ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТ И ИХ КИСЛОТНО-АДДИТИВНЫЕ СОЛИ

Получают соединения общей формулы

которые ингибируют протеазы вирусного происхождения и используются в фармацевти-ческих препаратах, в частности, для лечения или вирусных инфекций.

Настоящее изобретение касается производных аминокислот и их кислотноаддитивных солей. Производные аминокислот, описанные в данном изобретении, имеют нижеследу-ющую общую формулу 1


где R - бензилоксикарбонил или 2-хинолилкарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот.
Соединения, имеющие формулу I, и указанные их соли кислот являются новыми и об-ладают ценными фармакологическими свойствами. В частности, они ингибируют проте-азы вирусного начала и их можно использовать для профилактики или лечения вирусных инфекций, в частности, заболеваний, вызываемых вирусом HIV и другими ретроидными вирусами.
Объектом настоящего изобретения являются соединения формулы I и их вышеупомя-нутые кислотно-аддитивные соли, которые применяют в качестве веществ, имеющих тера-певтическое действие. Указанные соединения и их соли могут быть использованы для ле-чения и предотвращения заболеваний, особенно при лечении или профилактике заболева-ний, вызванных вирусной инфекцией. Представленные согласно изобретению соединения и их соли применяют при приготовлении лекарств для лечения или профилактики вирус-ных инфекций.
Приемлемые для фармацевтического использования соли присоединения кислот - это соли, образованные в результате реакций этих новых соединений с неорганическими кис-лотами, например, галоидводородными кислотами, такими как хлористоводородная кисло-та или бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и другие, или с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота , лимон-ная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, метансульфокисло-та, п-толуолсульфокислота и др.
Согласно настоящему изобретению, соединения, имеющие формулу I, и их соли, при-годные для фармацевтического использования, можно получить следующим образом:
а) взаимодействием 2-[(3(S)-амино-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичный бутил-декагидро-(4аS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида, имеющего формулу II


с кислотой общей формулы III



где R имеет значение, определенное выше, или ее реакционноспособным производным;
б) восстановлением соединения, имеющего общую формулу IV



где R имеет ранее определенное значение, и отделением желаемого 2(R)-гидрокси-изомера от полученной смеси, или
в) взаимодействием 2-[3(S) - [(L-аспа-рагинил)амино]-2(R)-гидрокси-4-фенил-бутил]-N-трет.бутилдекагидро-(4аS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида, имеющего формулу V


с агентом, образующим бензилоксикарбонильную группу или 2-хинолилкарбонильную группу;
г) если необходимо, осуществляют превращение полученного соединения, имеющего формулу I, в фармацевтически приемлемую соль, полученную взаимодействием с кисло-той.
Взаимодействие соединения, имеющего формулу II, с кислотой, формулы III, согласно способу (а), можно осуществить, применяя методы, известные из химии пептидов. Так, тогда используется кислота формулы III, реакцию предпочтительно проводят в присут-ствии конденсирующего агента, такого как гидроксибензотриазол и дициклогексилкарбо-диимид. Эту реакцию осуществляют в инертном органическом растворителе, таком как эфир (например, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и др.) или в диметилформамиде при низкой температуре, предпочтительно от примерно - 10°С до + 5°С, а особенно при тем-пературе около 0°С. Подходящими реакционноспособными производными кислот форму-лы III, используемыми в данном способе, являются, например, соответствующие галоидан-гидриды (например, хлорангидрид), ангидриды кислот, смешанные ангидриды, активиро-ванные сложные эфиры и др. При использовании реакционноспособных производных ре-акция обычно проводится в инертных органических растворителях, таких как галоидзаме-щенные алифатические углеводороды (например, дихлорметан) или в эфире (например, диэтиловом эфире, тетрагидрофуране и др.) и, что благоприятно, в присутствии органиче-ского основания (например, N-этилморфолина, диизопропилэтиламина и др.) при низкой температуре, желательно от приблизительно - 10°С до +5°С, особенно при температуре около 0°С.
Реакция восстановления соединений формулы IV (согласно способу, описанному в (б)), может быть осуществлена в соответствии с методами, известными для восстановления карбонильной группы до гидроксильной. Так, например, восстановление осуществляется с использованием комплексных гидридов металлов, таких как боргидрид щелочного метал-ла, особенно боргидрид натрия, в присутствии подходящего органического растворителя, такого как алканол (например, метанол, этанол, пропанол, изопропанол и др.). Обычно реакцию восстановления проводят при комнатной температуре. Отделение желаемого 2(R)-гидрокси-изомера от полученной смеси можно осуществить известными способами, например, хроматографией и т.д.
Для осуществления процесса согласно (в) подходящим реагентом для получения бензи-локсикарбонильной группы является бензиловый эфир хлормуравьиной кислоты. Подхо-дящими реагентами для получения 2-хинолилкарбонильной группы являются соответ-ствующая кислота и ее реакционноспособное производное, такое как соответствующий галоидангидрид (например, хлорангидрид кислоты), ангидрид кислоты, смешанные ан-гидриды, активированные сложные эфиры и т.д. Взаимодействие соединения формулы V с вышеупомянутыми реагентами осуществляется способом, описанным в стадии (а).
Превращение соединений формулы I в фармацевтически приемлемые соли кислот, со-гласно методу (г), можно осуществить обработкой этих соединений по общепринятому методу неорганической кислотой, например, галоидводородной кислотой, такой как хло-ристоводородной или бромистоводородной кислотами, серной кислотой, азотной кисло-той, фосфорной кислотой и др.; или органической кислотой, такой как уксусная кислота, лимонная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, метансульфо-кислота, паратолуолсульфокислота и др.
Соединение формулы II, используемое в качестве исходного вещества в методе (а), яв-ляется новым. Оно может быть получено, например, взаимодействием соединения, имею-щего общую формулу VI.


где R1 - группа, защищающая аминогруппу (например, трет. бутоксикарбонильная или бен-зилоксикарбонильная), а “Х” - атом хлора или брома, с N-трет.-бутилдекагидро-(4аS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамидом, имеющим формулу VII


и восстановлением полученного соединения общей формулы VIII



где R1 имеет значение, определенное ранее, отделением желаемого 2(R)-гидроксиизомера от полученной смеси и отщеплением группы R1 от полученного соединения, имеющего общую формулу IX

в которой R1 имеет ранее определенное значение, с образованием соединения формулы II.
Взаимодействие соединения формулы VI, где предпочтительно одна группа R1 означа-ет бензилоксикарбонил, с соединением формулы VII можно осуществить известным спо-собом, например, в инертном органическом растворителе, таком как галоидзамещенный алифатический углеводород (например, дихлорметан и т.д.) и в присутствии основания (например, триалкиламин, такой как триэтиламин и др.) обычно при комнатной темпера-туре.
Восстановление соединения формулы VIII с получением соединения формулы IX и с последующим отделением желаемого 2(R)-гидрокси-изомера можно осуществить методом, описанным ранее, согласно способу (б) настоящего изобретения, то есть восстановлением соединения формулы IV и отделением 2(R)- гидрокси - изомера из полученной смеси.
Отщепление группы R1 от соединения формулы IX можно также осуществить извест-ным способом, используя сильную неорганическую кислоту, такую как галоидводородная кислота или сильную органическую кислоту (например, трифторуксусная кислота и т.д.) удобнее всего при температуре от примерно 0°С до комнатной температуры. С другой стороны, аминоблокирующая группа R1, отщепляемая гидрогенолитически, может быть подвергнута отщеплению при использовании водорода в присутствии благородного ме-талла в качестве катализатора (например, палладиевого катализатора, такого как палладий на угле) в органическом растворителе или в смеси растворителей, которые в условиях ре-акции инертны (например, алканол, такой как этанол, изопропанол, или сложный эфир алканкарбоновой кислоты, как, например, этилацетат и др.), обычно при комнатной тем-пературе.
Следующий метод получения соединения формулы II включает сначала взаимодей-ствие соединения общей формулы X



где R1 определен ранее, с соединением, имеющим формулу VII, описанную ранее, жела-тельно в инертном органическом растворителе, таком как алканол (например, метанол и др.) диметилформамид или в аналогичном растворителе при повышенной температуре, лучше от приблизительно 60°С до примерно 120°С, с после-дующим отщеплением груп-пы R1 в продукте реакции (соединение формулы IX), как было описано ранее.
Соединения формулы IV, которые используются в качестве исходных веществ для по-лучения по (б), можно приготовить при отщеплении аминозащитной группы R1 от соеди-нения, имеющего формулу VIII, и взаимодействием продукта реакции с кислотой форму-лы III, или с ее реакционноспособным производным. Взаимодействие можно осуществлять способом, аналогичным опсанному ранее в (а).
Соединение, имеющее формулу V и которое используется в качестве исходного веще-ства в осуществлении процесса по (в), является новым и служит еще одним объектом настоящего изобретения.
Соединение формулы V можно получить, например, отщеплением бензилоксикарбо-нильной группы R от соединения формулы I, в котором R - бензилоксикарбонильная или трет.бутоксикарбонильная группа, с образованием соединения I, но в котором R означает третичную бутоксикарбонильную группу. Это последнее соединение можно получить, например, при взаимодействии соединения формулы II с N-(трет.бутоксикарбонил)-L-аспарагином, согласно методике (а). Процесс отщепления выполняется способом, анало-гичным описанному ранее в связи с отщеплением группы R1 от соединений формулы VIII.
Исходные вещества формулы III и их реакционноспособные производные, так же как и соединения формул VI, VII, и X, описанные выше, поскольку они являются новыми и не аналогичны известным соединениям, можно получить способом, аналогичным для полу-чения известных соединений, или способом, описанным в нижеприведенных примерах или аналогичных им.
Более того, реагенты, использованные в методике (в) являются большей частью извест-ными соединениями.
Как было упомянуто выше, соединения формулы I и их фармацевтически приемлемые соли ингибируют протеазы вирусного начала и поэтому пригодны для лечения и профи-лактики вирусных инфекций, в частности, инфекций, вызванных вирусом HIV и другими ретроидными вирусами.
Ингибирование протеазы вируса HIV вне организма соединениями, которые представ-лены в настоящем изобретении, можно продемонстрировать посредством следующего те-ста:
Протеаза HIV была экспрессирована в E.coli и частично очищена от растворимых экс-трактов бактерии фракционированием сульфатом аммония (0%-30%). Активность протеазы анализировалась с применением в качестве субстрата защищенного гексапептида сукци-нил-Ser-Leu-Asn-Tyr-Pro-Ile изобутиламида (S1) или защищенного гептапептида сукцинил-Val-Ser-Gln-Asn-Phe-Pro-Ile изобутиламида (S2) в качестве субстрата. Отщепление субстрата оценивалось посредством количественного определения образовавшегося H-Pro-Ile изобу-тиламида при помощи спектрофотометрического анализа N-терминального пролина.
1,25 мМ субстрата растворяли в 125 мМ цитратного буфера (рН = 5,5), содержащего 0,125 мг/мл Tween 20. К 80 мкл вышеупомянутого буферного субстрата добавляли 10 мкл раствора исследуемого соединения различных концентраций (растворенного в метаноле или в диметилсульфоксиде и разбавленного водой, содержащей 0,1% Tween 20) и 10 мкл протеазы. Переваривание осуществлялось при температуре 37°С в течение установленно-го времени, затем процесс останав-ливали добавлением 1 мл цветного реагента [30 мкг/мл изатина и 1,5 мг/мл 2-(4-хлоробензоил) бензойной кислоты в 10% ацетоне в этаноле (соот-ношения объем/объем) ]. Раствор нагревали на водяной бане, затем пигментированный осадок подвергался вторичному растворению в 1 мл 1% пирогаллола с 33% содержанием воды в ацетоне (соотношения вес/объем/объем). Оптическая плотность раствораизмерялась методом спектрофотометрии при 599 нм. Образование H-Pro-Ile изобутиламида в присут-ствии исследуемого соединения сравнивали с контрольными, концентрация исследуемого соединения, дающая 50% ингибирования (150), была определена графическим построением различных концентраций применямых исследуемых соединений.
Антивирусная активность соединений in vitro формулы I может быть продемонстриро-вана на примере анализа, описанного ниже:
Активность против вируса HIV
В этой пробе были использованы HTLV-III (штамм RF), выращенные в клетках С8166 (СD4+ человеческого Т-лимфобластоидного происхождения), с применением среды RPMI 1640 с бикарбонатным буфером, антибиотиками и 10% сывороткой коровьего эмбриона.
Суспензию клеток заражали вирусом в количестве, десятикратном TCD50, адсорбцию
осуществляли при температуре 37°С в течение 90 минут. Клетки отмывались средой 3 ра-за. Тест выполнялся в 6-мл пробирках с культурой ткани, каждая пробирка содержала 2х105 инфицированных клеток в 1,5 мл среды. Анализируемые соединения растворялись в вод-но-эфирной среде или в диметилсуль фоксиде в зависимости от растворимости, и добавля-лось 15 мкл раствора субстанции. Культуры инкубировали при температуре 37°С в тече-ние 72 часов во влажной атмосфере с содержанием 5 % углекислого газа. Затем культуры центрифугировали, а аликвотная проба надосадочной жидкости переводилась в раствори-мое состояние посредством Nonidet Р40 и подвергалась действию пробы антигена, а в ко-торой была первичная антисыворотка, имеющая конкретную реактивность против белка вируса 24 и систему нахождения пероксидазы хрена обыкновенного. Окрашенное образо-вание определялось методом спектрофотометрии и наносилось на диаграмму в зависимо-сти от концентраций исследуемой субтанции. Концентрация, при которой наблюдалась 50% защита, определялась индексом (150).
Проба на цитотоксичность, основанная на поглощении красителя и метаболизме или на внедрении меченого радиоактивного изотопа аминокислоты, представляет собой серию опытов, наряду с вышеуказанной пробой, для определения антивирусной селективности.
Результаты, полученные при проведении вышеуказанных исследований, где исполь-зуются соединения, имеющие формулу I, в качестве анализируемых соединений, объеди-нены в следующей таблице.





ТАБЛИЦА


Соединение I
R I50
Ингибирование HIV протеазы (мкМ) Активность
против вируса
S1 S2 HIV (nM)
Бензилоксикар-бонил 0,024 0,0027 20
2-хинолилкар-бонил 0,033 0,00037 2

Соединения, описываемые формулой I, а также их фармацевтически приемлемые соли, можно использовать в качестве лекарственных препаратов. Фармацевтические препараты должны быть приготовлены для внутренного применения, например, перорального (в форме таблеток, облаток, драже, мягких и твердых желатиновых капсул, растворов, эмуль-ский или суспензий), назального (в форме носовых аэрозолей) или ректального (в форме суппозиториев). Помимо этого, полученные препараты пригодны и для парентерального применения, например, внутримышечного или внутривенного (в форме растворов для инъекций).
В промышленном производстве таблеток, облаток, драже и твердых желатиновых кап-сул соединения формулы I и их соли можно сочетать с инертными неорганическими или органическими наполнителями. В качестве таких наполнителей можно использовать лак-тозу, кукурузный крахмал или их производные, тальк, стеариновую кислоту и ее соли.
Подходящей средой для мягких желатиновых капсул являются растительные масла, воск, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д.
Подходящей средой для растворов и сиропов могут быть вода, полиолы, сахароза, ин-вертный сахар, глюкоза и т.д.
Подходящей средой для растворов для инъекций являются вода, спирты, полиолы, глицерин, растительные масла и т.д.
Подходящей средой для суппозиториев могут быть натуральные или отвердевшие мас-ла, воск, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.д.
Более того, в состав фармацевтических препаратов могут входить консервирующие вещества, растворители, вещества, повышающие вязкость, стабилизирующие агенты, ан-тикоагулянты, смачивающие агенты, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, ароматизирующие вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, покры-вающие вещества (облочки) или антиоксиданты. Кроме того, могут входить и другие ве-щеста, имеющие терапевтическую ценность.
Согласно настоящему изобретению соединения, имеющие формулу I, и их фармацев-тические приемлемые соли присоединения кислот можно использовать для лечения и про-филактики вирусных заболеваний, в частности, ретровирусных инфекций. Дозировка мо-жет варьироваться в широких пределах и, естественно, подбирается индивидуально в каж-дом конкретном случае. Обычно в случае орального применения достаточно следующей суточной дозы - примерно от 3 мг до примерно 3 г, предпочтительно от примерно 10 мг до примерно 1 г (например, приблизительно 300 мг на человека), предпочтительно разделен-ную на прием в течение суток на 1-3 раза, причем каждая доза, как правило, одинаковая. Однако, следует отметить, что верхний предел может быть превышен, если это показано.
Приведенные ниже примеры наглядно иллюстрируют настоящее изобретение.
Пример 1
Раствор 561 мг 2-[3(S)-амино-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-трет.-бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида и 372 мг N- (бензилоксикарбонил)-L-аспарагина в 20 мл сухого тетрагидрофурана охлаждали в смеси льда с солью. Добавляли 189 мг гидрок-синбензотриазола, 161 мг N-этилморфолина и 317 мг дициклогексилкарбодиимида, смесь перемешивали в течение 16 часов. Затем смесь разбавляли этиловым эфиром уксусной кислоты и фильтровали. Фильтрат промывали водным раствором бикарбоната натрия и раствором хлорида натрия. Растворитель удалялся упариванием, а осадок подвергался хро-матографии на силикагеле с применением смеси дихлорметана и метанола (9:1) для элюи-рования, получая 434 мг 2-[3(S)-[N-(бензилоксикарбонил)-L-аспарагинил]амино]-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил-N-третичный бутилдекагидро (4аS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде белого твердого вещества из смеси метанол /диэтиловый эфир; Масс-спектр:650 [M+H]+; ЯМР: б (d4CH3OH,400 MНz):
7,33 (5H, m, PhCH2O), 7,25 (2H, m), 7,18 (2H, m); 7,09 (1H, m), 5,05 (2H, s, PhCH2O), 4,42 (1H, dd, Asn  J = 7,8, 6,1), 4,22 (1H, m, - CH2CHCH(OH)- J = 10,7 около 4, около 4), 3,85 (1H, m, - CHCH(OH)CH2- J = 8,0, 6,2, около 4), 3,02 (1H, dd, PhCH(H)CH J = - 13,9, около 4), 3,02, (1H, dd, 1eq J = - 12,0, немного), 2,69 ((1H, dd, - PhCH(H)CH- J = - 13,9, 10,7), 2,63 (1Н, dd, - CH-(OH)CH(H)N - J = -12,6 8,0), 2,62 (1H, dd, - H3ax J = около 11, немного), 2,57 (1H, dd, Asn 1 J = - 15,2, 6,1), 2,38 (1H, dd, Asn 2 J = - 15,2, 7,8), 2,19 (1H, dd, - CH(OH)CH(H)N- J = - 12,6, 6,2), 2,17 (1H, dd, 1ax J = - 12,0, 3,2), 2,07 (1H, m, H4ax J = -12,7, около 11, около 11,5), 1,78 (1H, m, H4a J4a -4ax = около 11,5, J4a-4eq = немного, J4a-8a = немного), 1,63 (1H, m, H8a J 8a-1ax = 3,2, J8a-1eq = немного, J8a-4a = немного), 1,35 (1H, m, H4eq J = -12,7, немного, немного), 1,30 (9Н, s, t-бутил), 2,0-1,2 (8Н, m).
Используемый в качестве исходного материала 2-[3(S)-амино-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичный бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамид полу-чали следующим образом:
(i) Суспензию из 12,676r (71,6 ммолей) 1,2,3,4-тетрагидро-3(S)-изохинолинкарбоновой кислоты (Chem. Pharm. Bull. 1983, 31, 312) в 200 мл 90%-ной уксусной кислоты гидрогени-зировали при 80°С и давлении 140 атм над 5%-ным родием на угле в течение 24 часов. Смесь охлождали до комнатной температуры, а катализатор затем отфильтровывали. Фильтрат испаряли до получения камеди, которую растворяли в 10 мл этилацетата, и мед-ленно добавляли к 100 мл энeргично перемешиваемого диизопропилового эфира. Полу-чался смолистый осадок. Надосадочные жидкости удалялись декантацией, а осадок экстра-гировали горячим этилацетатом. Этот горячий раствор вливали в интенсивно перемеши-ваемую смесь 150 мл диэтилового эфира и диизопропилового эфира (1:1) до получения светло-серого твердого вещества, которое отфильтровывали, промывали диэтиловым эфи-ром и высушивали. Таким образом получали 5,209 г смеси декагидроизохинолин-3(S)-карбоновых кислот, в состав которых входили в большей степени (около 65%) 4aS,8aS изомеры вместе с 4aR,8aR изомерами (около 25%) и около 10% трансизомеров; MS: m/e 184 [M+H]+.
(ii) 9,036 г (49,4 ммоля) предшествующей смеси декагидроизохинолин-3(S)-карбоновых кислот растворяли в 50 мл (50 ммоль) 1М раствора гидроксида натрия; полученный рас-твор охлаждали до 0°С. 7,40 мл (51,87 ммоля) бензилхлороформиата и 58,7 мл (58,7 ммоль) 1М раствора гидроксида натрия добавляли по каплям в течение 1 часа, поддерживая тем-пературу на уровне 0-5°С охлаждением. Затем смесь перемешивали еще 2 часа, за это время температура сеси доводилась до комнатной. Добавляли 100 мл диэтилового эфира и смесь фильтровали, в результате чего получали нерастворимый R,R-изомер, который отделяли. Водный слой фильтрата сепарировали и доводили до pH = 1,5-2 добавлением концентри-рованной соляной кислоты, в результате чего осаждалось масло. Смесь дважды экстраги-ровали 100 мл этилацетата. Объединенные органические экстракты промывались водой, высушивались над безводным сульфатом натрия и упаривались до получения масла. Это масло растворяли в 35 мл этилацетата с добавлением 2,85 мл (25 ммолей) циклогексилами-на. Белый осадок собирали фильтрованием, получая (после нескольких дробных перекри-сталлизаций из смеси метанол/этилацетат) 2,38 г циклогексиламиновой соли 2-(бензилоксикарбонил)-декагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоновой кислоты; MS: m/e 318 [M+H]+.
(iii) 2,334 г циклогексиламиновой слои 2-(бензилоксикарбонил)-декагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоновой кислоты разделили между 50 мл этилацетата и 50 мл 10%-ного раствора лимонной кислоты. Органическую фазу отделили, промыли водой, отфиль-тровали и упарили до получения 1,87г 2-(бензилоксикарбонил)-декагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоновой кислоты в виде бесцветной смолы; MS: m/e 318 [M+H]+.
(iv) Раствор 0,634 г (2,0 ммоля) 2-(бензилоксикарбонил)-декагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоновой кислоты в 6 мл диметоксиэтана обработали 0,23 г (2,0 ммоля) N-гидроксисукцинимидом и 0,412 г (2,0 ммоля) дициклогексилкарбодиимидом. Смесь пе-ремешивали при комнатной температуре 18 часов. Смесь фильтровали, и фильтрат упари-вали до получения 0,879 г эфира N-гидроксисукцинимида в виде светло-желтого масла. Раствор 0,828г (2,0 ммоля) эфира N-гидроксисукцинимида перемешивали в 5 мл дихлор-этана, охлаждали до 0°С и обрабатывали 0,219 г (3,0 ммоля) третичного бутиламина. Смесь перемешивали при 0°С в течение 2 часов, затем в течение 4,5 часов при комнатной темпе-ратуре. Затем смесь промывали 2М соляной кислотой, раствором карбоната натрия и рас-твором хлорида натрия, высушивали безводным сульфатом магния и упаривали. Осадок растворяли в 20 мл диэтилового эфира и отфильтровывали. Фильтрат упаривали до полу-чения 0,712 г 2-(бензилоксикарбонил)-N-третичный бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде белого твердого вещества; МS: m/e 373 [M+H]+.
(v) Раствор 0,689 г (1,85 ммоля) 2-(бензилоксикарбонил)-N-третичный бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в 20 мл этанола гидрогенизировали в присут-ствии 0,01 г 10%-ного палладия на угле при комнатной температуре и при атмосферном давлении в течение 18 часов. Катализатор удаляли фильтрацией, а растворитель удаляли упариванием до получения количественного выхода N-третичного бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде чистого масла; MS: m/e 239 [M+H]+, кото-рое использовалось на следующей стадии без дальнейшей очистки.
(vi) Раствор 440 мг N-третичного бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида и 549 мг 3(S)-бензилоксиформамидо)-1,2(S)-эпокси-4-фенилбутана в 6 мл этанола перемешивали при 60°С в течение 7 часов. Затем добавляли дополнительные 54 мг 3(S)-(бензилоксиформамидо)-1,2(S)-эпокси-4-фенилбутана, раствор перемешивали при 20°С в течение 16 часов. Растворитель удаляли упариванием, а осадок подвергали хрома-тографии на силикагеле с использованием смеси диэтилового эфира:н-гексана:метанола (47,5:47,5:5) для элирования с получением 771 мг 2-[3(S)-(бензилоксиформамидо)-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичного бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде белого твердого осадка; MS: m/e 536 [M+H]+.
(vii) Раствор 747 мг 2-[3(S)-(бензилоксиформамидо)-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-трет.-бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в 40 мл этанола гидрогени-зировали на 10% палладия на угле при 20°С, атмосферном давлении в течение 5 часов. Ка-тализатор удаляли фильтрацией, а фильтрат упаривали до получения 561 мг 2-[3(S)-амино-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-трет.-бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде светло-желтого твердого вещества, которое использовалось на следу-ющих стадиях без дальнейшей очистки.

Пример 2
Раствор 154 мг 2-[3(S)-[(L-аспарагинил)-амино]-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичного бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида и 52 мг хинальдино-вой кислоты в 6 мл сухого тетрагидрофурана охлаждали в смеси льда и соли. Добавляли 41 мг гидроксибензотриазола, 35 мг N-этилморфолина и 68 мг дициклогексилкарбодиида, смесь перемешивали в течение 64 часов. Смесь разбавляли этилацетатом и отфильтровыва-ли. Фильтрат промывали водным раствором бикарбоната натрия и раствором хлорида натрия, затем испаряли. Осадок хроматографировался на силикагеле с применением ди-хлорметана и метанола (9:1) для элюирования с целью получения 50 мг N-третичного бу-тилдекагидро-2-[2(R)-гидрокси-4-фенил-3-(S)-[ [N-(2-хинолилкарбонил)-L-аспарагинил]-амино]-бутил]- (4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде белого осадка; MS: m/e 671 [M+H]+; ЯМР:  (d4 CH3OH, 400 Mhz):
8,52 (1H, m), 8,18 (1H, m), 8,14 (1H, m), 8,02 (1H, m), 7,84 (1H, m), 7,69 (1H, m), 7,18 (2H, m), 6,90 (2H, m), 6,72 (1H, m), 4,93 (1H, dd, Asn  CH J = 6,6, 6,8), 4,27 (1H, m, -CH2CHCH (OH)- J = 3,8, 3,8, 11,0), 3,89 (1H, m, -CHCH(OH)CH2- J = 7,2, 6,4, 3,8), 3,06 (1H, dd, H1eq J = -12,0, 3,0), 3,02 (1H, dd, PhCH(H)CH- J = -14,0, 3,8), 2,77 (1H, dd, Asn 1 J = -15,6, 6,6), 2,68 (1H, dd, Asn 2 J = -15,6, 6,8), 2,68 (1H, dd, PhCH(H)CH - J = -14,0, 11,0), около 2,68 (1H, dd, -CH(OH)CHN- J = 12,0 7,2), 2,63 (1H, dd, H3ax J = 11,0, 2,2), 2,22 (1H, dd, -CH(OH)CH(H)N- J = -12,0, 6,4), 2,18 (1Н, dd, H1ax J = - 12,0 2,2), 2,06 (1H, m, H4ax J = -11,0, 11,0, 11,0), 1,78 (1H, m, 4a J4a-4ax = 11,0, J4a-4ax = 11,0 J 4a-4eq = около 4, J4a-8a = около 4), 1,65 (1H, m, 8a J8a -1ax = 2,2, J8a-1eq = 3,0, J8a-4a = около 4), 1,37 (1H, m, H4eq J = -11,0, 2,2, около 4), 1,30 (9H, s, t-бутил), 2,0-1,2 (8H, m).
Используемый в качестве исходного 2-[3(S)-[(L-аспарагинил)-амино]-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичный бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамид полу-чали следующим методом:
Раствор 195 мг 2-[3(S)- [[N- (бензилоксикарбонил)-L-аспарагинил]амино]-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичного бутилдекагидро (4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в 20 мл этанола гидрировали при комнатной температуре и атмосферном давлении в течение 18 часов над 10%-ным палладием на угле. Катализатор отфильтровы-вали, а фильтрат упаривали при пониженном давлении до получения 154 мг 2-[3(S)- [(L-аспарагинил)амино]-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичного бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида, который использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.

Пример 3

Раствор 287 мг N-(2-хинолилкарбонил)-L-аспарагина и 401 мг 2-[3(S)-амино-2(R)-гидрокси-4-фенилбутил]-N-третичного бутилдекагидро-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбок-самида [полученного способом, описанным в примере 1 (i)-(vii)] в 3 мл тетрагидрофурана охлаждали до -10°С и добавляли 163 мг 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(3Н)-она и 220 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивали при -10°С в течение 2 часов и при температуре 20°С в течение 16 часов, затем разбавляли этилацетатом и отфильтровывали. Фильтрат промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, насыщенным раство-ром хлорида натрия, а затем упаривали. Осадок подвергали хроматографии на силикагеле с использованием 4% (по объему) метанола в дихлорметане для элюции с получением 537 мг N-третичного бутилдекагидро-2[2(R)-гидрокси-4-фенил-3(S)- [[N(2-хинолил- карбонил)-L-аспарагинил]-амино]бутил]- (4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида, который был иден-тичен продукту, полученному в первом абзаце примера 2.
Вследствие реакции вышеуказанного свободного основания с пара-толуол-сульфоноксикислотой и кристаллизации из метанол/этилацетата получали пара-толуолсульфонат N-трет.-бутилдекагидро-2-[2(R)-гидрокси-4-фенил- 3(S) - [[N- (2-хинолилкарбонил)-L-аспарагинил]амино]бутил]-(4aS,8aS)-изохинолин-3(S)-карбоксамида в виде белого твердого вещества с точкой плавления 246-248°С (разложение).
N-(2-хинолилкарбонил)-L-аспарагин, используемый в качестве исходного материала, получали следующим образом:
Смесь 540 мг сложного эфира амида ян-тарной кислоты и хинальдиновой кислоты и
300 мг L-аспарагин моногидрата в 2 мл диметилформамида перемешивали при 20°С в те-чение 96 часов. Растворитель удаляли испа-рением до получения белого твердого осадка, который интенсивно перемешивали в 10 мл дихлорметана, отфильтровывали и промывали дихлорметаном. Таким образом получали 431 мг N-(2-хинолилкарбонил)-L-аспарагина в виде белого твердого вещества; MS: m/e 288 [M + H]+.
Следующий пример иллюстрирует приготовление фармацевтического препарата, со-держащего соединение формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, в виде ак-тивного ингредиента.

Пример А

Водный раствор активного ингредиента стерильно отфильтровывали, смешивали при нагревании со стерильным желатиновым раствором, который содержал фенол в качестве консерванта с применением таких количеств, чтобы получить 1,00 мл конечного раствора, который содержал бы 3,0 мг активного ингредиента, 150,0 мг желатина, 4,7 мг фенола и дистиллированной воды до 1мл. Смесь разливали в пробирки емкостью 1,0 мл в условиях антисептики.

Европейский патент №0346847, 1989,М.кл. 5 С07Д 217/26.