СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВИРУСВАКЦИНЫ ОСПЫ КОЗ

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к изготовлению вакцин.
Способ включает изготовление вакцины по общеизвестному способу. При этом используют вируссодержащий патологический материал, со-держащий эпизоотический местный штамм вируса оспы коз «Д» и проводят его 10-кратное разведение.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к изготовлению вакцин.
Наиболее близким к заявляемому является известный способ изготовления вакцины (1, 2), имеющий некоторые сходные с заявляемой разработкой существенные признаки такие как, приготовление первично-трипсинизированной культуры клеток; использование сыворотки крупного рога-того скота и питательной среды Игла-МЭМ и суспензии трипановой сини в соотношении 1:1; разливание на стерильные матрасы емкостью 100, 200, 500 и 1000 мл; хранение в течение суток в термостате или в инкубаторе при t=+37+38°С; добавление суспензии, содержащей вирусный штамм; последовательное разведение вируса (с 10-1 до 10-12) в поддерживающей среде Игла-МЭМ; определение стерильности; использование лактозы (4%) и пептонный 20% стабилизатор для лиофилизации; изучение биологической и вирулентной характеристик путем введения штамма.
Недостатками прототипа являются дефицит, дороговизна и низкий показатель эпизоотической эффективности вакцины.
Целью изобретения является разработка но-вой, дешевой и более подходящей для условий Таджикистана вакцины для профилактики оспы коз, причем из эпизоотических лиофилизированных штаммов вируса оспы коз с повышенной эффективностью воздействия.
Поставленная цель была достигнута на основе изучения выявленных местных штаммов коз хозяйств (Дангаринского р-на) Республики Таджикистан. При изучении штаммов были проведены общеизвестные методы и способы, заключающиеся в следующем:
1.Приготовление первичнотрипсинизированных культур клеток.
Для получения культуры клеток проводили обескровливание суягных (беременных) коз и овец, затем извлекали плоды ягнят и козлят. В асептических условиях от плодов отбирали почки, легкие и тестикулы. Органы отмывали от крови рабочим раствором Хенкса с добавлением антибиотика (200 ЕД бензилпенициллина калиевая соль и 200 мкг стрептомицина сульфат на см3). После этого в легкие вводили 0,25% раствор трипсина (t=+37°С) до появления разрывов под оболочкой (другие органы погружали в этот же раствор). Затем органы измельчали ножницами на кусочки размером 2-3 мм. Измельченную ткань промывали рабочим раствором Хенкса с антибиотиками до просветления непосадочной жидкости. Промытую ткань заливали 0,25%-ым раствором трипсина (t=+37°С) и помещали на магнитную мешалку в течение 10-15 минут. После этого надосадок сливали, а в колбу заливали свежий раствор трипсина. Дезагрегацию повторяли до полного истощения ткани. Полученный надосадок центрифугировали при 1000 об/мин-10 минут. Надосадок ресуспендировали питательной средой Игла - МЭМ с добавлением 10 % сыворотки крови козы и вносили в культуральные сосуды.
2. Для выращивания и поддержания культуры клеток использовали сыворотку крупного рогатого скота и питательную среду Игла-МЭМ.
3. Из полученной суспензии брали 0,5 мл и добавляли трипановую синь в соотношении 1:1 и встряхивали. Трипановую синь готовили по схеме: 500 мг порошка на 100 мл дистиллированной воды. Эта процедура нужна для подсчета количества клеток. Мертвые клетки окрашивались краской синего цвета. Количество клеток вычисляли по формуле:
Н = X • 1000 • 2 ,
0,9

где, Н - концентрация клеток (тысяча клеток /1 мл); Х- количество клеток в камере; 2- коэффициент разведения.
Посадочная концентрация культуры клеток 100-120 тысяч клеток в 1 мл. Если количество клеток выше 100 - 120 тысяч клеток в 1 мл, тогда следует разбавить питательной средой до нужной концентрации.
4. Готовую суспензию культуры клеток разливали на стерильные матрасы емкостью 100 мл - 200 мл.
5. После чего, матрасы оставили в термостат (37-38°С) под резиновыми пробками или в инкуба-торе под ватно-марлевыми пробками на сутки.
6. Затем всю суспензию сливали из матрасов и туда же наливали суспензию из патологического материала, содержащий вирусный штамм «Д» и оставляли на 48 часов. После чего сливали весь материал с вирусами. Готовили последовательные 15-кратные разведения вируса (с 10-1 до 10-12) в поддерживающей среде Игла-МЭМ. Каждое раз-ведение вируса вносили по 1 см3 в 4 пробирки с суточным монослоем клеток. В качестве контроля брали пробирки с неинфицированной культурой клеток. Культивирование вируса проводили при температуре 37±0,5°С. Через каждые 2-3 суток производили смену поддерживающей среды. Про-бирки ежедневно в течение 15 суток просматривали под световым микроскопом на наличие цитопатических изменений. Титр вируса определяли по методу Риза и Менча.
7. Определение стерильности проводили по ГОСТ- 2885-89.
Отсутствие в пробирках роста грибной и бактериальной микрофлоры указывало на стерильность проверяемого образца.
8. Для лиофилизации использовали лактозу (4%), пептонный 20% стабилизатор, который смешивали в равных объёмах с культуральные виру-сом, полученным в клинических матрасах. Техническую жидкость разливали по ампулам (0,3-0,5 см3), промораживали при -50°С и лиофилизирова-ли на сублимационных установках Heto и Hetosicc. Лиофилизацию материала проводили в течение 18-20 часов при остаточном давлении в камере 45-70 мкм рт. ст. Досушивание вируса вели при -18-20° С в течение 3-4 часов. Отпайку ампул проводили без вакуума в потоке стерильного воз-духа.

9. Биологическую характеристику изучали путём введения изучаемого штамма овцам, козам, кроликам и белым мышам.
10. Маркерная характеристика:
Иммунологические свойства и безвредность изучали после приготовления вакцины из выше-указанных штаммов и вакцинировали по 2 головы из каждой серии, на козах 6-7 месячного возраста, которых прививали опытными сериями препарата в количестве 1-ой прививной дозы. Материал вводили подкожно в подмышечную область в объёме 1,0 см3 через 14 суток после прививки, этих коз и одну контрольную заразили внутрикожно в под-хвостовую складку вирулентным вирусом ОК штамм «Д» в дозе 1000 ИД50 в объёме 0,5 см3. После контрольного заражения у двух привитых коз в течение 3-4 суток отмечали повышение темпера-туры тела, которое не превышало 40,5°С, без клинического проявления болезни. Титр ВН-антител в сыворотке крови опытных животных на 14 сутки после прививки составлял 1:2 - 1:4, что указывает на возможность использования этой реакции для оценки иммуногенности вакцины (исключая контрольное заражение). Контрольный козлёнок за-болел на 4-е сутки и пал с характерными признаками оспы на 16 сутки после заражения. В течение 7-ми суток температурная реакция у него была в пределах 41,6 - 41,8°С. Учитывая имеющиеся сведения о возможной циркуляции в полевых условиях вируса оспы коз на овцах, была также изучена безвредность вирус вакцины для этого вида животных. С этой целью 2-м ягнятам 6-7-ми месячного возраста и 2-м взрослым овцам вводили смесь двух серий вакцины (подкожно в подмышечную область) в количестве 100 прививочных доз. За животными вели наблюдение с ежедневной тер-мометрией в течение 21 суток. В течение этого срока козы оставались клинически здоровыми. На 6-7-е сутки у одной козы (привитой вирус вакциной серии № 1) отмечали 3-х дневное повышение температуры тела (до 40,7°С) без реакции на месте введения вируса. Таким образом, было показано, что испытуемые серии вирус вакцины безвредны для коз при введении им 100 прививных доз вакцины. Овцы клинически не реагировали на вакцинацию, что указывает на безвредность вакцины, полученной на основе штамма «Д» и для этого вида животных. Таким образом, проведённые исследования указывают на безвредность и иммуногенность экспериментальной серии вирус вакцины, полученной на основе штамма «Д» для коз. Вакцина была также безвредна и для ягнят и взрослых овец. Производственные испытания этого образца вирус вакцины в полевых условиях были проведены в хозяйствах Оксу, С. Кабирова и Дангара Дангаринского района на 1250 головах коз и на 800 головах овец.
11. Биотехнологическая характеристика (название и свойства полезного штамма вируса).
12. Вирулентная характеристика: вирулентность определяли путём введения вирулентным вирусом ОК штамма «Д» в дозе 1000 ИД50 в объёме 0,5 см3 внутрикожно в подхвостовую складку 6-7 месячного возраста козы.
13. Признаки штаммов вируса оспы коз:
а) родословные вируса;
б) проведено 20 пассажей с целью изучения его реверсибельности путём введения культурального вируса на восприимчивых животных и в культуре клеток;
в) ростовая характеристика (выращивание вируса в культуре клеток) - проводили по стандартным общепринятым условиям.
Результаты исследования показали, что вы-деленный эпизоотический штамм вируса оспы коз «Д» является стабильным без участия посторонних микрофлор и вирулентным для коз.
Результаты экспериментальных и производственных опытов показывают, что вирус вакцина, производимая из эпизоотических штаммов вируса оспы коз «Д» является безвредной и иммуногенов. Его применение позволит предупреждать заболевание коз оспой и повышать сохранность коз до 98-100%.
Изобретение позволяет проводить профилактику оспы коз, выявлять эпизоотические штаммы вирусов и своевременно проводить вакцинацию из того же вида штамма вируса, а также по регионам определять и оккупировать вспышки оспы коз и овец.

1. Методические указания по поддержанию при-виваемых клеточных линий и хранению их рас-плодок в жидком азоте. Москва, 1979 г.
2. Методические указания по перфузионной дезогрегации почек поросят, телят и ягнят для получения свежеизолированных клеток и их выращиванию в пристеночных культурах. Москва, 1990 г.