СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ ФИТОСТЕРОЛОВ, КОМПОЗИЦИИ, ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ПРОДУКТ

Настоящее изобретение относится к способу получения и очистки композиции растительных стеролов из мыла в виде пульпы, включающему экстракцию из мыла в виде пульпы кремообразного осадка и очистки этого осадка с получением композиции.

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к получе-нию и выделению композиции стеролов из мыла в виде пульпы, к композициям perse, и к использова-нию этих композиций и их производных в качестве агентов для профилактики и лечения первичной и вторичной дислипидемии.

Предшествующий уровень техники
Прямой причиной сердечного приступа и грудной жабы является разрушающий процесс, известный как атеросклероз. Атеросклероз являет-ся следствием ряда наследственных (генетиче-ских) факторов и факторов окружающей среды. Проявление данных факторов в нашей цивилиза-ции, среди которых питание представляется наиболее важным, ведет к развитию атеросклеро-за. Рост атеросклеротических бляшек, заполнен-ных холестерином, ограничивает в конечном счете поступление крови к сердечной мышце, или, аль-тернативно, к мозгу или ногам, в зависимости по-ложения бляшки в артериальном русле.
Одним из главных факторов риска атероскле-роза, который можно модифицировать, является уровень холестерина в крови. Ряд известных ис-следований показали, что уровень холестерина в крови несомненно является важным свидетель-ством предрасположенности к вероятности риска сердечного приступа, а также инфарктов. Взаимо-связь между концентрацией холестерина в крови и риском возникновения данных нарушений являет-ся постоянной, (варьируя вокруг уровней холесте-рина) по степени (чем выше уровень, тем больше вероятность заболевания), при отсутствии кажу-щегося порога (даже путем понижения, так назы-ваемых низких уровней, можно дополнительно понизить риск заболевания). Например, у людей старше 40 лет уровень холестерина в крови, со-ставляющий 7,0 ммоль/л, вызывает риск заболева-ний коронарных артерий в три - четыре раз боль-ший, чем при уровне холестерина ниже 5,0 ммоль/л.
Взаимосвязь проявляется очень ясно, когда уровни составляют более 5,2 ммоль/л. Например, смертность среди мужчин, имеющих уровни холе-стерина 8,0 ммоль/л составляла почти в шесть раз меньше, чем среди мужчин, имеющих уровни 4/0 ммоль/л. Совсем недавние наблюдения находятся в соответствии с ранними исследованиями.
Другие крупные клинические исследования четко показали, что путем снижения высоких уровней холестерина можно понизить риск воз-никновения смертельных и не смертельных ин-фарктов сердца, грудной жабы, изменений в элек-трокардиограммах и операций коронарного шун-тирования. Наиболее известным и первым подоб-ным исследованием было клиническое исследова-ние липидов, в котором исследования по первич-ной коронарной профилактике показали, что на каждый 1% сниже
ния общего уровня холестерина в крови, сни-жение риска возникновения заболеваний коронар-ных артерий составляло 2%.
Для любого успешного долговременного профилактического лечения гиперхолестеринемии необходимо начинать с относительно раннего возраста и продолжать независимо ни от чего. Несмотря на то, что диета с низким содержанием жира является краеугольным камнем такого дол-говременного лечения, до 60% пациентов через 6 месяцев перестают ее соблюдать. Подобные труд-ности отмечаются во многих странах Запада, благодаря общему характеру питания с высоким содержанием жира. У многих пациентов плохой профиль холестерина осложняется преобладани-ем дополнительных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, таких как высокое дав-ление, диабет, ожирение и курение.
В последние 10 - 15 лет изменение питания для лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых заболеваний значительно усовершен-ствовалось. В частности, исследователи обнару-жили, что растительные стеролы (фитостеролы) являются эффективными для снижения уровня холестерина в плазме: Lees et al., Atherosclerosis, 28 (1977) 325-338; Kudehodkar et al., Atherosclerosis, 28 (1976) 239; Day Artery, 18(3) : 125-132 (1991).
Фитостеролы представляют соединения по-добные стеролу, синтезируемые в растениях, не имеющих пищевого значения для человека. В рас-тениях они необходимы для функционирования клеток, по механизму подобному механизму дей-ствия холестерина у людей. В среднем питание в странах Запада содержит 360 мг фитостеролов в день. Недавно, на растительные стеролы было обращено серьезное внимание, благодаря их воз-можным противораковым свойствам и их способ-ности снижать уровни холестерина при принятии с пищей многими млекопитающими, включая че-ловека.
Химически по структуре фитостеролы подоб-ны холестерину. Основными фитостеролами яв-ляются бета-ситостерол, кампестерол и стигма-стерол. Другие включают стигмастанол (бета- ситостанол), ситостанол, десмостерол, халина-стерол, пориферастерол, клионастерол и брасси-кастерол. Химические структуры бета-ситостерола, кампестерола и стигмастерола сле-дующие:
бета - ситостерол

5 302 6

кампестерол


стигмастерол


Механизм снижения холестерина в крови у животных фитостеролами неизвестен, но, по-видимому, он включает ингибирование абсорбции холестерина из проксимального отдела тощей кишки, посредством конкуренции с холестерином за специфические места связывания. Данные ис-следований также свидетельствуют, что некото-рые фитостеролы не абсорбируются в прокси-мальном отделе тощей кишки (ситостанол), и если имеется абсорбция (бета-ситостерол), то в очень ограниченных количествах.
На основании результатов данных исследо-ваний было широко изучено использование фито-стеролов в качестве пищевой добавки для сниже-ния абсорбции холестерина. Lees et al., supra; Pol-lak, Pharmac. Ther., 31 (1985) l77-208; Ralcht et al., Biochimica et Biophysica Acta 388 (1975) 374-384.
Lee et al., supra, сравнили действие препара-тов ситостерола из двух источников, стеролов сои и соснового масла, на холестерин в плазме. Было обнаружено, что препараты растительного стеро-ла эффективны при лечении пациентов с гиперхо-лестеринемией. Pollak, supra, сделал обзор статей по фитостеролам и их влиянию на липиды сыво-ротки. Raicht, supra, дополнительно описал дей-ствие бета-ситостерола на баланс стерола и фер-менты, лимитирующие скорость метаболизма стерола.
В целом, принято, что фитостеролы пред-ставляют собой уникальное сочетание безопасно-сти при долговременной терапии, эффективности и разнообразия при лечении человека. Следующим намерением в отношении фитостеролов является их выделение и очистка из растительных источни-ков и определение дополнительных источников, которые эффективны по цене, приемлемы для раз-работки в большом масштабе и, которые прояв-ляют гипохолестеринемическое действие.
Обычно, фитостеролы выделяют из таких ис-точников, как масло кукурузы, масло зародыша пшеницы, смолы соевых бобов и смолы кукуруз-ного масла. Аналогично, в качестве источника фитостерола используют смолу соснового масла, которую получают в процессе производства бума-ги из древесины, в частности из древесины сосны. В общем, в этом способе древесная стружка вы-держивается с каустической содой для получения пульпы, или “мыла” Мыло затем перегоняют для удаления летучих материалов, получая смолу в виде остатка. Именно из данной смолы исследова-тели выделили фитостеролы.
У данных традиционных источников фито-стеролов имеется несколько существенных недо-статков. Смола соснового масла представляет крайне сложный материал, содержащий смолы, жирные кислоты, окисленные продукты, омылен-ные материалы и фитостеролы. Хотя смола недо-рога, поскольку она является отходом различных производственных процессов, выделение стеролов с высоким молекулярным весом с хорошими выхо-дами и высокой чистотой, требующейся для фар-мацевтического использования очень трудно.
Патент США № 3840570, принадлежащий Jullian, описывает способ получения стеролов из смолы соснового масла экстракцией смесью вода-спирт-углеводород, с последующим омылением и последующей очисткой. Исходный материал в настоящем способе представляет смолу соснового масла, из которой экстрагируются фитостеролы и различные примеси. Признается, что в любом спо-собе очистки смолы соснового масла особенно трудно отделить от стеролов примеси спиртов и кислот с длинной углеводородной цепью (которые сами по себе представляют спирты с высоким молекулярным весом).
Другие способы очистки стеролов из смолы соснового масла описаны в Патенте США №2835682, принадлежащему Steiner and Fritz; Патенту США №2715638, принадлежащему Albrecht and Herrlinger; Патенте США №2573891, принадлежащего Christenson. Важно отметить, что в каждом из данных известных способов очистки исходным материалом являлась смола соснового масла, для которой проблемы выделения обсуж-дены выше.
Предмет настоящего изобретения состоит в том, чтобы избежать или уменьшить вышеуказан-ные недостатки.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение описывает способ очистки и получения композиции фитостерола из мыла в виде пульпы, который включает экстрак-цию из мыла в виде пульпы кремообразного осад-ка и очистку настоящего осадка с получением уникальной композиции фитостерола. Более кон-кретно, кремообразный осадок экстрагируют из мыла в виде пульпы с использованием процесса экстракции растворителем. Затем, очисткой кре-мообразного осадка путем кристаллизации полу-чают композицию настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также включает уни-кальные композиции, которые эффективны для предотвращения или лечения дислипидемии, и которые включают бета-ситостерол, кампестерол и стигмастанол. Композиции фитостеролов, опи-санные в настоящем изобретении, существенно отличаются от найденных в растениях, пище или маслах. В частности, наличие стигмастанола, по-видимому, увеличивает эффективность. Настоя-щие композиции могут дополнительно содержать подобные соединения, которые могут являться фитостеролами или нет. В частности, эти подоб-ные соединения могут включать тритерпены, спирты с длинной углеводородной цепью и другие растворимые в спирте органические соединения.
Настоящее изобретение далее включает ис-пользование композиций, описанных здесь для профилактики или лечения первичной или вторич-ной дислипидемии и атеросклероза, включая за-болевания коронарных сосудов сердца, заболева-ния периферических сосудов и инфаркты у людей и животных.
Уникальные композиции настоящего изобре-тения проявляют отличные результаты по пони-жению общего (ТС) и уровня холестерина в крови содержащей липопротеин с низкой плотностью (LDL) Кроме того, неожиданно было обнаружено, что композиции настоящего изобретения поддер-живают или повышают уровень холестерина в плазме крови, содержащей липопротеин с высокой плотностью (HDL) у различных видов животных. Данная особенность настоящего изобретения осо-бенно важна, демонстрируя тот факт, показанный в исследовании, что независимо от уровней ТС, при снижении уровня HDL в плазме, риск атеро-склероза увеличивается. Фитостеролы, выделен-ные из смолы соснового масла, соевых бобов и других источников, согласно настоящему изобре-тению проявляют данный уникальный эффект HDL.
Хотя известно, что для получения некоторых видов фитостеролов из смолы, отогнанной из мы-ла, полученного при обработке древесной струж-ки, тем не менее композиции фитостеролов нико-гда не получали из компонентов мыла в виде пульпы, которая получалась способом обработки древесных стружек. Смола соснового масла явля-ется существенно отличной по составу от мыла в виде пульпы. По-видимому, неожиданное действие композиций настоящего изобретения является следствием, по крайней мере, частично, использо-вания мыла в виде пульпы в качестве исходного материала, и благодаря уникальному способу очистки.

Краткое описание рисунков
Следующие рисунки иллюстрируют различ-ные аспекты изобретения, где:
Фиг.1 представляет собой изображение спек-тра газовой хроматографии для одной из компози-ций (далее Forbes-2), входящей в объем настояще-го изобретения;
Фиг.2 представляет собой изображение спек-тра Фиг.1 при времени удерживания от 35 до 45 минут;
Фиг.3 представляет изображение спектра Фиг.1 при времени удерживания от 22 до 27 ми-нут;
Фиг.4 представляет цифровое описание спек-тра газовой хроматографии Фиг. 1;
Фиг.5 представляет изображение спектра га-зовой хроматографии для другой композиции (да-лее Forbes-3), входящей в объем настоящего изоб-ретения;
Фиг.6 представляет изображение спектра Фиг.5 при времени удерживания от 32 до 48 ми-нут;
Фиг.7 представляет цифровое описание спек-тра газовой хроматографии Фиг.5;
Фиг.8 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие Forbes-l и Forbes-2 на концентрацию ТС у крыс;
Фиг. 9 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие Forbes-l и Forbes-2 на концентрацию холестерина LDL у крыс;
Фиг.10 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие Forbes-l и Forbes-2 на концентрацию холестерина HDL у крыс;
Фиг.11 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие Forbes-3 на ТС в сы-воротке у хомячков;
Фиг.12 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие Forbes-3 на холесте-рин LDL в сыворотке у хомячков;
Фиг.13 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие Forbes-3 на холесте-рин HDL в сыворотке у хомячков;
Фиг.14 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью различных диет на уровень холестерина в плазме у самцов и самок хомячка;
Фиг.15 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью различных диет на уровень холестерина в плазме у самцов хомячка;
Фиг.16 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью различных диет на уровень холестерина в плазме у самок хомячка;
Фиг.17 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью различных диет на уровень триглицеридов в плаз-ме у самцов и самок хомячка;
Фиг.18 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью различных диет на соотношение HDL/aпo-В у самцов и самок хомячка;
Фиг.19 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью диеты на уровень общего холестерина у хомячка на 45 день исследования;
Фиг.20 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью диеты на корреляцию холестерина и ситостано-ла;
Фиг.21 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью диеты на уровень HDL у хомячка на 45 день ис-следования;
Фиг.22 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью диеты на соотношение не-апоА/апоА у хомячка на 45 день исследования; и
Фиг.23 представляет столбчатую диаграмму, иллюстрирующую действие лечения с помощью диеты на не-апоА стеролы у хомячка на 45 день исследования.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Способ настоящего изобретения включает следующие стадии:
(А) получение или приготовление исходного материала, мыла в виде пульпы, полученно-го растительного материала;
(В) экстракция из мыла кремообразного осад-ка при использовании подходящего раство-рителя;
(С) очистка кремообразного осадка с получе-нием композиции фитостеролов.
Имеются многочисленные возможные мыла в виде пульпы, полученного из растительного мате-риала. В общем, в известном способе (способ “Kraft”), древесные стружки обрабатывают кау-стической содой с получением мыла. Древесные стружки могут включать стружку любой твердой древесины или мягкой древесины, включая, но не ограничиваясь, древесины пихты, кедра, сосны, ели, дуба, тсуги и тополя. Наиболее предпочти-тельно, стружки поставляют из любого Северо-западного тихоокеанского американского или Европейского леса, в котором встречаются раз-личные виды древесных пород.
На стадии экстракции мыло смешивают с ке-тоном и водным раствором. Для экстракции сте-ролов используется углеводородный раствори-тель. Эту стадию можно провести при температу-рах обычно от около 25С до около 150С, наибо-лее предпочтительно от около 50С до около 100С. Наиболее предпочтительно, эта стадия экстракции продолжается свыше 15-24 часов. Важно отметить, что использование спирта не требуется на стадии экстракции. Процесс экстрак-ции настоящего изобретения проводят при ис-пользовании смеси кетон-вода-углеводородный растворитель.
Кетон выбирают из группы, имеющей общую структуру RCOR1, где R и R1 являются алкильны-ми группами. Предпочтительно, алкильные груп-пы являются С1-С6 группами. Наиболее предпо-чтительно, кетон является 2-пропаноном (ацето-ном). Углеводород может быть выбран из группы, содержащей все С5-С10 углеводороды. Наиболее предпочтительно, углеводородом является гексан.
Как показано на Фиг.1, продуктом стадии экстракции является кремообразный осадок или остаток, из которого выделяют с помощью очист-ки композицию фитостерола. Данная стадия очистки может быть проведена кристаллизацией, хроматографическим разделением или любым другим подходящим способом. Наиболее предпо-чтительно, кремообразный осадок растворяют в спирте, медленно охлаждают, затем (фильтруют и промывают холодным спиртом. Осадок сушат, полученный продукт представляет композицию фитостерола.
В предпочтительном способе, на стадии очистки, используемый спирт выбирается из груп-пы, имеющей общие структуры: R-CHOHR, R-CH2ОH и RCOH, где R является С1-C2 алкильной группой. Наиболее предпочтительно, спиртом является метанол. Стадия охлаждения может быть проведена при температурах от 10С до ОС, наиболее предпочтительно, от 3 до 4С в течение 24 часов.
Композиция фитостерола, полученная спосо-бом настоящего изобретения, может быть включе-на непосредственно в пищевые добавки, препара-ты витаминов и в лекарственные препараты для текущего и профилактического лечения атеро-склероза и его последствий, инфарктов, сердечных приступов и заболеваний периферических сосу-дов. Кроме того, одно из воплощений настоящего изобретения включает, описанные здесь компози-ции фитостеролов, в виде медикаментов в сочета-нии с подходящими наполнителями и, носителями. Например, настоящие композиции могут быть включены или альтернативно назначены вместе с агентами, понижающими уровень липидов, для снижения необходимой дозировки и, следователь-но, токсичности данных последни соединений.
Композиции фитостерола настоящего изоб-ретения проявляют заметную способность к моди-фикации липопротеинов, даже в более низких кон-центрациях фитостерола, чем в известных соста-вах. Наиболее неожиданно, однако, было обна-руженное действие данных композиций по увели-чению уровней плазмы липопротеинов высокой плотности (HDL), действие ранее не связанное ни с какими-либо другими композициями фитостеро-лов, полученными из соснового масла. Предпола-гается, что причиной данного уникального дей-ствия может быть использование мыла в виде пульпы в качестве исходного материалам или условие присутствия стигмастанола в качестве элемента композиции.
В предпочтительном варианте, композиции настоящего изобретения содержат следующее соотношение фитостеролов: бета-ситостерол (1): кампестерол (0,2-0,4): и стигмастерол (0,2-0,5). Наиболее предпочтительно, кампестерол и стиг-мастерол вместе составляют, по крайней мере, 50% от общего количества бета-ситостерола. В наиболее предпочтительном варианте, компози-ции настоящего изобретения включают следую-щее соотношение фитостеролов в сравнении с фитостеролами, полученными из соевых бобов.

Соотношение известных фитостеролов
Приблизи-
тельная чистота (%) В-Ситос-терол Кампес-
терол Стиг-масте-рол
Бобы сои 1 0,640 0,005
Forbes-1 91,0 1 0,354 0,414
Forbes-2 77,0 1 0,330 0,203
Forbes-3 90,0 1 0,268 0,299
Состав и чистота двух других экстрактов, входя-щих в объем настоящего изобретения, следующая:

Состав %
Приблизи-
тельная чистота (%) В-Ситос-терол Кампес-
терол Стигмас-
терол
Forbes-4 99,0 62,6 16,6 23,2
Forbes-5 98,3 64,7 16,4 17,2

В каждой композиции, описанной здесь, мо-гут присутствовать дополнительные соединения, которые представляют фитостеролами или нет. Например, было обнаружено, что кампестанол, другой фитостерол, может присутствовать в отно-сительно небольших количествах. Кроме того, могут присутствовать жирные спирты с прямой цепью, такие как бегенил (С22) и лигноцерил (С24). Для определения природы данных сопут-ствующих соединений был проведен газо-жидкостной хроматографический анализ каждой из наиболее предпочтительных композиций настоящего изобретения. Условия проведения газовой хроматографии для фитостеролов были следующие: начальная температура 80С, кото-рую поддерживали в течение 1 минуты; линейный подъем до 120С со скоростью 20С в минуту, которую поддерживали в течение 15 минут; ли-нейное снижение до 24С со скоростью 20С в минуту, которую поддерживали в течение 15 ми-нут; линейный подъем до 26С со скоростью 20С в минуту, которую поддерживали в течение 25 минут. В конце каждого этапа температуру ли-нейно повышали до 320°С и поддерживали, как минимум, в течение 5 минут. Температура впрыс-кивания составляла 300С и температура детекто-ра составляла 320С. Скорость протока в колонке составляла 1 мл в минуту и скорость протока в отверстии клапана составляла 4 мл в минуту. Скорость потока продува клапана составляла 4,5 мл в минуту. Газообразный носитель представлял собой гелий. Результаты анализа газо-жидкостной хроматографии для двух наиболее предпочти-тельных композиций по настоящему представлены на Фиг.1-7.
Для композиции Forbes-2, наличие известных стеролов проявляется в области 35-45 минуты, на Фиг.1 и 2. Наличие бета-ситостерола проявляется в пике 87, кампестерола проявляется в пике 81 и стигмастанола в пике 84. Пики 65, 66 и 77 на Фиг.2 относятся к сопутствующими соединениями, кото-рые могут обладать гипохолестеролемическим действием. Возможно также, что эти сопутствую-щие соединения могут иметь синергитическое действие на действие известных фитостеролов в композиции. Аналогично, на Фиг.5 и 6, кампесте-рол, стигмастанол и бета-ситостерол представле-ны пиками 6, 7 и 8, соответственно.
Другая предпочтительная композиция, вхо-дящая в объем настоящего изобретения, включает следующие компоненты:
Кампестерол 14,1%
Кампестанол 3,5%
В-ситостерол 62,8%
стигмастанол 16,9%
для общей концентрации фитостеролов 97,3%.

ПРИМЕР 1 - Экстракция и очистка
Партию 3 кг мыла в виде пульпы получили от B.C. Chemicals Inc. Приготовили смесь из 3 л аце-тона и 1,5 л воды, к которой добавляли мыло. Смесь непрерывно экстрагировали 4,5 л гексана при 50С в течение 24 часов при использовании испарителя объемом 18 л. Затем продукт, полу-ченный экстракцией, сушили над сульфатом натрия и оставляли выпариваться. Получали 460 г остатка или кремообразного осадка.
Кремообразный осадок нагревали и переме-шивали, используя магнитную мешалку и медлен-но добавляли 460 мл метанола. Смесь кипятили с обратным холодильником при перемешивании в течение 15 минут и медленно охлаждали в течение 3-5 часов. Смесь охлаждали при 3-4°С в течение ночи и затем фильтровали и дважды промывали 150 мл холодного метанола. Наконец, смесь вы-держивали в вакууме в течение 2 дней, получая 100 г смеси с чистотой 82% (то есть, 82 г фитосте-ролов).

ПРИМЕР 2 - Оценка действия композиции фи-тостерола на крысах.
Девяносто самцов крыс Wistar (80-100 г) раз-делили на 3 экспериментальных группы: исполь-зуют композицию Forbes-l; используют компози-цию Forbes-2 и используют композицию, получен-ную из соевых бобов. Тридцать крыс в каждой группе далее разделили на 5, в зависимости от режима питания, как указано в Таблице 2. Крыс содержали при чередующемся световом цикле и кормили в течение 10 дней базовым полуочищен-ным кормом (Таблица 1), дополненным различным количеством холестерина и фитостерола (Таблица 2). В каждой из 5 диетических групп 2 крысам вводили композицию Forbes-l, 2 крысам вводили композицию Forbes-2 и 2 крысам вводили фитосте-рол, полученный из соевых бобов (Sigma).

Таблица 1.
Состав исследуемого питания

Ингредиенты %
Казеин 20
Кукурузный крахмал 21,5
Сахароза 35
Фиксированное масло* 18
DL-метионин 0,5
Смесь минералов 4,00
Смесь витаминов 1,00
* Смесь масла сафлоры и свиного топленого сала в соотношении 1:3

Таблица 2.
Режим питания

Группа Добавленный к основному питанию стерол (%)
Холестерин Фитостерол
1 0 0
2 1 0
3 1 0,2
4 1 0,5
5 1 1

В конце периода кормления крысам внутри-брюшинно вводили оксид дейтерия (0,4 мл) и ли-шали пищи и воды на, по крайней мере, 2 часа. Затем крыс анестезировали галотаном. Образцы крови отбирали из сердца. Образцы печени, тонко-го кишечника и мышц быстро удаляли, взвешива-ли, помещали в жидкий азот и хранили при -80°С до определения синтеза холестерина. Общий хо-лестерин и холестерин LDL и HDL определяли при помощи стандартных наборов (Biopacific Diagnistic Inc).
Результаты действия композиций фитостеро-ла на общий холестерин, LDL и HDL холестерин представлены на Фиг.8, 9 и 10, соответственно. Из Фиг.9 очевидна эффективность Forbes-l и Forbes-2 по снижению холестерина LDL, и на Фиг.10 видно увеличение холестерина HDL, в частности под действием Forbes-l. На Фиг.8, добавление холесте-рина (диетическая группа 2) к основному пита-нию (группа 1), приводит к увеличению концен-трации циркулирующего холестерина. Прогрес-сивное добавление повышающихся количеств фитостерола (группы 3-5) приводит к нормализа-ции уровней холестерина в группах, получавших Forbes-l и Forbes-2, но не при введении фитостеро-лов соевых бобов, что определено путем регрес-сионного анализа. Фиг.9 показывает, что фитосте-ролы Forbes-l и Forbes-2 обладают лучшей эффек-тивностью по снижению холестерина LDL, чем фитостеролы соевых бобов. Фиг.10 показывает улучшенную способность предпочтительных ком-позиций настоящего изобретения в повышении HDL, в частности, Forbes-1, по сравнению с фито-стеролами соевых бобов.

ПРИМЕР 3 - Оценка действия композиций фи-тостерола на хомячках.
Настоящее исследование было проведено для изучения действия пищевых композиций фитосте-ролов настоящего изобретения на вызванное хо-лестерином, содержащимся в пище, увеличение концентрации холестерина в сыворотке у хомяч-ков.
В целом, 40 самцов хомячков (80-100 г), от-дельно размещенных в клетках из нержавеющей стали, кормили кормом для грызунов и акклима-тизировали в течение 3 дней в условиях атмосфе-ры комнаты (20-22°С, световой период 17.00 - 05.00). Затем хомячков разделили на пять групп по 8 животных в каждой и кормили в течение 34 дней основным полуочищенным кормом (Таблица 3), дополненным различными количествами холе-стерина и одной из композиций фитостерола настоящего изобретения (Forbes 3) (Таблица 4).

Таблица 3
Состав исследуемого корма

Ингредиенты весовой %
Казеин 20
Кукурузный крахмал 28
Сахароза 36,3
Кукурузное масло 5,0
Целлюлоза 5,0
DL-метионин 0,5
Смесь минералов 4,00
Смесь витаминов 1,00
Битартрат холина 0,2
Холестерин 0,025, 0,25

Таблица 4
Режим питания

Груп-
пы Холестерин, добав-ленный к контроль-ному корму Фитостерол, добав-ленный к контроль-ному корму
% %
1 0,025 нет
2 0,25 нет
3 0,25 0,25
4 0,25 0,5
5 0,25 0,1

В конце периода кормления животным внут-рибрюшинно вводили оксид дейтерия (0,4 мл) и лишали пищи и воды на, по крайней мере, 2 часа. Затем хомячков анестезировали галотаном. Об-разцы крови отбирали из сердца. Образы других тканей, включая печень, тонкий кишечник и мыш-цы быстро отделяли, взвешивали, помещали в жидкий азот и хранили при - 80°С до определения синтеза холестерина. Общий холестерин и холе-стерин LDL и HDL определяли при помощи стан-дартных наборов. Результаты статистически оце-нивали путем анализа ONEWAY, метода среднего отклонения (SYSTAT).
Хомячки, которых кормили кормом с высоким содержания холестерина, имели значительно бо-лее высокий уровень общего холестерина и холе-стерина LDL в сыворотке, чем те, которые полу-чали обычный корм с содержанием холестерина (0,025%). Добавление фитостерола в количестве 0,5% и 1% заметно снижало данное увеличение, вызванное высоким потреблением холестерина (Фиг.11 и 12). Концентрация холестерина LDL в группе 5 было ниже, по сравнению с его уровнями у хомячков, которым давали корм с нормальным содержанием холестерина (Фиг.12). Более того, наблюдалась отрицательная регрессия соотноше-ния общего холестерина и холестерина LDL уров-ня фитостерола (Фиг.13).
Добавление фитостерола призывает к не-большому увеличению HDL, но не вызывает суще-ственную разницу (Фиг.13).
ПРИМЕР 4 - Оценка действия композиции фи-тостерола на хомячков при исследовании в тече-ние 90 дней.
Шесть групп по 20 хомячков (10 самцов и 10 самок) кормили полуочищенным кормом, содер-жащим 30% жира (отношение полиненасыщен-ных/насыщенных жиров = 0,3) в течение 90 дней. Корм 1 не содержал холестерин. Корма 2-6 со-держали 0,25% (по весу) пищевого холестерина. Корма 3 и 4 содержали 0,5 и 1% фитостеролов Forbes (более, чем 90% чистоты), соответственно. Корма получали из исходных ингредиентов каж-дую неделю. Уровни жира, фитостерола и холе-стерина определяли при помощи газожидкостной хроматографии. Все животные имели свободный доступ к воде и корму в течение всего эксперимен-тального периода. Животных еженедельно взве-шивали. Каждодневный и средний за неделю при-ем пищи также определяли путем взвешивания чашек с пищей до и после каждого 24 часового периода кормления. Через 90 дней кормления жи-вотных умерщвляли при использовании галотана и отбирали образцы крови для анализов профиля липопротеина. Определяли уровни общего холе-стерина, холестерина в частицах, содержащих апоВ, и холестерина HDL, и триглицеридов. Непо-средственно перед умерщвлением определяли также скорость синтеза и абсорбции холестерина, используя способ выведения 14C-холестерина из кишечника и включения дейтерия в холестерин ткани, соответственно. Исследовали также вклю-чение фитостеролов в ткани кишечника и другие ткани. Кроме того, образцы кишечника и печени хранили для доставка в Bio-Research Laboratories в Sennevill, Quebec, для анализа на гистологию, кан-церогенность и функцию ферментов.

Результаты:
Результаты представлены на Фиг.14-18. Группы в данных Фиг. часто обозначены номером, который соответствует описанным в схеме экспе-римента. Буквы над столбцами в графической диаграмме обозначают значительные различия между группами. Там, где приведены буквы, столбцы с одинаковыми буквами не являются зна-чимо различными, тогда как столбцы с различны-ми буквами являются различными на статистиче-ском уровне р<0,05.
На Фиг.14-16 показаны данные по циркули-рующему холестерину для caмцов и самок хомяч-ков, потреблявших исследуемый корм в течение более 90 дней. Значительное влияние пола наблюдали для уровней циркулирующего общего холестерина у животных, потреблявших корм 2, основной корм, добавленный только холестери-ном, и корм 5, содержащий холестерин + фитосте-ролы соевых бобов. Хотя самки не отличались по уровню холестерина от самцов при принятии ос-новного корма (группа 1), однако проявляли силь-ный ответ на добавление только холестерина, по сравнению с самцами. Добавление фитостеролов снижает эту разницу, за исключением группы 5.
Данные по уровню холестерина, в зависимо-сти от пола, представлены на Фиг.15 и 16. Для самцов (Фиг.15) добавление только холестерина к основному корму приводит к значительному уве-личению уровня циркулирующего общего холе-стерина. Добавление фитостеролов Forbes в коли-честве 0,5% приводит к тенденции снижения уров-ня холестерина, однако, добавление фитостеролов Forbes в количестве 1% выявляет статистически значимое снижение холестерина, до, приблизи-тельно, того же уровня, как в контрольной группе, без добавления холестерина. Когда к корму до-бавляли фитостеролы соевых бобов в количестве 0,5 и 1%, заметного снижения уровня циркулиру-тощего общего холестерина у самцов не было. Для HDL наблюдали различное действие Forbes по сравнению с соевыми бобами, если кормление с Forbes не вызывает изменения уровня HDL в груп-пе, получавшей только холестерин (группа 2), то кормление соевыми бобами приводит к значитель-ному снижению уровней HDL у обеих исследо-ванных уровней (группы 5 и 6). Не наблюдали значительных различий в отношении частиц апоВ, содержащих холестерин, однако, имелась тенден-ция к снижению уровней при кормлении холесте-рином Forbes в количестве 1%, по сравнению с другими группами.
Данные для самок представлены на Фиг.16. Для общего холестерина и холестерина HDL, име-лось заметное влияние добавления только холе-стерина в пищу. Добавление любого типа источ-ника фитостерола в концентрации 1% приводит к значительному и сходному снижению концентра-ций общего холестерина и холестерина HDL. На уровни частиц, содержащих апоВ, питание не влияло.
Уровни циркулирующего триглицерида у хо-мячков, потреблявших исследуемое питание в течение 90 дней, представлены на Фиг.17. Наблю-дается увеличение уровня циркулирующего триг-лицерида у самок животных, получавших основ-ное питание, дополненное холестерином и Forbes в количестве 0,5%, по сравнению с животными, по-лучавшими только основной корм, однако, других различий у обеих полов внутри групп не обнару-жено. У самцов никакого влияния питания или тенденции к нему на концентрацию триглицеридов не обнаружено.
В общем виде, порядок результатов по иссле-дованию корма на самцах следующий:

Таблица 5

Общий
холестерин LDL HDL
Forbes 0,5% 4 2 1
Forbes 1,0% 1 1 2
Соя 0,5% 2 3-4 4
Соя 1,0% 3 4-3 3

Можно четко видеть преимущество компози-ций Forbes (настоящего изобретения). Кроме того, подобный порядок был обнаружен для соотноше-ния HDL:AпоВ у самцов (Фиг. 18):
Forbes 0,5% 2
Forbes 0,1% 1
Соя 0,5% 4
Соя 1,0% 3
Было также обнаружено, что соотношение HDL:LDL для композиций Forbes, было больше почти в два раза, чем только для одного В-ситостерола.

ПРИМЕР 5 - Действие композиции фитосте-рола на кроликов
В настоящем исследовании два кролика были изучены в течение более 43 дней в отношении действия одной из композиций настоящего изобре-тения (корм с Forbes 1%) на профили общего холе-стерина. Результаты следующие:

Таблица 6: Профили общего холестерина у кролика (мг/дл)



Дата Кролик А Кролик В
14.06.95 95 215
18.06.95 129 162
26.06.95 - начало кормления
с Forbes 1%
07.07.95 75 106
09.07.95 - начало кормления
с Forbes 1%
18.07.95 90 112
25.07.95 82 118
01.08.95 95 119
08.08.95 76 114

Можно было видеть снижение общего холе-стерина у обеих кроликов А и В в течение двух недель введения композиции фитостерола (Forbes 1%) .Данное действие продолжается даже после прекращения введения Forbes 1%. Действие компо-зиции настоящего изобретения по снижению об-щего холестерина задерживается после начальной фазы введения.

ПРИМЕР 6 - Действие композиции фитосте-рола на апо-Е дефицитных мышей.
Животные: Девятнадцать 5-ти недельных самцов апо-Е дефицитных мышей были получены от Jackson Laboratory, США. Животных случай-ным образом разделили на две группы, 9 живот-ных в контрольной группе и 10 животных в экспе-риментальной группе с Forbes. После 5 дней пери-ода адаптации у мышей отбирали кровь из хво-стовой вены в капиллярную трубку и отделяли плазму путем центрифугирования крови. Опреде-ляли липиды плазмы мышей.
Питание: Корм для мышей с низким содержа-нием жира, низким содержанием холестерина получали от Jamieson’s Pet Food Distributors Ltd., Vancouver, B.C. Фитостеролы, полученные из сос-нового масла экстрагировали из мыла соснового масла, используя способ настоящего изобретения. При помощи газожидкостной хроматографии оце-нивали чистоту и процентный состав каждого отдельного фитостерола в смеси конечного про-дукта. Конечный продукт имел до 95% чистоты и содержал 69% ситостерола, 15% кампестерола и 16% стигмастенола. Корм для мышей размололи до состояния мелкого порошка. К этому порошку добавляли 0,01-5% (по весу) холестерин (Sigma) и хорошо перемешивали. Часть данного дополнен-ного холестерина корма повторно гранулировали, сушили и использовали для кормления контроль-ной группы мышей, а к другой его части добавили 2% (по весу) фитостеролов, экстрагированных из соснового масла, повторно гранулировали, суши-ли и использовали для кормления эксперимен-тальной группы мышей.
Биомедицинское исследование: Уровень об-щего холестерина плазмы и триглицерда опреде-ляли при помощи ферментативного набора (Boehringer Mannheim), а холестерин HDL, ранее опубликованным способом, с использованием полиэтиленгликоля 6000.
Вес тела и потребление пищи. Вес тела мы-шей и потребление пищи измеряли еженедельно.

Таблица 7: Средний вес тела мышей (г), (представлены только ежемесячные измерения).

Дата Группа Forbes Контрольная группа
20.06.95 21,42 21,02
24.07.95 29,82 28,00
22.08.95 32,12 29,73
12.09.95 34,16* 30,78
*p<0,05

Таблица 8: Среднее еженедельное потребле-ние пищи мышами (г), (представлены только изме-рения за месяц)

Дата Группа Forbes Контрольная группа
26.06-03.07.95 19,61 21,21
01.08-08.08.95 32,62* 29,20
15.08-22.08.95 29,32 27,10
05.09-12.09.95 35,56 30,25
*p<0,05

Другие обнаружения: В отношении нового корма никаких побочных эффектов не обнаруже-но. Все животные из обеих групп выглядели нор-мальное имели нормальное поведением, включая нормальное в отношении пище. Одна мышь из контрольной группы была обнаружена мертвой 11.07.95. Поскольку вес тела не был сохранен, аутопсию не проводили. У другой мыши из группы Forbes была обнаружена дегидратация с потерей веса. Животное было умерщвлено и причиной его заболевания была обнаружена аномалия прикуса (избыточный рост зубов).
Статистический анализ: Результаты анали-зировали, используя t-тест для двух образцов, предполагающий равные средние отклонения.
Результаты:
Результаты, полученные к настоящему вре-мени, суммированы в следующих Таблицах.

Таблица 9: средний уровень общего холесте-рина в плазме мышей (мг/дл).

Дата Группа Forbes Контрольная группа
20.06.95 606,28 599,61
18.07.95 1027,96* 1622,56
06.09.95 1168,57* 1508,63
*p<0,0001

Таблица 10: Средние значения уровня триг-лицерида в плазме (мг/дл).


Дата Группа Forbes Контрольная группа
20.06.95 110,97 120,31
18.07.95 210,17 143,71
06.09.95 224,48 152,25

Таблица 11: Средние значения уровня холе-стерина HDL (мг/дл).

Дата Группа Forbes Контрольная группа
08.07.95 42,00* 18,29
*p<0,001

Данные результаты показывают, что группа, принимающая композицию Forbes, проявляет зна-чительное (33%) снижение общего холестерина, незначительное увеличение триглицеридов и зна-чительное увеличение холестерина HDL (>100%).

ПРИМЕР 7 - Действие композиции фитосте-ролов на хомячков - 45-и дневное исследование.
Пятьдесят хомячков GS выдерживали в тече-ние двух недель в помещении для ухода за живот-ными перед началом кормления полуочищенным кормом в течение 45 дней. Их разделили на пять групп кормления с 0,25% холестерином и смесями с одним из четырех растительных фитостеролов: из соевых бобов, соснового масла, чистого сито-станола и искусственной смеси, представляющей фитостеролы соснового масла. Контрольная груп-па получала только 0,25% холестерина. Потреб-ление пищи регистрировали в течение периода исследования на каждый третий день. Вес тела измеряли каждую неделю и во время сбора образ-цов ткани. За три дня до умерщвления хомячков GS слегка анестезировали диэтиловым эфиром и через яремную вену вводили 0,4 мл Intralipid, со-держащего 0,18 мг 13С-холестерина. Сразу после инъекции животных кормили через желудочный зонд 0,6 мл смесью липидов (кокосового, оливко-вого и подсолнечного масла), содержащих 0,44 мг 13С-холестерина. Затем хомячков GS содержали в их проволочных клетках в течение 72 часов, обес-печивая водой и пищей по потребности.
В день умерщвления каждому хомячку GS в/б вводили 1 мл дейтерированной воды и оставляли на один час перед умерщвлением. Животных ане-стезировали диэтиловьм эфиром и отбирали об-разцы крови путем кардиопунктуры. Собирали печень и желчный пузырь, тонкий кишечник, тол-стый кишечник и сердце, замораживали жидким азотом и хранили замороженными при -80°С. Их трупы и фекалии хранили при -20°С для дальней-шего анализа липидов и стеролов.

Измерение потребления пищи, веса тела и печени:
Потребление пищи хомячками измеряли каж-дые три дня. Статистический анализ не показал существенных различий среди пяти групп в по-треблении пищи. Среднее дневное потребление пищи в пяти группах варьировалось от 8,84 до 9,34 г в день, значение p=0,4. Животные имели значительное увеличение веса тела с, около, 25 до 40 г в течение периода исследования, значение р<0,05 (парный t-тест). Конечное измерение веса тела было в интервале от 112,5 до 154,3 г. Ника-кой статистической значимости не было отмечено среди различных обработанных групп, значение р=0,43.
Вес печени значительно различался среди различных групп. Группа, получавшая ситоста-нол имела самый низкий вес печени по сравнению с контрольной и другими группами, получавшими 0,25% холестерина, и различные фитостеролы, соответственно. Кроме того, группа, получавшая соевые бобы, показала значительную разницу, подобную разнице группы, получавшей только ситостанол, при статистическом анализе данных при использовании Newman-Keuls теста. В целом, все группы, получавшие растительные стеролы, имели более низкий вес печени, по сравнению с контрольной группой, получавшей один холесте-рин, значение p=0,01. Хомячки GS, получавшие стеролы масла сосны и ситостанол, имели в сред-нем вес печени на 15% и 20% меньше, чем кон-трольная группа, соответственно. Природное мас-ло сосны и искусственно приготовленное масло сосны имели сходные значения по весу печени, что позволяет предположить, что соединение, отсутствующее в соевых бобах, растительный стерол ситостанол играет важную роль в сниже-нии содержания стерола в печени.

Анализ липидов: I. Общий холестерин:
Величину общего холестерина определяли, используя стандартный набор ферментативных реактивов на автоанализаторе VP. Образцы крови исследовали дважды и в окончательном статисти-ческом анализе использовали среднее значение из двух. Для анализов различных липидов использо-вали методы Newman- Keuls и Bonferroni по спо-собу АNOVA. Ситостанол значительно на 34% понижал уровни общего холестерина в плазме хомячков GS по сравнению с контролем. Среднее значение для контрольной группы составляло 226,9 мг/дл, и для одной из групп, принимающей ситостанол составляло 151,2 мг/дл, значение p=0,007. Фитостеролы масла сосны и смеси искус-ственного масла сосны показывают сходное сни-жение холестерина в плазме (17,5%), 118,4 мг/дл и 186,1 мг/дл, соответственно. Однако, если исклю-чить из анализа значение одного из образцов, выходящих из шкалы, фитостеролы масла сосны (Forbes) проявляли значительное снижение значе-ния общего холестерина (175,2 мг/дл), значение р<0,02 в группе масла сосны, в сравнении с кон-трольной (только 0,25% холестерин) группой. Корреляция между присутствием ситостанола и низким уровнем плазмы было значительным, зна-чение p<0,0001, и r=0,46.

II. Холестерин HDL:
Доля апоА липопротеинов, присутствующих в холестерине HDL, не имеет никаких существен-ных изменений своего значения из пяти различных групп, значение p=0,18. Наблюдалось значитель-ное снижение на 15% среднего значения HDL в группе, получавшей ситостанол. Тем не менее, данный элемент не оказывает действия на значи-тельное снижение общего холестерина, которое составляло 34%. Отношение не апоА липопротеи-нов к апоА. липопротеинам (HDL) существенно не изменялось между группами. Запутывающее дей-ствие по незначительному снижению значения HDL в группах, получающих ситостанол и масло сосны, вносит вклад в получение несущественного результата в величине соотношения не апоА/апоА (HDL) В общем, различные типы фитостеролов несущественно изменяют уровень холестерина HDL в плазме хомячков GS.

III. LDL и/или не апоА стеролы.
Ситостанол проявляет эффективность по снижению не апоА стеролов в плазме. Было пока-зано снижение на 55% не апоА липопротеинов, значение p=0,02. Подобно их действию на общий холестерин, масло сосны и искусственная смесь масла сосны снижали уровень не АпоА стеролов на 21%, соответственно, что снова свидетельству-ет о имеющейся строгой корреляции между со-держанием систостанола в фитостеролах и их полезным действием по снижению уровней холе-стерина в плазме хомячков GS. Однако, данное снижение не было статистически значимым из-за вариабельности значений триглицерида.

IV. Триглицерид:
При использовании метода ANOVA для опре-деления величины триглицерида, они не подходи-ли для нормального теста. Хомячков GS забивали в условиях отсутствия голодания (важное состоя-ние для будущего анализа синтеза холестерина, кинетики и абсорбции). Из-за подобной ситуации, различные значения выпадали из шкалы. Соглас-но ANOVA по Ranks, уровни триглицерида не показывают какого-либо статистического разли-чия среди групп. Растительные стеролы не влияли на уровень триглицерида в плазме у хомячков GS.



Таблица 12: Ряд эффективности

Общий холестерин HDL LDL ТГ
Контроль С С С С
-ситостанол соевых бобов 4 1 3-4 1-4
Масло сосны
(Forbes) 2-3 2-2 2-3 1-4
Сигмастанол 1 4 1 1-4
Искусственное масло сосны 3-2 3-2 4-3-2 1-4

В заключение композиция по маслу сосны, полученная из мыла настоящего изобретения име-ет наиболее предпочтительный профиль, благода-ря увеличению холестерина HDL и снижению общего холестерина. Это действие на HDL не наблюдается у искусственной композиции масла сосны. Подобным образом, общее действие систо-станола не благоприятно, благодаря значительно-го увеличения HDL.
Хотя окончательно не ясно, представляется, что в отношении растительных стеролов, относи-тельно гидрофильные стеролы в большей степени ингибируют абсорбцию общего холестерина, то-гда как относительно гидрофобные стеролы име-ют большее влияние на уровень HDL. Композиции фитостеролов настоящего изобретения являются уникальными, поскольку имеют оба данных эф-фекта.

FR 2510118, 1983
US 3965085, 1974
US 4044031, 1977
Л.ФИЗЕР, М.ФИЗЕР, “Стероиды”, Москва, “Мир”, 1964, с.363.