СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ МАРКЕРОВ ГЕПАТИТА

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и стоматологии.
Способ выявления вирусных маркеров гепатита, заключается в том, что после многократно повторяющихся циклов синтеза ДНК мишени в присутствии термастобильной ДНК – полимеразы, дезоксинуклеозид- трифосфатов (ДНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок – праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК – мишени, отбирают слюну 1,5 миллилитра, центрифугируют 15 минут при обороте 12 тысяч в минуту. Удаляют пипеткой надосадочную жидкость и добавляют к 50 миллилитрам осадка 200 миллилитров ДНК – экспресса.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и стоматологии.
Заявленное изобретение не имеет аналогов.
Цель изобретения является внедрение нового, простого и легкого способа выявления вирусных маркеров в слюне у больных с хроническим диффузным поражением печени.
Поставленная цель заключается в том, что заявляемое изобретение предусматривает собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозид-трифосфатов (ДНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок – праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени. [1; 2]
Каждый цикл состоит из трёх стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94 ˚С происходит разделение цепей ДНК, затем при 57 ˚С – 60 ˚С присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72 ˚С протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5 -3 ˚С.
В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции с помощью электрофореза.
Проведение ПЦР (полимеразная цепная реакция) анализа включает три лабораторных этапа:
1) обработка клинических проб (выделения ДНК);
2) постановка реакции ПЦР (амплификация);
3) детекции продуктов амплификации (в дан-ной методике-электрофоретическое разделение продуктов в агорозном геле).
Для реализации заявляемого технического решения осуществляют исследование объекта в течение 21 дня.
Объектом исследования в течение 21 дня ста-ли больные с хроническим диффузным поражением печени. Каждый день у одних и тех же больных брали слюну на исследование.
Для исследования использовали только свежий материал (не замороженный). В полипропиленовую пробирку 1,5 миллилитра отбирали исходного материала, центрифугировали в течение 15 минут при обороте 12 тысяч в минуту. Тщательно удаляли пипеткой надосадочную жидкость, оставив на дне около 50 миллилитров жидкости с осадком. К осадку добавляли всю плотность (рt) 200мл ДНК экспресса, тщательно перемешивали пепитированием и полученную суспензию переносили обратно в пробирку. Затем выделяли ДНК по известной методике: проведения исследования клинического материала на наличие РНК и ДНК вирусных гепатитов способом ПЦР.
Положительный эффект заявленного технического решения подтверждается примерами конкретного выполнения способа, проведенного в клинике и описанного для конкретных больных.
Пример 1
Больная С. 52 года, жалобы на боли в правом подреберье, носовые кровотечения, умеренная желтуха. Диагноз: хронический вирусный гепатит С.
У больной каждый день в течение 21 дня брали слюну на исследование. В полипропиленовую пробирку 1,5 миллилитра отбирали исходного материала, центрифугировали в течение 15 минут при обороте 12 тысяч в минуту. Тщательно удаляли пипеткой надосадочную жидкость, оставив на дне около 50 миллилитров жидкости с осадком. К осадку добавляли всю рt 200мл ДНК экспресса тщательно перемешивали пепитированием и полученную суспензию переносили обратно в пробирку.
Затем выделяли РНК по методике: проведения исследования клинического материала на наличие РНК вирусных гепатитов методом ПЦР.
У больного с хроническим вирусным гепатитом С, проба слюны дала положительные результаты.
Пример 2
Больной У. 29 лет, жалобы на слабость, утомляемость, нервозность, боли в правом подреберье, диспепсические расстройства. Диагноз: хронический вирусный гепатит В.
У больного в течение 21 дня брали слюну на исследование.
В полипропиленовую пробирку 1,5 миллилитра отбирали исходного материала, центрифугиро-вали в течение 15 минут при обороте 12 тысяч в минуту. Тщательно удаляли пипеткой надосадочную жидкость, оставив на дне около 50 миллилитров жидкости с осадком. К осадку добавляли всю рt 200мл ДНК экспресса тщательно перемешивали пепитированием и полученную суспензию переносили обратно в пробирку.
Затем выделяли ДНК по методике проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей инфекции методом ПЦР. У больного с хроническим вирусным гепатитом В, проба слюны дала положительные результаты.

«Оптимизация» этиопатогенетической терапии хронического гепатита С», В.Г. Радченко, В.В. Стельмах, В.К. Козлов Санкт-Петербург 2004 г.
2. Научно-производительная фирма Литех. «Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК и РНК вирусов методом ПЦР». Москва 2006 г.