное анти-CD20 антитело очищали от супер-натанта, используя аффинную хроматографию белка А.
Очищенное химерное анти-CD20 анализиро-вали при помощи электрофореза в полиакриламид-ном геле и доводили очистку до более, чем прибли-зительно 95%. Родство и специфичность химерного антитела определяли на основе 2В8. Химерное антитело анти-CD20 тестировали на связывание при прямых и конкурирующих испытаниях, и при сравнении с мышиным анти-CD20 моноклональ-ным антителом 2В8 оно показало сравнимое род-ство и специфичность для ряда случаев CD20 по-ложительных линий В-клеток (данные не представ-лены). Константу кажущегося сродства (“Кар”) химерного антитела определяли путем прямого связывания меченного радиоактивными изотопами I125 химерного анти-CD20 и сравнивали с мечен-ным радиоактивными изотопами 268 по графику Scatchard; установленная константа Кар для хи-мерного анти-CD20, полученного из яичника ки-тайского хомячка, составила 5,2 х 10-9 М, а для антитела, полученного из SР2/0 7,4 х 10-9 М. Рас-четная константа Кар для 2В8 составила 3,5 х 10-9 М. Использовали прямую конкуренцию при радио-иммунном анализе для подтвердения специфично-сти и сохранения иммунореактивности химерного антитела путем сравнения его способности эффек-тивно конкурировать с 2В8. Потребовались доста-точные эквивалентные количества химерных анти-тел анти-CD20 и 2В8 для 50%-нoго ингибирования связывания с антигенами CD20 на В-клетках (дан-ные не представленны), то есть наблюдали мини-мальную потерю ингибирования активности анти-тел анти-CD20, возможно благодаря химеризации.
Результаты Примера II. В показывают, что химерные антитела анти-CD20 были получены из трансфектом яичника китайского хомячка и SP2/0 с использованием векторов ТСАЕ 8. Эти химерные антитела имели в основном ту же самую специфич-ность и способность к связыванию как мышиное моноклональное антитело 2B8 анти-CD20.

С. Определение иммунологической активности химерных антител анти-СD20
i. Анализ C1q человека
Химерные антитела анти-CD20, полученные из клеточных линий яичника китайского хомячка и SР2/0, оценивали на связывание C1q человека при анализе в проточной цитометрии с использованием флуоресцентного меченного C1q (C1q, получали от Quidel, Mira Mesa, СА, Prod. № А400, а метку FITC от Sigma, St. Louis MO, Prod. № F-7250; FITC). Мо-чение C1q производили согласно протоколу, опи-санному в Selected Methods In Cellular Immunology, Michell & Shiigi, Ed. (W.H. Freeman & Co., San Fracis-co, CA, 1980, p. 292). Аналитические результаты получали c использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACScanTM (флуоресцию изме-ряли в диапазоне 515-545 нм). Эквивалентные ко-личества химерного антитела анти-CD20, lgG1 человека, К-белка миеломы (Binding Site, San Diego, Са, Prod. No. BP078), и 2B8 инкубировали с эквива-лентным количеством клеток SB, положительных к CD20, затем промывали буфером FACS (0,2 % BSA в PBS, рН 7,4, 0,02 % азида натрия) для удаления неприсоединившегося антитела и инкубировали с C1q, меченным FITC. После 30 - 60 минут инкуба-ции клетки опять промывали. Три условия, включая C1q, меченный FITC в качестве контрольного, ана-лизировали на FACScanTM и составляли инструк-ции для их получения. Результаты представлены на рисунке 6.
Результаты на рисунке 6 показывают, что зна-чительное увеличение флюоресценции наблюдали только при условии химерного антитела анти-CD20; то есть только клетки SB с прилегающим к ним химерным антителом анти-CD20 были поло-жительны на C1q, в то время как при других усло-виях, такую же структуру получали как контроль-ную.

ii. Зависимый от комплемента лизис клетки
Химерные антитела анти-CD20 анализирова-ли на их способность лизировать клеточные линии лимфомы в присутствии сыворотки человека (ис-точник комплемента). SВ клетки, положительные к CD20, помечали 51Сr путем смешивания 100 мкКи 51Cr с 1 х 106 SB клеток в течение 1 часа при 37°С. Меченные SB клетки инкубировали в присутствии эквивалентных количеств комплемента человека и эквивалентных количеств (0-50 г/мл) химерных антител анти-CD20 или 2B8 в течение 4 часов при 37С (см., Brunner, К.Т. et al., “Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labeled allogenic target cells in vitro.” Immunology 14:181-189 (1968). Результаты представлены на рисунке 7.
Результаты рисунка 7 показывают, что при этих условиях химерные антитела анти-CD20 про-извели значительный лизис (49 %).

iii. Анализ эффектор клеточной цитотоксично-сти в зависимости от антитела
Для этого исследования использовали CD20-положительные клетки (SB) и CD20 - отрицатель-ные клетки (линия НSВ лейкемии Т-клеток; см., Adams, Richard, “Formal Discussion,” Can. Res. 27:2479-2482 (1967); ATCC deposit No. ATCC CCL 120.1); и помечали их 51Cr. Анализ проводили согласно протоколу, описанному в Brunner, К.Т. et al., "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labeled allogenic target cells in vitro.” Immunology 14:181-189 (1968). Наблюдали значительный лизис CD20-положительных целевых SВ клеток, зависимый от химерных антител анти-CD20 (меченных 51Cr) в конце 4 часа инкубации при 37С. Этот эффект наблюдали для антитела, полученного из яичника китайского хомячка и SР2/0 (клетками эффектора были периферические лимфоциты человека; соотношение клеток эффек-тора к мишени составляло 100:1. Эффективный лизис целевых клеток получали при 3,9 г/мл. Напротив, при тех же условиях мышиное монокло-нальное антитело 2B8 анти-CD20 давало стати-стически незначительный эффект, и отсутствовал лизис CD20-отрицательных клеток HSB. Результа-ты представлены на рисунке 8.
Результаты примера II показывают, что хи-мерные антитела анти-CD20 из примера 1 были иммунологически активны.

III. Истощение клеток in vivo с помощью хи-мерного АНТИ-СD20
А. Исследование приматов кроме человека
Проводили три отдельных исследования при-матов кроме человека. Для удобства они обозначе-ны здесь как “Химерное анти-CD20: “СНО и SP2/0;” “Химерное анти-CD20: “CHO” и “Высокая дозировка химерного анти-CD20”. Условия были следующими:
Химерное анти-CD20: СНО и SP2/0
Шесть обезьян cynomolgus весом от 4,5 до 7 кг (White Sands Research Center, Alamogordo, HM) разделили на три группы по две обезьяны в каждой. Оба животного каждой группы получали ту же самую дозу иммунологически активного химерного антитела анти-CD20. Одно животное в каждой группе получало очищенное антитело, выработан-ное трансфектомой СHO; другое получало антите-ло, выработанное трансфектомой SP2/0. Три груп-пы получали дозировки антитела, соответствую-щие 0,1 мг/кг, 0,4 мг/кг, и 1,6 мг/кг ежедневно в те-чение четырех (4) последовательных дней. Химер-ное иммунологически активное антитело анти-CD20 смешивали со стерильным физиологическим раствором и вводили внутривенно. Образцы крови брали перед каждой инфузией. Дополнительные образцы крови брали, начиная с 24 часов после последней инъекции (T=O) и после этого на 1, 3, 7, 14 и 28 дни. Затем брали образцы крови с интерва-лом в две недели до завершения исследования на 90-ый день.
Приблизительно 5 мл цельной крови от каждо-го животного центрифугировали со скоростью 2000 об/мин в течение 5 минут. Плазму брали для анали-за уровней растворимых химерных антител анти-CD20. Осадок (содержащий лейкоциты перифери-ческой крови и эритроциты крови) повторно сус-пендировали в сыворотке эмбриона жеребенка для анализа флуоресцентно меченного антитела (см., “Fluorescent Antibody Labeling of Lymphoid Cell Population,” выше).

Химерное анти-GD20: СНО
Шесть обезьян cynomolgus весом от 4 до 6 ки-лограмм (White Sands) разделяли на три группы по две обезьяны в каждой. Всем животным вводили иммунологически активные химерные антитела анти-CD20, выработанные трансфектомой СНО (в стерильном физиологическом растворе). Три груп-пы разделяли следующим образом: подгруппа 1 получала ежедневно внутривенные инъекции 0,01 мг/кг антитела с промежутком через четыре (4) дня; подгруппа 2 ежедневно получала внутривенные инъекции 0,4 мг/кг антитела с промежутком через четыре (4) дня; подгруппа 3 получала однократ-ную внутривенную инъекцию 6,4 мг/кг антитела. У всех трех подгрупп образцы крови получали до начала лечения; дополнительные образцы крови были также брали при T=O, 1, 3, 7, 14 и 28 дней после последней инъекции. Эти образцы обраба-тывали для анализа флуоресцентно меченного антитела (см., "Fluorescent Antibody Labeling of Lymphoid Cell Population," выше). Кроме определе-ния количества В-клеток периферической крови брали биопсии лимфоузлов на 7, 14 и 28 дни после последней инъекции, а также окрашивали препарат одной клетки для количественного определения популяций лимфоцитов при проточной цитометрии.

Высокая дозировка химерного анти-CD20
Двум обезьянам cynomolgus (White Sands) вво-дили 16,8 мг/кг иммунологически активных химер-ных антител анти-CD20 из трансфектом СНО (в стерильном физиологическом растворе) ежене-дельно в течение четырех последовательных недель. После завершения лечения обоих животных анестезировали для удаления костного мозга; а также брали биопсию лимфоузлов. Оба набора тканей окрашивали для определения наличия В-лимфоцитов, используя Leu 16 для проточной ци-тометрии по протоколу, описанному в Ling, N.R. et al., “В-cell and plasm-cell antigens.” Leucocyte Typing III White Cell Differentiations Antigens, A.J. McMi-chael, Ed. (Oxford University Press, Oxford UK 1987), p. 302.
Флуоресцентное мочение антител лимфоид-ной клеточной популяции.
После удаления плазмы лейкоциты дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса ("HBSS") и повторно суспензировали в эк-вивалентном объеме плазмы эмбриональной бычь-ей сыворотки (инактивация при нагревании до 56°С в течение 30 минут). Препарат клетки в объеме 0,1 мл распределяли в каждую из шести (6) конических трубок для центрифугирования объемом 15 мл. Флуоресцентные меченные моноклональные анти-тела со специфичностью для маркеров CD2 на по-верхности лимфоцитов человека (АМАС, Westbrook, Я), CD20 (Becton Dickinson) и lgM чело-века (Binding Site, San Diego, CA) добавляли в 3 трубки для определения популяций Т- и В-лимфоцитов. Все реагенты предварительно тести-ровли на положительную реакцию соответствую-щих антигенов лимфоцитов обезьян. Химерное антитело анти-CD20, связанное с поверхностью В-клетки CD20 обезьяны обнаружили в четвертой трубке, используя поликлональное козлиное анти-тело lgG человека, связанное с фикоэритрином (АМАС). Этот реагент предварительно адсорбиро-вали на lg-сефарозной колонне для обезьяны, чтобы предотвратить взаимную реактивность к lg обезья-ны. Таким образом, осуществили специфическое обнаружение и количественное определение хи-мерного анти-CD20 антитела, связанного с клетка-ми. Пятая трубка содержала реагенты анти - lgM и анти-lgG человека для двойного окрашивания по-пуляции В-клеток. Шестой образец, включали без реагентов для определения аутофлуоресценции. Клетки инкубировали с флуоресцентными антите-лами в течение 30 минут, промывали и фиксирова-ли в 0,5 мл буферного раствора для фиксаций (0,15 М NaCI, 1 % параформальдегида, рН 7,4) и анали-зировали на приборе Becton Dickinson FACScanTM. Популяции лимфоцитов первоначально обнаружи-вали путем прямого перпендикулярного светорас-сеяния угла в точечно графическом растре с непо-меченными лейкоцитами. Изолировали суммарную популяцию лимфоцитов, исключая все остальные популяции. Последующие измерения флюоресцен-ции отражали только селективные, специфические для лимфоцитов явления.

Истощение В-лимфоцитов периферической крови
Не установлено никаких заметных для наблюдения отличий между эффективностью анти-тел, производимых СНО и SР2/0, при истощении В-клеток in vivo, хотя наблюдали небольшое увели-чение восстановления В-клеток после 7-го дня у обезьян, которым вводили химерные антитела ан-ти-CD20, вырабатываемые трансфектомой СНО при уровне дозы, равной 1,6 мг/кг и 6,4 Мг/кг, а у обезьян, которым вводили антитело, вырабатывае-мое SР2/0 при уровне дозы 0,4 мг/кг. На рисунках 9А, В и С представлены результаты, полученные при исследовании химерного анти-CD20: СНО и SP2/0. Рисунок 9А относится к уровню дозы 0,4 мг/кг; рисунок 9В к уровню дозы 1,6 мг/кг; и рису-нок 9С - к уровню дозы 6,4 мг/кг. Как видно из ри-сунка 9, катастрофическое сокращение (> 95 %) уровней В-клеток в периферической крови наблюдали после терапевтического лечения на всех тестируемых диапазонах дозы. Эти уровни сохранялись вплоть до семи (7) дней после инфу-зии. После этого периода времени начиналось вос-становление В- клеток, причем время инициации восстановления не зависело от уровней доз.
При исследовании химерного анти-CD20: СНО использовали в 10 раз меньшую дозу концен-трации антитела (0,01 мг/г) для инъекций (общая 0,04 мг/кг) с интервалом четыре инъекции ежеднев-но. На рисунке 10 представлены результаты этого исследования. Такие дозы истощали популяцию В-клеток периферической крови до приблизительно 50 % нормального уровня, определяемого с помо-щью либо анти-поверхностного lgM или антитела Leu 16. Результаты также показывают, что насы-щаемости антигена CD20 в популяции В-лимфоцита не достигали при использовании имму-нологически активного химерного антитела анти-CD20 при такой концентрации дозы и за такой времени для приматов кроме человека. В-лимфоциты, покрытые антителами, были обнару-жены в образцах крови в течение первых трех дней после начала терапевтического лечения. Однако, уже на седьмой день клетки, покрытые антителами, не были обнаружены.
В таблице 1 обобщены результаты воздей-ствия однократных и многократных доз иммуноло-гически активного химерного антитело анти-CD20 на популяции клеток периферической крови. Одно-кратная доза составляла 6,4 мг/кг многократная доза - 0,4 мг/кг через четыре (4) последовательных дня (эти результаты получены от обезьян, описан-ных выше).

Таблица 1
Популяция клеток периферической крови при исследовании введения приматам С2В8

Обезь-яна Доза День CD2 Анти-Hu lgG
A 0,4 мг/кг

(4 дозы) предварительное обескровливание
0
7
21
28
81,5
86,5
85,5
93,3
85,5
-
0,2
0,0
-
-
B 0,4 мг/кг

(4 дозы) предварительное обескровливание
0
7
21
28
81,7
94,6
922
84,9
84,1
-
0,1
0,1
-
-
C 6,4 мг/кг

(1 доза) предварительное обескровливание
7
21
28
77,7
85,7
86,7
76,7
0,0
0,1
-
-
D 6,4 мг/кг

(1 доза) предварительное обескровливание
7
21
28
85,7
94,7
85,2
85,9
0,1
0,1
-
-

Обезь-яна Анти-Hu lgG+
Анти-Hu lgM* Leu-16 % Истощение
В-клеток
А -
0,3
0,1
-
- 9,4
0,0
1,2
2,1
4,1 0
97
99
78
66
B -
0,2
0,1
-
- 14,8
0,1
0,1
6,9
8,7 0
99
99
53
41
C 0,2
0,1
-
- 17,0
0,0
14,7
8,1 0
99
15
62
D 0,1
0,2
-
- 14,4
0,0
9,2
6,7 0
99
46
53
* Двойное окрашивание популяции указывает на степень покрытия В-клетками химерными анти-CD20.

Данные, представленные в Таблице 1, показы-вают, что истощение В-клеток периферической крови при условиях доступа антитела произошло быстро и эффективно, независимо от уровней одно-кратной или многократной дозы. Кроме того, ис-тощение наблюдалось в течение по крайней мере семи (7) дней после последней инъекции, а частич-ное восстановление В-клеток наблюдали на 21-ый день.
В таблице II представлено воздействие имму-нологически активных химерных антител анти-CD20 на популяции клеток лимфоузлов при ис-пользовании режима лечения, приведенного в таб-лице 1 (4 ежедневных дозы по 0,4 мг/кг; 1 доза 6,4 мг/кг). Приводятся также сравнительные значения для здоровых лимфоузлов (контрольная обезьяна, подмышечный и паховый) и здорового костного мозга (две обезьяны).

Таблица II
Популяция клеток лимфоузлов

Обезьна Доза День CD2 Анти-Hu lgG
A 0,4 мг/кг
(4 дозы) 7
14
28 66,9
76,9
61,6 -
19,6
19,7
B 0,4 мг/кг
(4 дозы) 75
14
28 9,4
83,2
84,1 -
9,9
15,7
C 6,4 мг/кг
(1 доза) 77
14
28 5,5
74,1
66,9 -
17,9
23,1
D 6,4 мг/кг
(1 доза) 7
14
28 83,9
74,1
84,1 -
17,9
12,8

Обезьяна Анти-Hu lgG+
Анти-Hu lgM* Leu-16 % подавления
В-лимфоцидов
А 7,4
0,8
- 40,1
22,6
26,0 1
44
36
B 29,9
0,7
- 52,2
14,5
14,6 0
64
64
C 22,3
1,1
- 35,2
23,9
21,4 13
41
47

D 12,5
0,2
- 19,7
8,7
12,9 51
78
68
Таблица II (продолжение)
CD2 Анти-Hu lgG+
Анти-Hu lgM Анти-Hu-lgM Leu-16 % подав-ления В-лимфо-цитов
Здоровые
Лимфо-узлы
Кон-трольный 1
Подмы-шечный 55,4 25,0 - 41,4 нет данных
Паховый 52,1 31,2 - 39,5 нет данных
Здоровый костный мозг
Кон-трольный 2 65,3 19,0 - 11,4 нет данных
Кон-трольный 3 29,8 28,0 - 16,6 нет данных

Результаты таблицы II показывают эффектив-ное истощение В-лимфоцитов при обоих режимах лечения. Таблица II также показывает, что у при-матов кроме человека не получают полной насы-щаемости В-клеток в лимфатических тканях при применении иммунологически активного химерно-го антитела анти-CD20. Кроме того, на седьмой (7) день после лечения, наблюдая клетки, покрытые антителами, визуализировали заметное истощение В-клеток лимфоузлов на 14-ый день.
На основе этих данных проводили исследова-ние введения однократной высокой дозы химерного анти-CD20, причем основное внимание уделяли фармакологии и токсикологии. То есть это иссле-дование проводили для оценки любой токсичности, связанной с введением химерного антитела, а так-же эффективности истощения В-клеток перифери-ческой крови лимфатических узлов и костного моз-га. Кроме того, поскольку данные Таблицы II пока-зывают, что при этом исследовании большая часть В-клеток лимфоузлов истощалась между 7 и 14 днями после начала лечения, то режим еженедель-ной дозировки может дать более эффективные ре-зультаты. В таблице II приведены исследования результатов введения высокой дозы химерного анти-CD20.

Таблица III
Популяции клеток лимфоузлов и костного
мозга

Обезь-яны CD2 CD20a mlgM+анти-С2В8b C2B8c К-во днейd
Паховый лимфо-узел
E 90,0 5,3 4,8 6,5 22
F 91,0 6,3 5,6 6,3 22
G 89,9 5,0 3,7 5,8 36
H 85,4 12,3 1,7 1,8 36
Костный мозг
E 46,7 4,3 2,6 2,8 22
F 41,8 3,0 2,1 2,2 22
G 35,3 0,8 1,4 1,4 36
H 25,6 4,4 4,3 4,4 36

aОбозначает популяцию, окрашенную с Leu16.
bОбозначает популяцию, окрашенную два-жды, положительную для поверхностных lgM кле-ток и клеток, покрытых химерными антителами.
cОбозначает полное окрашивание популяции для химерного антитела, включая двойное окраши-вание поверхностного lgM положительных клеток и одиночное окрашивание (поверхностный lgM от-рицательных клеток).
dКоличество дней после инъекции оконча-тельной дозы 16,8 мг/кг.
При исследовании обоих животных на 22-ой день после прекращения лечения обнаружили ме-нее 5% В-клеток по сравнению с 40% в контроль-ных лимфоузлах (см. таблицу II, выше). Аналогич-но, в костном мозге животных, которым вводили химерное антитело анти-CD20, уровни CD20 по-ложительных клеток составляли менее 3% по срав-нению с 11-15% у здоровых животных (см. таблицу II, выше). Из животных, которых исследовали на 36-ой день после прекращения лечения, одно жи-вотное (Н) имело приблизительно 12% В-клеток в лимфоузле и 4,4% В- клеток в костном мозге, в то время как другое животное (G) - приблизительно 5% В-клеток в лимфоузле и 0,8% в костном мозге. Эти данные подтверждают значительное истоще-ние В-клеток.
Результаты примера III.А подтверждают то, что введение низких доз иммунологически активно-го химерного анти-CD20 приводит к длительному истощению В-клеток периферической крови у при-матов. Эти данные также указывают, что значи-тельное истощение популяций В-клеток было достигнуто в периферических лимфоузлах и кост-ном мозге при повторном введении высоких доз антитела. Продолжительный контроль тестируе-мых животных показал, что даже при таком серь-езном истощении В-лимфоцитов периферической крови в течение первой недели лечения не наблю-дали никаких неблагоприятных для здоровья эф-фектов. Кроме того, обнаруженное восстановление популяции В-клеток позволяет сделать вывод, что лечение не оказывало неблагоприятного воздей-ствия на плюрипотентные стволовые клоки этих приматов.

В. Клинический анализ. С2В8
i. Клинические испытания С2В8 в фазе I/II ис-следование терапии однократной дозой
Пятнадцать пациентов, имеющие гистологиче-ски зарегистрированные рецидивы В-клеток лим-фомы, получали С2В8 в фазе I/II при клиническом испытании.
Каждый пациент получал однократную дозу С2В8 при исследовании с увеличением дозы. Три пациента получили дозы: 10 мг/м2; 50 мг/м2; 100 мг/м2; 250 мг/м2 и 500 мг/м2. Лечение проводили путем внутривенной инфузии через проходной фильтр размером 0,22 микрон С2В8, разбавленного до окончательного объема 250 см3 или при макси-мальной концентрации 1 мг/мл стандартного фи-зиологического раствора. Начальная скорость составляла 50 см3/час в течение первого часа. Если не наблюдали никакой токсичности, то скорость введения дозы увеличивали до максимальной 200 см3/час.
Токсичность (как указывал специалист) рас-полагалась в диапазоне от "нет", до "лихорадки" и до "замедленной" (два пациента), до "серьезной" (один пациент); все пациенты завершили терапев-тическое лечение. Лимфоциты периферической крови анализировали для определения воздействия С2В8 на Т- клетки и В-клетки. Последовательно у всех пациентов наблюдали истощение В-лимфоцитов периферической крови, причем после инфузии С2В8 это истощение поддерживалось в течение более двух недель.
Один пациент (получавший 100 мг/м2 С2В8) проявил частичный ответ на лечение С2В8 (сниже-ние более, чем на 50% суммы произведений пер-пендикулярных диаметров всех измеряемых инди-катором поражений), продолжающийся более чем четыре недели, во время которых никакие новые поражения не появлялись, а ни одно из имеющихся поражений не увеличивалось. По крайней мере один пациент (получавший 500мг/м2) обнаружил незначительный ответ на лечение С2В8 (снижение менее чем на 50%, но не менее 25% суммы произве-дений двух самых длинных перпендикулярных диаметров всех измеряемых индикатором пораже-ний). Для демонстрации эффективности результаты PBLs представлены на рисунке 14; данные пациен-та, проявляющего PR, представлены на рисунке 14А; для пациента, проявляющего MR, данные приведены на рисунке 14B. На рисунке 14 указано: = лимфоциты; CD3+ клетки (T-клетки); CD20+ клетки; = CD19+ клетки; = каппа; = лямбда; и С2В8. Очевидно, что маркеры В-клеток CD20 и СD19, каппа и лямбда, истощались в течение более чем двух недель. При-чем имелось небольшое первоначальное снижение количества Т-клеток, которое вернулось к прибли-зительному исходному уровню за относительно короткий промежуток времени.

ii. Клиническое испытание С2В8 в фаз I/II; ис-следование терапии многократной дозой
Для этого исследования пригодны пациенты, имеющие гистологическое подтверждение лимфо-мы В-клеток с регистрацией прогрессирующей болезни. Исследование состоит из двух частей: в фазе 1, включающей увеличение дозы для опреде-ления значения токсичности, ограничивающей дозу и для определения биологически активного допу-стимого уровня дозы, три пациента будут получать еженедельно внутривенно инфузии С2В8 в общем количестве из четырех (4 отдельных инфузий. Сум-марная доза на каждом из трех уровней будет сле-дующей: 500 мг/м2 (125 мг/м2/инфузии); 1000 мг/м2 (250 мг/м2/инфузии); 1500 мг/м2 (375 мг/м2/ инфузии. Определяют биологически активную допустимую доза и самую низкую дозу допустимой токсичности и адекватной активности). В фазе 11 дополнитель-ные пациенты получат биологически активную допустимую дозу с акцентом на определение ак-тивности четырех доз С2В8.

iv. Комбинированная терапия: С2В8 и Y2B8
Способ комбинированной терапии с примене-нием С2В8 и Y2B8 исследовали на ксенографиче-ской модели мыши (мыши nu/nu, самки, в возрасте приблизительно 10 недель) с использованием лим-фобластической опухоли В-клеток (клетки опухоли Ramos). Для сравнения дополнительным мышам также вводили С2В8 и Y2B8.
Клетки опухоли Ramos (АТСС, CRL 1596) со-держали в культуре, используя RPMI1640, допол-ненный 10% эмбриональной сывороткой жеребен-ка и глутамином при 37С и в 5% СО2. Опухоли инициировали в девяти самках голых мышей в воз-расте около 7-10 недель путем подкожной инъек-ции 1,7 х 106 клеток Ramos в объеме 0,10 мл (HBSS), используя шприц объемом 1 см3 с иглой массой 25 г. Животных содержали под колпаком в ламинарном потоке и во всех клетках изымали продукты жизнедеятельности и подавали пищу и воду. Клетки опухоли пассировали после эксцизии опухоли и пропускания их через фильтр с 40 ячей-ками. Клетки промывали дважды с 1X HBSS (50 мл) центрифугированием (1300 об/мин), повторно сус-пендировали в 1X HBSS до 10 х 106 клеток/мл, и замораживали до 70°С до использования.
Для эксперимента размораживали клетки от нескольких замороженных серий, осаждали цен-трифугированием (1300 об/мин) и промывали два-жды 1X HBSS. Клетки затем повторно суспендиро-вали до приблизительно 2,0 х 106 клеток/мл. При-близительно 9 - 12 мышей получали инъекцию 0,10 мл суспензии клеток с использованием шприца объемом 1 см3 с иглой весом 25 г. Инъекции произ-водили приблизительно в среднюю области левого бока животного. Опухоли развивались приблизи-тельно через две недели. Опухоли иссекали и обра-батывали как описано выше. Исследуемые мыши получали инъекции 1,67 х 106 клеток в 0,10 мл HBSS как описано выше.
На основе предварительных экспериментов по дозированию определено, что 200 мг С2В8 и 100 мКи Y2B8 будут использовать для исследования. Девяносто самок мышей nu/nu (приблизительно 10-недельного возраста) получали инъекции клеток опухоли. Приблизительно десять дней спустя бра-ли для исследования четыре группы из 24 мышей по шесть мышей в группе, причем поддерживали сравнимое распределение размера опухоли в каж-дой группе (средний размер опухоли, выраженный как произведение длины на ширину опухоли, со-ставлял приблизительно 80 мм2). Следующие груп-пы получали инъекции как указано через хвосто-вую вену, используя шприц Гамильтона объемом 100 мкл с иглой весом 25 г:
А. стандартный физиологический раствор
В. Y2B8 (100 мКи)
С. С2В8 (200 мкг); и
D. Y2B8 (100 мКи) + С2В8 (200 мкг)
Группы, тестируемые на С2В8, получали вто-рую инъекцию С2В8 (200 мкг/мышь) спустя семь дней после начальной инъекции. Измерения опухо-ли проводили через каждые два или три дня, ис-пользуя кавернометр.
Подготовка материалов для введения произ-водили согласно следующим протоколам:

А. Подготовка Y2B8
Хлорид иттрия-[90] (6 мКи) помещали в поли-пропиленовую трубку и доводили рН до 4,1-4,4 с помощью не содержащего металла 2М ацетата натрия. Добавляли и осторожно перемешивали при встряхивании 2B8-MX-DTPA (0,3 мг в стандартном физиологическом растворе; см. выше для приготов-ления 2B8-MX-DTPA). После 15 минут инкубации реакцию гасили путем добавления 0,05 на объем 20 мM EDTA и 0,05 на объем 2М ацетата натрия. Концентрацию радиоактивности определяли путем растворения 5,0 мкл реакционной смеси в 2,5 мл 1 х PBS, содержащего 75 мг/мл HSA и 1 мM DTPA (“рецептурный буфер”). Подсчет выполняли, до-бавляя 10,0 мкл к 20 мл коктейля сцинтилляции Ecolume. Остаток реакционной смеси добавляли к рецептурному буферу объемом 3,0 мл, стерильно фильтровали и сохраняли при 2-8°С до использо-вания. Определяли удельную активность (14 мКи/мг на время инъекции) с использованием кон-центрации радиоактивности и рассчитанной кон-центрации белка, основанной на количестве анти-тела, добавляемого в реакционную смесь. Связан-ную с белком радиоактивность определяли, ис-пользуя моментальную тонкослойную хромато-графию. Включение радионуклидов составило 95%. Y2B8 разбавляли в рецепторном буфере непосредственно перед применением и стерильно фильтровали (окончательная концентрация радио-активности составила 1,0 мКи/мл).

В. Приготовление C2В8
С2В8 приготавливали как описано выше. С2В8 получали в виде стерильного реагента в стандартном физиологическом растворе при 5,0 мг/мл. Перед инъекцией С2В8 разбавляли в стан-дартном физиологическом растворе до 2,0 мг/мл и стерильно фильтровали.

С. Результаты
После лечения размер опухоли представляли в виде произведения длины на ширину, а измерения проводили по дням, указанным на рисунке 11 (Y2B8 по сравнению с физиологическим раство-ром) и рисунке 12 (С2В8 по сравнению с физиоло-гическим раствором); и рисунке 13 (Y2B8 + С2В8 по сравнению с физиологическим раствором). Так-же определяли стандартную погрешность.
Как указано на рисунке 13, комбинация Y2B8 и С2В8 проявила эффекты уничтожения опухоле-вых клеток, сравнимые с эффектами, проявляемыми как Y2B8, так и С2В8.

V. Стратегии альтернативной терапии
С точки зрения предшествующих примеров очевидны стратегии альтернативной терапии. Одна из таких стратегий заключается в использовании терапевтической дозы С2В8, после чего в пределах приблизительно одной недели вводят комбинацию либо 2В8 и меченного радиоактивными изотопами 2В8 (например, Y2B8); или 2В8, С2В8 и, например Y2B8; или С2В8 и, например Y2B8. Дополнитель-ная стратегия заключается в использовании мечен-ных радиоактивными изотопами С2В8. Такая стра-тегия позволяет использовать преимущества имму-нологически активного участка С2В8 и преимуще-ства, связанные с радиоактивной меткой. Предпо-чтительные радиоактивные метки включают ит-трий-90, имеющий больший период полураспада при циркуляции С2В8 по сравнению с мышиным антителом 2В8. Благодаря способности С2В8 ис-тощать В-клетки, а также благодаря преимуще-ствам использования радиоактивной метки, пред-почтительная альтернативная стратегия заключа-ется в введении пациенту однократных доз или многократных доз С2В8 для истощения большей части или всех, периферических В-клеток. Это по-требовало бы применения меченного радиоактив-ными изотопами 2В8. В результате истощения В-клеток периферической крови меченное радиоак-тивными изотопами 2В8 обладает повышенной возможностью поражать клетки опухоли. Предпо-чтительно используют 2В8, меченное йодом [131]. В литературе имеются сообщения о результатах применения этой метки (см. Kaminski). Меченное радиоактивными изотопами 2В8 (или С2В8) также применяют вначале для увеличения проницаемости опухоли с последующим однократным или много-кратным введением С2В8. Цель этой стратегии заключается в увеличении возможности попадания С2В8 как в наружную, так и во внутреннюю массу опухоли. Дальнейшая стратегия включает приме-нение хемотерапевтических агентов в комбинации с С2В8. Эти стратегии включают так называемое “поражающее” лечение хемотерапевтическим агентом с последующим введением С2В8, сопро-вождаемым повторением этого протокола. В каче-стве альтернативы возможно проведение началь-ного лечения однократными или многократными дозами С2В8 и последующего хемотерапевтиче-ского лечения. Предпочтительные хемотерапевти-ческие агенты включают (но не ограничены): цик-лофосфамид; доксорубицин; винкристин; и предни-зон, см. Armitage, J.О. et al., Cancer 50:1695 (1982), приведенные здесь в качестве ссылки.
Вышеописанные альтернативные стратегии терапии не ограничивают изобретение, а иллю-стрируют его.

VI. Информация о депозитах
АНТИ-CD20 в ТСАЕ 8 (трансформированный в Е. соli для депозита) был внесен в Американскую Коллекцию Культур Тканей (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, соглас-но Будапештскому договору о международном признании депонирования штаммов микроорганиз-мов для патентной процедуры (“Будапештский Договор”). Микроорганизм тестировали в АТСС 9 ноября 1992 года и определи его жизнеспособность на эту дату. АТСС присвоил этому микроорганиз-му следующий номер штамма АТСС: АТСС 69119 (анти-CD20 в ТСАЕ 8). Гибридому 2В8 регистриро-вали в АТСС 22 июня 1993 года согласно Буда-пештскому договору. Жизнеспособность культуры определили на 25 июня 1993 года, и зарегистриро-вали в АТСС эту гибридому под следующем номе-ром АТСС: НВ 11388.

G. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ-НОСТЕЙ
(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ
(i) Авторы: Anderman Darrell, Henna Nabil, Laonard John, Newman Roland и Mitchell Reff и William H. Rastetter
(ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛИМФОМЫ В-КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗО-ВАНИЕМ ХИМЕРНЫХ И МЕЧЕННЫХ РАДИОАК-ТИВНЫХ АНТИТЕЛ В В-ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛО-ВЕКА С ОГРАНИЧЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЕЙ АНТИГЕНА
(iii) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО-СТЕЙ: 8
(iv) АДРЕС:
(А) АДРЕСАТ: Фармацевтическая Корпорация АЙДЕК
(В) УЛИЦА: 11011 Торреяна Роуд
(C) ГОРОД: Сан Диего
(D) ШТАТ: Калифорния
(Е) СТРАНА: США
(F) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС: 92121
(v) КОМПЬЮТЕРНАЯ ЧИТАЕМАЯ ФОРМА:
(А) ТИП НОСИТЕЛЯ: Дискета, 3.5 дюйм, 1.44 МБ
(В) КОМПЬЮТЕР: Макинтош
(С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: MS DOS
(D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Microsoft Word 5.0
(vi) ДАННЫЕ О НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ:
(А) НОМЕР ЗАЯВКИ:
(В) ДАТА ПОДАЧИ:
(С) КЛАССИФИКАЦИЯ:
(viii) ИНФОРМАЦИЯ О ПАТЕНТНОМ ПОВЕ-РЕННОМ/АГЕНТЕ:
(А) ИМЯ: Burgeon, Richard Р. Jr.
(В) НОМЕР РЕГИСТРАЦИИ: 34,787
(С) НОМЕР ДЕЛА:
(ix) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОНАЯ ИНФОР-МАЦИЯ:
(А) ТЕЛЕФОН: (619) 550-8500
(В) ТЕЛЕФАКС: (619) 550-8750
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО-СТИ SEQ ID №1:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ-НОСТИ:
(А) ДЛИНА: 8540 оснований
(В) ТИП: нуклеиновая кислота
(С) ЦЕПОЧКА: одиночная
(D) ТОПОЛОГИЯ: круговая
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(iii) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: да
(iv) АНТИ-СМЫСЛОВАЯ: нет
(ix) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID №1

SU 1420020 Al, 30.08.1988
WO 88/04936 Al, 14.06.1988
EP 0421876 A, 14.04.1991
EP 0400464 Al, 05.12.1990
WO 90/15625 Al, 27.12.1990
US 5106738 A, 21.04.1992