ВАКЦИНА ПРОТИВ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПОВ Н5 И Н7 ИНАКТИВИРОВАННАЯ

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и био-технологии. Вакцина содержит активное вещество и целе-вую добавку. В качестве активного вещества вакцина со-держит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» типа А, подтип Н5N2, инфекционный титр вируса 8,2 lg ЭИД50/см3, эмбриональную жидкость- 10-суточные эмбрионы SPF(СПФ)-кур, инфекционный титр – 8,45 ЭИД50/см3, гемагглютинирующий титр – 7,0 log2, ВСG ß–пропиолактон в концентрации, масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG фирмы «Seppic» (Франция).
Вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту птицы от эпизоотического вируса подтипа H5 и Н7, а также предотвратить выделение иммунизированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, применяющееся в ветеринарии для специфической профилактики высокопатогенного гриппа птиц (ГП) подтипов Н5 и Н7.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Новосибирский» ГП типа А, подтипа H5N1, полученного в 10-12-суточных эм-брионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД50/мл и ГА-активностью не менее 1:64, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении, мас.%, 30:70-40:60 [1].
Целью изобретения является расширение арсенала вакцин против гриппа птиц инактивированных, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью, обеспечивающих эффективную защиту домашней птицы против вируса (ВПГП) подтипа (H5 и Н7) и предотвращающих выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.
Поставленная цель достигается созданием вакцины против ГП инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтип Н5 и Н7, инфекционный титр вируса 8,2 lg ЭИД50/см3, эмбриональную жидкость- 10-суточные эмбрионы SPF(СПФ)-кур, инфекционный титр – 8,45 ЭИД50/см3, гемагглютинирующий титр – 7,0 log2, ВСG ß – пропиолактон в концентрации, масляный адъювант Монтанид ИЗА 70 VG (фирма «Сеппик», Франция).
Штамм «Приморский» типа А, подтип Н5N2, проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации.
Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной вакцины против вируса ГП.
Штамм «Приморский» вируса гриппа птиц является стабильным, обладает высокой вирулентностью и адаптирован к размножению в эмбрионах кур.
Совместно с ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и Ветеринарным институтом ТАСХН разработан стандарт (СТО 00495674-003-2006), который устанавливает требования к вакцине [2].
Техническая новизна предлагаемой вакцины состоит в том, что в отличие от прототипа вакцина состоит из гетеро-генных штаммов Н5N2, Н7N1 а также её можно создать в виде моновалентной Н5N2 и Н7N1 и в виде бивалентной (Н5N2, Н7N1).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют штамм тип А, Н5N2, 10-суточные эмбрионы SPF-кур, инфекционный титр – 8,45 ЭИД50/см3, гемагглютинирующий титр – 7,0 log2.
Экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) очищают от балластных примесей центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10-15 мин. После центрифугирования вирусный материал сливают в 10-20-литровые бутыли и подвергают инактивации.
Перед инактивацией инфекционная активность вируса должна быть не ниже 9,0 lg ЭЛД50/мл, а ГА-активность не ниже 7,0 log2.
Для инактивации вируса используют ВСG ß-пропиолактон. ВСG ß-пропиолактон добавляют в вируссодержащую суспензию при перемешивании в виде 10%-ного раствора, а бетапропиолактон до конечной концентрации 1:2000-1:4000. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов при температуре от 20 до 37°С. По окончании инактивации ВСG ß–пропиолактон нейтрализуют внесением тио-сульфата натрия в суспензию антигенного материала.
После контроля на стерильность и авирулентность антиген подвергают повторной очистке от балластных приме-сей, пропуская его через промежуточную центрифугу ОТР-102К-01 при 15000-17000 об/мин со скоростью подачи антигена 40-50 л/час и фильтровальную установку.
Очищенный и авирулентный антигенный материал должен иметь ГА-активность не менее 1:64 и рН в пределах 7,2-7,4. Вакцину получают путем диспергирования очищен-ного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении 30:70 по весу.
Стандарт, «Вакцина против высокопатогенного гриппа птиц (ВПГП) подтипов Н5 и Н7 инактивированная», Санкт-Петербург-Душанбе, 2010 г [3].
Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета типа «вода в масле».
Допускается в верхней части флакона наличие слоя масляного адъюванта. При интенсивном встряхивании однородность содержимого легко восстанавливается.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.
1. Вакцина против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, инактивированная предназначена для вакцинации.
2. Активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтипа Н5 и Н7 в эффективном количестве.
3. Целевая добавка в виде масляного адъюванта марки Montanide ISA-70 VG фирмы «Seppic» (Франция).
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, являются:
1. Вакцина против ГП инактивированна.
2. Содержит активное вещество в эффективном количестве.
3. Целевая добавка в виде масляного адъюванта.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является то, что в качестве активного вещества она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтипа Н5 и Н7 в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Вакцина состоит из двух антигенов (H5N2; H7H1), а у прототипа один антиген (H5N1). Вакцина гетерогенна по N- антигенным в (H5N1).

2. Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтипа Н5иН7, полученный в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД50/мл и ГА-активностью не менее 1:64, в количестве 30,0 мас.%.
3. В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG фирмы «Seppic» (Франция), обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.
4.Вакцина содержит масляный адъювант в количестве до 100,0 мас.%.
5.Вакцина содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтипа Н5 и Н7 и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
Антигенный материал 30,0
Масляный адъювант до 100,0
Сыворотку крови получают от всех цыплят опытной и контрольной групп до вакцинации и через 28 суток после прививки для выявления специфических антител.
Для удаления термолабильных ингибиторов исследуемые сыворотки разводят на стерильном физиологическом растворе в 4 раза и прогревают на водяной бане при температуре 560С в течение 30 минут.
Исследования сывороток в РТГА проводят согласно инструкции по применению соответствующего набора. Исследуют индивидуальные сыворотки, полученные от цыплят контрольной и опытных групп до и после вакцинации.
Вакцину считают антигенной активной, если через 28 суток после вакцинации уровень сывороточных антитель к вирусу ГП (как подтипа Н5, так и подтипа Н7) у 90 % привитых цыплят будет иметь значение не ниже, чем 5 log2 (1:32). При этом титры антител к вирусу (ВПГП) у цыплят контрольной группы в течение всего опыта должны отсутствовать.
Вакцину получают путем диспергирования очищен-ного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении 30:70 по весу.
Содержание антигенного материала и масляного адъюванта в прививной дозе вакцины в соотношении, мас.%, 30:70 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.
Вакцину считают безвредной, если все цыплята в течение срока наблюдения останутся живыми, без клинических признаков переболевания. При вскрытии птицы на месте введения вакцины не должно быть ярко выраженной воспалительной реакции и некроза тканей. Допускается остатков нерассосавшегося адъюванта.
Внешний вид, полученной вакцины, белого цвета (до-пускается оттенки сероватого, розоватого или желтоватого) типа «вода–масло», дисперсная фаза которой содержит один из инактивированных антигенов вируса высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, или их смесь, а дисперсионная среда-масляный адъювант.
Допускается в верхней части флакона наличие слоя масляного адъюванта. При интенсивном встряхивании однородность содержимого легко восстанавливается. Не допускается наличие прозрачного, бесцветного или желтоватого оттенка слоя жидкости на дне флакона (посторонние примеси, плесень).
Стерильность вакцины определяют методом бактериологического контроля стерильности, она должна быть стерильна.
Стабильность вакцины определяют методом центрифугирования образца вакцины, высота столба прозрачной фракции не должна превышать 30 мм.
Контагиозность – контагиозна, неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными. Контаминация бактериальной и грибной микрофлорой должна отсутствовать.
Вязкость вакцины в пределах 20-150 мм2/с, полностью инактивированна безвредна.
Антигенная активность на 28 сутки после вакцинации, титр в РТГА не ниже 1:32.
Иммуногенная активность 90% защиты.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.
Патогенность - высокая (внутривенный индекс 2,87, что соответствует высокопатогенным штаммам вируса ГП).
Вирулентность - 100% гибель внутримышечно зараженных цыплят в дозе 106,0 ЭЛД50.
Онкогенность - отсутствует.
Результаты проведенных испытаний показали, что предлагаемая вакцина обладает высокой инфекционной антигенной и иммуногенной активностью после инактивации и обеспечивает надежную защиту домашней птицы против высокопатогенного гриппа птиц (ВПГП) подтипов Н5 и Н7 инактивированной, а также предотвращает выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.
Антигенную и иммуногенную активность вакцины (ВПГП) подтипа H5иН7 оценивают по результатам серологических исследований иммунизированной птицы.
Результаты контроля вакцины на антигенную активность по уровню титров антител
Пример 1. Для проверки антигенной активности вакцины 10 цыплятам 45 дневного возраста однократно подкожно в область верхней трети шеи вводят препарат в объеме одной дозы (0,5 см3). 10 инактивных цыплят оставляют в качестве контроля.
Через 14 недель после вакцинации у всех цыплят брали кровь, получали сыворотки и исследовали их на наличие антител к вирусу гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в РТГА. Результаты опыта на антигенную активность по уровню титров антител приведены в таблице 1.
При постановке реакции использовали анти-гены для диагностики гриппа птиц (H5N3 и H7N3) производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» и те же антигены, которые использовали при изготовлении опытных образцов вакцин.





Таблица 1

Антигенная активность инактивированной эмульгированной вакцины против ГП



Таким образом, как видим из таблицы, полученные средние титры антител к вирусу гриппа птиц у цыплят опытных групп значительно превышают минимальный протективный титр, что свидетельствует о высокой антигенной и иммуногенной активности испытуемых образцов инактивированных вакцин.

Испытания иммуногенной активности вакцины против ВПГП подтипов Н5 и Н7 инактивированной эмульгированной (бивалентной) методом контрольного заражения

Пример 2. В опыте были использованы:
- вакцина против ВПГП подтипов Н5 и Н7 инактивированная эмульгированная (бивалентная), серия №1, изготовленная так, как описано в примере 2;
- 40 голов цыплят-бройлеров 25-дневного возраста, не имеющие специфических антител к анти-генным детерминантам вируса гриппа А птиц. - вирус гриппа А птиц подтип Н5N2, 4 пассаж, биологическая активность 8,5 lg ЛД50/см3 и 9,75 lg ЭЛД50/см3, гемагглютинирующая активность 1:32;
Цыплята были разбиты на 4 группы по 10 го-лов в каждой:
1 группа – вакцину вводили каждому цыпленку подкожно в область средней трети шеи одно-кратно, в дозе 0,5 см3 согласно инструкции по применению;
2 группа – физиологический раствор подкожно в объеме 0,5 см3 однократно (контроль вируса);
3 группа – контроль патогенности при кон-тактном способе заражения;
4 группа – контроль содержания и кормления.
Птицу 4-й группы содержали изолированно от первых трех групп.
Перед вакцинацией, а также через 14 и 28 дней после вакцинации (перед заражением 2-й группы) у цыплят отбирали кровь для получения сыворотки и определяли уровень специфических антител в РТГА к вирусу гриппа А птиц.
Пример 3. На 28 день с начала опыта цыплятам-бройлерам 2-й группы внутримышечно ввели вирус гриппа А птиц с антигенной формулой Н5N1 в дозе 100 ЛД50, однократно в объеме 1,0 см3. Инфицированных цыплят в тот же день подсадили к цыплятам 1 и 3-й групп.
Их содержали совместно в одном боксе напольно, на несменяемой подстилке, а перед взятием крови на 28 день окольцевали.
Для определения уровня накопления вируса в пробах из клоаки цыплят, иммунизированных вакциной и зараженных высокопатогенным виру-сом гриппа А птиц подтип Н5N2 были отобраны:
- 2 пробы (№ 40 и № 41) из клоаки от вакцинированных цыплят, отобранные на 2 сутки после контрольного заражения;
- 6 проб (№№ 40, 41, 42, 44, 48, 49) из клоаки от вакцинированных цыплят, отобранные на 3 сутки после контрольного заражения;
- 2 пробы (№ 1 и № 2) из клоаки от контрольных (не вакцинированных) цыплят на 2-е сутки после контрольного заражения;
Использовали по 4 куриных эмбриона на 1 разведение материала. Доза введения – 0,2 см3. Пробы клоаки от вакцинированных цыплят исследовали в разведениях – 10-1, 10-2 и 10-3. Пробы клоаки от контрольных цыплят исследовали в разведениях 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 и 10-6. Ежедневно проводили овоскопию эмбрионов на пред-мет гибели. Погибшие эмбрионы помещали в холодильник при (2-8)0С. Погибшие и все оставшиеся в живых эмбрионы через 5 суток после введения материала (после охлаждения) были исследованы в РГА, этими исследованиями подтверждали специфичность гибели эмбрионов. За птицей проводили ежедневное наблюдение дважды в сутки (1000 и 1600), фиксируя отклонения от физиологической нормы. Наблюдение проводили в течение 10 дней после контрольного заражения, регистрируя заболеваемость, смертность, летальность.
Результаты опыта по контрольному заражению приведены в таблице 2.





Таблица 2
Динамика падежа птицы после контрольного заражения


Примечание: в числителе – количество боль-ной (б) и павшей (п) птицы,
в знаменателе – количество птицы в опыте.
Из данных табл.2, следует, что вакцина предохраняет от вируса гриппа А птиц, подтип Н5N2 - 100% поголовья птицы. В контрольной зараженной группе все цыплята пали на 2-3-4 день, а в контрольной группе при контактном способе заражения – 4-5-й день наблюдения.
Пример 4. Специфичность гибели цыплят-бройлеров от вируса гриппа А птиц подтип Н5N2 подтверждена на основании данных обнаружения и идентификации специфического антигена вируса гриппа с помощью “Набора препаратов на основе моноклональных антител для дифференциальной диагностики гриппа птиц и болезни Ньюкасла твердофазным иммуноферментным методом” (ТУ 9388-053-00495549-02) в пробах органов (селезенка, желудок, легкие, кишечник, головной мозг, почки, печень).
Результаты определения титра специфических антител в сыворотках крови после 14 и 28 суток после начала основного опыта, представлены в таблице 3.

Таблица 3
Сероконверсия антител в РТГА у цыплят вакцинированных и контрольных групп
Представленные в таблице 3 результаты исследования сывороток крови цыплят 1 группы показывают, что через 14 дней после вакцинации у 80% цыплят были титры 1:16 и выше, а через 28 дней – они увеличились до 100%. У цыплят контрольных групп (2 и 3) титры антител не выявлялись.
Через 10 дней после заражения у вакцинированной птицы, перед выводом ее из опыта, была получена сыворотка, с целью определения уровня прироста специфических антител к вирусу гриппа А птиц. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Титры антител у вакцинированных зараженных ВПГП цыплят по результатам РТГА.


Как явствует из данных таблицы 4., у вакцинированных и зараженных цыплят наблюдается 2-4-х кратное увеличение сероконверсии антител.
Были также определены уровни накопления антигена в отобранных клоакальных пробах вакцинированных и зараженных патогенным вирусом цыплят, а также у цыплят зараженного контроля, контроля интактных эмбрионов и эмбрионов, которым вводили только физ. раствор.
Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Титры антигена в клоакальных смывах вакцинированных и зараженных цыплят
и эмбрионов.
Примечание: + - положительный результат в РГА; - - отрицательный результат в РГА; п. – пал, н.и. – не исследовали.
Из представленных данных табл.5., видно, что титр вируса в группе вакцинированных и зараженных патогенным вирусом цыплят на 2 и 3 сутки был минимальным (менее 0,5 lg ЭИД50/см3, в то время как в группе зараженного контроля – 6,21 lg ЭИД50/см3).
В группах эмбрионов, используемых в качестве контроля (физиологический раствор и ин-тактные) вирус не обнаружен.
Пример 5.
Исследовано формирование иммунитета к гриппу птиц у цыплят разного возраста после вакцинации препаратом (серия 01), изготовленным так, как описано в примере 2.
Формирование иммунитета к гриппу птиц у цыплят разного возраста изучали на 4 опытных (n=10) и 4 контрольных (n=10), свободных от антител к вирусу гриппа группах цыплят в возрасте 1; 10; 20 и 30 сут. Цыплят опытных групп иммунизировали вакциной против ВПГП подтипов Н5 и Н7 инактивированной эмульгированной (бивалентной) подкожно в область средней третьи шеи в объемом 0,3 см3 суточных цыплят и 0,5 см3 цыплят других возрастов.
Результаты определения активности антител к ГП в РТГА свидетельствуют (табл. 5), что вакцина против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 инактивированная обладает высокой антигенной активностью и способна вызывать формирование антигемагглютинирующих антител у вакцинированных цыплят различных возрастов.

Таблица 6
Среднегрупповые титры антигемагглютинирующих антител (log2)
у цыплят разного возраста к гриппу птиц, привитых вакциной
против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, log2


Пример 6.
Антигенную активность вакцины против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 инактивированной (серия 02), изготовленной так, как описано в примере 1, изучали на цыплятах 45-суточного возраста, свободных от антител к виру-су гриппа птиц, из которых сформировали две группы (n=15). Цыплят опытной группы иммунизировали однократно подкожно в среднюю треть шеи в объеме 0,5 мл, птица контрольной группы была непривитой. Срок наблюдения составлял 360 дней
Напряженность и продолжительность иммунного ответа изучали по антигенной активности вакцины против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 инактивированной (серия 02), изготовленной так, как описано в примере 2. Для этого цыплят 45-суточного возраста, свободных от антител к вирусу гриппа птиц, (n=15) иммунизировали бивалентной вакциной, оставляя контрольную группу цыплят (n=15) интактной.
Исследование проводили в течение 360 дней, каждый месяц отбирая пробы крови и исследуя полученные сыворотки в РТГА.
Результаты определение активности антител к ГА в РТГА свидетельствуют (табл. 7), что вакцина против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 инактивированная обладает высокой антигенной активностью и способна вызывать формирование напряженного и продолжительного иммунитета к гриппу птиц типа А.

Таблица 7
Антигенная активность (среднегрупповые титры
антигемагглютинирующих антител, log2) вакцины
против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н5 и Н7



а). Вакцина безвредна.
б). Однократная вакцинация индуцирует вы-работку защитных антител через 21 сутки.
в). Вакцина обладает 100% протективной эффективностью.
Таким образом, результаты данного эксперимента показали высокую вирулентность штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтипа Н5 и Н7 способность передаваться алиментарным путем и вызывать гибель неиммунных цыплят.
В то же время вакцинированные цыплята бы-ли полностью защищены от заражения вирулентным вирусом, что доказано отсутствием клинических признаков заболевания и отсутствием его репликации.
Таким образом, приведенная информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемой вакцины следующей совокупности условий:
- вакцина против ГП инактивированная, пред-назначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- вакцина против ГП инактивированная, изготовленная на основе штамма «Приморский» вируса ГП типа А, подтипа Н5 и Н7, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивой птицы от эпизоотического вируса подтипа Н5 и Н7, а также предотвратить выделение иммунизированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

1. Патент Российской Федерации № RU 2323741. «Вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульсионная», 2008 г.
2. Джавадов Э.Д./ Контроль над гриппом птиц/ Джавадов Э.Д., Придыбайло Н.Д., Амдий Э.М., Мирзоев Д.М., Салимов Т. М.,// Доклады ТАСХН.- Душанбе, 2006.-№ 9.-стр.120-123.
3. Ronda E., Garcia-Gancedo A., Alonso M.L. et al. Вакцина против классической чумы птиц, изготовленная из клеток куриного эмбриона, инактивированная бетапропиолактоном. Матер. IX Междунар. конгресса по микробиологии. Тез. докл., М., 1966, 465.
4.Стандарт, «Вакцина против высокопатогенного гриппа птиц (ВПГП) подтипов Н5 и Н7 инактивированная», Санкт-Петербург-Душанбе, 2010 г.