КОНЪЮГАТЫ ИНТЕРФЕРОНА

В изобретении описан физиологически активный конъюгат ПЭГ-α-IFN, имеющий формулу:
(см. рис.)

Интерферон, в частности, α2a-интерферон, представляет собой фармацевтически активный протеин, который обладает антивирусной и антипролиферативной активностью. Например, интерферон применяют для лечения лейкемиче-ского ретикулеза и саркомы Капоши, и он также проявляет активность в отношении гепатита. Для улучшения стабильности и растворимости и уменьшения иммуногенности фармацевтически активные протеины, такие, как интерферон, могут быть конъюгированы с полимером полиэти-ленгликолем (ПЭГ).
Биологическая доступность терапий с ис-пользованием протеинов часто ограничена их коротким периодом полураспада в плазме, что препятствует достижению их максимального лечебного действия. В последние годы было под-тверждено, что ПЭГ-конъюгированные биологи-ческие молекулы обладают полезными лечебны-ми свойствами (Inada и др., J. Bioact. and Compatible Polimers 5, 343 (1990); Delgado и др., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249 (1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 91 (1993). Они обладают лучшей физической стабильностью и теплостойкостью, защищены (нечувствительны) от ферментативно-го разложения, имеют повышенную раствори-мость, более продолжительный период полурас-пада в кровотоке in vivo, пониженный клиренс и повышенную эффективность. Были опубликованы данные о том, что разветвленные ПЭГ-конъюгаты обладают более высоким значением рН и тепло-стойкостью и большей стабильностью по отно-шению к протеолитическому разложению по сравнению с линейными ПЭГ-конъюгатами (Monfardini и др., Bioconjugate Chem. 6, 62 (1995)). Другими свойствами ПЭГилированных протеинов являются пониженная иммуногенность и антигенность, а также пониженная токсичность. Другим эффектом ПЭГилирования определенных протеинов может быть снижение активности in vitro, сопровождаемое увеличением активности in vivо. Это было обнаружено, в частности, на G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоци-тов) (Satake- Ishikawa и др., Сеll Structure and Function 17, 157-160 (1992), на IL-2 (интерлейкин-2) (Katre и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487 (1987)), на TNF-α (фактор некроза опухоли) (Tsutsumi и др., Jpn. J. Cancer Res. 85, 9 (1994)), на IL-6 (интерлейкин-6) (Inoue и др., J. Lab. Clin. Med. 124, 529 (1994)) и на CD4-IgG (антиген Т-лимфоцитов-иммуноглобулин G) (Chamow и др., Bioconj. Chem. 5, 133 (1994)) и на других.
Было обнаружено, что в случае интерферо-на ПЭГилирование снижает антивирусную ак-тивность in vitro, но увеличивает антипролифера-тивную активность в отношении клеток опухоли человека. Однако новый ПЭГ-конъюгат интерфе-рона по настоящему изобретению обладает неожиданными свойствами, заключающимися в том, что антипролиферативная активность ПЭГ- интерферона существенно выше не только тако-вой самого интерферона, но и других ПЭГ-конъюгатов интерферона. Хотя антипролифера-тивная активность конъюгата существенно уве-личена по сравнению с активностью других ПЭГ- конъюгатов α-интерферона, однако в этом случае наблюдается аналогичное снижение антивирус-ной активности. Кроме того, ПЭГ-конъюгат α-интерферона по настоящему изобретению не обладает иммуногенностью, в результате чего фактически при его введении не образуются ан-титела. В противоположность этому другие ПЭГ-конъюгаты α-интерферона в определенной степе-ни вызывают образование антител.
Следовательно, предметом изобретения яв-ляется новый класс ПЭГ- производных α-интерферона (α-IFN). Конъюгат по настоящему изобретению, как описано ниже, включает ПЭГ, имеющий разветвленное строение. Разветвленный ПЭГ обладает тем преимуществом, что он имеет возможность присоединять две молекулы линей-ного ПЭГ в одной точке, удваивая таким образом массу присоединенного ПЭГ и не увеличивая количества точек ПЭГилирования.
По сравнению с немодифицированным α-IFN (т.е. α-IFN без присоединенного ПЭГ) конъюгат обладает увеличенным периодом полураспада в кровотоке и временем нахождения в плазме, уменьшенной иммуногенностью, пониженным клиренсом и увеличенной антипролиферативной активностью, что сопровождается пониженной антивирусной активностью in vitro. Конъюгат по настоящему изобретению по сравнению с други-ми конъюгатами ПЭГ-α-IFN обладает существен-но более высокой антипролиферативной актив-ностью, не связанной пропорциональной зависи-мостью с усилением или снижением других ха-рактеристик, и фактически не обладает иммуно-генностью.
Физиологически активные виды конъюгата ПЭГ-α-IFN по настоящему изобретению имеют формулу:

5 328 6
Конъюгат по настоящему изобретению име-ет такие же области применения, что и α-IFN, например, в качестве антипролиферативного средства. В частности ПЭГ-конъюгаты α-интерферона по настоящему изобретению при-годны для лечения иммуномодуляторных нару-шений, таких, как заболевания, относящиеся к опухоли, например, лейкемический ретикулез, хронический миелолейкоз (ХМЛ) и саркома Ка-поши, и инфекционных болезней с помощью тако-го же способа, который применят для лечения этих болезней α-интерфероном (в частности α2a-IFN). Однако конъюгат по настоящему изобрете-нию обладает улучшенными свойствами, вклю-чающими лучшую стабильность, более высокую растворимость, увеличенный период полураспа-да в кровотоке и большее время нахождения в плазме. Кроме того, эти конъюгаты обладают антипролиферативной активностью, превосхо-дящей таковую для α - IFN. Также было потвер-ждено, что конъюгат проявляет неожиданное разделение антивирусного и антипролифератив-ного действия. Это свойство дает дополнительное преимущество в том случае, если необходимо усилить определенную активность конъюгата и в то же время уменьшить или устранить нежела-тельную активность. Например, если нежела-тельное побочное воздействие связано с антиви-русной активностью, то устранение этой актив-ности будет устранять это побочное воздействие, сохраняя при этом антипролиферативную актив-ность. Таким образом, настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции на основе соединений формулы I или их солей и способы их получения.
Фармацевтические композиции по настоя-щему изобретению, применяемые для лечения или предупреждения заболеваний, включают конъ-югат интерферона общей формулы I и терапевти-чески инертный нетоксичный и терапевтически приемлемый носитель. Предназначенные для применения фармацевтические композиции могут быть приготовлены и дозированы в соответствии с принятой медицинской практикой с учетом под-лежащего лечению заболевания, состояния кон-кретного пациента, места доставки конъюгата протеина, способа введения и других факторов, известных специалистам в данной области тех-ники.
Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой физиологически активный конъюгат ПЭГ-α-IFN, имеющий формулу

где R и R’ независимо друг от друга обозначают низший алкил; X обозначает NH или О (Х обо-значает по крайней мере одну из функциональ-ных групп в молекуле α-IFN, выбранную из NH2 или ОН); n и n’ представляют собой целые числа, сумма которых составляет от 600 до 1500; и средняя молекулярная масса звеньев полиэти-ленгликоля в этом конъюгате составляет от при-близительно 26000 Да до приблизительно 66000 Да. Конъюгат формулы I имеет разветвленное строение, в котором два фрагмента ПЭГ присо-единены к протеину через простую связь.
Числа n и n’ выбирают таким образом, что-бы образовавшийся конъюгат формулы I обладал физиологической активностью α-IFN, причем эта активность может быть такой же, более высокой или представлять собой часть соответствующей активности немодифицированного α-IFN. Числа n и n’ (причем n и n’ могут быть одинаковыми или разными) обозначают количество звеньев эти-ленгликоля в ПЭГ. Одно звено ПЭГ, ОСH2CH2, имеет молекулярную массу приблизительно 44 Да. Молекулярная масса конъюгата (за исключе-нием молекулярной массы α-IFN) зависит от чи-сел n и n’. Сумма n и n’ для конъюгата формулы I составляет от 600 до 1500, что приводит к полу-чению конъюгата, имеющего общую среднюю молекулярную массу звеньев ПЭГ от приблизи-тельно 26000 до 66000 Да и предпочтительно от приблизительно 35000 до 45000 Да, в частности от приблизительно 39000 до 40000 Да, причем особенно предпочтительна молекулярная масса 40000 Да. Предпочтительная сумма n и n’ со-ставляет от приблизительно 800 до 1200, причем средняя сумма составляет от приблизительно 850 до 1000, а предпочтительной суммой является приблизительно 910. Каждое из чисел n и n’ по отдельности может быть равно 420 или 520, или оба могут быть равны 420 или 520, или оба могут быть равны 455. Предпочтительное отношение n к n’ может составлять от приблизительно 0,5 до 1,5, причем наиболее предпочтительное отноше-ние составляет от приблизительно 0,8 до прибли-зительно 1,2. Понятие “приблизительно” в отно-шении некоторого значения молекулярной массы означает, что она находится в статистически приемлемой области этого значения, определяе-мого стандартными аналитическими методами.
Также предпочтительным является конъюгат формулы I, в котором α-IFN представляет собой α2a-IFN, конъюгат, в котором R и R’ обозначают метил, конъюгат, в котором X обозначает NH, и конъюгат, в котором n и n’ каждый или оба вме-сте равны либо 420, либо 520. Такой конъюгат, обладающий всеми вышеуказанными характери-стиками, является особенно предпочтительным.
7 328 8
R и R’ могут обозначать любой низший ал-кил, представляющий собой алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, такой, как метил, этил, изопропил и т.д. Эта группа также включает разветвленные алкилы. Предпочти-тельным алкилом является метил. В двух группах ПЭГ формулы I R и R’ могут быть одинаковыми или различными.
Под α-IFN (α-интерферон) и его разновидно-стями α2a-IFN понимают природный или реком-бинантный протеин, предпочтительно человече-ский, получаемый из любого обычного источни-ка, такого, как ткани, путем химического синтеза протеина из культуры клеток с использованием нативных и рекомбинантных клеток. Под объем настоящего изобретения подпадает любой про-теин, обладающий активностью α-IFN, в том чис-ле мутеины или модифицированные каким-либо другим образом протеины. Методика получения и выделения α-IFN из природных или рекомби-нантых источников хорошо известна (Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221, 1 (1983)). Предпо-чтительным α-IFN, как указано выше, является α2a-IFN, получаемый известными способами (Pestka, Sci. Am. 249, 36 (1983), Европейский па-тент 43980)).
Физиологически активный конъюгат форму-лы I обладает активностью α-IFN, под которой понимают любую частичную или усиленную известную активность α-IFN, определяемую раз-личными способами, известными в данном обла-сти техники. В частности конъюгаты по настоя-щему изобретению обладают активностью α-IFN, а именно, как установлено, антипролифератив-ным действием в отношении клеток опухоли и антивирусной активностью в отношении клеток, зараженных вирусом. Эти виды активности явля-ются известными активностями, свойствеными α-IFN. Такая активность конъюгата может быть определена способами, хорошо известными в данной области техники, например, описанными ниже способами (см., также у Rubinstein и др., J. Virol. 37, 755 (1981); Borden и др., Саnc. Res. 42, 4948 (1982)). Одним из предметов настоящего изобретения является конъюгат формулы I, обла-дающий более высокой антипролиферативной активностью и меньшей антивирусной активно-стью по сравнению с немодифицированным α-IFN.
Конъюгат формулы I получают путем кова-лентного связывания α-IFN с ПЭГ, который может быть активирован замещением гидроксильной группы ПЭГ на связывающую группу с образо-ванием реагента, представляющего собой произ-водное ПЭГ в виде N-гидроксисукцинимидного эфира (в частности монометокси-ПЭГ) формулы II. Реагент может быть получен традиционными методами (Monfardini и др., см. выше). Связыва-ние происходит через амидную или эфирную связь. В предпочтительном конъюгате связывание происходит через амидную связь (Х обозначает NH). Одним из предметов настоящего изобрете-ния является способ усиления антипролифера-тивной активности α-IFN при одновременном снижении антивирусной активности α-IFN путем связывания α-IFN, как описано выше, с реагентом формулы II с получением конъюгата ПЭГ-IFN.
X обозначает место присоединения на α-IFN, посредством которого ПЭГ- реагент формулы II ковалентно связывается с α-IFN. Реагенты присо-единяются к первичным аминогруппам (ХН = NH2), например, лизина, или к N-концам α-IFN. Реагенты также могут быть присоединены к гид-роксилу (ХН = ОН), например, серина.


Реагент формулы II (ПЭГ2-NHS), в котором в целом две цепи монометокси-ПЭГ (м-ПЭГ) связа-ны с лизином, каждая с α- и - аминогруппами, через карбаматные (уретановые) связи и который содержит карбоксильную группу лизина, активи-рованную до сукцинимидилового эфира, может быть получен обычными методами в соответ-ствии с известными способами (Monfardini и др., см. выше), применимыми к реагенту, в котором R обозначает низший алкил и с требуемым значе-нием n. Такой реагент поставляется, например, фирмой Shearwater Polymers, Inc. (Хантсвилл, шт. Алабама). Предпочтительная средняя молеку-лярная масса получаемого ПЭГ составляет при-близительно 20000 Да, что обеспечивает общую массу ПЭГ в ПЭГ2-NHS приблизительно 40000 Да (полимеры с другими молекулярными массами могут быть получены традиционными методами путем изменения значения n в исходных материа-лах для реагента формулы II, представляющих собой спиртовой ПЭГ).
Реагент формулы II может быть конъюгиро-ван с α-IFN традиционными способами. В част-ности реагент формулы II сначала подвергают взаимодействию с одной или несколькими пер-вичными аминогруппами (например, с N- конце-выми группами или с боковыми цепями лизина) α-IFN (например, α2a-IFN) для образования амид-ной связи между a-IFN и полимерной основой ПЭГ. Реакция ПЭГилирования также может про-исходить между ПЭГ2- NHS и свободными (если они присутствуют) гидроксильными группами (например, серина) α-IFN с образованием слож-ноэфирной связи. Механизм реакции приведен выше. Условия реакции являются обычными для специалистов в данной области техники и более подробно приведены ниже. ПЭГ- реагент объеди-няют с α-IFN в среднещелочных условиях при низкой температуре и в условиях, пригодных для нуклеофильного замещения, что приводит к по-лучению конъюгата формулы I. Это также пока-зано выше на схеме реакции.
9 328 10
Присоединение реагентов к α-IFN может быть осуществлено традиционными методами. Могут быть использованы ПЭГ по настоящему изобретению с любыми выбранными молекуляр-ными массами. Условия реакции могут быть вы-браны таким образом, чтобы обеспечить получе-ние конъюгата по изобретению с одним присо-единенным реагентом. Конъюгат формулы I, к которому присоединен один реагент формулы II, отделяют от немодифицированного α-IFN и от конъюгатов, имеющих более одной присоединен-ной молекулы реагента, традиционными спосо-бами.
Для разделения конъюгатов на основе раз-личия в зарядах могут применяться методы очистки, такие, как катионообменная хромато-графия, которая позволяет эффективно разделять конъюгаты на основе их различных молекуляр-ных масс. Содержание фракций, получаемых в результате катионообменной хроматографии, может быть определено по молекулярной массе с использованием принятых способов, например, с помощью масс-спектроскопии, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ПААГ-ДСН) или других извест-ных методов, применяемых для разделения моле-кулярных энантиомеров по молекулярной массе. Затем соответственно определяют фракцию, ко-торая содержит конъюгат формулы I, очищенный от немодифицированного α-IFN и от конъюгатов, имеющих более одного присоединенного реаген-та. Кроме того, реагенты формулы II при кислот-ном гидролизе высвобождают по одной молекуле лизина на молекулу реагентам так что количе-ство молекул лизина при гидролизе показывает количество групп ПЭГ, присоединенных к проте-ину, и таким образом может быть подтверждено количество молекул реагента, присоединенных к конъюгату.
Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, которые не ограничивают его объем. В этих примерах использован α2a-IFN. Другие виды α-IFN также могут быть конъюгированы с ПЭГ способами, приведенными в примерах.
Описание чертежей
Фиг. 1: Противоопухолевая активность ПЭГ2-α2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали по-чечные клетки человека линии А498. Всем жи-вотным за 33 дня до начала эксперимента (день -33) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии А498. Обработку с помощью ПЭГ2-α2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (30, 60, 120 или 300 мкг) ПЭГ2-α2а-IFN вводили под-кожно в противоположный относительно опухо-ли бок, 1 раз в неделю в течение 4 - недельного периода.
Фиг. 2: Противоопухолевая активность α2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии А498. Всем животным за 33 дня до начала эксперимента (день -33) под-кожно вводили имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии А498. Обработ-ку с помощью α2a-IFN начинали в день 0 экспе-римента. Указанные количества (10, 20, 40 или 100 мкг) α2a-IFN вводили подкожно в противопо-ложный относительно опухоли бок, 3 раза в не-делю в течение 4- недельного периода.
Фиг. 3: Противоопухолевая активность ПЭГ2-α2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали по-чечные клетки человека линии ACHN. Всем жи-вотным за 25 дней до начала эксперимента (день -25) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии ACHN. Обработку с помощью ПЭГ2-α2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (30, 60, 120 или 300 мкг) ПЭГ2-α2a-IFN вводили под-кожно в противоположный относительно опухо-ли бок, 1 раз в неделю в течение 5 - недельного периода.
Фиг. 4: Противоопухолевая активность α2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии ACHN. Всем животным за 25 дней до начала эксперимента (день -25) под-кожно вводили имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии ACHN. Обра-ботку с помощью α2a-IFN начинали в день 0 экс-перимента. Указанные количества (10, 20, 40 или 100 мкг) α2a-IFN вводили подкожно в противопо-ложный относительно опухоли бок, 3 раза в не-делю в течение 5 - недельного периода.
Фиг. 5: Противоопухолевая активность ПЭГ2-α2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали по-чечные клетки человека линии G402. Всем жи-вотным за 45 дней до начала эксперимента (день -45) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии G402. Обработку с помощью ПЭГ2-α2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (30, 60, 120 или 300 мкг) ПЭГ2-α2а- IFN вводили под-кожно в противоположный относительно опухо-ли бок, 1 раз в неделю в течение 5 - недельного периода.
11 328 12
Фиг. 6: Противоопухолевая активность α2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии G402. Всем животным за 45 дней до начала эксперимента (день -45) под-кожно вводили имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии G402. Обработ-ку с помощью α2a-IFN начинали в день 0 экспе-римента. Указанные количества (10, 20, 40 или 100 мкг) α2a-IFN вводили подкожно в противопо-ложный относительно опухоли бок, 3 раза в не-делю в течение 5- недельного периода.

Пример 1
Получение конъюгата формулы I
Материалы
α2a-Интерферон получали известными спо-собами (Pestka, см. выше). Полиэтиленгликолевый (ПЭГ) реагент формулы II был приобретен у фирмы Shearwater Polymers, Inc. (Хантсвилл, шт. Алабама). Смола Fractogel® EMD СМ 650(S) с размером частиц 25-40 мкм поставляется фирмой ЕМ Separations (Гиббстаун, МА). Концентриро-ванный (10X) забуференный фосфатом физиоло-гический раствор (ЗФР), рН 7,3, был приобретен у фирмы BioWhittaker (Уолкерсвилл, MD). Наборы гелей для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил- (лаурил) -сульфата натрия (ПААГ-ДСН) и приборы для электрофоре-за были приобретены у фирмы NOVEX (Сан Ди-его, шт. Калифорния). Концентрированный кра-ситель Fast Stain для окрашивания протеина ПЭГ-конъюгатов при электрофорезе в ПААГ-ДСН был приобретен у фирмы Zoion Research, Inc. (Нью-тон, МА). Набор для определения эндотоксина в тесте с использованием лизата амебоцитов (LAL-тест) был приобретен у фирмы Associates of Саре Cod, Inc. (Вудс Хол, МА). Все другие применяе-мые реагенты были наиболее высокого доступно-го качества. Крысы с канюлями, имплантирован-ными в яремнуго вену, и мыши линии BDF-l были приобретены у фирмы Charles River Laboratories (Вилмингтон, МА).
Методика эксперимента
А. Маломасштабное получение конъюгата формулы I
208 мг (5,2 мкмоля) реагента формулы II (средняя молекулярная масса 40000 Да) добавля-ли к 50 мг (2,6 мкмоля) α-IFN в 10 мл 100 мМ бо-ратного буфера, рН 8,0. Конечное молярное со-отношение протеин:реагент составляло 1:2. Ре-акционную смесь перемешивали при 4°С в тече-ние 2 часов. Реакцию прекращали путем доведе-ния рН до 4,5 с помощью ледяной уксусной кис-лоты.
Реакционную смесь 50 - кратно разбавляли водой, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и вносили в колонку типа Amicon, запол-ненную 100 мл (3,2х13 см) смолы Fractogel EMD СМ 650(S) при скорости потока 20 мл/мин. Ко-лонку предварительно уравновешивали с помо-щью 10 мМ ацетата аммония, рН 4,5. Выходящий из колонки продукт анализировали с помощью УФ -абсорбции при 280 нм. Затем колонку про-мывали уравновешивающим буфером до тех пор, пока УФ-абсорбция не возвращалась к базовому уровню. Конъюгаты ПЭГ-IFN, имеющие более одного присоединенного реагента формулы II (олигомеры ПЭГ-IFN), элюировали с помощью 40 мМ ацетата аммония, рН 4,5, а конъюгат форму-лы I элюировали с помощью 0,12 М NaCl в 40 мМ аммоний-ацетатном буфере. Оставшийся на ко-лонке немодифицированный IFN элюировали с помощью 0,5М NaCl в таком же буфере. Колонку регенерировали, промывая 1,0 М NaCl, с после-дующей промывкой уравновешивающим буфе-ром. Объединенные фракции конъюгатов форму-лы I концентрировали с использованием вакуум-ного фильтра для перемешанных клеток типа Amicon, снабженного мембраной типа YM10, до концентрации приблизительно 1 мг/мл.
Примененная для очистки катионообменная смола Fractogel СМ 650(S) эффективно адсорби-ровала ПЭГ и немодифицированный IFN. Интен-сивность адсорбции зависела от степени ПЭГи-лирования. Конъюгаты связывались менее сильно по сравнению с немодифицированным IFN. Оли-гомеры ПЭГ-IFN элюировали с помощью 40 мМ ацетата аммониям в то время как конъюгат фор-мулы I элюировали с помощью 0,12 М NaCl. Не-модифицированный IFN элюировали с помощью 0,5 М NaCl. Все препараты содержали <5 ЭЕ (эндотоксиновых единиц)/мг эндотоксинов. Обра-зовавшийся препарат содержал >99% конъюгата формулы I и был лишен немодифицированного IFN.
Б. Крупномасштабное получение конъюгата формулы I
6240 мг (156 мкмолей) реагента формулы II (средняя молекулярная масса 40000 Да) раство-ряли при 4°С в 63 мл 1 мМ НСl и быстро добав-ляли к 125 мл растворам содержащего 1000 мг (52 мкмоля) интерферона в 50 мМ боратном бу-фере, рН 9,0. Конечное отношение проте-ин/реагент составляло 1:3, а конечная концен-трация протеина в реакционной смеси была рав-на 5,3 мг/мл. Реакционную смесь перемешивали при 4°С в течение 2 часов. Реакцию прекращали путем доведения рН до 4,5 с помощью ледяной уксусной кислоты.
Реакционную смесь 10-кратно разбавляли водой и наносили на колонку, заполненную 600 мл смолы Fractogel EMD СМ 650(М) и предвари-тельно уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 4,5, при линейной скоро-сти 1,3 см/мин. Колонку промывали уравовеши-вающим буфером, а затем 10 мМ NaCl для удале-ния избытка реагентам побочных продуктов ре-акции и олигомеров ПЭГ-IFN. Конъюгат формулы I элюировали с помощью уравновешивающего буфера, содержащего 200 мМ NaCl. Немодифи-цированный интерферон, еще сохранившийся на колонке, удаляли, промывая 0,75 М NaCl в урав-новешивающем буфере. Конъюгат формулы I, который элюировали при концентрации 0,3-0,5 мг/мл, затем концентрировали и для окончатель-ного приготовления лекарственного средства фильтровали путем диализа в 20 мМ натрийаце-татном буфере, рН 5,0, содержащем 150 мМ NaCl. Общий выход конъюгата формулы I составлял 40-45%.
13 328 14
Очищенный ПЭГ-IFN из препарата при крупномасшабном способе получения состоит более чем на 99% из конъюгата формулы I. Сред-няя молекулярная масса конъюгата формулы I из этого примера составляет 62000 Да, включая молекулярную массу α2a-IFN, которая равна 19241 Да, и средную молекулярную массу реа-гента, которая находится в интервале между 40000 Да и 45000 Да, составляя приблизительно 43000 Да.

Пример 2
Характеристика конъюгата формулы I
Определение протеина
Концентрации протеина определяли, ис-пользуя значение A280, равное 1, для раствора с концентрацией α2a-IFN 1 мг/мл.
Анализ с использованием ПААГ-ДСН
Конъюгат анализировали с помощью элек-трофореза в полиакриламидном геле (8-16%) в присутствии додецил- (лаурил-)сульфата натрия в восстановительных условиях в соответствии с методами Laemmli (Nature 227, 680 (1970)). ПА-АГ-ДСП-гели, содержащие ПЭГ-конъюгаты, окрашивали для определения протеина, исполь-зуя краситель Fast Stain (фирма Zoion Research, Inc.), в соответствии с инструкциями производи-теля.
Определение уровней эндотоксина
Уровни эндотоксина определяли, используя LAL-тест в соответствии с инструкциями произ-водителя. Все препараты содержали <5 ЭЕ/мг эндотоксинов.

Пример 3
Биологические активности in vitro конъюгата формулы I
Антивирусная активность в бычьих почеч-ных клетках
Антивирусную активность in vitro α2a-IFN и конъюгата формулы I, полученного по описанной в примере 1.А методике, определяли с помощью биологического анализа культуры клеток, ис-пользуя бычьи почечные клетки линии Madin-Darby (MDBK), зараженные вирусом везикуляр-ного стоматита (Rubinstein и др., см. выше). Пока-затели антивирусных активностей приведены в таблице 1 наряду с соответствующими остаточ-ными активностями в процентах по отношению к исходному IFN.
Таблица 1
Показатели антивирусных активностей

Образ-цы Тип ПЭГ Общая масса ПЭГ (кДа) № моди-фиц. Lys Удель-ная актив-ность (ед/мг) Оста-точная актив-ность (%)
α2а-IFN - - - 2,00х108 100
Конъю-гат фор-мулы I развет-влен-ный 40 1 1,40х107 7

Антипролиферативная активность in vitro на клетках опухоли человека
Антипролиферативную активность in vitro определяли на человеческих клетках линии Daudi (лимфома Беркитта), как описано у Borden и др. Человеческие клетки линии Daudi поддерживали в виде стационарных суспензионных культур в среде RPMI 1540, дополненной 10%-ной феталь-ной бычьей сывороткой и 2 мМ глутамином (Grand Island Biologicals, Гранд Исланд, шт. Нью-Йорк). Клетки подвергали скринингу и было об-наружено, что они лишены микоплазмы. Клетки (2х104) добавляли в лунки планшетов для микро-титрования (Costar, МА) с 100 мкл среды. Различ-ные концентрации IFN и конъюгата формулы I, полученного по описанной в примере 1.А методи-ке, добавляли в лунки объемом 100 мкл. Планше-ты инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 72 часов. За 16 часов до сбора клеток их обрабаты-вали 3Н- тимидином (New England Nuclear, Бо-стон, МА) в дозе 0,25 ммКи/лунку. Клетки соби-рали на стеклянные фильтры и измеряли радио-активность с использованием жидкостного сцин-тилляционного счетчика. Результаты выражали в виде % ингибирования, вычисляемого по форму-ле:
% ингибирования = [(A-B)/A]x100,
где
А обозначает количество импульсов в минуту в контрольной культуре (клетки, инкубированные в чистой среде);
В обозначает количество импульсов в минуту в экспериментальной культуре.
Опыты проводили в четырех повторностях, а стандартное отклонение во всех случаях состав-ляло менее 20% от среднего значения. Экспери-менты повторяли по крайней мере дважды, полу-чая сопоставимые результаты. Антипролифера-тивные активности (IC50) IFN и конъотгата фор-мулы I приведены в таблице 2. Данные показы-вают, что существует 28 - кратное увеличение антипролиферативной активности конъюгата формулы I по сравнению с таковой у IFN.

Таблица 2
Антипролиферативная активность in vitro в отношении клеток линии Daudi человека (лимфо-мы Беркитта)

Образец Антипролифертивная активность
15 328 16
IC50 (нг/мл) Увеличение
α2а-IFN 0,56 1х
Конъюгат формулы I 0,02 28х

Пример 4
Фармакокинетика
Самок крыс линии Sprague Dawley со сред-ней массой тела 240-260 г, которым хирургиче-ским путем имплантировали канюли в яремные вены, размещали каждую по отдельности, обес-печивая свободный доступ к пище и воде, и со-держали при 12-часовом свето-темновом цикле. Через 4-6 часов после введения канюли, находя-щиеся в яремных венах, заливали ЗФР. На следу-ющий день после введения в канюли 0,15-0,2 мл ЗФР крысам инъецировали 2х106 единиц α-IFN в 0,2-0,4 мл ЗФР, а затем вновь инъецировали 0,15-0,2 мл ЗФР, чтобы гарантированно обеспечить поступление всего количества лекарства в орга-низм животного. Таким образом, каждое живот-ное получало дозу 8х106 единиц α-IFN/кг массы тела.
Через 5, 15 и 30 минут, а также через 1, 3, 5, 12 и 24 часа после инъекции IFN и конъюгата формулы I отбирали образцы крови. После от-брасывания первой порции крови объемом 0,15-0,2 мл через яремную канюлю каждый раз отби-рали аликвоту крови объемом 0,5 мл, используя новый шприц. При комнатной температуре об-разцы помещали в пробирки для отделения сыво-ротки. Сразу после того, как все образцы в рас-сматриваемый момент времени были собраны, пробирки центрифугировали при 14000xg в тече-ние 10 минут в центрифуге Эппендорфа с охла-ждением. Отделенную сыворотку переносили в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и замораживали при -80C до проведения биологи-ческого анализа. Образцы сыворотки соответ-ствующим образом разбавляли и для каждого момента времени определяли антивирусную ак-тивность, как описано ранее. Из графика зависи-мости активности от времени определяли оконча-тельный период полураспада конъюгата форму-лы I и α-IFN, эти данные приведены в таблице 3, в которой также указано время его нахождения в плазме.

Таблица 3
Окончательные периоды полураспада (t1/2) и среднее время нахождения в плазме

Образец t1/2 (ч) Время нахождения в плазме (ч)
α2а-IFN 2,1 1,0
Конъюгат формулы I 15,0 20,0

Окончательный период t1/2 определяли мето-дом линейной регрессии в логарифмическом масштабе.

Пример 5
Иммуногенность
Нормальным мышам линии BDF-l (десять особей в группе) внутрибрюшинно инъецировали один раз в день пять раз в неделю различные препараты интерферона, содержащие 300000 единиц антивирусной активности. Некоторым мышам также инъецировали составную форму α2a-IFN, которая является более иммуногенной, чем мономерная форма. Образцы крови брали на 19 день после последней инъекции и анализиро-вали сыворотку на наличие нейтрализующих антител.
Как видно из таблицы 4, мыши, которым инъецировали α2a-IFN, вырабатывали нейтрали-зующие антитела, и эта реакция была сильно увеличена у мышей, которым инъецировали составные формы интерферона. У большинства животных, которым инъецировали конъюгат по настоящему изобретению, не было обнаружено антител.

Таблица 4
Иммуногенность

Антитело (ИНЕ/мл)*
Обработка Среднее значение Диапазон
α2а-IFN 2400 217-8533
Составные формы α2а-IFN 42667 8000-768000
Конъюгат форму-лы I 0 0-1133

* Интерферон-нейтрализующие единицы/мл

Пример 6
Противоопухолевая активность in vivo
Противоопухолевую активность in vivo конъюгата формулы I (ПЭГ2- α2a-IFN) и немоди-фицированного α2a-IFN оценивали путем опре-деления их способности уменьшать размер раз-личных человеческих клеток опухоли, подкожно имплантированных мышам. Результаты показаны на фиг. 1-6.
Методика: Лишенным шерсти мышам (линии Harlan), у которых отсутствовала вилочковая железа, подкожно вводили в заднюю часть левого бока имплантат, содержащий 2х106 почечных клеток человека линии А498 (фиг. 1 и 2), почеч-ных клеток человека линии ACNH (фиг. 3 и 4) или почечных клеток человека линии G402 (фиг. 5 и 6). В течение 3-6 недель опухолям давали офор-миться, как указано далее. Критерий размера, приемлемого для исследования, составлял от 0,05 до 0,5 см3. Мышам вводили совокупные ежеднев-ные дозы ПЭГ2-α2a-IFN или немодифицирован-ного α2a-IFN, составляющие 30, 60, 120 или 300 мкг. В случае ПЭГ2-α2a-IFN мышей обрабатыва-ли один раз в неделю (в понедельник), используя по 30, 60, 120 или 300 мкг ПЭГ2-α2a-IFN на об-работку. В случае немодифицированного α2a- IFN мышей обрабатывали три раза в неделю (в понедельник, среду и пятницу), используя по 10, 20, 40 или 100 мкг α2a-IFN на обработку. Про-должительнoсть обработки составляла 4-5 недель в зависимости от интенсивности роста (агрессивности) опухоли. Объемы опухоли изме-ряли каждый понедельник до обработок.
17 328 18
Результаты: ПЭГ2-α2a-IFN привел к замет-ному уменьшению размера опухоли, вызванной клетками А498, по сравнению с немодифициро-ванным α2a-IFN при всех исследованных уровнях еженедельных доз на 7 день, 14 день, 21 день и 28 день после начала обработки (фиг. 1 и 2). Обра-ботку продолжали в течение 4 недель. Через семь дней после прекращения обработки трех мышей в каждой группе умервщляли. У трех мышей, под-вергавшихся обработке ПЭГ2-α2a-IFN, не обна-ружили остатков опухоли. У мышей, подвергав-шихся обработке немодифицированным α2a-IFN, масса опухоли, вызванной клетками А498, соста-вила 1,28 г, 0,62 г и 1,60 г соответственно у каж-дой из трех мышей. Масса опухоли, вызванной клетками А498, составила 2,32 г, 2,37 г и 1,94 г у каждой из трех мышей в контроле. На 80 день после окончания четырехнедельного периода обработки наличие опухоли определяли пальпа-цией семи мышей. При пальпации у всех семи мышей не обнаружили наличия опухолевой тка-ни.
ПЭГ2-α2a-IFN привел к значительному уменьшению размера опухоли, вызванной клет-ками ACNH, по сравнению с немодифицирован-ным α2a-IFN при уровнях еженедельных доз 60, 120 и 300 мкг на 14 день, 21 день, 28 день и 35 день (фиг. 3 и 4).
ПЭГ2-α2a-IFN привел к значительному уменьшению размера опухоли, вызванной клет-ками G402, по сравнению с немодифицированным α2a-IFN при уровнях еженедельных доз 60 и 120 мкг на 14 день, 21 день, 28 день и 35 день (фиг. 5 и 6).

1. RU 2006036 CI, 15.01.1994
2. Машковский М.Д., Лекарственные средства, Москва, Медицина, 1985, ч.2, с.386.