СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО МЕТИОНИНОВОГО ГОЛОДАНИЯ КЛЕТОК В ОРГАНИЗМЕ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, ПОЛИНУКЛЕОТИД, КАТАЛИТИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОЙ МЕТАЗЫ
(51) МПК: 7 A61K 38/51, C11Q 1/68, G01N 33/573
Сведения о документе ▾
- (11) Номер документа
- 294
- (13) Код типа документа
- P
- (51) МПК
- 7 A61K 38/51, C11Q 1/68, G01N 33/573
- (45) Дата публикации
- 30.03.2001
- Статус
- Прекратил действие
Заявка ▾
- (21) Рег. номер заявки
- 96000320
- (22) Дата подачи заявки
- 22.12.1994
- (31) Конвенционный приоритет
- 08/176,413
- (32) Дата подачи конв. заявки
- 29.12.1993
- (33) Страна приоритета
- US
PCT ▾
- (86) Дата заявки PCT
- 22.12.1994
- (86) Номер заявки PCT
- PCT/US 94/14919
Лица ▾
- (71) Заявитель(и)
- Дзе Ридженс оф дзе Юниверсити оф Калифорния (US)
- (72) Автор(ы)
- НОБОРИ, Цутому, КАРСОН Деннис, А. (US)
- (73) Патентообладатель(и)
- Дзе Ридженс оф дзе Юниверсити оф Калифорния (US)
Реферат
Изобретение относится к области медицины. В частности, описан усовершенствованный способ химиотерапии злокачественных клеток млекопи-тающих, которые имеют абсолютную потребность в метионине, но не содержат метилтиоаденозин-фосфорилазу (МТАазу). Способ предусматривает детекцию МТАза-отрицательных клеток в организ-ме млекопитающих, введение метионин-у-лиазы в достаточном количестве для снижения объема МТАаза-отрицательных клеток в организме млеко-питающего и совместное введение метилтиоадено-зина в количестве, достаточном для постоянной доступности метионина для незлокачественных клеток млекопитающего. Предложены также ката-литически активный полипептид рекомбинантной МЕТазы и полинуклеотид, кодирующий этот поли-пептид. Технический результат изобретения - рас-ширение арсенала средств для борьбы со злокаче-ственными клетками. 3 с. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 фиг.
Формула изобретения
1. Способ осуществления селективного мети-онинового голодания клеток в организме млекопитающих, которые предположительно являются метилтиоаденозинфосфорилаза (МТАаза) -отрицательными, отличающийся тем, что определяют, являются ли клетки МТАаза отрицательными, при этом используют средства детекции как каталитически активной, так и каталитически неактивной МТАазы в образцах клеток, и вводят терапевтически эффективное количество L-метионин-L-дезамино Y-меркаптометанлиазы (МЕТазы) млекопитающему при практически од-новременном введении ему терапевтически эффек-тивного количества метилтиоаденозина (МТА), при этом МЕТазу и МТА вводят в фармацевтиче-ски приемлемых носителях.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что МЕТаза представлена рекомбинантным микробным белком, который специфично разрушает ме-тионин млекопитающих in vivо.
3. Способ пo п.2, отличающийся тем, что МЕТаза имеет последовательность аминокислот SEQ ID № 5;
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что МЕТазу экспрессируют с помощью полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последователь-ность SEQ ID № 4;
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что МЕТаза связана с полиэтиленгликолем.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что МЕТазу и МТА одновременно вводят млекопитающему.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что МЕТаза и МТА смешаны в одном фармацевтически приемлемом носителе.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что средства детекции наличия или отсутствия каталитически активной и каталитически неактивной МТАаза включают иммуноанализ.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что де-текция наличия или отсутствия каталитически активной и каталитически неактивной МТАазы проводится анализом, включающим получение пригодного для анализа образца клеток, предположительно являющихся МТАаза-отрицательными, добавление олигонуклеотидных зондов, которые специфично гибридизуются с нуклеиновой кислотой, кодирующей МТАазу, к образцу в условиях, обеспечивающих определяемую гибридизацию зондов с любой такой нуклеи-новой кислотой, присутствующей в образце, и детекцию присутствия нуклеиновой кислоты в образце.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что образец помещают в условия, способствующие селективной амплификации в образце любой нук-леиновой кислоты, кодирующей МТАазу.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что предусматривает этап определения уровня содер-жания метионина в плазме млекопитающего перед и после введения ему МЕТазы.
12. Способ по п.11. отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество МЕТазы, составляющее 10-20000 ед/м2, вводят по меньшей мере однократно в общем количестве, достаточном для уменьшения числа МТАаза-отрицательных клеток в организме млекопитающего.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество МЕТазы представлено количеством, которое снижает уровень содержания метионина в плазме млекопитающего приблизительно до 10% от уровня, пред-шествовавшего введению МЕТазы.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количеством МТА представлено количеством, достаточным для под-держания концентрации МТА в плазме млекопитающего на уровне 1 - 10 мкМ.
15. Полинуклеотид, кодирующий каталитически активный полипептид МЕТазы.
16. Полинуклеотид по п.15, отличающийся тем, что он имеет последовательность нуклеоти-дов (SEQ ID № 4).
17. Каталитически активный полипептид рекомбинантной МЕТазы.
18. Полипептид по п.17, отличающийся тем, что он получен при экспрессии полинуклеотида по п.15 или 16.
19. Полипептид по п.18, отличающийся тем, что имеет последовательность аминокислот (SEQ ID № 5).
20. Полипептид по п.18, отличающийся тем, что получен при экспрессии полинуклеотида в прокариотах.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что МЕТаза представлена рекомбинантным микробным белком, который специфично разрушает ме-тионин млекопитающих in vivо.
3. Способ пo п.2, отличающийся тем, что МЕТаза имеет последовательность аминокислот SEQ ID № 5;
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что МЕТазу экспрессируют с помощью полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последователь-ность SEQ ID № 4;
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что МЕТаза связана с полиэтиленгликолем.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что МЕТазу и МТА одновременно вводят млекопитающему.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что МЕТаза и МТА смешаны в одном фармацевтически приемлемом носителе.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что средства детекции наличия или отсутствия каталитически активной и каталитически неактивной МТАаза включают иммуноанализ.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что де-текция наличия или отсутствия каталитически активной и каталитически неактивной МТАазы проводится анализом, включающим получение пригодного для анализа образца клеток, предположительно являющихся МТАаза-отрицательными, добавление олигонуклеотидных зондов, которые специфично гибридизуются с нуклеиновой кислотой, кодирующей МТАазу, к образцу в условиях, обеспечивающих определяемую гибридизацию зондов с любой такой нуклеи-новой кислотой, присутствующей в образце, и детекцию присутствия нуклеиновой кислоты в образце.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что образец помещают в условия, способствующие селективной амплификации в образце любой нук-леиновой кислоты, кодирующей МТАазу.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что предусматривает этап определения уровня содер-жания метионина в плазме млекопитающего перед и после введения ему МЕТазы.
12. Способ по п.11. отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество МЕТазы, составляющее 10-20000 ед/м2, вводят по меньшей мере однократно в общем количестве, достаточном для уменьшения числа МТАаза-отрицательных клеток в организме млекопитающего.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество МЕТазы представлено количеством, которое снижает уровень содержания метионина в плазме млекопитающего приблизительно до 10% от уровня, пред-шествовавшего введению МЕТазы.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количеством МТА представлено количеством, достаточным для под-держания концентрации МТА в плазме млекопитающего на уровне 1 - 10 мкМ.
15. Полинуклеотид, кодирующий каталитически активный полипептид МЕТазы.
16. Полинуклеотид по п.15, отличающийся тем, что он имеет последовательность нуклеоти-дов (SEQ ID № 4).
17. Каталитически активный полипептид рекомбинантной МЕТазы.
18. Полипептид по п.17, отличающийся тем, что он получен при экспрессии полинуклеотида по п.15 или 16.
19. Полипептид по п.18, отличающийся тем, что имеет последовательность аминокислот (SEQ ID № 5).
20. Полипептид по п.18, отличающийся тем, что получен при экспрессии полинуклеотида в прокариотах.
Описание
Изобретение относится к способу избира-тельного разрушения злокачественных клеток в организме млекопитающего на основе различий метаболизма в злокачественных и незлокаче-ственных (нормальных) клетках. В частности, оно предусматривает голодание злокачественных клеток, которые не имеют фермента, необходимо-го для превращения метилтиоаденозина в метио-нин посредством деградации метионина и гомоци-стеина плазмы.
Аминокислота метионии (МЕТ) необходима для роста нормальных и злокачественных клеток. Для некоторых злокачественных клеток это тре-бование является абсолютным, например без адекватного снабжения метионином эти клетки погибают.
Клетки млекопитающих получают МЕТ из трех источников. Он может быть получен из пищи или при биохимическом синтезе МЕТ из L- гомо-цистеина (гомоцистеина) или метилтиоаденозина (МТА) (как продукт пути биосинтеза полиаминов). В последнем случае МТА превращается в МЕТ с помощью метилтиоаденозинфосфорилазы (МТАазы).
За последнее десятилетие исследователи идентифицировали много линий злокачественных клеток, которые не имеют МТАазы и не могут вследствие этого превращать МТА в МЕТ. Напри-мер, Katamari и соавт., Рrос. Nat’l Acad. Sci. USA, 78: 1219-1213(1981) сообщают, что 23% из 3 ли-ний клеток злокачественных опухолей человека не имели определяемой МТАазы, при этом актив-ность МТАазы имелась в каждой из 16 изученных линий. МТАаза-отрицательные клетки удовлетво-ряют свою потребность в МВТ конверсией гомо-цистеина. Однако при недоступности гомоцистеи-на эти клетки погибают.
L-Метионин-L-дезамино-у-меркаптометанлиаза (ЕD 4.4.1.11; МЕТаза), как известно, разлагает не только МЕТ, но и гомоци-стеин. Вследствие этого теоретически возможно заставить голодать злокачественные клетки, не имеющие МТАазы (т.е., МТАаза-отрицательные клетки), разложением МЕТ плазмы и гомоцистеи-на с помощью МЕТазы. При этом ожидается, что нормальные МТАаза-положительные клетки бу-дут удовлетворять потребность в МЕТ постоян-ным превращением МТА в МЕТ.
Разработка этого подхода была начата в 1972 г. Кrеis в Cancer Treat. Rprts., 63: 1069-1072 (1972). Используя 11 линий злокачественных кле-ток в культурах, не содержащих МЕТ, Кrеis инги-бировал рост ряда злокачественных клеток введе-нием в культуры МТАазы. Он также обнаружил, что 2 линии нормальных клеток были частично “излечены” от эффектов МЕТ-голодания при до-бавлении в культуры гомоцистеина. Однако, не-смотря на обнадеживающие результаты исследо-ваний in vitro, Кreis описал ряд препятствий, стоя-щих на пути успешного применения МТАазы в химиотерапии in vivo, в том числе недоступность средств, обеспечивающих выживание нормальных клеток in vivo, потенциальную иммуногенность очищенного или частично очищенного фермента и необходимость получения фермента, устойчивого к разложению протеолитическими ферментами in vivо (Kreis, Chemotherapy (Muggia, FM, ed. The Hague, Boston and London: Martinus-Nijihoff, 1983) стр. 219- 248). Другим препятствием разработки успешного подхода к МЕТ-голоданию злокаче-ственных клеток оказалась необходимость иден-тифицикации злокачественных новообразований, являющихся подходящими мишенями для терапии, т.е. определение МТАаза-отрицательных злокаче-ственных новообразований. В соответствии с этим был разработан способ анализа, который опреде-ляет, является ли злокачественное новообразова-ние МТАаза-отрицательным, по определению, проявляется ли какая-либо каталитическая актив-ность в культуре клеток (Seidenfeld et al., Biochem. Biophys. Res. Соmmun., 95: 1861-1866, 1980). Од-нако, вследствие промышленной недоступности необходимого для анализа радиохимического субстрата, его применение в рутинных определе-ниях в настоящее время неосуществимо. Более того, анализ не объясняет каталитическую актив-ность МТАазы in vitro, поскольку с его помощью нельзя определить, присутствует ли в культуре клеток какой-либо фермент, независимо от опре-деления, является ли он каталитически активным во время проведения анализа.
Этого ограничения в анализе активности можно избежать, разработав способ иммуноана-лиза, который с значительно большей чувстви-тельностью определяет относительно малые ко-личества фермента. Однако, выделение фермента МТАазы из природных источников для получения антител, применяющихся в иммунологической детекции МТАазы, оказалось трудоемким процес-сом, который дает относительно низкий выход (Rangion et al., J. Bid. Chem., 261: 12324-12329/1986).
Даже в случае разработки адекватных спо-соба детекции МТАаза-отрицательных клеток получение адекватного количества МЕТазы из природных источников остается таким же слож-ным, как и получение МТАазы. Получение МЕ-Тазы средствами, отличными от выделения натив-ного фермента, пока не достигнуто, что отчасти объясняется неполным секвенированием гена МЕ-Тазы (Nakayama et. al., Biochem. 27: 1587-1592, 1988).
В связи с указанными причинами, эффектив-ный подход к осуществлению in vivo МЕТ-голодания МТАаза-отрицательных злокачествен-ных клеток остается нереализованным. В данном изобретении предлагается разработка этого под-хода.
Изобретение предусматривает усовершен-ствованный способ селективного голодания МТАаза-отрицательных клеток в сочетании со средствами детекции МТАаза-отрицательных клеток. Согласно этому способу, злокачественные новообразования, которые были идентифицирова-ны как являющиеся МТАаза-отрицательными, обрабатывают терапевтически эффективным ко-личеством МЕТазы, предпочтительно рекомби-нантной МЕТазы, наиболее предпочтительно рекомбинантной МЕТазы, конъюгированной с полиэтиленгликолем или эквивалентной молеку-лой. В частности, МЕТазу вводят млекопитающим (предпочтительно человеку) в дозе, которая сни-жает уровень МЕТ в плазме до уровня, вызываю-щего метиониновое голодание МТАаза-отрицательных клеток (обычно не более 10% до-терапевтического уровня метионина). Нормаль-ные (МТАаза-положительные) клетки получают метионин посредством введения МТА.
Изобретение также предусматривает способ детекции МТАаза-отрицательных клеток в злока-чественных новообразованиях, в частности полу-чение антител (в том числе моноклональных анти-тел) и их применение в иммуноанализе МТАазы. Изобретение также позволяет определять наличие гена, который кодирует МТАазу, применяя способ на основе амплификации нуклеиновых кислот, в частности полимеразно-цепьевую реакцию (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинант-ной МЕТазе, полученной при выделении и клони-ровании гена, кодирующего МЕТазу, что обеспе-чивает получение значительных количеств МЕТа-зы для применения в способах, предлагаемых в данном изобретении.
На фиг. 1 показана схема пути метаболизма при синтезе полиаминов и восстановление МТА с помощью МТАазы.
Фиг. 2 представляет сравнение МТАаза-положительных и МТАаза-отрицательных чело-веческих и других линий клеток, определенных иммуноблоттингом.
Фиг. 3 представляет сравнение МТАаза-положительных и МТАаза-отрицательных линий клеток человека и первичных клонов, определен-ных иммуноблоттингом.
Фиг. 4 представляет сравнение роста МТАаза-отрицательных клеток человека, обрабо-танных МЕТазой, и таких же клеток, выросших в среде, богатой метионином.
Способ детекции МТАаза-отрицательных клеток.
На фиг. 1 схематически представлены пути метаболизма при синтезе in vivo МЕТ из МТА и деградации МЕТ МЕТазой. Как указано выше, для успешной терапии рака метиониновым голодани-ем необходима детским МТА-отрицательных кле-ток в целевом злокачественном новообразовании. Для этой цели предложен описанный ниже способ детекции МТАазы, пригодный для применения в способах по изобретению.
А. Способ иммуноанализа МТАазы
1. Получение антигенных МТАазы и пепти-дов МТАазы.
Антитела, специфичные к МТАазе, получают иммунизацией животных антигенными МТАазой или пептидами МТАазы. В основном антигенные пептиды МТАазы выделяют и очищают из тканей млекопитающих способом, описанным (Rangion et al., J. Bid. Chem., 265: 6241-6246 (1990). Пример, иллюстрирующий применение этого способа, представлен ниже. Аминокислотная последова-тельность полной МТА представлена в SEQ. ID. № 1.
2. Иммунизация антигенными пептидами МТАазы для получения антител против МТАазы.
При наличии антигенных пептидов антитела против иммунизирующих пептидов получают введением пептидов млекопитающим, например кроликам, мышам или крысам. Для иллюстрации последовательности аминокислот двух антиген-ных пептюдов МТАазы приведены в Списке по-следовательностей в приложении, приведенном в конце описания, как SEQ. ID. № 2 и № 3. Антитела, образованные кроликами, иммунизированными этими пептидами, проявили 50%, максимального ответа на очищенную МТАазу, соответственно в разведениях 1:1500 и 1:4000.
Протокол множественной инъекционной им-мунизации предпочтителен для использования при иммунизации животных антигенными пептидами МТАазы (см., например, Langone et al., eds., “Production of Antisera with Small Doses of Immunigen: Multople Intradermal Injections”, Methods of Enzymology (Acad. Press, 1981). Например, хороший иммунный ответ получают у кроликов при внутрикожной инъекции 1 мг анти-генного пептида МТАазы, эмульгированного в Полном адъюванте Фрейнда, с последующими одной-несколькими вторичными инъекциями этого же антигена в указанном адьюванте через не-сколько недель.
При желании иммунизирующий пептид может быть связан с белком-носителем посредством конъюгации с помощью известных способов. Обычно используют носители, химически связан-ные с пептидом, включая гемоцианин лимфы улит-ки (KLH), тироглобулин, бычий сывороточный альбумин (BSA) и токсоид столбняка. Связанный белок применяют затем для иммунизации живот-ного, например мыши или кролика. Поскольку считается, что МТАаза является консервативной для видов млекопитающих, предпочтительно при-менение белков-носителей для повышения имму-ногенности белка МТАазы.
Поликлональные антитела, образуемые жи-вотными, могут быть очищены, например, связы-ванием с матриксом, с которым были связаны пеп-тиды, соответствующие антителам, и последую-щей элюцией с него. Исследователям известны различные иммунологические способы очистки и/или концентрирования поликлональных антител и моноклональных антител (см., например Coligan et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
Для детекции МТАаза-отрицательных клеток предпочтительно применение моноклональных антител, вследствие их специфичности и простоты получения. Для получения моноклональных анти-тел предпочтительна иммунизация мышей или крыс. Термин “антитело” применяют в настоящем изобретении для обозначения интактных молекул и их фрагментов, например Fab и F(ab’)2, которые способны связывать эпитопную детерминанту. Также в данном контексте термин “mAb’s изобре-тения” означает моноклональные антитела, спе-цифичные к МТАазе.
Основным способом получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела (mAb’s), является известный способ, предложен-ный Kohler and Milstein, Nature, 256: 495/1975). Он предусматривает выделение лимфоцитов из реги-ональных лимфоузлов пяти различных онкологи-ческих больных с меланомой, тератокарциномой или раком шейки матки, глиомы или легкого. Лим-фоциты получали из хирургического материала, смешивали их и сливали с SHFP-l. Гибридомы отбирали по продукции антител, связанных с ли-ниями раковых клеток. Для получения и иденти-фикации mAb’s со специфичностью к МТАазе можно использовать эквивалентные способы.
Подтверждение специфичности к МТАазе среди mAb’s изобретения получают с помощью относительно рутинных способов скрининга, например твердофазного иммуноферментного анализа ELISA, для определения элементарных реакционных образцов mAb.
Возможно установление идентичности спе-цифичности mAb со специфичностью mAb изобре-тения без проведения экспериментов, определяю-щих, препятствуют ли тестируемые mAb связыва-нию mAb изобретения с МТАазой. Если тестируе-мые mAb конкурируют в связывании с mAb изоб-ретения, вероятно, что эти два моноклональных антитела связывают один и тот же или близкие эпитопы.
Иным путем установления идентичности спе-цифичности mAb со специфичностью mAb изобре-тения является предварительное инкубирование mAb изобретения с антигеном, который в норме реактивен, и определение, ингибируется ли спо-собность тестируемых mAb связывать антиген. В случае ингибирования тестируемых mAb, вероят-но, что они имеют такую же или близкую эпитоп-ную специфичность, как mAb изобретения.
3. Способ иммуноанализа для детекции МТАаза-отрицательных клеток
Полученные, как описано выше, подходящие антитела используют для детекции МТАазы в злокачественных новообразованиях. Пример им-муноанализа для этой цели (например, способ иммуноблоттинга) представлен в примере 1 ниже. Однако, специалистам известны иные описанные в других источниках способы иммуноанализа для детекции антител, применяющие жидкую или твердую фазы (при связывании с носителем). Де-текция МТАазы с помощью антител против МТАазы может быть осуществлена способами иммуноанализа, которые проводят предваритель-но, после или одновременно, в том числе иммуно-гистохимическими способами анализа физиологи-ческих образцов. Подходящие способы иммуно-анализа содержат конкурентный и неконкурент-ный способы, которые проводят прямым или не-прямым образом. Примерами способов иммуно-анализа являются радиоиммуноанализ (RIА) и сэндвичевый (иммунометрический) анализ. Иссле-дователям известны также иные способы иммуно-анализа.
Кроме того, в антитела, применяемые в имму-ноанализах, может быть введена определяемая метка. Метка представляет собой вещество, кото-рое ковалентно связано или прочно ассоциирова-но с зондом нуклеиновой кислоты, что обеспечи-вает детекцию зонда. Например, метка может представлять собой радиоизотоп, ферментный субстрат или ингибитор, фермент, контрастное вещество (в том числе коллоидные металлы), лю-минофоры, хемолюминесцентные молекулы, липо-сомы, содержащие любую из указанных меток, или члены специфично связывающихся пар. Под-ходящая метка не теряет определяемости в тече-ние амплификации.
Специалистам в области диагностики извест-ны соответствующие определяемые метки для использования в детекционных анализах in vitro. Например, подходящими радиоизотопами для применения in vitro являются 3Н, 125I, 131I, 32Р, 14С, 35S. Амплифицированные фрагменты с радиоизо-топными метками определяют непосредственно с помощью счетчика гамма-излучения, авторадио-графией или саузерн-блоттингом амплифициро-ванных фрагментов в сочетании с денситометрией. Примерами подходящих хемолюминесцентных молекул являются акридины и люминал. Целевые последовательности, гибридизованные с зондами, деривированными акридиновым эфиром, защище-ны от гидролиза интеркаляцией. Примерами под-ходящих люминофоров служат флуоресцеин, фикобилипротеин, хелаты редкоземельных метал-лов, дансил или родамин.
Примерами подходящих ферментных суб-стратов или ингибиторов являются соединения, которые специфично связывают пероксидазу хре-на, глюкозоксидазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, -галактозидазу, пируват-киназу или щелочную фосфатазу ацетилхо-линэстеразу. Примерами контрастных веществ служат коллоидное золото или магнитные части-цы.
Специфично связывающиеся пары содержат две различные молекулы. На поверхности или в полости одной из них имеется область, которая специфично связывается с другой молекулой, об-ладающей определенной пространственной и полярной организацией. Членов специфично свя-зывающейся пары часто называют лиганд и ре-цептор или лиганд и антилиганд. Например, если рецептор представлен антителом, лигандом явля-ется соответствующий антиген. Иные специфично связывающиеся пары представлены парами гор-мон-рецептор, фермент-субстрат, биотин-авидин и гликопротеин-рецептор. Сюда же относятся фраг-менты и часта специфично связывающихся пар, сохраняющие специфичность связывания, напри-мер фрагменты иммуноглобулинов, в том числе фрагменты Fab и т.п. Антитела могут быть моно- и поликлональными. При использовании члена спе-цифично связывающейся пары в качестве метки, предпочтительным способом разделения является аффинная хроматография.
Антитела могут быть также связаны с носи-телем. Примерами известных носителей являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилозы, природные или моди-фицированные целлюлозы, полиакриламиды, ага-розы и магнетит. Носитель может быть раствори-мым или нерастворимым в зависимости от целей изобретения. Исследователям известны иные но-сители для связывания антител, их также можно получить обычными способами.
В. Детекция МТАаза-отрицательных клеток с по-мощью анализа на основе ПЦР.
С целью упрощения и ускорения детекции МТАаза-отрицательных клеток предпочтительно проведение анализа с использованием описанных МТАаза-специфичных антител. Однако, известны иные средства для детекции наличия МТАаза-отрицательных клеток в злокачественных новооб-разованиях. Например, используя описание нук-леиновой кислоты в SЕQ. ID. № 1, исследователь может сконструировать олигонуклеотидные зон-ды, гибридизующиеся с ДНК МТАазы, присут-ствующей в образце клеток. Кроме того, поскольку считается, что недостаточность МТАазы обу-словлена геномной делецией гена, кодирующего белок МТАазы, можно заключить, что определе-ние в образце клеток отсутствия гена, кодирующе-го МТАазу, указывает на то, что эти клетки явля-ются МТАаза-отрицательными .
Детальное описание способа амплификации и детекции гена МТАазы приведено в находящей-ся на рассмотрении заявке США № 08/176855 от 29 декабря 1993 г., содержание которой в части, относящейся к способу, включено в данное описа-ние путем отсылки.
С. МТАаза-отрицательные кандидаты для тера-пии МТАазным голоданием.
Для терапии согласно изобретению (терапии МЕТ-голоданием) отбирают злокачественные новообразования, в которых не определяется ка-талитически активный или каталитически неак-тивный белок МТАазы. Во всех исследованных к настоящему времени линиях злокачественных клеток МТАаза-отрицательность (при ее наличии) является отличительным признаком клеточной популяции. Иными словами, если некоторые клет-ки злокачественного новообразования являются МТАаза-отрицательными, можно ожидать, что все клетки новообразования будут МТАаза-отрицательными. Это соответствует имеющимся представлениям, что недостаточность МТАазы является результатом делеции гена, а не мутации. Гомогенность злокачественных новообразований по МТАаза-недостаточности значительно повы-шает эффективность МЕТ-голодания в качестве средства противораковой терапии по сравнению с терапевтическими способами, основанными на гетерогенных признаках, например на терапии моноклональными антителами против опухоле-вых антигенов. Однако, для целей изобретения важно, чтобы злокачественное новообразование имело существенную недостаточность МТАазы, например не содержало определяемых количеств белка МТАазы.
К злокачественным новообразованиям чело-века, которые, как полагают в настоящее время, отличаются существенной недостаточностью МТАазы, относятся новообразования, приведен-ные в табл.1.
С помощью описанных способов детекции исследователи могут определить недостаточность МТАазы в иных злокачественных новообразова-ниях без чрезмерных экспериментов.
II. Терапия с помощью МЕТ-голодания
А. Получение МЕТазы
Для реализации способов изобретения необ-ходимы источники МТА и МЕТазы. Средства для получения МТА описаны выше. В данном изобре-тении МЕТазу выделяют из микроорганизмов, в том числе Trichomonas vaginalis (Lockwood et al., J. Biochem. 279: 675-682, 1991), Clostridium sporo-genes (Kries et al., supra, 1867, EC4.4.1.11) и Pseu-domoaas putida (Nakayama et al., Biochem., 27: 1587-1591, 1988).
С помощью библиотеки к ДНК, сконструиро-ванной из Р. putida, идентифицировали полную нуклеотидную последовательность МЕТазы. Она приведена в Списке последовательностей SEQ. ID. № 4, аминокислотная последовательность приве-дена в SEQ. ID. № 5.
Эта информация дает возможность легко син-тезировать МЕТазу или экспрессировать ее из клона ДНК с помощью известных способов, опи-санных выше применительно к МТАазе. Пример клонирования МЕТазы и ее экспрессии в E.coli представлен ниже в примерах II и III.
Очищенную, частично очищенную, синтези-рованную или рекомбинантную МЕТазу приме-няют в терапевтическом способе согласно изобре-тению. Предпочтительна рекомбинантная МЕТа-за, поскольку ее легко получить и она обладает относительно низкой иммуногенностью. Иммуно-генность фермента может быть дополнительно понижена связыванием его с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или эквивалентной биологически совмести-мой молекулой. Связывание с ПЭГ может также снизить период полужизни конъюгата МЕТазы in vivo.
Конъюгат ПЭГ-МЕТаза получают ковалент-ным связыванием ПЭГ с ферментом, как описано для L-аспарагина (Benedich е1 а1., din Ехр. lalmunol. 48: 273-278, 1982). Способы связывания ПЭГ с белками известны, и не описываются де-тально в данной заявке. Результаты, полученные при лечении больных с лимфомой Неходжкинса L-аспарагиназой, связанной с ПЭГ, не предполагают значительного снижения активности МЕТазы in vivo при связывании с ПЭГ (см. результаты, полу-ченные in vivo с ПЭГ-L-acпарагиназой, представ-ленные Muss et al., Invest. New Drugs, 8: 125-130 (1990). Исследователям известны иные средства увеличения периода полужизни белков in vivo, которые могут быть использованы в случае МЕ-Тазы, в том числе, но не ограничены ими, это гли-козилирование и сукцинилирование.
В. Терапевтические способы
Злокачественные новообразования с значи-тельной недостаточностью МЕТазы лечат соглас-но представленному в изобретении способу при-менения МЕТазы. Предпочтителен выбор злокаче-ственных новообразований, в отношении которых может быть использована региональная хемоте-рапия, например злокачественных новообразова-ний, локализованных или содержащихся в обла-сти тела, которая доступна для внутриартериаль-ного, наружного, чрескожного или эквивалентного им способу введения МЕТазы непосредственно в место новообразования. Примерами злокаче-ственных новообразований, чувствительных к региональной терапии, являются меланомы, рак яичников (введение через перитонеальный кате-тер) и рак мочевого пузыря (введение через уретральный катетер). Онкологам также известны другие злокачественные новообразования, кото-рые, если они МТАаза-отрицательные, можно лечить с помощью региональной хемотерапии по изобретению.
Специалисты оценят возможность системного применения предлагаемых в изобретении терапев-тических препаратов. Однако, дозы препаратов должны быть приведены в соответствие с их кли-ренсом и потенциальной токсичностью в отноше-нии нормальных клеток. В частности, необходимы мониторинг клинических проявлений метионино-вого голодания нормальных клеток и его компен-сация введением дополнительных количеств МТА.
Злокачественные новообразования с суще-ственной недостаточностью МТАазы предпочти-тельно лечат согласно изобретению, как описано ниже.
МЕТазу вводят млекопитающим (в частности, человеку) парентерально, предпочтительно внут-риартериально. МЕТазу вводят в фармацевтиче-ски приемлемом носителе, который может содер-жать стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных рас-творителей являются пропиленгликоль, полиэти-ленгликоль, растительные масла, например олив-ковое масло, и пригодные для инъекций органиче-ские эфиры, например этилалеат. Водные носите-ли включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и буферные среды. Как указано выше, для снижения иммуногенности предпочтительно использование конъюгата МЕТазы с ПЭГ.
Носители для парентерального введения представлены раствором хлорида натрия, декс-трозой Рингера, декстрозой и хлоридом натрия, маслами Рингера с лактозой или иммобилизован-ными. Носители для внутривенного введения представлены жидкостями, питательными напол-нителями и электролитными наполнителями, например на основе декстрозы Рингера, и т.п. Воз-можно введение консервантов и иных добавок, например антимикробных агентов, антиоксидан-тов, хелатирующих агентов, инертных газов и т.п.
Доза МЕТазы составляет 10-20000, предпо-чтительно 5000-6000 ед/м2 (или ниже при внутри-артериальном введении) при одном - нескольких введениях в неделю в течение одного - нескольких дней. МЕТаза обычно выводится из организма млекопитающего в течение 24 час после введения. При использовании средств, пролонгирующих период полужизни фермента, например конъюга-ции с ПЭГ, этот период может быть увеличен на несколько часов - несколько дней. Вследствие этого необходим мониторинг уровня метионина в плазме млекопитающего и введение дополнитель-ных доз МЕТазы для получения терапевтически значимого снижения концентрации метионина в плазме млекопитающего. Это снижение должно быть достаточным для индукции заметного уменьшения объема МТАаза-отрицательных клеток, например уменьшения объема злокаче-ственных клеток или опухоли у млекопитающего. Доза, обеспечивающая такой результат, является терапевтически эффективной дозой. Исследования на грызунах in vivo с использованием частично очищенной МЕТазы показали, что терапевтически эффективной дозой является доза, снижающая уровень метионина в плазме до содержания не более 10% от предтерапевтического уровня.
Мониторинг уровня метионна в плазме (и его изменений) можно проводить с помощью периоди-ческих (желательно ежедневных) анализов in vitro образцов крови пациента, получающего МЕТазу, в течение курса лечения. На основании результа-тов исследований, проведенных на грызунах, можно ожидать снижения уровня метионина в плазме до не более 10%, через один час после введения МЕТазы. Способы анализа метионина в плазме известны. Например, концентрацию мети-онина в плазме определяют способом газожид-костной хроматографии этерифицированных ами-нокислот (н-бутиловый эфир) (Roach et al., J. Chromatog. 44: 269-278 (1969). Известны также иные способы определения метионина в плазме.
Следует отметить, что МТАаза не может раз-рушать внутриклеточный метионин, поэтому адекватное поступление МТА для образования внутриклеточного метионина обеспечивает выжи-вание МТАаза-положительных клеток при сниже-нии уровня экзогенного метионина МЕТазой. Од-нако, без введения экзогенного метионина (или L-гoмоцистеина как субстрата для образования метионина, также разлагаемого МЕТазой) МТАаза-отрицательные клетки с абсолютной потребностью в метионине не выживут при отсут-ствии метионина в плазме.
Подтверждение и мониторинг эффективности терапии можно проводить на основании клиниче-ских данных об уменьшении клеточного объема злокачественного новообразования, получаемых известными способами, а также по данным перио-дического определения объема МТА-отрицательных клеток в злокачественном новооб-разовании описанными в данной заявке средства-ми. На основании клинических данных, получен-ных при использовании L-аспарагиназы для лече-ния онкологических больных, можно ожидать, что токсичность МЕТазы будет очень низкой и выра-женной в основном в аллергических реакциях, которые лечат известными способами, например введением эпинефрина.
Поэтому МТА следует вводить млекопитаю-щим совместно с МЕТазой, при этом предпочти-тельно одновременное введение. Поскольку МТА не является субстратом для МЕТазы, их можно смешивать в одном фармацевтически приемлемом носителе. Альтернативно МТА можно вводить через 24 час после введения МЕТазы (предпочти-тельно раньше) с целью “поддержания” МТАаза-положительных клеток с истощающимся запасом эндогенного метионина.
Доза МТА, необходимая для поддержания нормальных клеток, зависит от ряда клинических факторов, в том числе локализации злокачествен-ного новообразования, объема МТАаза-отрицательных клеток в новообразовании, про-должительности МТАаза-терапии и доступности для пациента МЕТ в пище. В общем случае МТА вводят в дозах, достаточных для поддержания уровня метионина в плазме до значения 1-10 МКМ.
Примеры, иллюстрирующие полное описание изобретения на практике, даны ниже. Эти приме-ры, однако, не ограничивают объем изобретения, который определен прилагаемой формулой изоб-ретения.
В примерах мин означает минуты, час - часы, а для обозначения единиц измерения, например мл, используются принятые сокращения.
Пример I
Способ иммуноанализа МТАазы
А. Получение антител против МТАазы
МТАазу выделили из бычьей печени, как опи-сано Rangione et al., см.выше. Ряд трипептидов из выделенного фермента секвенировали известными способами. На основе полученных последова-тельностей пептиды 40 (из 18 аминокислот, SEQ. ID. № 2) и 51 (из 14 аминокислот, SEQ. ID. № 3) синтезировали модифицированным твердофазным способом Merrifield (Chen et al., Proc Nat’L Acad. Sci. USA, 81: 1784-1788, 1984). Bce пептиды со-держали остаток цистеина на С-конце для облег-чения связывания с белком-носителем, KLH, с помощью эфира m-малеимидобензоил-К-гидроксисукцимида.
Новозеландских белых кроликов (два кроли-ка на пептид) иммунизировали в течение двух месяцев конъюгатами пептид-KLH. Первичные инъекции содержали 1 мг синтетического конъ-югата пептид-KLH, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Вторичные инъекции содер-жали 1 мг антигена в неполном адъюванте Фрейн-да. После 3-4 инъекций сыворотки частично очи-щали 50% насыщенным раствором сульфата ам-мония и исследовали на наличие антипептидной и анти-МTАазной реакции с помощью ELISA.
В частности, планшеты для микротитрования предварительно покрывали. пептидами или МТАазой в концентрации 10 мкг/мл в BBS (0,2 М бората натрия - 0,15 М NaCI, рН 8,5) и выдержи-вали в течение ночи при 4С. Затем планшеты однократно промывали BBS, содержащим 0,05% Твин 20, и инкубировали в течение 4 час с BBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбу-мина, для блокирования неспецифичных сайтов связывания. Затем контрольную сыворотку и ин-дуцированную пептидом антисыворотку в раз-личных разведениях вносили в 0,1 мл аликвотах и инкубировали в течение ночи. Планшеты дважды промывали BBS, содержащим 0,05% Tween 20, и в течение 1 час обрабатывали меченным щелочной фосфатазой иммуноглобулином козы против кро-лика F(ab’)2 (Jackson Laboratories, Inc., West Grove, PA) в разведении 1:1000 в BBS. Затем планшеты промывали и добавляли в каждую лунку 0,2 мл -0,1 М динатриевой соли р-нитрофенилфосфата в 0,1 М растворе бикарбоната натрия, рН 9,0. По-глощение измеряли при длине волны 40,5 нм через 30 мин.
В. Способ иммуноблоттинга иммунореактивной МТАазы
Было определено присутствие МТАаза- от-рицательных клеток в ряде линий клеток человека и биопсий опухолей (см. табл. 1, случаи, помечен-ные “иммуноанализ”). Другими МТАаза-положительными образцами оказались BV-173 (хронический миелогенный лейкоз, CML), Molt-16 (острый лимфолейкоз, ALL), Malt-4 (ALL), U397 (гистиоцитная лимфома), SUP-TS (ALL), U-373MG (глиобластома) и T98G (глиобластома).
Клеточные экстракты, полученные из фер-мент-положительных клеток, подвергли электро-форезу в 12,5% полиакриламидном геле, содер-жащем 0,1% додецилсульфата натрия, вместе с нанесением различных количеств МТАазы, выде-ленной из бычьей печени, как описано выше.
В частности, неочищенные клеточные экс-тракты (10-150 мкг на 1 дорожку) разделили элек-трофорезом в 12,5% полиакриламидном геле, со-держащем 0,1% додецилсульфата натрия. После электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны (0,45 мм, Bio-Rad, Richmond, СА) неспецифические сайты связывания блокировали 3% порошковыми молоком в BBS. Белки обрабатывали в течение 16 час при комнатной температуре антисывороткой, разведенной 1:500 в BBS, содержащем 3% порош-ковое молоко. Затем белки промыли избытком BBS и провели детекцию реактивных бэндов по связыванию 125I-белка А (ICN Radiochemicals, Irvine, СА) в течение 1 час. Мембраны промыли, наложили на бумажные полотенца и экспониро-вали на пленке Kodak XAR-5 (tm) при 70С.
Бэнды на авторадиограммах сканировали денситометром (Bio-Rad) и определили их количе-ство с помощью калибровочной кривой, получен-ной при определении иммунореактивных бэндов очищенного фермента.
С. Результаты
В 67% (4 из 6) линий и биопсий нелегочных клеток, например в глиомах, отмечена полная недостаточность в иммунореактивном ферменте (фиг. 2). 5 из 6 последовательных образцов биоп-сий из глиом человека с различными гистологиче-скими характеристиками (табл. 1) были с полной недостаточностью (фиг. 3). Контрольные опыты показали, что в норме мозг человека обладает значительной активностью МТАазы (фиг. 3, до-рожка 7). Таким образом, полная недостаточность МТАазы является обычной и специфичной мета-болической аномалией в глиомах человека.
Из 19 исследованных линий клеток немелко-клеточного рака легких МТАаза полностью от-сутствовала в 6 линиях клеток (см. табл. 1 и фиг. 4).
Таблица 1
Злокачественные новообразова-ния метод определения
недостаточности МТАзы:
Немелкоклеточные раки легких: Иммуноанализ •
А-549 (Аденосаркома)
Sk-Lu-1 (Аденосаркома)
Н322 (бронхоальвеолярный
рак)
Н1334 (крупноклеточная кар-
цинома)
Н1437 (аденосаркома)
Н1581 (крупноклеточная кар-
цинома)
* Линии клеток опухолей мозга: Иммуноанализ •
А-172
U-87MG
U-138MG
Hs683
Первичные опухоли мозга: Иммуноанализ •
Астроцитома
Мультиформная глиоблас-
тома
Олигосроцитома
Лимфомы и лейкемии: Иммуноанализ •
СЕМ (острый лимфолейкоз)
К-Т-1 (острый лимфолейкоз)
NALL-1 (острый лимфолей-
коз)
К562 (хронический миело-
лейкоз)
DHL-9 (злокачественная
лимфома)
HSB2 (острый лимфолейкоз)
Другие:
256 сарциносаркома Уолкера Клинические дан-ные**
Jurkat Иммуноанализ***
K562 Иммуноанализ***
Capan-1 (аденосаркома под-
желудочной железы) Иммуноанализ****
Примечания:
*получены из Американской Коллекции Типовых культур, Роквилл, Мериленд.
**описано Kreis et al., Cancer Res., 33: 1866-1869 (1973)
***описано Rangione et al., Biochem. J. 281: 533-538 (1992)
****описано Kreis et al., Cancer Trmt. Rpts., 63: 1069-1072 (1979)
• недостаточность МТАазы во всех других злокаче-ственных новообразованиях была определена и описана Nobori et al., Cancer Res. 53: 1098-1101 (1993), Cancer Res. 51: 3193-3197 (1991).
Пример II
Клонирование МБТазы из Pseudomonas putida
На основании частичной аминокислотной последовательности МЕТазы, опубликованной Wakayama et al., Diochem., 27: 1587- 1591, 1988), были сконструированы дегенерированные олиго-нуклеотидные праймеры, которые использовали в ПЦР при анализе гена МЕТазы.
С помощью ПЦР амплифицировали фрагмент из приблизительно 300 пар оснований, который был субклонировон в плазмидный вектор pBluescript II КS (Stratagene, San Diego). С помо-щью внутреннего олигонуклеотидного зонда этот субклонированный продукт ПЦР проанализиро-вали с использованием саузерн-блоттинга с целью подтверждения идентичности фрагмента гену МЕТазы. Дальнейший анализ с помощью саузерн-блоттинга показал, что этот фрагмент, получен-ный при ПЦР, гибридизуется с фрагментом 5,0 т.п.н. Bgl 11 в ДНК Pseudomollas putida.
На основании этих результатов сконструиро-вали бактериофаговую библиотеку геномной ДНК, содержащую геномную ДНК Pseudomonas putida. Расщепленную Bgl II ДНК Pseudomonas putida разделили электрофорезом в 0,8% в агароз-ном геле с низкой точкой плавления. Фрагменты Bgl II размером 4/т.п.н. - б/т.п.н. были вырезаны и выделены из геля. C помощью фрагмента Klenow эти фрагменты Bgl II были частично наполнены и субклонированы в бактериофаговый вектор yFix II. Этот вектор расщепили Xho I и частично наполнили Klenow. Библиотеку упаковали в бак-териофаговые частицы с помощью упаковываю-щего экстракта gigapack (Stratagene). После упа-ковки библиотеку амплифицировали и оттитрова-ли.
Для выделения полного гена МЕТазы прове-ли скрипнет библиотеки, используя фрагмент, полученный с помощью ПЦР. После скрининга 200000 клонов было отобрано 8 независимых первичных клонов, из которых только два были истинно положительными и уникальными. Первый клон содержал вставку 5,1 т.п.н., а второй клон содержал вставку 5,9 т.п.н. Эти вставки были суб-клонированы в pBluescript II KS с последующим картированием и секвенированием. Было установ-лено, что последовательность гена МЕТазы со-держит 1651 пару осн. (см. SEQ. ID. № 4).
Пример III
Экспрессия рекомбинантной МЕТазы
Рекомбинантный ген МЕТазы экспрессирова-ли в векторе С5. Этот же вектор применяли для экспрессии МТАазы (см. Пример VII заявки США № 08/176 855 от 29 декабря 1993). Единственную колонию рекомбинантной E.coli с клонированным C5 использовали для инокуляции 50 мл культуры. Была использована стандартная среда LB с до-бавкой 50 мкг/мл ампициллина в указанную куль-туру и бактериальные культуры большого объема. Инокулированную 50 мл культуру инкубировали при 37С в течение ночи. Затем эту культуру раз-водили в 100 раз свежей средой LB. Клетки выра-щивали в культуре большого объема (11) в тече-ние 1,5 час при сильном встряхивании при 37С. Для индукции экспрессии МЕТазы в культуру большого объема добавляли изопропилтио--D-галактозид (IPTG) в конечной концентрации 0,01, 0,1 и 1 мМ, и культуры дополнительно инкубиро-вали в течение 4 час. Оптимальная концентрация IPTG для экспрессии белка составляла 1 мM.
Через четыре часа после добавления IPTG клетки отделяли центрифугированием при 19000 g в течение 10 мин при 4С. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали и промывали холодным солевым раствором и повторно центрифугирова-ли. Ресуспендированный осадок клеток промыва-ли 100-200 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 15 мкМ 2-меркаптоэтанола. Затем добавляли 1 мM ЭДТК и 30 мкМ пиридок-саль-5’-фосфата (буфер А) и еще раз центрифуги-ровали осадок. Отмытую ресуспендированную (в буфере) суспензию клеток помещали в устройство для разрушения клеток, которое проводили под давлением 155 кг/см2 N2 в течение 20 мин при 4С. Лизированные клетки центрифугировали при 43000 g в течение 20 мин при 4С. Супернатант, полученный из клеточного экстракта, очищали на колонке для аффинной хроматоврафии с красите-лями-лигандами.
Клеточный экстракт (10 мл) помещали на ко-лонку с гелем “DYEMATRIX” (Orange А) (Amicon Inc., Beverly, МА.) (12х2,6 см). Колонку наполняли и уравновешивали согласно инструкциям произ-водителя. Затем образец, нанесенный на колонку, промывала 5 объемами буфера А для удаления несвязанного материала. Связанный продукт элю-ировали линейным градиентом 0-1,5 М КСl в бу-фере А. Фракции по 10 мл собирали и анализиро-вали с использованием у-лиазы. Фракции с основ-ным пиком активности метионин у-лиазы объеди-няли и концентрировали до 2-3 мл с помощью “CENTRICON 30” (Amicon Inc.).
К концентрированным фракциям (0,314 г/мл) добавляли (NH4)2SO4 в твердом виде, получая ко-нечную концентрацию 2,4 М. Полученные образ-цы центрифугировали при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант фильтровали с помощью 0,45 фильтра acrodis (Amicon Inc.) Колонку уравнове-шивали 2,4 М (NH4)2SO4, растворенным в буфере А. Связанный белок элюировали буфером с ли-нейно понижающимся градиевтом концентрации (NH4)2SO4 (скорость 0,5 мл/мин). Фракции с актив-ностью МЕТазы объединяли и концентрировали, как описано выше. Концентрацию белка опреде-ляли способом, предложенным Bradford.
Чистоту препарата фермента проверяли в SDS-10% глицин-трис 1 мм геле (Novex, San Diego, СА). Активность МЕТазы определяли измерением количества образующейся 2-кетомасляной кисло-ты способом Esaki & Skoda (Меth Enzymol. 143: 459 465 (1987), содержание которого включено в настоящее описание. Полученный фермент имел специфичную активность 300 ед/мл, где 1 ед = 1 мкМ продукта, получающегося в мин.
Пример IV
Селективное голодание МТАаза-отрицательных клеток в линиях клеток немелко-клеточного рака легких
МТАаза-отрицательные линии клеток немел-коклеточного рака легких, идентифицированные в примере 1, обрабатывали in vitro в культуре кле-ток МЕТазой и МТА в соответствии с терапевти-ческим способом, предложенным в изобретении. Фермент-положительные (SK-MES-l) и фермент-отрицательные (А-549) линии клеток культивиро-вали, в течение 4 дней в следующих средах: а) метионин-содержащей среде с добавлением 10% диализованной лошадиной сыворотки, б) среде с пониженным содержанием метионина с добавле-нием 10% диализованной лошадиной сыворотки, в) среде с пониженным содержанием метионина с добавлением 10% диализованной лошадиной сыворотки и 16 мкМ MeSAdo. Пролиферация ука-занных клеточных линий, особенно фермент-отрицательных клеток А- 549, значительно задер-живалась в среде без метионина (27 и 3,3%) от роста в контроле для SK-MES-l и А-549, соответ-ственно). Добавление МТА в указанную среду усиливало рост фермент-положительных клеток SK-MES-l (77% от роста в контроле). Однако, про-лиферация фермент-отрицательных клеток А-549 не усиливалась в присутствии МТА (4,3%, от ро-ста в контроле) (табл. 2).
Эти данные показывают, что рост MeSAdo- фосфорилаза-отрицательных клеток может быть селективно блокирован в среде с пониженным содержанием метионина с добавлением MeSAdo.
Таблица 2
Рост (% к контролю)b
Линия Наличие Без метионина
клеток ферментаа Без MeSAdo C MeSAdo
SK-MES-1 + 27 2.6 77 4.7
A-549 - 3.3 0.6 4.3 1.1
a +, наличие; - отсутствие.
b Процент роста в контроле = 100 х (рост клеток на среде с пониженным содержанием метионина с или без МТА)/(рост клеток на среде с метиони-ном).
Пример V
Метиониновое голодание злокачественных клеток человека, обусловленное рекомбинантной МЕТазой
Для изучения антипролиферативных эффек-тов рекомбинантной МТАазы, полученной, как описано в примерах II и III, клетки DMEM SK-MES-l и А-549 культивировали в среде и 10% диа-лизованной эмбриональной бычьей сыворотке с добавлением 0,06 ед/мл рекомбинантной МЕТазы. Через три дня определяли наличие пролиферации клеток. Эффект МЕТазы выражали в процентах относительно роста клеток в среде без фермента.
Как показано на фиг. 4, рост клеток фермент-положительной (SK-MES-l) и фермент-отрицательной (А-549) линий в средах с добавле-нием МЕТазы усиливался на 26,6 и 2,96%, соот-ветственно. Однако, при добавлении 20 мкг МТА в качестве альтернативного источника клеточного метионина рост клеток восстанавливался до 61,4%, от уровня контроля у фермент-положительных клеток, тогда как рост фермент-отрицательных клеток снижался до 2%.
Список последовательностей:
SEQ. ID. № l - последовательность аминокислот полной МТАазы.
SEQ. ID. № 2 - последовательность аминокислот антигенного пептида МТАазы.
SEQ. ID. № 3 - последовательность аминокислот антигенного пептида МТАазы, отличная от после-довательности аминокислот пептида SEQ. ID. № 2.
SEQ. ID. № 4- последовательность нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего МЕТазу.
SEQ. ID. № 5 - последовательность аминокислот МЕТазы, выведенная на основе последовательно-сти нуклеотидов SEQ. ID. № 4.
Аминокислота метионии (МЕТ) необходима для роста нормальных и злокачественных клеток. Для некоторых злокачественных клеток это тре-бование является абсолютным, например без адекватного снабжения метионином эти клетки погибают.
Клетки млекопитающих получают МЕТ из трех источников. Он может быть получен из пищи или при биохимическом синтезе МЕТ из L- гомо-цистеина (гомоцистеина) или метилтиоаденозина (МТА) (как продукт пути биосинтеза полиаминов). В последнем случае МТА превращается в МЕТ с помощью метилтиоаденозинфосфорилазы (МТАазы).
За последнее десятилетие исследователи идентифицировали много линий злокачественных клеток, которые не имеют МТАазы и не могут вследствие этого превращать МТА в МЕТ. Напри-мер, Katamari и соавт., Рrос. Nat’l Acad. Sci. USA, 78: 1219-1213(1981) сообщают, что 23% из 3 ли-ний клеток злокачественных опухолей человека не имели определяемой МТАазы, при этом актив-ность МТАазы имелась в каждой из 16 изученных линий. МТАаза-отрицательные клетки удовлетво-ряют свою потребность в МВТ конверсией гомо-цистеина. Однако при недоступности гомоцистеи-на эти клетки погибают.
L-Метионин-L-дезамино-у-меркаптометанлиаза (ЕD 4.4.1.11; МЕТаза), как известно, разлагает не только МЕТ, но и гомоци-стеин. Вследствие этого теоретически возможно заставить голодать злокачественные клетки, не имеющие МТАазы (т.е., МТАаза-отрицательные клетки), разложением МЕТ плазмы и гомоцистеи-на с помощью МЕТазы. При этом ожидается, что нормальные МТАаза-положительные клетки бу-дут удовлетворять потребность в МЕТ постоян-ным превращением МТА в МЕТ.
Разработка этого подхода была начата в 1972 г. Кrеis в Cancer Treat. Rprts., 63: 1069-1072 (1972). Используя 11 линий злокачественных кле-ток в культурах, не содержащих МЕТ, Кrеis инги-бировал рост ряда злокачественных клеток введе-нием в культуры МТАазы. Он также обнаружил, что 2 линии нормальных клеток были частично “излечены” от эффектов МЕТ-голодания при до-бавлении в культуры гомоцистеина. Однако, не-смотря на обнадеживающие результаты исследо-ваний in vitro, Кreis описал ряд препятствий, стоя-щих на пути успешного применения МТАазы в химиотерапии in vivo, в том числе недоступность средств, обеспечивающих выживание нормальных клеток in vivo, потенциальную иммуногенность очищенного или частично очищенного фермента и необходимость получения фермента, устойчивого к разложению протеолитическими ферментами in vivо (Kreis, Chemotherapy (Muggia, FM, ed. The Hague, Boston and London: Martinus-Nijihoff, 1983) стр. 219- 248). Другим препятствием разработки успешного подхода к МЕТ-голоданию злокаче-ственных клеток оказалась необходимость иден-тифицикации злокачественных новообразований, являющихся подходящими мишенями для терапии, т.е. определение МТАаза-отрицательных злокаче-ственных новообразований. В соответствии с этим был разработан способ анализа, который опреде-ляет, является ли злокачественное новообразова-ние МТАаза-отрицательным, по определению, проявляется ли какая-либо каталитическая актив-ность в культуре клеток (Seidenfeld et al., Biochem. Biophys. Res. Соmmun., 95: 1861-1866, 1980). Од-нако, вследствие промышленной недоступности необходимого для анализа радиохимического субстрата, его применение в рутинных определе-ниях в настоящее время неосуществимо. Более того, анализ не объясняет каталитическую актив-ность МТАазы in vitro, поскольку с его помощью нельзя определить, присутствует ли в культуре клеток какой-либо фермент, независимо от опре-деления, является ли он каталитически активным во время проведения анализа.
Этого ограничения в анализе активности можно избежать, разработав способ иммуноана-лиза, который с значительно большей чувстви-тельностью определяет относительно малые ко-личества фермента. Однако, выделение фермента МТАазы из природных источников для получения антител, применяющихся в иммунологической детекции МТАазы, оказалось трудоемким процес-сом, который дает относительно низкий выход (Rangion et al., J. Bid. Chem., 261: 12324-12329/1986).
Даже в случае разработки адекватных спо-соба детекции МТАаза-отрицательных клеток получение адекватного количества МЕТазы из природных источников остается таким же слож-ным, как и получение МТАазы. Получение МЕ-Тазы средствами, отличными от выделения натив-ного фермента, пока не достигнуто, что отчасти объясняется неполным секвенированием гена МЕ-Тазы (Nakayama et. al., Biochem. 27: 1587-1592, 1988).
В связи с указанными причинами, эффектив-ный подход к осуществлению in vivo МЕТ-голодания МТАаза-отрицательных злокачествен-ных клеток остается нереализованным. В данном изобретении предлагается разработка этого под-хода.
Изобретение предусматривает усовершен-ствованный способ селективного голодания МТАаза-отрицательных клеток в сочетании со средствами детекции МТАаза-отрицательных клеток. Согласно этому способу, злокачественные новообразования, которые были идентифицирова-ны как являющиеся МТАаза-отрицательными, обрабатывают терапевтически эффективным ко-личеством МЕТазы, предпочтительно рекомби-нантной МЕТазы, наиболее предпочтительно рекомбинантной МЕТазы, конъюгированной с полиэтиленгликолем или эквивалентной молеку-лой. В частности, МЕТазу вводят млекопитающим (предпочтительно человеку) в дозе, которая сни-жает уровень МЕТ в плазме до уровня, вызываю-щего метиониновое голодание МТАаза-отрицательных клеток (обычно не более 10% до-терапевтического уровня метионина). Нормаль-ные (МТАаза-положительные) клетки получают метионин посредством введения МТА.
Изобретение также предусматривает способ детекции МТАаза-отрицательных клеток в злока-чественных новообразованиях, в частности полу-чение антител (в том числе моноклональных анти-тел) и их применение в иммуноанализе МТАазы. Изобретение также позволяет определять наличие гена, который кодирует МТАазу, применяя способ на основе амплификации нуклеиновых кислот, в частности полимеразно-цепьевую реакцию (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинант-ной МЕТазе, полученной при выделении и клони-ровании гена, кодирующего МЕТазу, что обеспе-чивает получение значительных количеств МЕТа-зы для применения в способах, предлагаемых в данном изобретении.
На фиг. 1 показана схема пути метаболизма при синтезе полиаминов и восстановление МТА с помощью МТАазы.
Фиг. 2 представляет сравнение МТАаза-положительных и МТАаза-отрицательных чело-веческих и других линий клеток, определенных иммуноблоттингом.
Фиг. 3 представляет сравнение МТАаза-положительных и МТАаза-отрицательных линий клеток человека и первичных клонов, определен-ных иммуноблоттингом.
Фиг. 4 представляет сравнение роста МТАаза-отрицательных клеток человека, обрабо-танных МЕТазой, и таких же клеток, выросших в среде, богатой метионином.
Способ детекции МТАаза-отрицательных клеток.
На фиг. 1 схематически представлены пути метаболизма при синтезе in vivo МЕТ из МТА и деградации МЕТ МЕТазой. Как указано выше, для успешной терапии рака метиониновым голодани-ем необходима детским МТА-отрицательных кле-ток в целевом злокачественном новообразовании. Для этой цели предложен описанный ниже способ детекции МТАазы, пригодный для применения в способах по изобретению.
А. Способ иммуноанализа МТАазы
1. Получение антигенных МТАазы и пепти-дов МТАазы.
Антитела, специфичные к МТАазе, получают иммунизацией животных антигенными МТАазой или пептидами МТАазы. В основном антигенные пептиды МТАазы выделяют и очищают из тканей млекопитающих способом, описанным (Rangion et al., J. Bid. Chem., 265: 6241-6246 (1990). Пример, иллюстрирующий применение этого способа, представлен ниже. Аминокислотная последова-тельность полной МТА представлена в SEQ. ID. № 1.
2. Иммунизация антигенными пептидами МТАазы для получения антител против МТАазы.
При наличии антигенных пептидов антитела против иммунизирующих пептидов получают введением пептидов млекопитающим, например кроликам, мышам или крысам. Для иллюстрации последовательности аминокислот двух антиген-ных пептюдов МТАазы приведены в Списке по-следовательностей в приложении, приведенном в конце описания, как SEQ. ID. № 2 и № 3. Антитела, образованные кроликами, иммунизированными этими пептидами, проявили 50%, максимального ответа на очищенную МТАазу, соответственно в разведениях 1:1500 и 1:4000.
Протокол множественной инъекционной им-мунизации предпочтителен для использования при иммунизации животных антигенными пептидами МТАазы (см., например, Langone et al., eds., “Production of Antisera with Small Doses of Immunigen: Multople Intradermal Injections”, Methods of Enzymology (Acad. Press, 1981). Например, хороший иммунный ответ получают у кроликов при внутрикожной инъекции 1 мг анти-генного пептида МТАазы, эмульгированного в Полном адъюванте Фрейнда, с последующими одной-несколькими вторичными инъекциями этого же антигена в указанном адьюванте через не-сколько недель.
При желании иммунизирующий пептид может быть связан с белком-носителем посредством конъюгации с помощью известных способов. Обычно используют носители, химически связан-ные с пептидом, включая гемоцианин лимфы улит-ки (KLH), тироглобулин, бычий сывороточный альбумин (BSA) и токсоид столбняка. Связанный белок применяют затем для иммунизации живот-ного, например мыши или кролика. Поскольку считается, что МТАаза является консервативной для видов млекопитающих, предпочтительно при-менение белков-носителей для повышения имму-ногенности белка МТАазы.
Поликлональные антитела, образуемые жи-вотными, могут быть очищены, например, связы-ванием с матриксом, с которым были связаны пеп-тиды, соответствующие антителам, и последую-щей элюцией с него. Исследователям известны различные иммунологические способы очистки и/или концентрирования поликлональных антител и моноклональных антител (см., например Coligan et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
Для детекции МТАаза-отрицательных клеток предпочтительно применение моноклональных антител, вследствие их специфичности и простоты получения. Для получения моноклональных анти-тел предпочтительна иммунизация мышей или крыс. Термин “антитело” применяют в настоящем изобретении для обозначения интактных молекул и их фрагментов, например Fab и F(ab’)2, которые способны связывать эпитопную детерминанту. Также в данном контексте термин “mAb’s изобре-тения” означает моноклональные антитела, спе-цифичные к МТАазе.
Основным способом получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела (mAb’s), является известный способ, предложен-ный Kohler and Milstein, Nature, 256: 495/1975). Он предусматривает выделение лимфоцитов из реги-ональных лимфоузлов пяти различных онкологи-ческих больных с меланомой, тератокарциномой или раком шейки матки, глиомы или легкого. Лим-фоциты получали из хирургического материала, смешивали их и сливали с SHFP-l. Гибридомы отбирали по продукции антител, связанных с ли-ниями раковых клеток. Для получения и иденти-фикации mAb’s со специфичностью к МТАазе можно использовать эквивалентные способы.
Подтверждение специфичности к МТАазе среди mAb’s изобретения получают с помощью относительно рутинных способов скрининга, например твердофазного иммуноферментного анализа ELISA, для определения элементарных реакционных образцов mAb.
Возможно установление идентичности спе-цифичности mAb со специфичностью mAb изобре-тения без проведения экспериментов, определяю-щих, препятствуют ли тестируемые mAb связыва-нию mAb изобретения с МТАазой. Если тестируе-мые mAb конкурируют в связывании с mAb изоб-ретения, вероятно, что эти два моноклональных антитела связывают один и тот же или близкие эпитопы.
Иным путем установления идентичности спе-цифичности mAb со специфичностью mAb изобре-тения является предварительное инкубирование mAb изобретения с антигеном, который в норме реактивен, и определение, ингибируется ли спо-собность тестируемых mAb связывать антиген. В случае ингибирования тестируемых mAb, вероят-но, что они имеют такую же или близкую эпитоп-ную специфичность, как mAb изобретения.
3. Способ иммуноанализа для детекции МТАаза-отрицательных клеток
Полученные, как описано выше, подходящие антитела используют для детекции МТАазы в злокачественных новообразованиях. Пример им-муноанализа для этой цели (например, способ иммуноблоттинга) представлен в примере 1 ниже. Однако, специалистам известны иные описанные в других источниках способы иммуноанализа для детекции антител, применяющие жидкую или твердую фазы (при связывании с носителем). Де-текция МТАазы с помощью антител против МТАазы может быть осуществлена способами иммуноанализа, которые проводят предваритель-но, после или одновременно, в том числе иммуно-гистохимическими способами анализа физиологи-ческих образцов. Подходящие способы иммуно-анализа содержат конкурентный и неконкурент-ный способы, которые проводят прямым или не-прямым образом. Примерами способов иммуно-анализа являются радиоиммуноанализ (RIА) и сэндвичевый (иммунометрический) анализ. Иссле-дователям известны также иные способы иммуно-анализа.
Кроме того, в антитела, применяемые в имму-ноанализах, может быть введена определяемая метка. Метка представляет собой вещество, кото-рое ковалентно связано или прочно ассоциирова-но с зондом нуклеиновой кислоты, что обеспечи-вает детекцию зонда. Например, метка может представлять собой радиоизотоп, ферментный субстрат или ингибитор, фермент, контрастное вещество (в том числе коллоидные металлы), лю-минофоры, хемолюминесцентные молекулы, липо-сомы, содержащие любую из указанных меток, или члены специфично связывающихся пар. Под-ходящая метка не теряет определяемости в тече-ние амплификации.
Специалистам в области диагностики извест-ны соответствующие определяемые метки для использования в детекционных анализах in vitro. Например, подходящими радиоизотопами для применения in vitro являются 3Н, 125I, 131I, 32Р, 14С, 35S. Амплифицированные фрагменты с радиоизо-топными метками определяют непосредственно с помощью счетчика гамма-излучения, авторадио-графией или саузерн-блоттингом амплифициро-ванных фрагментов в сочетании с денситометрией. Примерами подходящих хемолюминесцентных молекул являются акридины и люминал. Целевые последовательности, гибридизованные с зондами, деривированными акридиновым эфиром, защище-ны от гидролиза интеркаляцией. Примерами под-ходящих люминофоров служат флуоресцеин, фикобилипротеин, хелаты редкоземельных метал-лов, дансил или родамин.
Примерами подходящих ферментных суб-стратов или ингибиторов являются соединения, которые специфично связывают пероксидазу хре-на, глюкозоксидазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, -галактозидазу, пируват-киназу или щелочную фосфатазу ацетилхо-линэстеразу. Примерами контрастных веществ служат коллоидное золото или магнитные части-цы.
Специфично связывающиеся пары содержат две различные молекулы. На поверхности или в полости одной из них имеется область, которая специфично связывается с другой молекулой, об-ладающей определенной пространственной и полярной организацией. Членов специфично свя-зывающейся пары часто называют лиганд и ре-цептор или лиганд и антилиганд. Например, если рецептор представлен антителом, лигандом явля-ется соответствующий антиген. Иные специфично связывающиеся пары представлены парами гор-мон-рецептор, фермент-субстрат, биотин-авидин и гликопротеин-рецептор. Сюда же относятся фраг-менты и часта специфично связывающихся пар, сохраняющие специфичность связывания, напри-мер фрагменты иммуноглобулинов, в том числе фрагменты Fab и т.п. Антитела могут быть моно- и поликлональными. При использовании члена спе-цифично связывающейся пары в качестве метки, предпочтительным способом разделения является аффинная хроматография.
Антитела могут быть также связаны с носи-телем. Примерами известных носителей являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилозы, природные или моди-фицированные целлюлозы, полиакриламиды, ага-розы и магнетит. Носитель может быть раствори-мым или нерастворимым в зависимости от целей изобретения. Исследователям известны иные но-сители для связывания антител, их также можно получить обычными способами.
В. Детекция МТАаза-отрицательных клеток с по-мощью анализа на основе ПЦР.
С целью упрощения и ускорения детекции МТАаза-отрицательных клеток предпочтительно проведение анализа с использованием описанных МТАаза-специфичных антител. Однако, известны иные средства для детекции наличия МТАаза-отрицательных клеток в злокачественных новооб-разованиях. Например, используя описание нук-леиновой кислоты в SЕQ. ID. № 1, исследователь может сконструировать олигонуклеотидные зон-ды, гибридизующиеся с ДНК МТАазы, присут-ствующей в образце клеток. Кроме того, поскольку считается, что недостаточность МТАазы обу-словлена геномной делецией гена, кодирующего белок МТАазы, можно заключить, что определе-ние в образце клеток отсутствия гена, кодирующе-го МТАазу, указывает на то, что эти клетки явля-ются МТАаза-отрицательными .
Детальное описание способа амплификации и детекции гена МТАазы приведено в находящей-ся на рассмотрении заявке США № 08/176855 от 29 декабря 1993 г., содержание которой в части, относящейся к способу, включено в данное описа-ние путем отсылки.
С. МТАаза-отрицательные кандидаты для тера-пии МТАазным голоданием.
Для терапии согласно изобретению (терапии МЕТ-голоданием) отбирают злокачественные новообразования, в которых не определяется ка-талитически активный или каталитически неак-тивный белок МТАазы. Во всех исследованных к настоящему времени линиях злокачественных клеток МТАаза-отрицательность (при ее наличии) является отличительным признаком клеточной популяции. Иными словами, если некоторые клет-ки злокачественного новообразования являются МТАаза-отрицательными, можно ожидать, что все клетки новообразования будут МТАаза-отрицательными. Это соответствует имеющимся представлениям, что недостаточность МТАазы является результатом делеции гена, а не мутации. Гомогенность злокачественных новообразований по МТАаза-недостаточности значительно повы-шает эффективность МЕТ-голодания в качестве средства противораковой терапии по сравнению с терапевтическими способами, основанными на гетерогенных признаках, например на терапии моноклональными антителами против опухоле-вых антигенов. Однако, для целей изобретения важно, чтобы злокачественное новообразование имело существенную недостаточность МТАазы, например не содержало определяемых количеств белка МТАазы.
К злокачественным новообразованиям чело-века, которые, как полагают в настоящее время, отличаются существенной недостаточностью МТАазы, относятся новообразования, приведен-ные в табл.1.
С помощью описанных способов детекции исследователи могут определить недостаточность МТАазы в иных злокачественных новообразова-ниях без чрезмерных экспериментов.
II. Терапия с помощью МЕТ-голодания
А. Получение МЕТазы
Для реализации способов изобретения необ-ходимы источники МТА и МЕТазы. Средства для получения МТА описаны выше. В данном изобре-тении МЕТазу выделяют из микроорганизмов, в том числе Trichomonas vaginalis (Lockwood et al., J. Biochem. 279: 675-682, 1991), Clostridium sporo-genes (Kries et al., supra, 1867, EC4.4.1.11) и Pseu-domoaas putida (Nakayama et al., Biochem., 27: 1587-1591, 1988).
С помощью библиотеки к ДНК, сконструиро-ванной из Р. putida, идентифицировали полную нуклеотидную последовательность МЕТазы. Она приведена в Списке последовательностей SEQ. ID. № 4, аминокислотная последовательность приве-дена в SEQ. ID. № 5.
Эта информация дает возможность легко син-тезировать МЕТазу или экспрессировать ее из клона ДНК с помощью известных способов, опи-санных выше применительно к МТАазе. Пример клонирования МЕТазы и ее экспрессии в E.coli представлен ниже в примерах II и III.
Очищенную, частично очищенную, синтези-рованную или рекомбинантную МЕТазу приме-няют в терапевтическом способе согласно изобре-тению. Предпочтительна рекомбинантная МЕТа-за, поскольку ее легко получить и она обладает относительно низкой иммуногенностью. Иммуно-генность фермента может быть дополнительно понижена связыванием его с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или эквивалентной биологически совмести-мой молекулой. Связывание с ПЭГ может также снизить период полужизни конъюгата МЕТазы in vivo.
Конъюгат ПЭГ-МЕТаза получают ковалент-ным связыванием ПЭГ с ферментом, как описано для L-аспарагина (Benedich е1 а1., din Ехр. lalmunol. 48: 273-278, 1982). Способы связывания ПЭГ с белками известны, и не описываются де-тально в данной заявке. Результаты, полученные при лечении больных с лимфомой Неходжкинса L-аспарагиназой, связанной с ПЭГ, не предполагают значительного снижения активности МЕТазы in vivo при связывании с ПЭГ (см. результаты, полу-ченные in vivo с ПЭГ-L-acпарагиназой, представ-ленные Muss et al., Invest. New Drugs, 8: 125-130 (1990). Исследователям известны иные средства увеличения периода полужизни белков in vivo, которые могут быть использованы в случае МЕ-Тазы, в том числе, но не ограничены ими, это гли-козилирование и сукцинилирование.
В. Терапевтические способы
Злокачественные новообразования с значи-тельной недостаточностью МЕТазы лечат соглас-но представленному в изобретении способу при-менения МЕТазы. Предпочтителен выбор злокаче-ственных новообразований, в отношении которых может быть использована региональная хемоте-рапия, например злокачественных новообразова-ний, локализованных или содержащихся в обла-сти тела, которая доступна для внутриартериаль-ного, наружного, чрескожного или эквивалентного им способу введения МЕТазы непосредственно в место новообразования. Примерами злокаче-ственных новообразований, чувствительных к региональной терапии, являются меланомы, рак яичников (введение через перитонеальный кате-тер) и рак мочевого пузыря (введение через уретральный катетер). Онкологам также известны другие злокачественные новообразования, кото-рые, если они МТАаза-отрицательные, можно лечить с помощью региональной хемотерапии по изобретению.
Специалисты оценят возможность системного применения предлагаемых в изобретении терапев-тических препаратов. Однако, дозы препаратов должны быть приведены в соответствие с их кли-ренсом и потенциальной токсичностью в отноше-нии нормальных клеток. В частности, необходимы мониторинг клинических проявлений метионино-вого голодания нормальных клеток и его компен-сация введением дополнительных количеств МТА.
Злокачественные новообразования с суще-ственной недостаточностью МТАазы предпочти-тельно лечат согласно изобретению, как описано ниже.
МЕТазу вводят млекопитающим (в частности, человеку) парентерально, предпочтительно внут-риартериально. МЕТазу вводят в фармацевтиче-ски приемлемом носителе, который может содер-жать стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных рас-творителей являются пропиленгликоль, полиэти-ленгликоль, растительные масла, например олив-ковое масло, и пригодные для инъекций органиче-ские эфиры, например этилалеат. Водные носите-ли включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и буферные среды. Как указано выше, для снижения иммуногенности предпочтительно использование конъюгата МЕТазы с ПЭГ.
Носители для парентерального введения представлены раствором хлорида натрия, декс-трозой Рингера, декстрозой и хлоридом натрия, маслами Рингера с лактозой или иммобилизован-ными. Носители для внутривенного введения представлены жидкостями, питательными напол-нителями и электролитными наполнителями, например на основе декстрозы Рингера, и т.п. Воз-можно введение консервантов и иных добавок, например антимикробных агентов, антиоксидан-тов, хелатирующих агентов, инертных газов и т.п.
Доза МЕТазы составляет 10-20000, предпо-чтительно 5000-6000 ед/м2 (или ниже при внутри-артериальном введении) при одном - нескольких введениях в неделю в течение одного - нескольких дней. МЕТаза обычно выводится из организма млекопитающего в течение 24 час после введения. При использовании средств, пролонгирующих период полужизни фермента, например конъюга-ции с ПЭГ, этот период может быть увеличен на несколько часов - несколько дней. Вследствие этого необходим мониторинг уровня метионина в плазме млекопитающего и введение дополнитель-ных доз МЕТазы для получения терапевтически значимого снижения концентрации метионина в плазме млекопитающего. Это снижение должно быть достаточным для индукции заметного уменьшения объема МТАаза-отрицательных клеток, например уменьшения объема злокаче-ственных клеток или опухоли у млекопитающего. Доза, обеспечивающая такой результат, является терапевтически эффективной дозой. Исследования на грызунах in vivo с использованием частично очищенной МЕТазы показали, что терапевтически эффективной дозой является доза, снижающая уровень метионина в плазме до содержания не более 10% от предтерапевтического уровня.
Мониторинг уровня метионна в плазме (и его изменений) можно проводить с помощью периоди-ческих (желательно ежедневных) анализов in vitro образцов крови пациента, получающего МЕТазу, в течение курса лечения. На основании результа-тов исследований, проведенных на грызунах, можно ожидать снижения уровня метионина в плазме до не более 10%, через один час после введения МЕТазы. Способы анализа метионина в плазме известны. Например, концентрацию мети-онина в плазме определяют способом газожид-костной хроматографии этерифицированных ами-нокислот (н-бутиловый эфир) (Roach et al., J. Chromatog. 44: 269-278 (1969). Известны также иные способы определения метионина в плазме.
Следует отметить, что МТАаза не может раз-рушать внутриклеточный метионин, поэтому адекватное поступление МТА для образования внутриклеточного метионина обеспечивает выжи-вание МТАаза-положительных клеток при сниже-нии уровня экзогенного метионина МЕТазой. Од-нако, без введения экзогенного метионина (или L-гoмоцистеина как субстрата для образования метионина, также разлагаемого МЕТазой) МТАаза-отрицательные клетки с абсолютной потребностью в метионине не выживут при отсут-ствии метионина в плазме.
Подтверждение и мониторинг эффективности терапии можно проводить на основании клиниче-ских данных об уменьшении клеточного объема злокачественного новообразования, получаемых известными способами, а также по данным перио-дического определения объема МТА-отрицательных клеток в злокачественном новооб-разовании описанными в данной заявке средства-ми. На основании клинических данных, получен-ных при использовании L-аспарагиназы для лече-ния онкологических больных, можно ожидать, что токсичность МЕТазы будет очень низкой и выра-женной в основном в аллергических реакциях, которые лечат известными способами, например введением эпинефрина.
Поэтому МТА следует вводить млекопитаю-щим совместно с МЕТазой, при этом предпочти-тельно одновременное введение. Поскольку МТА не является субстратом для МЕТазы, их можно смешивать в одном фармацевтически приемлемом носителе. Альтернативно МТА можно вводить через 24 час после введения МЕТазы (предпочти-тельно раньше) с целью “поддержания” МТАаза-положительных клеток с истощающимся запасом эндогенного метионина.
Доза МТА, необходимая для поддержания нормальных клеток, зависит от ряда клинических факторов, в том числе локализации злокачествен-ного новообразования, объема МТАаза-отрицательных клеток в новообразовании, про-должительности МТАаза-терапии и доступности для пациента МЕТ в пище. В общем случае МТА вводят в дозах, достаточных для поддержания уровня метионина в плазме до значения 1-10 МКМ.
Примеры, иллюстрирующие полное описание изобретения на практике, даны ниже. Эти приме-ры, однако, не ограничивают объем изобретения, который определен прилагаемой формулой изоб-ретения.
В примерах мин означает минуты, час - часы, а для обозначения единиц измерения, например мл, используются принятые сокращения.
Пример I
Способ иммуноанализа МТАазы
А. Получение антител против МТАазы
МТАазу выделили из бычьей печени, как опи-сано Rangione et al., см.выше. Ряд трипептидов из выделенного фермента секвенировали известными способами. На основе полученных последова-тельностей пептиды 40 (из 18 аминокислот, SEQ. ID. № 2) и 51 (из 14 аминокислот, SEQ. ID. № 3) синтезировали модифицированным твердофазным способом Merrifield (Chen et al., Proc Nat’L Acad. Sci. USA, 81: 1784-1788, 1984). Bce пептиды со-держали остаток цистеина на С-конце для облег-чения связывания с белком-носителем, KLH, с помощью эфира m-малеимидобензоил-К-гидроксисукцимида.
Новозеландских белых кроликов (два кроли-ка на пептид) иммунизировали в течение двух месяцев конъюгатами пептид-KLH. Первичные инъекции содержали 1 мг синтетического конъ-югата пептид-KLH, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Вторичные инъекции содер-жали 1 мг антигена в неполном адъюванте Фрейн-да. После 3-4 инъекций сыворотки частично очи-щали 50% насыщенным раствором сульфата ам-мония и исследовали на наличие антипептидной и анти-МTАазной реакции с помощью ELISA.
В частности, планшеты для микротитрования предварительно покрывали. пептидами или МТАазой в концентрации 10 мкг/мл в BBS (0,2 М бората натрия - 0,15 М NaCI, рН 8,5) и выдержи-вали в течение ночи при 4С. Затем планшеты однократно промывали BBS, содержащим 0,05% Твин 20, и инкубировали в течение 4 час с BBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбу-мина, для блокирования неспецифичных сайтов связывания. Затем контрольную сыворотку и ин-дуцированную пептидом антисыворотку в раз-личных разведениях вносили в 0,1 мл аликвотах и инкубировали в течение ночи. Планшеты дважды промывали BBS, содержащим 0,05% Tween 20, и в течение 1 час обрабатывали меченным щелочной фосфатазой иммуноглобулином козы против кро-лика F(ab’)2 (Jackson Laboratories, Inc., West Grove, PA) в разведении 1:1000 в BBS. Затем планшеты промывали и добавляли в каждую лунку 0,2 мл -0,1 М динатриевой соли р-нитрофенилфосфата в 0,1 М растворе бикарбоната натрия, рН 9,0. По-глощение измеряли при длине волны 40,5 нм через 30 мин.
В. Способ иммуноблоттинга иммунореактивной МТАазы
Было определено присутствие МТАаза- от-рицательных клеток в ряде линий клеток человека и биопсий опухолей (см. табл. 1, случаи, помечен-ные “иммуноанализ”). Другими МТАаза-положительными образцами оказались BV-173 (хронический миелогенный лейкоз, CML), Molt-16 (острый лимфолейкоз, ALL), Malt-4 (ALL), U397 (гистиоцитная лимфома), SUP-TS (ALL), U-373MG (глиобластома) и T98G (глиобластома).
Клеточные экстракты, полученные из фер-мент-положительных клеток, подвергли электро-форезу в 12,5% полиакриламидном геле, содер-жащем 0,1% додецилсульфата натрия, вместе с нанесением различных количеств МТАазы, выде-ленной из бычьей печени, как описано выше.
В частности, неочищенные клеточные экс-тракты (10-150 мкг на 1 дорожку) разделили элек-трофорезом в 12,5% полиакриламидном геле, со-держащем 0,1% додецилсульфата натрия. После электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны (0,45 мм, Bio-Rad, Richmond, СА) неспецифические сайты связывания блокировали 3% порошковыми молоком в BBS. Белки обрабатывали в течение 16 час при комнатной температуре антисывороткой, разведенной 1:500 в BBS, содержащем 3% порош-ковое молоко. Затем белки промыли избытком BBS и провели детекцию реактивных бэндов по связыванию 125I-белка А (ICN Radiochemicals, Irvine, СА) в течение 1 час. Мембраны промыли, наложили на бумажные полотенца и экспониро-вали на пленке Kodak XAR-5 (tm) при 70С.
Бэнды на авторадиограммах сканировали денситометром (Bio-Rad) и определили их количе-ство с помощью калибровочной кривой, получен-ной при определении иммунореактивных бэндов очищенного фермента.
С. Результаты
В 67% (4 из 6) линий и биопсий нелегочных клеток, например в глиомах, отмечена полная недостаточность в иммунореактивном ферменте (фиг. 2). 5 из 6 последовательных образцов биоп-сий из глиом человека с различными гистологиче-скими характеристиками (табл. 1) были с полной недостаточностью (фиг. 3). Контрольные опыты показали, что в норме мозг человека обладает значительной активностью МТАазы (фиг. 3, до-рожка 7). Таким образом, полная недостаточность МТАазы является обычной и специфичной мета-болической аномалией в глиомах человека.
Из 19 исследованных линий клеток немелко-клеточного рака легких МТАаза полностью от-сутствовала в 6 линиях клеток (см. табл. 1 и фиг. 4).
Таблица 1
Злокачественные новообразова-ния метод определения
недостаточности МТАзы:
Немелкоклеточные раки легких: Иммуноанализ •
А-549 (Аденосаркома)
Sk-Lu-1 (Аденосаркома)
Н322 (бронхоальвеолярный
рак)
Н1334 (крупноклеточная кар-
цинома)
Н1437 (аденосаркома)
Н1581 (крупноклеточная кар-
цинома)
* Линии клеток опухолей мозга: Иммуноанализ •
А-172
U-87MG
U-138MG
Hs683
Первичные опухоли мозга: Иммуноанализ •
Астроцитома
Мультиформная глиоблас-
тома
Олигосроцитома
Лимфомы и лейкемии: Иммуноанализ •
СЕМ (острый лимфолейкоз)
К-Т-1 (острый лимфолейкоз)
NALL-1 (острый лимфолей-
коз)
К562 (хронический миело-
лейкоз)
DHL-9 (злокачественная
лимфома)
HSB2 (острый лимфолейкоз)
Другие:
256 сарциносаркома Уолкера Клинические дан-ные**
Jurkat Иммуноанализ***
K562 Иммуноанализ***
Capan-1 (аденосаркома под-
желудочной железы) Иммуноанализ****
Примечания:
*получены из Американской Коллекции Типовых культур, Роквилл, Мериленд.
**описано Kreis et al., Cancer Res., 33: 1866-1869 (1973)
***описано Rangione et al., Biochem. J. 281: 533-538 (1992)
****описано Kreis et al., Cancer Trmt. Rpts., 63: 1069-1072 (1979)
• недостаточность МТАазы во всех других злокаче-ственных новообразованиях была определена и описана Nobori et al., Cancer Res. 53: 1098-1101 (1993), Cancer Res. 51: 3193-3197 (1991).
Пример II
Клонирование МБТазы из Pseudomonas putida
На основании частичной аминокислотной последовательности МЕТазы, опубликованной Wakayama et al., Diochem., 27: 1587- 1591, 1988), были сконструированы дегенерированные олиго-нуклеотидные праймеры, которые использовали в ПЦР при анализе гена МЕТазы.
С помощью ПЦР амплифицировали фрагмент из приблизительно 300 пар оснований, который был субклонировон в плазмидный вектор pBluescript II КS (Stratagene, San Diego). С помо-щью внутреннего олигонуклеотидного зонда этот субклонированный продукт ПЦР проанализиро-вали с использованием саузерн-блоттинга с целью подтверждения идентичности фрагмента гену МЕТазы. Дальнейший анализ с помощью саузерн-блоттинга показал, что этот фрагмент, получен-ный при ПЦР, гибридизуется с фрагментом 5,0 т.п.н. Bgl 11 в ДНК Pseudomollas putida.
На основании этих результатов сконструиро-вали бактериофаговую библиотеку геномной ДНК, содержащую геномную ДНК Pseudomonas putida. Расщепленную Bgl II ДНК Pseudomonas putida разделили электрофорезом в 0,8% в агароз-ном геле с низкой точкой плавления. Фрагменты Bgl II размером 4/т.п.н. - б/т.п.н. были вырезаны и выделены из геля. C помощью фрагмента Klenow эти фрагменты Bgl II были частично наполнены и субклонированы в бактериофаговый вектор yFix II. Этот вектор расщепили Xho I и частично наполнили Klenow. Библиотеку упаковали в бак-териофаговые частицы с помощью упаковываю-щего экстракта gigapack (Stratagene). После упа-ковки библиотеку амплифицировали и оттитрова-ли.
Для выделения полного гена МЕТазы прове-ли скрипнет библиотеки, используя фрагмент, полученный с помощью ПЦР. После скрининга 200000 клонов было отобрано 8 независимых первичных клонов, из которых только два были истинно положительными и уникальными. Первый клон содержал вставку 5,1 т.п.н., а второй клон содержал вставку 5,9 т.п.н. Эти вставки были суб-клонированы в pBluescript II KS с последующим картированием и секвенированием. Было установ-лено, что последовательность гена МЕТазы со-держит 1651 пару осн. (см. SEQ. ID. № 4).
Пример III
Экспрессия рекомбинантной МЕТазы
Рекомбинантный ген МЕТазы экспрессирова-ли в векторе С5. Этот же вектор применяли для экспрессии МТАазы (см. Пример VII заявки США № 08/176 855 от 29 декабря 1993). Единственную колонию рекомбинантной E.coli с клонированным C5 использовали для инокуляции 50 мл культуры. Была использована стандартная среда LB с до-бавкой 50 мкг/мл ампициллина в указанную куль-туру и бактериальные культуры большого объема. Инокулированную 50 мл культуру инкубировали при 37С в течение ночи. Затем эту культуру раз-водили в 100 раз свежей средой LB. Клетки выра-щивали в культуре большого объема (11) в тече-ние 1,5 час при сильном встряхивании при 37С. Для индукции экспрессии МЕТазы в культуру большого объема добавляли изопропилтио--D-галактозид (IPTG) в конечной концентрации 0,01, 0,1 и 1 мМ, и культуры дополнительно инкубиро-вали в течение 4 час. Оптимальная концентрация IPTG для экспрессии белка составляла 1 мM.
Через четыре часа после добавления IPTG клетки отделяли центрифугированием при 19000 g в течение 10 мин при 4С. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали и промывали холодным солевым раствором и повторно центрифугирова-ли. Ресуспендированный осадок клеток промыва-ли 100-200 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 15 мкМ 2-меркаптоэтанола. Затем добавляли 1 мM ЭДТК и 30 мкМ пиридок-саль-5’-фосфата (буфер А) и еще раз центрифуги-ровали осадок. Отмытую ресуспендированную (в буфере) суспензию клеток помещали в устройство для разрушения клеток, которое проводили под давлением 155 кг/см2 N2 в течение 20 мин при 4С. Лизированные клетки центрифугировали при 43000 g в течение 20 мин при 4С. Супернатант, полученный из клеточного экстракта, очищали на колонке для аффинной хроматоврафии с красите-лями-лигандами.
Клеточный экстракт (10 мл) помещали на ко-лонку с гелем “DYEMATRIX” (Orange А) (Amicon Inc., Beverly, МА.) (12х2,6 см). Колонку наполняли и уравновешивали согласно инструкциям произ-водителя. Затем образец, нанесенный на колонку, промывала 5 объемами буфера А для удаления несвязанного материала. Связанный продукт элю-ировали линейным градиентом 0-1,5 М КСl в бу-фере А. Фракции по 10 мл собирали и анализиро-вали с использованием у-лиазы. Фракции с основ-ным пиком активности метионин у-лиазы объеди-няли и концентрировали до 2-3 мл с помощью “CENTRICON 30” (Amicon Inc.).
К концентрированным фракциям (0,314 г/мл) добавляли (NH4)2SO4 в твердом виде, получая ко-нечную концентрацию 2,4 М. Полученные образ-цы центрифугировали при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант фильтровали с помощью 0,45 фильтра acrodis (Amicon Inc.) Колонку уравнове-шивали 2,4 М (NH4)2SO4, растворенным в буфере А. Связанный белок элюировали буфером с ли-нейно понижающимся градиевтом концентрации (NH4)2SO4 (скорость 0,5 мл/мин). Фракции с актив-ностью МЕТазы объединяли и концентрировали, как описано выше. Концентрацию белка опреде-ляли способом, предложенным Bradford.
Чистоту препарата фермента проверяли в SDS-10% глицин-трис 1 мм геле (Novex, San Diego, СА). Активность МЕТазы определяли измерением количества образующейся 2-кетомасляной кисло-ты способом Esaki & Skoda (Меth Enzymol. 143: 459 465 (1987), содержание которого включено в настоящее описание. Полученный фермент имел специфичную активность 300 ед/мл, где 1 ед = 1 мкМ продукта, получающегося в мин.
Пример IV
Селективное голодание МТАаза-отрицательных клеток в линиях клеток немелко-клеточного рака легких
МТАаза-отрицательные линии клеток немел-коклеточного рака легких, идентифицированные в примере 1, обрабатывали in vitro в культуре кле-ток МЕТазой и МТА в соответствии с терапевти-ческим способом, предложенным в изобретении. Фермент-положительные (SK-MES-l) и фермент-отрицательные (А-549) линии клеток культивиро-вали, в течение 4 дней в следующих средах: а) метионин-содержащей среде с добавлением 10% диализованной лошадиной сыворотки, б) среде с пониженным содержанием метионина с добавле-нием 10% диализованной лошадиной сыворотки, в) среде с пониженным содержанием метионина с добавлением 10% диализованной лошадиной сыворотки и 16 мкМ MeSAdo. Пролиферация ука-занных клеточных линий, особенно фермент-отрицательных клеток А- 549, значительно задер-живалась в среде без метионина (27 и 3,3%) от роста в контроле для SK-MES-l и А-549, соответ-ственно). Добавление МТА в указанную среду усиливало рост фермент-положительных клеток SK-MES-l (77% от роста в контроле). Однако, про-лиферация фермент-отрицательных клеток А-549 не усиливалась в присутствии МТА (4,3%, от ро-ста в контроле) (табл. 2).
Эти данные показывают, что рост MeSAdo- фосфорилаза-отрицательных клеток может быть селективно блокирован в среде с пониженным содержанием метионина с добавлением MeSAdo.
Таблица 2
Рост (% к контролю)b
Линия Наличие Без метионина
клеток ферментаа Без MeSAdo C MeSAdo
SK-MES-1 + 27 2.6 77 4.7
A-549 - 3.3 0.6 4.3 1.1
a +, наличие; - отсутствие.
b Процент роста в контроле = 100 х (рост клеток на среде с пониженным содержанием метионина с или без МТА)/(рост клеток на среде с метиони-ном).
Пример V
Метиониновое голодание злокачественных клеток человека, обусловленное рекомбинантной МЕТазой
Для изучения антипролиферативных эффек-тов рекомбинантной МТАазы, полученной, как описано в примерах II и III, клетки DMEM SK-MES-l и А-549 культивировали в среде и 10% диа-лизованной эмбриональной бычьей сыворотке с добавлением 0,06 ед/мл рекомбинантной МЕТазы. Через три дня определяли наличие пролиферации клеток. Эффект МЕТазы выражали в процентах относительно роста клеток в среде без фермента.
Как показано на фиг. 4, рост клеток фермент-положительной (SK-MES-l) и фермент-отрицательной (А-549) линий в средах с добавле-нием МЕТазы усиливался на 26,6 и 2,96%, соот-ветственно. Однако, при добавлении 20 мкг МТА в качестве альтернативного источника клеточного метионина рост клеток восстанавливался до 61,4%, от уровня контроля у фермент-положительных клеток, тогда как рост фермент-отрицательных клеток снижался до 2%.
Список последовательностей:
SEQ. ID. № l - последовательность аминокислот полной МТАазы.
SEQ. ID. № 2 - последовательность аминокислот антигенного пептида МТАазы.
SEQ. ID. № 3 - последовательность аминокислот антигенного пептида МТАазы, отличная от после-довательности аминокислот пептида SEQ. ID. № 2.
SEQ. ID. № 4- последовательность нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего МЕТазу.
SEQ. ID. № 5 - последовательность аминокислот МЕТазы, выведенная на основе последовательно-сти нуклеотидов SEQ. ID. № 4.
(56) Документы, цитированные в отчёте
WO 92/00757, 23.01.92. Dushange et al. Structure of Met. IBLF... J. Biol. Chem. - 1983. 258, p. 14868 - 14871.
📎 Прикреплённые файлы
-
294.pdf⬇ Скачать