АНТИФИБРИНОВОЕ АНТИТЕЛО ДЛЯ ПРИМЕ-НЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОТРОМБОТИЧЕ-СКОГО СРЕДСТВА
(51) МПК: 7 A61K 39/395, C07K 16/18, A61P 9/10
Сведения о документе ▾
- (11) Номер документа
- 301
- (13) Код типа документа
- P
- (51) МПК
- 7 A61K 39/395, C07K 16/18, A61P 9/10
- (45) Дата публикации
- 06.08.2001
- Статус
- Прекратил действие
Заявка ▾
- (21) Рег. номер заявки
- 96000411
- (22) Дата подачи заявки
- 21.02.1995
- (31) Конвенционный приоритет
- 204,015
- (32) Дата подачи конв. заявки
- 24.02.1994
- (33) Страна приоритета
- US
PCT ▾
- (86) Дата заявки PCT
- 21.02.1995
- (86) Номер заявки PCT
- PCT/US 95/01825
Лица ▾
- (71) Заявитель(и)
- АМЕРИКАН БИОГЕНЕТИК САЙЕНСИЗ., ИНК., (US)
- (72) Автор(ы)
- Пол И. ГАРГАН (US)
- (73) Патентообладатель(и)
- АМЕРИКАН БИОГЕНЕТИК САЙЕНСИЗ., ИНК., (US)
Реферат
Настоящее изобретение относится к способам применения антифибринового антитела для ингибирования образования тромбов. Оно также относится к фармацевтическим композициям, а также к наборам, для применения в таких способах.
Формула изобретения
1. Способ ингибирования образования тромбов у человека, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом ингибировании, эффективного количества антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1.
2. Способ ингибирования образования тромбов у человека, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом ингибировании, эффективного количества фрагмента или производного антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, фрагмент или производное которого содержит связывающий домен указанного антитела.
3. Способ лечения человека для снижения у человека опасности постхирургических тромботических осложнений, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом ангиопластики.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом трансплантации органов.
6. Способ лечения человека для снижения у человека опасности постхирургических тромботических осложнений, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества фрагмента или производного антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, фрагмент или производное которое содержит связывающий домен указанного антитела.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом ангиопластики.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом трансплантации органов.
9. Способ лечения тромботического сосудистого заболевания у человека, включающий в себя введение человеку нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1.
10. Способ по п.9, отличающийся тем,что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой удар.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой эмболию легких.
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой тромбоз глубоких вен.
13. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой артериальный или венозный тромбоз.
14. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.
15. Способ лечения тромботического сосудистого заболевания у человека, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества фрагмента или производного антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, фрагмент или производное которого содержит связывающий домен указанного антитела.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой удар.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой эмболию легких.
18. Способ по п.15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой тромбоз глубоких вен.
19. Способ по п.15, отличающийся тем,что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой артериальный или венозный тромбоз.
20. Способ по п.15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.
21. Фармацевтическая композиция, содержащая неконъюгированное антифибриновое моноклональное антитело МН-1, продуцируемое гибридомой АТСС 9739, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом упомянутая композиция находится в стерильной форме.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая неконъюгированный фрагмент или производное антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное атитело МН-1, фрагмент или производное которого содержит связывающий домен указанного антитела, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом упомянутая композиция находится в стерильной форме.
23. Набор для лечения человека, нуждающегося в ингибировании образования тромба, при этом упомянутый набор включает в себя неконъюгированное антифибриновое моноклональное антитело МН-1, продуцируемое гибридомой AТСС 9739, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анититело МН-1, или его фрагмент или производ ное, содержащее связывающий домен указанного антитела, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом упомянутый набор находится в стерильной форме.
24. Набор по п.23, отличающийся тем, что содержит также фармацевтически приемлемый носитель, который находится в стерильной форме.
2. Способ ингибирования образования тромбов у человека, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом ингибировании, эффективного количества фрагмента или производного антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, фрагмент или производное которого содержит связывающий домен указанного антитела.
3. Способ лечения человека для снижения у человека опасности постхирургических тромботических осложнений, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом ангиопластики.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом трансплантации органов.
6. Способ лечения человека для снижения у человека опасности постхирургических тромботических осложнений, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества фрагмента или производного антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, фрагмент или производное которое содержит связывающий домен указанного антитела.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом ангиопластики.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что постхирургические тромботические осложнения являются результатом трансплантации органов.
9. Способ лечения тромботического сосудистого заболевания у человека, включающий в себя введение человеку нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1.
10. Способ по п.9, отличающийся тем,что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой удар.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой эмболию легких.
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой тромбоз глубоких вен.
13. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой артериальный или венозный тромбоз.
14. Способ по п.9, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.
15. Способ лечения тромботического сосудистого заболевания у человека, включающий в себя введение человеку, нуждающемуся в упомянутом лечении, эффективного количества фрагмента или производного антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитела, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, фрагмент или производное которого содержит связывающий домен указанного антитела.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой удар.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой эмболию легких.
18. Способ по п.15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой тромбоз глубоких вен.
19. Способ по п.15, отличающийся тем,что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой артериальный или венозный тромбоз.
20. Способ по п.15, отличающийся тем, что тромботическое сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.
21. Фармацевтическая композиция, содержащая неконъюгированное антифибриновое моноклональное антитело МН-1, продуцируемое гибридомой АТСС 9739, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело МН-1, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом упомянутая композиция находится в стерильной форме.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая неконъюгированный фрагмент или производное антифибринового моноклонального антитела МН-1, продуцируемого гибридомой АТСС 9739, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное атитело МН-1, фрагмент или производное которого содержит связывающий домен указанного антитела, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом упомянутая композиция находится в стерильной форме.
23. Набор для лечения человека, нуждающегося в ингибировании образования тромба, при этом упомянутый набор включает в себя неконъюгированное антифибриновое моноклональное антитело МН-1, продуцируемое гибридомой AТСС 9739, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анититело МН-1, или его фрагмент или производ ное, содержащее связывающий домен указанного антитела, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом упомянутый набор находится в стерильной форме.
24. Набор по п.23, отличающийся тем, что содержит также фармацевтически приемлемый носитель, который находится в стерильной форме.
Описание
1. Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к спосо-бам применения антифибринового антитела для ингибирования in vivo образования тромбов. Оно также относится к фармацевтическим композици-ям для применения в таких способах.
2. Предпосылки создания изобретения
2.1. Образование тромбов при заболевании или хирургическом вмешательстве
Сгустки крови, или тромбы, образуются в ме-стах повреждения кровеносных сосудов. Клиниче-ские проявления патологического тромбообразо-вания или тромботического заболевания являются исключительно разнообразными, и включают тромбоз глубоких вен (DVT) и артериальный и венозный тромбоз. Тромбоэмболия и тромботиче-ские осложнения иного сосудистого заболевания (например, атеросклероза) могут привести в ре-зультате к закупорке основных артерий, что ведет к ишемии органов и сопутствующим опасным для жизни состояниям, таким как инсульт (удар), ин-фаркт миокарда, и т.п.
Кроме того, инвазивные хирургические про-цедуры, включая, но не ограничиваясь ею, бал-лонную ангиопластику, и пересадка органов (как естественных, так и искусственных) могут вызы-вать образование тромбов. Например, при бал-лонной ангиопластике - процедуре, применяемой для очистки закупоренных артерий, действитель-но может быть повреждена стенка артерии, что вызывет реокклюзию посредством осаждения но-вого тромба. Сообщается, что чрез кожная транслюминальная коронарная ангиопластика оставляет сосуд пораженным за счет реокклюзии с частотой 25-35%. (Gimple, L. w., et al., Circulation, 86: 1536-46 (1992). См. также Sarembock, I. J. et al., Circulation, 80: 1029-40 (1989); и Ip J.H., et al., JACC 17: 77В-88В (1991). Действительно, в одном сообщении утверждается, что “механизм ангио-пластики, включающий, в большинстве случаев, эндотелиальное повреждение и разрушение тром-боцитов или расслоение, весьма подобен процес-су, который ведет к острым ишемическим синдро-мам”. Tenaglia, A.N., Ann. Rev. Med., 44: 465-79, 466 (1993).
Так как показано, что системное лечение ан-тикоагулянтами, такими как гепарин и кумарин, для предотвращения постангиопластической ре-окклюзии (Ip, J.H. et al., JACC, 17: 77В-88В (1991)), имеет небольшой эффект или вовсе его не имеет, и так как такое лечение антикоагулянтами часто несет опасность общего кровотечения у пациентов (Physicians’ Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993)), были бы полезны новые сайт-специфические способы лечения, когда обра-зование тромбов ингибируется или их образова-нию ставится препятствие, как в случае доклини-ческого сосудистого заболевания, так и в случае инвазивных хирургических процедур.
2.2. Система гемостаза
Механизм гемостаза, посредством которого образуется тромб, представляет собой комплекс-ный физиологический реактивный механизм, включаемый при восстановлении повреждения травмированного кровеносного сосуда. См. Harker, L.A., and Mann, K.G., “Thrombosis and Fi-brinolysis” b Thrombosis in Cardiovascular Disorders, Euster, v. and verstraete, M. (eds), W.B. Saunders Co. (1992), pp.1-16.
Гемостаз достигается при совместном взаи-модействии стенки поврежденного кровеносного сосуда, тромбоцитов и коагуляционной системы. см. Furil, B. and Furil, B.C., Cell, 53: 505-18 (1988).
Роль коагуляционной системы состоит в предоставлении нерастворимой фибриновой мат-рицы для стабилизации и закрепления тромбоци-товой пробки, которая собирается на субэндоте-лиальной структуре поврежденного сосуда в ме-сте повреждения. Коагуляция является процессом амплификации, включающим последовательность ферментных реакций, в которых проферменты (факторы свертывающей системы крови) последо-вательно активируются с образованием активных ферментов. Образование фибриновой матрицы из циркулирующего фибриногена является результа-том этой каскадной последовательности фермент-ных реакций, в результате которых в требуемом месте быстро образуется фермент тромбин, с по-мощью которого происходит конверсия фибрино-гена до фибрина, и фибрин сшивается фактором ХIIIа, за счет чего образуется тромб.
Последовательность реакций можно упро-щенно представить с помощью следующего трех-стадийного процесса.
Тромбин
Стадия 1
- Протеолиз: фибриноген
Мономеры фибрина (Des AA, Des AABB)
+ FPA и FPB
Стадия 2
- Полимеризация: Мономеры фибрина
Растворимые полимеры фибрина
(несшитые и сшитые)
Стадия 3
- Коагуляция: Растворимые полимеры
фибрина
Нерастворимый фибриновый сгусток
Фибриноген состоит из трех пар неидентич-ных полипептидных цепей A, B и . См. L. Stryer, Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman and Company New York (1988) p.249. На начальной стадии, ко-гда фибриноген превращается в фибрин, что пока-зано выше на стадии 1, фибриноген расщепляется тромбином с выделением фибринопептида А (FРА) из амино-концевых окончаний двух фибриноген-ных А-цепей. Остающаяся часть молекулы фиб-риногена представляет собой “мономер фибрина”, обозначаемый DES AA. Как также показано на стадии 1, тромбин одновременно (но не медлен-нее) также отщепляет фибринопептид В (FРВ) от амино-концевых окончаний двух фибриногенных В-цепей. Остающаяся часть молекулы фибрино-гена после второго отщепления также представля-ет собой мономер фибрина, обозначаемый DesAABВ. B результате выделения FРА и FРВ на - и -цепях мономера фибрина выявляются новые амино-концевые окончания. Cм. W. Nieuwenhuizen, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4:93-96 (1993). На стадии 2 мономеры фибрина самопроизвольно начинают образовывать межмономерные некова-лентные связи (несшитые) с образованием раство-римого полимера. Фактор ХIIIа действует на этот полимер посредством ферментативного добавле-ния ковалентных поперечных связей между звень-ями мономера фибрина. Сшитый полимер может оставаться растворимым, но в определенный мо-мент в процессе полимеризации и сшивания фиб-риновый полимер становится нерастворимым, образуя фибриновый сгусток, как указывается на стадии 3.
Растворимые полимеры фибрина являются промежуточными предшественниками фибриново-го сгустка. В результате, полагают, у индивидуу-мов с надвигающимся или существующим тромбо-зом уровень растворимых полимеров фибрина в плазме повышается. Показано, что обнаружение и измерение количества этих полимеров в крови, в частности, растворимых полимеров фибрина Des AABB полезно в качестве указания на начинаю-щееся образование сгустка крови. Cм. Nieuwenhuizen, p.94; и Marder et al., патент США № 5206140.
2.3. Антитела для компонентов гемостатиче-ской системы
Как встречающиеся в природе, так и выра-щенные в лаборатории антитела играют некото-рую роль в характеризации компонентов гемоста-тической системы и в разъяснении их функций.
Marciniak, E, and Greenwood, M.F., Blood, 53; 81-82 (1979) описывают пример ингибитора свер-тывания крови в сыворотке 14-летнего пациента с синдромом Дауна, который присутствовал в IgG -фракции, и который ингибировал ферментное вы-деление фибринопептида А из фибриногена. Hoots, W.K., et al, New Eng. J. Med., 304: 857-61 (1981), описывают случай 13-летнего пациента, страда-ющего от активного гепатита, а также от наруше-ния коагуляции, при котором нарушение обнару-живалось по присутствию антител в крови паци-ента, что отражает высокую аффинность как к фибриногену, так и к фибрину, и которые ингиби-ровали полимеризацию мономеров фибрина, предотвращая, таким образом, образование фиб-ринового геля.
Sola, B, et al., Thromb Res., 29: 643-53 (1983), описывают создание линии гибридомных клеток, секретирующих моноклональные антитела, спе-цифические как для фибриногена человека, так и для фибрина. Elms, M.J., et al., Thromb Haemostas, 50: 591-94 (1983), описывают получение линии гибридомных клеток, секретирующих монокло-нальные антитела, которые распознают антиген-ную детерминанту в D-димере - специфический фрагмент, являющийся результатом разрушения сшитого фибрина, Hui, K.Y., et al., Science, 222: 1129-32 (1983), и Sheefers - Borchel, U. et al., Proc, Natl Асаd, Sci. USA., 82: 7091-95 (1985), описыва-ют применение антигенов синтетических гекса-пептидов, представляющих собой амино-концы - и - цепи, соответственно, человеческого фибри-на, для получения моноклональных антител, ко-торые связываются с фибрином даже в присут-ствии фибриногена. Kudryk. B et al., Mol. Jmmunol., 21" 89-94 (1984), описывают получение линии гибридомных клеток, секретирующих монокло-нальные антитела для N - DSK - части фибриноге-на. Sobel, J.H., et al., Thromb and Haem., 60: 153-59 (1988), описывают применение двух различных моноклональных антител, которые связываются с фрагментами CNBr A- цепи фибриногена, для исследования одних из первых событий пере-крестного связывания между соседними молеку-лами фибрина. Mirshaahi, et al., Fibrinogen, 4: 49-54 (1990), описывают получение линии гибридомных клеток, которые секретируют моноклональные антитела для фибриногена, которые способны ингибировать полимеризацию фибрина. Cierniewski, C.S., and Budrynski, A.Z., Biochemistry, 31: 4248-53 (1992), описывают получение и при-менение поликлональных и моноклональных ан-тител, направленных против очищенного челове-ческого фибриногена, которые тормозят интенсив-ность полимеризации мономеров фибрина, и также препятствуют воздействию тромбина на фибрино-ген. Tymkewycz, P.M., et al., Blood Coag and Fibrinol., 4: 211-21 (1993), описывают получение пяти моноклональных антител с высокой аффино-стью к фибрину, которые не реагируют с фибрино-геном. Gargan, P.E., et al., Fibrinolysis, 7: 275-83 (1993), описывают создание линии гибридомных клеток - МН-1, которая продуцирует монокло-нальные антитела, специфические как к сшитой, так и к несшитой полимерной структуре фибрина, но не обнаруживающие иммунореактивности ни к фибриногену, ни к каким-либо продуктам разло-жения фибрина или фибриногена. Кроме того, антитело МН-1 не реагирует с мономерами фиб-рина Des AA или Des AABB, и не является сколь-ко-нибудь реактивным в отношении отдельных -, -или -цепей фибриногена.
Для дальнейшего обсуждения применения моноклональных антител, специфических к ком-понентам системы гемостаза, см. Kudryk, B. J., et al., “Monoclonal Antibodies as Probes for. Fibrin (ogen) Proteolysis” b Monoclonal Antibodies in Jmmunoscintigraphy, Chatal, J-F (ed), CRC Press, Boca Raton, El (1989), pp. 365-398.
Разработаны модифицированные антитела для гемостатических компонентов для клиниче-ского применения в качестве средств для сцинти-графии тромбов in situ. Cм., например, Liau, C-S, and Su, C-T, J. Form Med Assoc, 88: 209-12 (1989); Wasser, M. N. J. M., et al., Blood, 74: 708-14 (1989); Walker, K.Z., et al., Eur. J. Nucl. Med., 16: 787-94 (1990); Alavi, A., et al., Radiology, 175: 79-85 (1990); Wasser, M. N. J. M., et al., Thromb. Res., Supp. X: 91-104 (1990); u kanke, M., et al., J. Nucl. Med., 32: 1254-60 (1991).
Разработаны для терапевтического примене-ния антитела к фибрину, конъюгированному с тромболитическими ферментами. Cм., например, Bode, C., et al., Science, 229: 765-67 (1985). Соглас-но этому сообщению, сайт-специфическая достав-ка тромболитического средства обладает значи-тельно возросшей эффективностью средства при разрушении сгустков.
Наконец, опубликовано несколько патентов США, относящихся к получению и/или способам применения моноклональных антител, специфиче-ских к фибриногену, или к продуктам его разру-шения. Cм. Патенты США №№ 4722903, 4758524 и 4916070 - перечень, не являющийся исчерпываю-щим.
2.4. Способы предупреждения образования тромбов
Противотромботическое лечение обычно включает введение одного или нескольких анти-коагулянтов, таких как гепарин или кумарин. Phy-sicians’ Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993); The Merk Manual of Diagnostics and Therapy, 15th Ed., Merk Sharpe & Dohme Research Labs (1987). Такие антикоагулянты часто приме-няются при попытке предотвратить рецидивиру-ющий тромбоз у пациентов, страдающих от сосу-дистого заболевания, и при попытке предупредить острую тромботическую реокклюзию после ан-гиопластики.
Основным недостатком применения таких си-стемных антикоагулянтов является опасность системного кровотечения. Лечащие врачи преду-преждают, что “у пациентов, получающих гепа-рин, кровотечение может произойти фактически в любом месте”. Physicians’ Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993), p.2568.
Кроме того, показано, что эффективность та-ких антикоагулянтов при предупреждении реок-клюзии после ангиопластики либо не отличается от эффективности обработки плацебо, либо явля-ется невоспроизводимой. (Ip, J.H., et al., JACC, 17: 77B-88B (1991)). Соответственно, преимущества при применении таких антикоагулянтов нейтрали-зуются как опасностью кровотечения, так и их сомнительной эффективностью в предупреждении реокклюзии.
Многие биологические и механические под-ходы использовались при попытках уменьшить степень реокклюзии после ангиопластики, но ле-чение не показывало устойчивых положительных результатов. Соответственно, имеется возрастаю-щий интерес к “сайт-специфической” или “направленной” доставке противотромботических средств к местам повреждения сосудов. Gimple, L. W., et al., Circulation, 86: 1536-46 (1992).
Сайт-специфическая доставка противотром-ботических средств с использованием антител для соответствующих компонентов гемостатической системы должна служить локализации таких средств в месте повреждения сосуда. Одно из преимуществ такой локализации состоит в том, что потребуется меньшая вводимая доза. Другим преимуществом локализации должно быть умень-шение опасности системного кровотечения.
В ряде случаев показано, что антитела для специфических компонентов гемостатической системы сами ингибируют полимеризацию фибри-на. Francis, S.E., et al., Am. J. Hem., 18: 111-19 (1985), описывают исследования моноклонально-го антитела, созданного против фибриногена, которое обладало “умеренной” антикоагулирую-щей активностью. Mirshahi, M., et al., Fibrinogen, 4: 49-54 (1990), описывают получение линии гибри-домных клеток, секретирующих моноклональные антитела, в которых антиген представлял собой фрагмент D-продукт плазминного разрушения фибриногена. Эти моноклональные антитела энергично реагировали с фибриногеном и ингиби-ровали полимеризацию фибрина. Сiernewski, C.S., and Budrynski, A.Z., Biochemistry, 31: 4248-53 (1992), описываит получение трех различные ли-ний гибридомных клеток, в которых антиген явля-ется естественным человеческим фибриногеном, и которые секретируют моноклональные антитела, подавляющие интенсивность полимеризации фиб-рина.
Однако, при разработке сайт-специфи-ческого лечебного или профилактического проти-вотромботического средства все эти три сообще-ния являются малополезными или вовсе бесполез-ными. Это действительно так, поскольку во всех упомянутых случаях антитела являются пере-крестно-взаимодействующими либо с фибриноге-ном, либо с продуктами разложения фибриногена, которые все являются убиквитарными для гемо-статической системы. Любое такое антитело, вве-денное пациенту, должно тесно связываться с фибриногеном или с продуктами разрушения фиб-риногена, и не будет способно ингибировать по-лимеризацию фибрина или образование тромбов в месте повреждения кровеносного сосуда.
Настоящее изобретение дает возможность совершенно иного подхода к проблеме ингибиро-вания образования тромбов, используя монокло-нальные антитела, которые являются фибрин-специфическими (антифибриновыми) (т.е., без су-щественного перекрестного взаимодействия с фибриногеном или с продуктами, образованными при плазминном разрушении фибриногена или фибрина). Настоящее изобретение относится к способу применения упомянутых антифибрино-вых моноклональных антител, при котором, на удивление, ингибируется образование тромбов в месте повреждения кровеносного сосуда.
3. Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относитя к способу ингибирования образования тромба в месте по-вреждения кровеносного сосуда у человека, нуж-дающегося в таком ингибировании, посредством введения антифибринового моноклонального ан-титела. Настоящее изобретение также относится к фрагментам или производным антифибринового моноклонального антитела, и упомянутые фраг-менты и производные содержат связывающий домен антитела. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, со-держащей антифибриновое моноклональное анти-тело, или его фрагмент, или его производное, и фармацевтически эффективный носитель, которая, в достаточном количестве, является эффективной при ингибировании образования тромба у челове-ка. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим наборам, содержащим один или несколько ингредиентов фармацевтической композиции изобретения.
4. Краткое описание рисунков
Рисунок 1. Включение моноклонального ан-титела МН-1 в реакционную смесь фибриноген-тромбинной коагуляции ингибирует как степень, так и абсолютную величину коагуляции. Кон-трольными реакционным смесями являются реак-ционные смеси “фибриноген” и “45J”.
Рисунок 2. Включение увеличивающегося ко-личества моноклонального антитела МН-1 в ре-акционную смесь фибриноген-тромбинной коагу-ляции приводит в результате к возрастающему уровню ингибирования коагуляции. Контрольной реакционной смесью является “фибриноген”.
5. Подробное описание изобретения
5.1. Полезность настоящего
Как ни удивительно, но обнаружено, что ан-тифибриновое моноклональное антитело может ингибировать полимеризацию фибрина и образо-вание тромбов. Таким образом, антифибриновые моноклональные антитела могут использоваться для предупреждения или лечения любого состоя-ния у человека, которое поддается профилактике или лечению посредством ингибирования полиме-ризации фибрина или образования тромбов. Например, антифибриновые моноклональные антитела являются полезными при лечении людей, страдающих от какого-либо сосудистого заболе-вания, которое несет с собой опасность патологи-ческого тромбоза. Примерами, которыми не огра-ничивается перечень таких сосудистых заболева-ний, являются тромбоз глубоких вен (DVT), арте-риальный и венозный тромбозы, удар, тромбоэм-болия, эмболия легких и тромботические ослож-нения при атеросклерозе.
Антифибриновые моноклональные антитела также полезны, например, при лечении людей, которых готовят к инвазивным хирургическим процедурам, во время или при восстановлении после этих процедур. В описании настоящего изобретения термин “инвазивная хирургическая процедура” относится к любой хирургической процедуре, которая может привести в результате к повреждению артериального или венозного кро-веносного сосуда, что может привести к тромбо-тическим осложнениям. Примерами, которые не ограничиваются такие процедуры, являются бал-лонная ангиопластика и пересадка органов (как природных, так и искусственных).
Кроме антифибриновых моноклональных ан-тител, могут быть созданы известными техниче-скими приемами фрагменты антител, которые содержат идиотип (связывающий домен) анти-фибринового антитела. Например, такие фрагмен-ты включают, но не ограничиваются ими, (1) F(ав)2-фрагменты, которые могут быть получены пепсиновым перевариванием молекулы антитела; (2) Fав-фрагменты, которые могут быть получены восстановлением дисульфидных мостиков F(ав)2-фрагментов; и (3) Fав-фрагменты, которые могут быть получены путем обработки молекулы анти-тела лапанном и восстановителем. Такие фраг-менты антител входят в объем настоящего изобре-тения. Для ознакомления с другими примерами получения и применения фрагментов антител см. Parham, P., et al., J. Jmmunol. Meth, 53: 133 (1982); и Khaw, B-A, et al., J. Nucl. Med, 34: 2264-68 (1993).
Кроме антифибриновых моноклональных ан-тител и фрагментов антител, могут быть получены известными техническими приемами другие про-изводные антител, которые содержат идиотип (связывающий домен) антифибринового антитела. Например, могут быть синтезированы рекомби-нантные и синтетические олигопептиды и их ана-логи, которые оказывают такое же ингибирующее действие на образование тромбов, как антифибри-новое моноклональное антитело или его фрагмен-ты. Такие производные включаются в объем настоящего изобретения. По поводу других при-меров применения синтетических олигопептидов с последовательностями на основе области первич-ного связывания моноклонального антитела см. Knight, L., et al., J. Nucl. Med, 35: 282-88 (1994).
Наконец, в объем настоящего изобретения входит любое функционально эквивалентное ан-тифибриновое антитело, его фрагмент или произ-водное. Термином “функционально эквивалент-ное” обозначается любое антифибриновое анти-тело, или его фрагмент, или его производное, ко-торые способны в достаточной степени ингиби-ровать образование тромбов у человека, нужда-ющегося в таком воздействии, посредством связы-вания с тем же эпитопом, с которым связывается антитело МН-1.
5.2. Получение и характеристика монокло-нального антитела МН-1
Многие из прежних подходов, принятых для выращивания антифибриновых антител, сосредо-точивались на иммунизации животных раствори-мыми фрагментами фибрина и синтетическими пептидами, которые имитируют доступные неоан-тигенные участки на фибрине. Cм. Hui, K.Y., et al., Science, 222: 1129-32 (1983); Sheefers - Borchel, V., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7091-95 (1985); Elms, et al., Thromb Haemostas, 50: 591-94 (1983), и Kudryk, B., et al., Mol. Jmmunol, 21: 89-94 (1984). Однако, предполагается, что связывающий сайт таких антител сохраняется во время процесса разрушения фибрина, и, следовательно, такие антитела также могут связываться с продуктами разрушения фибрина.
Патент США № 5120834 (далее обозначае-мый здесь “патент 834”), Gargan et al., выданный 9 июня 1992, который включается в настоящее в качестве ссылки, относится, главным образом, к способу получения моноклональных антител от стерильных животных посредством иммунизации упомянутых животных выбранным антигеном. Полагают, что преимущество использования сте-рильной системы, с которой получают монокло-нальные антитела, состоит в том, что такая систе-ма будет проявлять весьма усиленный иммунный отклик на антиген, увеличивая вероятность опре-деления местонахождения лимфоцита, который продуцирует антитело, способное к связыванию со специфическим эпитопом антигена. Установле-но, что такая система является особенно пригод-ной для создания высоко специфического антите-ла к фибрину, которое имеет небольшое пере-крестное взаимодействие с фибриногеном или не имеет его. Выращивание такого выбирающего антитела являлось проблематичным, так как име-ется оценка, что структурные и конформационные подобия между фибрином и фибриногеном превы-шают 98% (Plow, E.F., et al., Semin Thromb Haemostas, 8: 36 (1982). В результате, только не-большой процент эпитопов на молекуле фибрина в действительности являются неоантигенами (т.е., единственно для фибрина).
Патент 834 относится к линии гибридомных клеток АТСС №. НВ 9739, секретирующих мо-ноклональное антитело МН-1. Моноклональное антитело МН-1 является специфическим к сшитым и несшитым полимерам фибрина, но не реагирует перекрестно с фибриногеном или с продуктами плазминного разрушения фибриногена или фиб-рина.
МН-1 очищают в соответствии с процедура-ми, описанными в патенте 834. МН-1 специфиче-ски связывается с фибрином и не реагирует пере-крестно с фибриногеном при конкурентном анали-зе. МН-1 не реагирует перекрестно ни с какими-либо продуктами, образовавшимися при плазмин-ном разрушении фибриногена, ни с какими-либо продуктами, образовавшимися при плазминном разрушении фибрина. В результате, можно заклю-чить, что (1) МН-1 распознает эпитоп интактной молекулы фибрина, который не присутствует или не открывается на поверхности молекулы предше-ственника - фибриногена; и (2) эпитоп явно разру-шается за счет переваривания плазмином сшитого фибрина.
Кроме того, МН-1, для определения аффин-ности МН-1 к фибрину, описывается с помощью анализа Scatchard (Frankel, et al., Mol Jmmunol, 16: 101-6 (1979)) с применением меченого 1251 антите-ла МН-1. Величина, полученная для константы диссоциации КD, составляет 6,7 х 10-10 М, что со-ответствует аффинности в 5000 крат от аффинно-сти тканевого плазменного активатора для фибри-на.
Вестерн-иммуноблоттинг-анализ показывает, что МН-1 не реагирует перекрестно с А-, В- или -цепями фибриногена. Тот же метод показывает, что МН-1 реагирует как со сшитым фибрином, так и с несшитым фибрином, причем аффинность к сшитому фибрину является большей из этих двух величин.
5.3. Способы введения
Согласно настоящему изобретению, анти-фибриновые моноклональные антитела, или их фрагменты, или их производные, вводят человеку, нуждающемуся в лечении с ингибированием тромбообразования. Антитела, или их фрагменты, или их производные, вводят человеку, предпочти-тельно, в форме, которая является неконъюгиро-ванной с каким-либо агентом мечения радиоак-тивным изотопом, тромболитическим или иным агентом, или какой-либо иной молекулой или ее частью. Однако, способы изобретения могут быть также осуществлены с использованием антител или их производных, которые конъюгируются с радиоизотопными метками, тромболитическими или иными агентами, или с какой-либо молекулой или ее частью, и охватываются объемом настоя-щего изобретения.
Термин “носитель” относится к разбавителю, эксципиенту или наполнителю, с которыми вводят антифибриновое антитело или его фрагмент или его производное.
Термин “фармацевтически приемлемый носи-тель” означает, что носитель одобрен федераль-ными органами управления или органами управ-ления штата, или внесены в перечень фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения на животных и, конкретнее, на людях.
Термин “противотромботическая компози-ция”, который используется в настоящем изобре-тении, относится к композиции, содержащей анти-фибриновое моноклональное антитело, или его фрагмент, или его производное, и фармацевтиче-ски приемлемый носитель, которая, в достаточном количестве, может ингибировать образование тромбов у человека, нуждающегося в упомянутом ингибировании.
Термин “эффективная доза”, который исполь-зуется в настоящем изобретении, относится к ко-личеству моноклонального антитела, или его фрагмента, или его производного, которое являет-ся достаточно большим, чтобы ингибировать об-разование тромбов у человека, нуждающегося в таком лечении. Дозировка не должна быть настолько большой, чтобы вызывать вредное по-бочное действие, такое как нежелательные пере-крестные реакции, и подобное. Вообще, дозировка будет изменяться в зависимости от возраста, со-стояния, пола и тяжести заболевания пациента, противопоказаний, если они имеются, иммунной толерантности, и других подобных переменных факторов, которые устанавливаются лечащим врачом. Хотя дозировки будут изменяться в зави-симости от индивидуального набора условий, в большинстве случаев сосудистых заболеваний и в большинстве случаев хирургических вмеша-тельств доза будет определяться массой тела че-ловека, нуждающегося в лечении, находясь в ин-тервале от 1 мкг/кг массы тела до 50 мкг/кг, пред-почтительно - в интервале от 5 мкг/кг до 10 мкг/кг массы тела.
5.4. Способы введения
Антифибриновые моноклональные антитела, или их фрагменты, или их производные, могут вводиться человеку любым подходящим спосо-бом, в том числе, парентерально, в виде однократ-ной инъекции ударной дозы вещества, непрерыв-ного вливания, или посредством сочетания этих двух способов. Введение также может быть осу-ществлено посредством прямой инфузии катете-ром, такой как внутрикоронарное введение, когда это показано.
Приготовление препаратов для парентераль-ного введения включает, например, восстановле-ние лиофилизованных антифибриновых монокло-нальных антител, или их фрагментов, или их про-изводных, в стерильном, свободном от эндотокси-нов, физиологическом растворе, или, более обоб-щенно, может включать восстановление или дис-пергирование антифибриновых моноклональных антител, или их фрагментов, или их производных, в стерильных водных или неводных растворах, суспензиях или эмульсиях. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, поли-этиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водными носителями являются вода, спиртоводные раство-ры, эмульсии или суспензии, в том числе, солевые и буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактирован-ную декстрозу Рингера, или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкие и пита-тельные дополнительные вещества, такие как на основе декстрозы Рингера, и подобные. Также могут присутствовать консерванты и другие до-бавки, такие как, например, противомикробные агенты, антиокислители, хелатирующие средства, и инертные газы, и подобные добавки. Предпочти-тельно, чтобы фармацевтические композиции настоящего изобретения находились в стерильной форме, которая удовлетворяет стандартам сте-рильности, установленным управлением питания и лекарственных препаратов Соединенных Шта-тов.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим наборам, содержащим один или несколько ингредиентов фармацевтических композиций изобретения, хранящихся в одном и том же или в разных контейнерах. Может быть приложена листовка, необязательно в самом та-ком контейнере (контейнерах), по форме, предпи-санной правительственным органом, контролиру-ющим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и в этой листовке отражается разрешение органа на производство, применение или продажу для применения человеком. Могут прилагаться ин-струкции, необязательно привязанные к наборам, которые содержат только лиофилизованное анти-тело, или его фрагменты, или его производные, о носителях, которые являются подходящими для введения человеку, нуждающемуся в лечении.
Объем, продолжительность, временной режим и способ лечения будут изменяться в зависимости от возраста, массы, состояния и пола человека, нуждающегося в лечении, а также в зависимости от типа и степени заболевания, которое требуется лечить, и регулируются назначениями лечащего врача в соответствии с каждым набором условий. Лечение может назначаться непосредственно пе-ред, во время или после любой хирургической процедуры, или как перед, так и во время проце-дуры, или как во время, так и после процедуры, в зависимости от конкретного набора условий при данном случае.
Например, при хирургической процедуре, та-кой как баллонная ангиопластика, часто случает-ся, что у больного человека уже имеется большое количество значительно рассеянных кровяных сгустков. В такой ситуации, вообще, будет выгод-но ввести противотромботические композиции непосредственно после осуществления процедуры ангиопластики, используя, предпочтительно, кате-тер, пока он еще на месте, с тем, чтобы прямо про-мыть поврежденную часть кровеносного сосуда противотромботической композицией, сосредото-чивая, посредством этого, лечение в одном этом месте. Это предотвращает потерю противотром-ботической композиции, которая может происхо-дить в результате, например, связывания антитела с тромбами в незатронутых местах.
В ситуациях, включающих инвазивные хи-рургические процедуры для пациентов, не болею-щих патологическими тромбозами, вообще, будет предпочтительно вводить противотромботиче-скую композицию либо непосредственно перед процедурой, либо во время процедуры, так как существует меньший риск потери противотромбо-тической композиции за счет связывания в неза-тронутых местах.
Кроме того, в большинстве случаев, включа-ющих хирургические процедуры, время, в течение которого существует повышенная опасность об-разования тромбов, имеет тенденцию ограничи-ваться моментом завершения процедуры. В ре-зультате, достаточным для эффективного ингиби-рования образования тромбов может быть только ограниченное количество обработок, или даже одна обработка достаточной длительности, по-средством чего значительно уменьшается опас-ность коагуляции, индуцированной хирургиче-ским вмешательством, со всеми присущими ей опасностями для пациента.
В случае хронического тромботического за-болевания временной режим, продолжительность и число противотромботических обработок зави-сят, в значительной степени, от диагностики со-стояния пациента до и после лечения и его реак-ции на предварительное противотромботическое лечение, что должно определяться, контролиро-ваться и оцениваться лечащим врачом.
5.5. Определение эффективности лечения
Эффективность противотромботического ле-чения моноклональным антителом МН-1, или его фрагментом, или его производным, может быть определена стандартными способами. Примерами таких способов являются, но не ограничиваются перечисленным, (1) ангиопластический монито-ринг посредством отображения прохождения кон-трастного вещества по артерии или вене, когда появление преграды на пути контрастного веще-ства указывает на необходимость дальнейшего лечения; (2) использование сцинтиграфии с при-менением антитромбового антитела, конъюгиро-ванного с радиоизотопной меткой, когда могут быть отслежены размер и местоположение тром-ба, чтобы установить необходимость дальнейшего лечения; (3) контроль за появлением и степенью клинических симптомов, когда возрастание числа или тяжести симптомов может указать на необхо-димость дальнейшего лечения; (4) измерение уровня тромбина в крови пациента, так как суще-ствует обратное соотношение между уровнями фибриногена и фибрина, когда падение уровня фибриногена может указать на возможное соот-ветствующее увеличение уровня фибрина и поли-меризацию фибрина, указывающие на необходи-мость дальнейшего лечения.
Теперь, имея общее описание настоящего изобретения, его будет легче понять, обратившись к характерному примеру, включенному в настоя-щее описание только с целью иллюстрации, и не предназначенному для каких-либо ограничений.
5. 6. Пример: ингибирование коагуляции in vitro.
Проводят ряд экспериментов in vitro, чтобы определить влияние МН-1 на коагуляцию. Очи-щенный человеческий фибриноген (Kabi, Chromogenix Co, Ohio) растворяют в 150 мМ за-буференном фосфатом солевом растворе, при фи-зиологическом значении рН, с концентрацией 1 мг/мл, и помещают приблизительно по 100 мкл в каждую лунку титрационного микропланшета (Costar). В каждую лунку, для образования реак-ционной смеси, добавляют приблизительно по 50 мкл бычьего тромбина до конечной концентрации 0,5 единиц NIH на мл. К реакционной смеси, в нулевой момент времени, добавляют приблизи-тельно 50 мкл либо (1) моноклонального антитела МН-1, чтобы получить конечную концентрацию антитела 100 мкг/мл; либо (2) моноклонального антитела 45J (моноклональное антитело 45J, ко-торое реагирует перекрестно с фибрином и фиб-риногеном, секретируется линией гибридомных клеток АТСС № НВ 9740, которую получают обычными техническими приемами, используя традиционных мышей Ва1 b/с, когда мышей им-мунизируют фибрином), чтобы получить конеч-ную концентрацию антитела 200 мкг/мл; либо (3) физиологического раствора. Дают возможность реакции протекать в течение 60 минут при 37С. Коагуляцию определяют спектрометрически при 340 нм каждые 2 минуты. Увеличение поглощения указывает, что коагуляция прогрессирует. Окон-чание процесса свертывания можно наблюдать как плато на кривой “поглощение - время”.
Рис.1 показывает, что обработка МН-1 по-давляет скорость коагуляции, что очевидно из меньшего наклона начального участка кривой “поглощение - время” для реакционной смеси, обработанной МН-1, по сравнению либо с кон-трольной реакционной смесью с 45J, либо с кон-трольной смесью с солевым раствором (фибрино-ген). Кроме того, МН-1 уменьшает абсолютную величину коагуляции, которая имеет место, что определяется по более низкому уровню пологого участка кривой для МН-1 при сравнении с кривы-ми для контрольных реакционных смесей. Кон-трольная реакционная смесь, содержащая антите-ло 45J (при удвоенной концентрации против МН-1), не обнаруживает какого-либо ингибирования коагуляции при сравнении с контрольной реакци-онной смесью с солевым раствором. Эти данные подтверждают предположение о том, что мо-ноклональное антитело МН-1 способно ингибиро-вать образование тромбов.
Во втором эксперименте проверяют действие МН-1 при нескольких различных концентрациях на время свертывания по сравнению с контроль-ной реакционной смесью с фибриногеном. На рис.2 приводятся профили реакции коагуляции (поглощение - время) при увеличении концентра-ции МН-1 в реакционной смеси. (1:1000 = 1 мкг/мл; 1:100 = 10 мкг/мл; 1:50 = 20 мкг/мл; 1:20 = 50 мкг/мл; 1:10 = 100 мкг/мл; фибриноген = кон-троль).
5.7. Депонирование гибридомы
Линии гибридомных клеток МН-1 и 45J депо-нированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС) 9 июня 1988 под инвентарими номерами НЕ 9739 и НИ 9740, соответственно. АТСС находится по адресу; 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Антитело МН-1 представляет собой антитело IgG, с легкой каппа-цепью, и наблюдалось, что МН-1 реагирует перекрестно как с человеческим фибрином, так и с кроличьим фибрином.
Настоящее изобретение не ограничивается в объеме депонированной линией гибридомных клеток АТСС № НB 9739 или моноклональным антителом МН-1, но предполагается, что они яв-ляются отдельными иллюстрациями антифибри-нового моноклонального антитела, которое инги-бирует образование тромбов. Любое функцио-нально эквивалентное антифибриновое монокло-нальное антитело, или его фрагмент, или его про-изводное, входят в объем настоящего изобретения. Термином “функционально эквивалентное” отме-чается, что моноклональное антитело, или его фрагмент, или его производное, способно ингиби-ровать образование тромбов посредством связы-вания с тем же эпитопом, с которым связывается антитело МН-1.
Настоящее изобретение может быть осу-ществлено в иных специфических формах без от-хода от его сущности или его существенных осо-бенностей, и, соответственно, следует скорее об-ратиться к прилагаемой формуле изобретения, чем к приведенному выше описанию, как к заявлению об объеме изобретения.
Все публикации и патенты, цитированные выше, включаются в настоящее в качестве ссылок.
Настоящее изобретение относится к спосо-бам применения антифибринового антитела для ингибирования in vivo образования тромбов. Оно также относится к фармацевтическим композици-ям для применения в таких способах.
2. Предпосылки создания изобретения
2.1. Образование тромбов при заболевании или хирургическом вмешательстве
Сгустки крови, или тромбы, образуются в ме-стах повреждения кровеносных сосудов. Клиниче-ские проявления патологического тромбообразо-вания или тромботического заболевания являются исключительно разнообразными, и включают тромбоз глубоких вен (DVT) и артериальный и венозный тромбоз. Тромбоэмболия и тромботиче-ские осложнения иного сосудистого заболевания (например, атеросклероза) могут привести в ре-зультате к закупорке основных артерий, что ведет к ишемии органов и сопутствующим опасным для жизни состояниям, таким как инсульт (удар), ин-фаркт миокарда, и т.п.
Кроме того, инвазивные хирургические про-цедуры, включая, но не ограничиваясь ею, бал-лонную ангиопластику, и пересадка органов (как естественных, так и искусственных) могут вызы-вать образование тромбов. Например, при бал-лонной ангиопластике - процедуре, применяемой для очистки закупоренных артерий, действитель-но может быть повреждена стенка артерии, что вызывет реокклюзию посредством осаждения но-вого тромба. Сообщается, что чрез кожная транслюминальная коронарная ангиопластика оставляет сосуд пораженным за счет реокклюзии с частотой 25-35%. (Gimple, L. w., et al., Circulation, 86: 1536-46 (1992). См. также Sarembock, I. J. et al., Circulation, 80: 1029-40 (1989); и Ip J.H., et al., JACC 17: 77В-88В (1991). Действительно, в одном сообщении утверждается, что “механизм ангио-пластики, включающий, в большинстве случаев, эндотелиальное повреждение и разрушение тром-боцитов или расслоение, весьма подобен процес-су, который ведет к острым ишемическим синдро-мам”. Tenaglia, A.N., Ann. Rev. Med., 44: 465-79, 466 (1993).
Так как показано, что системное лечение ан-тикоагулянтами, такими как гепарин и кумарин, для предотвращения постангиопластической ре-окклюзии (Ip, J.H. et al., JACC, 17: 77В-88В (1991)), имеет небольшой эффект или вовсе его не имеет, и так как такое лечение антикоагулянтами часто несет опасность общего кровотечения у пациентов (Physicians’ Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993)), были бы полезны новые сайт-специфические способы лечения, когда обра-зование тромбов ингибируется или их образова-нию ставится препятствие, как в случае доклини-ческого сосудистого заболевания, так и в случае инвазивных хирургических процедур.
2.2. Система гемостаза
Механизм гемостаза, посредством которого образуется тромб, представляет собой комплекс-ный физиологический реактивный механизм, включаемый при восстановлении повреждения травмированного кровеносного сосуда. См. Harker, L.A., and Mann, K.G., “Thrombosis and Fi-brinolysis” b Thrombosis in Cardiovascular Disorders, Euster, v. and verstraete, M. (eds), W.B. Saunders Co. (1992), pp.1-16.
Гемостаз достигается при совместном взаи-модействии стенки поврежденного кровеносного сосуда, тромбоцитов и коагуляционной системы. см. Furil, B. and Furil, B.C., Cell, 53: 505-18 (1988).
Роль коагуляционной системы состоит в предоставлении нерастворимой фибриновой мат-рицы для стабилизации и закрепления тромбоци-товой пробки, которая собирается на субэндоте-лиальной структуре поврежденного сосуда в ме-сте повреждения. Коагуляция является процессом амплификации, включающим последовательность ферментных реакций, в которых проферменты (факторы свертывающей системы крови) последо-вательно активируются с образованием активных ферментов. Образование фибриновой матрицы из циркулирующего фибриногена является результа-том этой каскадной последовательности фермент-ных реакций, в результате которых в требуемом месте быстро образуется фермент тромбин, с по-мощью которого происходит конверсия фибрино-гена до фибрина, и фибрин сшивается фактором ХIIIа, за счет чего образуется тромб.
Последовательность реакций можно упро-щенно представить с помощью следующего трех-стадийного процесса.
Тромбин
Стадия 1
- Протеолиз: фибриноген
Мономеры фибрина (Des AA, Des AABB)
+ FPA и FPB
Стадия 2
- Полимеризация: Мономеры фибрина
Растворимые полимеры фибрина
(несшитые и сшитые)
Стадия 3
- Коагуляция: Растворимые полимеры
фибрина
Нерастворимый фибриновый сгусток
Фибриноген состоит из трех пар неидентич-ных полипептидных цепей A, B и . См. L. Stryer, Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman and Company New York (1988) p.249. На начальной стадии, ко-гда фибриноген превращается в фибрин, что пока-зано выше на стадии 1, фибриноген расщепляется тромбином с выделением фибринопептида А (FРА) из амино-концевых окончаний двух фибриноген-ных А-цепей. Остающаяся часть молекулы фиб-риногена представляет собой “мономер фибрина”, обозначаемый DES AA. Как также показано на стадии 1, тромбин одновременно (но не медлен-нее) также отщепляет фибринопептид В (FРВ) от амино-концевых окончаний двух фибриногенных В-цепей. Остающаяся часть молекулы фибрино-гена после второго отщепления также представля-ет собой мономер фибрина, обозначаемый DesAABВ. B результате выделения FРА и FРВ на - и -цепях мономера фибрина выявляются новые амино-концевые окончания. Cм. W. Nieuwenhuizen, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4:93-96 (1993). На стадии 2 мономеры фибрина самопроизвольно начинают образовывать межмономерные некова-лентные связи (несшитые) с образованием раство-римого полимера. Фактор ХIIIа действует на этот полимер посредством ферментативного добавле-ния ковалентных поперечных связей между звень-ями мономера фибрина. Сшитый полимер может оставаться растворимым, но в определенный мо-мент в процессе полимеризации и сшивания фиб-риновый полимер становится нерастворимым, образуя фибриновый сгусток, как указывается на стадии 3.
Растворимые полимеры фибрина являются промежуточными предшественниками фибриново-го сгустка. В результате, полагают, у индивидуу-мов с надвигающимся или существующим тромбо-зом уровень растворимых полимеров фибрина в плазме повышается. Показано, что обнаружение и измерение количества этих полимеров в крови, в частности, растворимых полимеров фибрина Des AABB полезно в качестве указания на начинаю-щееся образование сгустка крови. Cм. Nieuwenhuizen, p.94; и Marder et al., патент США № 5206140.
2.3. Антитела для компонентов гемостатиче-ской системы
Как встречающиеся в природе, так и выра-щенные в лаборатории антитела играют некото-рую роль в характеризации компонентов гемоста-тической системы и в разъяснении их функций.
Marciniak, E, and Greenwood, M.F., Blood, 53; 81-82 (1979) описывают пример ингибитора свер-тывания крови в сыворотке 14-летнего пациента с синдромом Дауна, который присутствовал в IgG -фракции, и который ингибировал ферментное вы-деление фибринопептида А из фибриногена. Hoots, W.K., et al, New Eng. J. Med., 304: 857-61 (1981), описывают случай 13-летнего пациента, страда-ющего от активного гепатита, а также от наруше-ния коагуляции, при котором нарушение обнару-живалось по присутствию антител в крови паци-ента, что отражает высокую аффинность как к фибриногену, так и к фибрину, и которые ингиби-ровали полимеризацию мономеров фибрина, предотвращая, таким образом, образование фиб-ринового геля.
Sola, B, et al., Thromb Res., 29: 643-53 (1983), описывают создание линии гибридомных клеток, секретирующих моноклональные антитела, спе-цифические как для фибриногена человека, так и для фибрина. Elms, M.J., et al., Thromb Haemostas, 50: 591-94 (1983), описывают получение линии гибридомных клеток, секретирующих монокло-нальные антитела, которые распознают антиген-ную детерминанту в D-димере - специфический фрагмент, являющийся результатом разрушения сшитого фибрина, Hui, K.Y., et al., Science, 222: 1129-32 (1983), и Sheefers - Borchel, U. et al., Proc, Natl Асаd, Sci. USA., 82: 7091-95 (1985), описыва-ют применение антигенов синтетических гекса-пептидов, представляющих собой амино-концы - и - цепи, соответственно, человеческого фибри-на, для получения моноклональных антител, ко-торые связываются с фибрином даже в присут-ствии фибриногена. Kudryk. B et al., Mol. Jmmunol., 21" 89-94 (1984), описывают получение линии гибридомных клеток, секретирующих монокло-нальные антитела для N - DSK - части фибриноге-на. Sobel, J.H., et al., Thromb and Haem., 60: 153-59 (1988), описывают применение двух различных моноклональных антител, которые связываются с фрагментами CNBr A- цепи фибриногена, для исследования одних из первых событий пере-крестного связывания между соседними молеку-лами фибрина. Mirshaahi, et al., Fibrinogen, 4: 49-54 (1990), описывают получение линии гибридомных клеток, которые секретируют моноклональные антитела для фибриногена, которые способны ингибировать полимеризацию фибрина. Cierniewski, C.S., and Budrynski, A.Z., Biochemistry, 31: 4248-53 (1992), описывают получение и при-менение поликлональных и моноклональных ан-тител, направленных против очищенного челове-ческого фибриногена, которые тормозят интенсив-ность полимеризации мономеров фибрина, и также препятствуют воздействию тромбина на фибрино-ген. Tymkewycz, P.M., et al., Blood Coag and Fibrinol., 4: 211-21 (1993), описывают получение пяти моноклональных антител с высокой аффино-стью к фибрину, которые не реагируют с фибрино-геном. Gargan, P.E., et al., Fibrinolysis, 7: 275-83 (1993), описывают создание линии гибридомных клеток - МН-1, которая продуцирует монокло-нальные антитела, специфические как к сшитой, так и к несшитой полимерной структуре фибрина, но не обнаруживающие иммунореактивности ни к фибриногену, ни к каким-либо продуктам разло-жения фибрина или фибриногена. Кроме того, антитело МН-1 не реагирует с мономерами фиб-рина Des AA или Des AABB, и не является сколь-ко-нибудь реактивным в отношении отдельных -, -или -цепей фибриногена.
Для дальнейшего обсуждения применения моноклональных антител, специфических к ком-понентам системы гемостаза, см. Kudryk, B. J., et al., “Monoclonal Antibodies as Probes for. Fibrin (ogen) Proteolysis” b Monoclonal Antibodies in Jmmunoscintigraphy, Chatal, J-F (ed), CRC Press, Boca Raton, El (1989), pp. 365-398.
Разработаны модифицированные антитела для гемостатических компонентов для клиниче-ского применения в качестве средств для сцинти-графии тромбов in situ. Cм., например, Liau, C-S, and Su, C-T, J. Form Med Assoc, 88: 209-12 (1989); Wasser, M. N. J. M., et al., Blood, 74: 708-14 (1989); Walker, K.Z., et al., Eur. J. Nucl. Med., 16: 787-94 (1990); Alavi, A., et al., Radiology, 175: 79-85 (1990); Wasser, M. N. J. M., et al., Thromb. Res., Supp. X: 91-104 (1990); u kanke, M., et al., J. Nucl. Med., 32: 1254-60 (1991).
Разработаны для терапевтического примене-ния антитела к фибрину, конъюгированному с тромболитическими ферментами. Cм., например, Bode, C., et al., Science, 229: 765-67 (1985). Соглас-но этому сообщению, сайт-специфическая достав-ка тромболитического средства обладает значи-тельно возросшей эффективностью средства при разрушении сгустков.
Наконец, опубликовано несколько патентов США, относящихся к получению и/или способам применения моноклональных антител, специфиче-ских к фибриногену, или к продуктам его разру-шения. Cм. Патенты США №№ 4722903, 4758524 и 4916070 - перечень, не являющийся исчерпываю-щим.
2.4. Способы предупреждения образования тромбов
Противотромботическое лечение обычно включает введение одного или нескольких анти-коагулянтов, таких как гепарин или кумарин. Phy-sicians’ Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993); The Merk Manual of Diagnostics and Therapy, 15th Ed., Merk Sharpe & Dohme Research Labs (1987). Такие антикоагулянты часто приме-няются при попытке предотвратить рецидивиру-ющий тромбоз у пациентов, страдающих от сосу-дистого заболевания, и при попытке предупредить острую тромботическую реокклюзию после ан-гиопластики.
Основным недостатком применения таких си-стемных антикоагулянтов является опасность системного кровотечения. Лечащие врачи преду-преждают, что “у пациентов, получающих гепа-рин, кровотечение может произойти фактически в любом месте”. Physicians’ Desk Reference, 47th Ed., Medical Economics Data (1993), p.2568.
Кроме того, показано, что эффективность та-ких антикоагулянтов при предупреждении реок-клюзии после ангиопластики либо не отличается от эффективности обработки плацебо, либо явля-ется невоспроизводимой. (Ip, J.H., et al., JACC, 17: 77B-88B (1991)). Соответственно, преимущества при применении таких антикоагулянтов нейтрали-зуются как опасностью кровотечения, так и их сомнительной эффективностью в предупреждении реокклюзии.
Многие биологические и механические под-ходы использовались при попытках уменьшить степень реокклюзии после ангиопластики, но ле-чение не показывало устойчивых положительных результатов. Соответственно, имеется возрастаю-щий интерес к “сайт-специфической” или “направленной” доставке противотромботических средств к местам повреждения сосудов. Gimple, L. W., et al., Circulation, 86: 1536-46 (1992).
Сайт-специфическая доставка противотром-ботических средств с использованием антител для соответствующих компонентов гемостатической системы должна служить локализации таких средств в месте повреждения сосуда. Одно из преимуществ такой локализации состоит в том, что потребуется меньшая вводимая доза. Другим преимуществом локализации должно быть умень-шение опасности системного кровотечения.
В ряде случаев показано, что антитела для специфических компонентов гемостатической системы сами ингибируют полимеризацию фибри-на. Francis, S.E., et al., Am. J. Hem., 18: 111-19 (1985), описывают исследования моноклонально-го антитела, созданного против фибриногена, которое обладало “умеренной” антикоагулирую-щей активностью. Mirshahi, M., et al., Fibrinogen, 4: 49-54 (1990), описывают получение линии гибри-домных клеток, секретирующих моноклональные антитела, в которых антиген представлял собой фрагмент D-продукт плазминного разрушения фибриногена. Эти моноклональные антитела энергично реагировали с фибриногеном и ингиби-ровали полимеризацию фибрина. Сiernewski, C.S., and Budrynski, A.Z., Biochemistry, 31: 4248-53 (1992), описываит получение трех различные ли-ний гибридомных клеток, в которых антиген явля-ется естественным человеческим фибриногеном, и которые секретируют моноклональные антитела, подавляющие интенсивность полимеризации фиб-рина.
Однако, при разработке сайт-специфи-ческого лечебного или профилактического проти-вотромботического средства все эти три сообще-ния являются малополезными или вовсе бесполез-ными. Это действительно так, поскольку во всех упомянутых случаях антитела являются пере-крестно-взаимодействующими либо с фибриноге-ном, либо с продуктами разложения фибриногена, которые все являются убиквитарными для гемо-статической системы. Любое такое антитело, вве-денное пациенту, должно тесно связываться с фибриногеном или с продуктами разрушения фиб-риногена, и не будет способно ингибировать по-лимеризацию фибрина или образование тромбов в месте повреждения кровеносного сосуда.
Настоящее изобретение дает возможность совершенно иного подхода к проблеме ингибиро-вания образования тромбов, используя монокло-нальные антитела, которые являются фибрин-специфическими (антифибриновыми) (т.е., без су-щественного перекрестного взаимодействия с фибриногеном или с продуктами, образованными при плазминном разрушении фибриногена или фибрина). Настоящее изобретение относится к способу применения упомянутых антифибрино-вых моноклональных антител, при котором, на удивление, ингибируется образование тромбов в месте повреждения кровеносного сосуда.
3. Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относитя к способу ингибирования образования тромба в месте по-вреждения кровеносного сосуда у человека, нуж-дающегося в таком ингибировании, посредством введения антифибринового моноклонального ан-титела. Настоящее изобретение также относится к фрагментам или производным антифибринового моноклонального антитела, и упомянутые фраг-менты и производные содержат связывающий домен антитела. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, со-держащей антифибриновое моноклональное анти-тело, или его фрагмент, или его производное, и фармацевтически эффективный носитель, которая, в достаточном количестве, является эффективной при ингибировании образования тромба у челове-ка. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим наборам, содержащим один или несколько ингредиентов фармацевтической композиции изобретения.
4. Краткое описание рисунков
Рисунок 1. Включение моноклонального ан-титела МН-1 в реакционную смесь фибриноген-тромбинной коагуляции ингибирует как степень, так и абсолютную величину коагуляции. Кон-трольными реакционным смесями являются реак-ционные смеси “фибриноген” и “45J”.
Рисунок 2. Включение увеличивающегося ко-личества моноклонального антитела МН-1 в ре-акционную смесь фибриноген-тромбинной коагу-ляции приводит в результате к возрастающему уровню ингибирования коагуляции. Контрольной реакционной смесью является “фибриноген”.
5. Подробное описание изобретения
5.1. Полезность настоящего
Как ни удивительно, но обнаружено, что ан-тифибриновое моноклональное антитело может ингибировать полимеризацию фибрина и образо-вание тромбов. Таким образом, антифибриновые моноклональные антитела могут использоваться для предупреждения или лечения любого состоя-ния у человека, которое поддается профилактике или лечению посредством ингибирования полиме-ризации фибрина или образования тромбов. Например, антифибриновые моноклональные антитела являются полезными при лечении людей, страдающих от какого-либо сосудистого заболе-вания, которое несет с собой опасность патологи-ческого тромбоза. Примерами, которыми не огра-ничивается перечень таких сосудистых заболева-ний, являются тромбоз глубоких вен (DVT), арте-риальный и венозный тромбозы, удар, тромбоэм-болия, эмболия легких и тромботические ослож-нения при атеросклерозе.
Антифибриновые моноклональные антитела также полезны, например, при лечении людей, которых готовят к инвазивным хирургическим процедурам, во время или при восстановлении после этих процедур. В описании настоящего изобретения термин “инвазивная хирургическая процедура” относится к любой хирургической процедуре, которая может привести в результате к повреждению артериального или венозного кро-веносного сосуда, что может привести к тромбо-тическим осложнениям. Примерами, которые не ограничиваются такие процедуры, являются бал-лонная ангиопластика и пересадка органов (как природных, так и искусственных).
Кроме антифибриновых моноклональных ан-тител, могут быть созданы известными техниче-скими приемами фрагменты антител, которые содержат идиотип (связывающий домен) анти-фибринового антитела. Например, такие фрагмен-ты включают, но не ограничиваются ими, (1) F(ав)2-фрагменты, которые могут быть получены пепсиновым перевариванием молекулы антитела; (2) Fав-фрагменты, которые могут быть получены восстановлением дисульфидных мостиков F(ав)2-фрагментов; и (3) Fав-фрагменты, которые могут быть получены путем обработки молекулы анти-тела лапанном и восстановителем. Такие фраг-менты антител входят в объем настоящего изобре-тения. Для ознакомления с другими примерами получения и применения фрагментов антител см. Parham, P., et al., J. Jmmunol. Meth, 53: 133 (1982); и Khaw, B-A, et al., J. Nucl. Med, 34: 2264-68 (1993).
Кроме антифибриновых моноклональных ан-тител и фрагментов антител, могут быть получены известными техническими приемами другие про-изводные антител, которые содержат идиотип (связывающий домен) антифибринового антитела. Например, могут быть синтезированы рекомби-нантные и синтетические олигопептиды и их ана-логи, которые оказывают такое же ингибирующее действие на образование тромбов, как антифибри-новое моноклональное антитело или его фрагмен-ты. Такие производные включаются в объем настоящего изобретения. По поводу других при-меров применения синтетических олигопептидов с последовательностями на основе области первич-ного связывания моноклонального антитела см. Knight, L., et al., J. Nucl. Med, 35: 282-88 (1994).
Наконец, в объем настоящего изобретения входит любое функционально эквивалентное ан-тифибриновое антитело, его фрагмент или произ-водное. Термином “функционально эквивалент-ное” обозначается любое антифибриновое анти-тело, или его фрагмент, или его производное, ко-торые способны в достаточной степени ингиби-ровать образование тромбов у человека, нужда-ющегося в таком воздействии, посредством связы-вания с тем же эпитопом, с которым связывается антитело МН-1.
5.2. Получение и характеристика монокло-нального антитела МН-1
Многие из прежних подходов, принятых для выращивания антифибриновых антител, сосредо-точивались на иммунизации животных раствори-мыми фрагментами фибрина и синтетическими пептидами, которые имитируют доступные неоан-тигенные участки на фибрине. Cм. Hui, K.Y., et al., Science, 222: 1129-32 (1983); Sheefers - Borchel, V., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7091-95 (1985); Elms, et al., Thromb Haemostas, 50: 591-94 (1983), и Kudryk, B., et al., Mol. Jmmunol, 21: 89-94 (1984). Однако, предполагается, что связывающий сайт таких антител сохраняется во время процесса разрушения фибрина, и, следовательно, такие антитела также могут связываться с продуктами разрушения фибрина.
Патент США № 5120834 (далее обозначае-мый здесь “патент 834”), Gargan et al., выданный 9 июня 1992, который включается в настоящее в качестве ссылки, относится, главным образом, к способу получения моноклональных антител от стерильных животных посредством иммунизации упомянутых животных выбранным антигеном. Полагают, что преимущество использования сте-рильной системы, с которой получают монокло-нальные антитела, состоит в том, что такая систе-ма будет проявлять весьма усиленный иммунный отклик на антиген, увеличивая вероятность опре-деления местонахождения лимфоцита, который продуцирует антитело, способное к связыванию со специфическим эпитопом антигена. Установле-но, что такая система является особенно пригод-ной для создания высоко специфического антите-ла к фибрину, которое имеет небольшое пере-крестное взаимодействие с фибриногеном или не имеет его. Выращивание такого выбирающего антитела являлось проблематичным, так как име-ется оценка, что структурные и конформационные подобия между фибрином и фибриногеном превы-шают 98% (Plow, E.F., et al., Semin Thromb Haemostas, 8: 36 (1982). В результате, только не-большой процент эпитопов на молекуле фибрина в действительности являются неоантигенами (т.е., единственно для фибрина).
Патент 834 относится к линии гибридомных клеток АТСС №. НВ 9739, секретирующих мо-ноклональное антитело МН-1. Моноклональное антитело МН-1 является специфическим к сшитым и несшитым полимерам фибрина, но не реагирует перекрестно с фибриногеном или с продуктами плазминного разрушения фибриногена или фиб-рина.
МН-1 очищают в соответствии с процедура-ми, описанными в патенте 834. МН-1 специфиче-ски связывается с фибрином и не реагирует пере-крестно с фибриногеном при конкурентном анали-зе. МН-1 не реагирует перекрестно ни с какими-либо продуктами, образовавшимися при плазмин-ном разрушении фибриногена, ни с какими-либо продуктами, образовавшимися при плазминном разрушении фибрина. В результате, можно заклю-чить, что (1) МН-1 распознает эпитоп интактной молекулы фибрина, который не присутствует или не открывается на поверхности молекулы предше-ственника - фибриногена; и (2) эпитоп явно разру-шается за счет переваривания плазмином сшитого фибрина.
Кроме того, МН-1, для определения аффин-ности МН-1 к фибрину, описывается с помощью анализа Scatchard (Frankel, et al., Mol Jmmunol, 16: 101-6 (1979)) с применением меченого 1251 антите-ла МН-1. Величина, полученная для константы диссоциации КD, составляет 6,7 х 10-10 М, что со-ответствует аффинности в 5000 крат от аффинно-сти тканевого плазменного активатора для фибри-на.
Вестерн-иммуноблоттинг-анализ показывает, что МН-1 не реагирует перекрестно с А-, В- или -цепями фибриногена. Тот же метод показывает, что МН-1 реагирует как со сшитым фибрином, так и с несшитым фибрином, причем аффинность к сшитому фибрину является большей из этих двух величин.
5.3. Способы введения
Согласно настоящему изобретению, анти-фибриновые моноклональные антитела, или их фрагменты, или их производные, вводят человеку, нуждающемуся в лечении с ингибированием тромбообразования. Антитела, или их фрагменты, или их производные, вводят человеку, предпочти-тельно, в форме, которая является неконъюгиро-ванной с каким-либо агентом мечения радиоак-тивным изотопом, тромболитическим или иным агентом, или какой-либо иной молекулой или ее частью. Однако, способы изобретения могут быть также осуществлены с использованием антител или их производных, которые конъюгируются с радиоизотопными метками, тромболитическими или иными агентами, или с какой-либо молекулой или ее частью, и охватываются объемом настоя-щего изобретения.
Термин “носитель” относится к разбавителю, эксципиенту или наполнителю, с которыми вводят антифибриновое антитело или его фрагмент или его производное.
Термин “фармацевтически приемлемый носи-тель” означает, что носитель одобрен федераль-ными органами управления или органами управ-ления штата, или внесены в перечень фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения на животных и, конкретнее, на людях.
Термин “противотромботическая компози-ция”, который используется в настоящем изобре-тении, относится к композиции, содержащей анти-фибриновое моноклональное антитело, или его фрагмент, или его производное, и фармацевтиче-ски приемлемый носитель, которая, в достаточном количестве, может ингибировать образование тромбов у человека, нуждающегося в упомянутом ингибировании.
Термин “эффективная доза”, который исполь-зуется в настоящем изобретении, относится к ко-личеству моноклонального антитела, или его фрагмента, или его производного, которое являет-ся достаточно большим, чтобы ингибировать об-разование тромбов у человека, нуждающегося в таком лечении. Дозировка не должна быть настолько большой, чтобы вызывать вредное по-бочное действие, такое как нежелательные пере-крестные реакции, и подобное. Вообще, дозировка будет изменяться в зависимости от возраста, со-стояния, пола и тяжести заболевания пациента, противопоказаний, если они имеются, иммунной толерантности, и других подобных переменных факторов, которые устанавливаются лечащим врачом. Хотя дозировки будут изменяться в зави-симости от индивидуального набора условий, в большинстве случаев сосудистых заболеваний и в большинстве случаев хирургических вмеша-тельств доза будет определяться массой тела че-ловека, нуждающегося в лечении, находясь в ин-тервале от 1 мкг/кг массы тела до 50 мкг/кг, пред-почтительно - в интервале от 5 мкг/кг до 10 мкг/кг массы тела.
5.4. Способы введения
Антифибриновые моноклональные антитела, или их фрагменты, или их производные, могут вводиться человеку любым подходящим спосо-бом, в том числе, парентерально, в виде однократ-ной инъекции ударной дозы вещества, непрерыв-ного вливания, или посредством сочетания этих двух способов. Введение также может быть осу-ществлено посредством прямой инфузии катете-ром, такой как внутрикоронарное введение, когда это показано.
Приготовление препаратов для парентераль-ного введения включает, например, восстановле-ние лиофилизованных антифибриновых монокло-нальных антител, или их фрагментов, или их про-изводных, в стерильном, свободном от эндотокси-нов, физиологическом растворе, или, более обоб-щенно, может включать восстановление или дис-пергирование антифибриновых моноклональных антител, или их фрагментов, или их производных, в стерильных водных или неводных растворах, суспензиях или эмульсиях. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, поли-этиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водными носителями являются вода, спиртоводные раство-ры, эмульсии или суспензии, в том числе, солевые и буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактирован-ную декстрозу Рингера, или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкие и пита-тельные дополнительные вещества, такие как на основе декстрозы Рингера, и подобные. Также могут присутствовать консерванты и другие до-бавки, такие как, например, противомикробные агенты, антиокислители, хелатирующие средства, и инертные газы, и подобные добавки. Предпочти-тельно, чтобы фармацевтические композиции настоящего изобретения находились в стерильной форме, которая удовлетворяет стандартам сте-рильности, установленным управлением питания и лекарственных препаратов Соединенных Шта-тов.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим наборам, содержащим один или несколько ингредиентов фармацевтических композиций изобретения, хранящихся в одном и том же или в разных контейнерах. Может быть приложена листовка, необязательно в самом та-ком контейнере (контейнерах), по форме, предпи-санной правительственным органом, контролиру-ющим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и в этой листовке отражается разрешение органа на производство, применение или продажу для применения человеком. Могут прилагаться ин-струкции, необязательно привязанные к наборам, которые содержат только лиофилизованное анти-тело, или его фрагменты, или его производные, о носителях, которые являются подходящими для введения человеку, нуждающемуся в лечении.
Объем, продолжительность, временной режим и способ лечения будут изменяться в зависимости от возраста, массы, состояния и пола человека, нуждающегося в лечении, а также в зависимости от типа и степени заболевания, которое требуется лечить, и регулируются назначениями лечащего врача в соответствии с каждым набором условий. Лечение может назначаться непосредственно пе-ред, во время или после любой хирургической процедуры, или как перед, так и во время проце-дуры, или как во время, так и после процедуры, в зависимости от конкретного набора условий при данном случае.
Например, при хирургической процедуре, та-кой как баллонная ангиопластика, часто случает-ся, что у больного человека уже имеется большое количество значительно рассеянных кровяных сгустков. В такой ситуации, вообще, будет выгод-но ввести противотромботические композиции непосредственно после осуществления процедуры ангиопластики, используя, предпочтительно, кате-тер, пока он еще на месте, с тем, чтобы прямо про-мыть поврежденную часть кровеносного сосуда противотромботической композицией, сосредото-чивая, посредством этого, лечение в одном этом месте. Это предотвращает потерю противотром-ботической композиции, которая может происхо-дить в результате, например, связывания антитела с тромбами в незатронутых местах.
В ситуациях, включающих инвазивные хи-рургические процедуры для пациентов, не болею-щих патологическими тромбозами, вообще, будет предпочтительно вводить противотромботиче-скую композицию либо непосредственно перед процедурой, либо во время процедуры, так как существует меньший риск потери противотромбо-тической композиции за счет связывания в неза-тронутых местах.
Кроме того, в большинстве случаев, включа-ющих хирургические процедуры, время, в течение которого существует повышенная опасность об-разования тромбов, имеет тенденцию ограничи-ваться моментом завершения процедуры. В ре-зультате, достаточным для эффективного ингиби-рования образования тромбов может быть только ограниченное количество обработок, или даже одна обработка достаточной длительности, по-средством чего значительно уменьшается опас-ность коагуляции, индуцированной хирургиче-ским вмешательством, со всеми присущими ей опасностями для пациента.
В случае хронического тромботического за-болевания временной режим, продолжительность и число противотромботических обработок зави-сят, в значительной степени, от диагностики со-стояния пациента до и после лечения и его реак-ции на предварительное противотромботическое лечение, что должно определяться, контролиро-ваться и оцениваться лечащим врачом.
5.5. Определение эффективности лечения
Эффективность противотромботического ле-чения моноклональным антителом МН-1, или его фрагментом, или его производным, может быть определена стандартными способами. Примерами таких способов являются, но не ограничиваются перечисленным, (1) ангиопластический монито-ринг посредством отображения прохождения кон-трастного вещества по артерии или вене, когда появление преграды на пути контрастного веще-ства указывает на необходимость дальнейшего лечения; (2) использование сцинтиграфии с при-менением антитромбового антитела, конъюгиро-ванного с радиоизотопной меткой, когда могут быть отслежены размер и местоположение тром-ба, чтобы установить необходимость дальнейшего лечения; (3) контроль за появлением и степенью клинических симптомов, когда возрастание числа или тяжести симптомов может указать на необхо-димость дальнейшего лечения; (4) измерение уровня тромбина в крови пациента, так как суще-ствует обратное соотношение между уровнями фибриногена и фибрина, когда падение уровня фибриногена может указать на возможное соот-ветствующее увеличение уровня фибрина и поли-меризацию фибрина, указывающие на необходи-мость дальнейшего лечения.
Теперь, имея общее описание настоящего изобретения, его будет легче понять, обратившись к характерному примеру, включенному в настоя-щее описание только с целью иллюстрации, и не предназначенному для каких-либо ограничений.
5. 6. Пример: ингибирование коагуляции in vitro.
Проводят ряд экспериментов in vitro, чтобы определить влияние МН-1 на коагуляцию. Очи-щенный человеческий фибриноген (Kabi, Chromogenix Co, Ohio) растворяют в 150 мМ за-буференном фосфатом солевом растворе, при фи-зиологическом значении рН, с концентрацией 1 мг/мл, и помещают приблизительно по 100 мкл в каждую лунку титрационного микропланшета (Costar). В каждую лунку, для образования реак-ционной смеси, добавляют приблизительно по 50 мкл бычьего тромбина до конечной концентрации 0,5 единиц NIH на мл. К реакционной смеси, в нулевой момент времени, добавляют приблизи-тельно 50 мкл либо (1) моноклонального антитела МН-1, чтобы получить конечную концентрацию антитела 100 мкг/мл; либо (2) моноклонального антитела 45J (моноклональное антитело 45J, ко-торое реагирует перекрестно с фибрином и фиб-риногеном, секретируется линией гибридомных клеток АТСС № НВ 9740, которую получают обычными техническими приемами, используя традиционных мышей Ва1 b/с, когда мышей им-мунизируют фибрином), чтобы получить конеч-ную концентрацию антитела 200 мкг/мл; либо (3) физиологического раствора. Дают возможность реакции протекать в течение 60 минут при 37С. Коагуляцию определяют спектрометрически при 340 нм каждые 2 минуты. Увеличение поглощения указывает, что коагуляция прогрессирует. Окон-чание процесса свертывания можно наблюдать как плато на кривой “поглощение - время”.
Рис.1 показывает, что обработка МН-1 по-давляет скорость коагуляции, что очевидно из меньшего наклона начального участка кривой “поглощение - время” для реакционной смеси, обработанной МН-1, по сравнению либо с кон-трольной реакционной смесью с 45J, либо с кон-трольной смесью с солевым раствором (фибрино-ген). Кроме того, МН-1 уменьшает абсолютную величину коагуляции, которая имеет место, что определяется по более низкому уровню пологого участка кривой для МН-1 при сравнении с кривы-ми для контрольных реакционных смесей. Кон-трольная реакционная смесь, содержащая антите-ло 45J (при удвоенной концентрации против МН-1), не обнаруживает какого-либо ингибирования коагуляции при сравнении с контрольной реакци-онной смесью с солевым раствором. Эти данные подтверждают предположение о том, что мо-ноклональное антитело МН-1 способно ингибиро-вать образование тромбов.
Во втором эксперименте проверяют действие МН-1 при нескольких различных концентрациях на время свертывания по сравнению с контроль-ной реакционной смесью с фибриногеном. На рис.2 приводятся профили реакции коагуляции (поглощение - время) при увеличении концентра-ции МН-1 в реакционной смеси. (1:1000 = 1 мкг/мл; 1:100 = 10 мкг/мл; 1:50 = 20 мкг/мл; 1:20 = 50 мкг/мл; 1:10 = 100 мкг/мл; фибриноген = кон-троль).
5.7. Депонирование гибридомы
Линии гибридомных клеток МН-1 и 45J депо-нированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС) 9 июня 1988 под инвентарими номерами НЕ 9739 и НИ 9740, соответственно. АТСС находится по адресу; 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Антитело МН-1 представляет собой антитело IgG, с легкой каппа-цепью, и наблюдалось, что МН-1 реагирует перекрестно как с человеческим фибрином, так и с кроличьим фибрином.
Настоящее изобретение не ограничивается в объеме депонированной линией гибридомных клеток АТСС № НB 9739 или моноклональным антителом МН-1, но предполагается, что они яв-ляются отдельными иллюстрациями антифибри-нового моноклонального антитела, которое инги-бирует образование тромбов. Любое функцио-нально эквивалентное антифибриновое монокло-нальное антитело, или его фрагмент, или его про-изводное, входят в объем настоящего изобретения. Термином “функционально эквивалентное” отме-чается, что моноклональное антитело, или его фрагмент, или его производное, способно ингиби-ровать образование тромбов посредством связы-вания с тем же эпитопом, с которым связывается антитело МН-1.
Настоящее изобретение может быть осу-ществлено в иных специфических формах без от-хода от его сущности или его существенных осо-бенностей, и, соответственно, следует скорее об-ратиться к прилагаемой формуле изобретения, чем к приведенному выше описанию, как к заявлению об объеме изобретения.
Все публикации и патенты, цитированные выше, включаются в настоящее в качестве ссылок.
(56) Документы, цитированные в отчёте
ЕР 0235805 А2, 09.09.87.
WO 88/04936 A1, 14.07.88.
Harker L.A. and Mann K.G. Thrombosis and fibrinolysis in: Thrombosis and cardiovascular disor-ders, 1992, pp.1-16.
WO 88/04936 A1, 14.07.88.
Harker L.A. and Mann K.G. Thrombosis and fibrinolysis in: Thrombosis and cardiovascular disor-ders, 1992, pp.1-16.
📎 Прикреплённые файлы
-
301 .pdf⬇ Скачать