СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ЯВАНСКОЙ ГАЛЛОВОЙ НЕМАТОДЕ РАСТЕНИЙ

Для получения растений, проявляющих устойчивость к заражению яванскими галловыми нематодами, проводится идентификация гена, который выражен на нематодном питающем сайте зараженного растения. Промотор гена питающего сайта выделяется и ассоциируется с последовательностью, которая кодирует молекулу, неблагоприятную для заражения яванской галловой нематодой. Далее растение трансформируется построенным таким образом химерным геном.

Настоящее изобретение касается сопротив-ляемости растений разрушающим воздействиям, вызываемым заражением яванской галловой нема-тодой.
Яванские галловые нематоды (Meloidogyne spp) являются основными болезнетворными бакте-риями для многих полезных растений, например, для овощных культур, пищевых бобовых культур, табака, томатов, арбуза обыкновенного, виногра-да, земляного ореха и хлопка.
Химическая борьба, агротехнические приемы и использование устойчивых разновидностей рас-тений являются основными подходами к борьбе с нематодами, которые в настоящее время доступны и очень часто применяются совместно друг с дру-гом для борьбы с яванской галловой нематодой. Существует необходимость в повышении эффек-тивности борьбы с нематодами, поскольку ука-занные подходы очень часто не отвечают требо-ваниям защиты сельскохозяйственных культур. Нематоды сомнительны для окружающей среды по своему воздействию и не всегда эффективны. Агротехнические приемы борьбы приводят к скрытым потерям у садоводов, проявляемым раз-личным образом. Широкий диапазон хозяев яван-ских галловых нематод ограничивает доступность не являющихся хозяином культур в экономическом отношении.
Эффективные устойчивые сорта часто недо-ступны, и те сорта, которые садовод может ис-пользовать, иногда усовершенствуют за счет чув-ствительных сортов при низких плотностях яван-ских галловых нематод. Кроме того, сопротивляе-мость может быть потеряна при высоких темпера-турах почвы в тропических и субтропических условиях. Когда яванская галловая нематода вторгается в корень растения, она мигрирует внутрь клеток до тех пор, пока не достигает кор-невой меристемы. В таком случае секреции гло-точных желез впрыскиваются через заостренный зонд нематоды в клетки в области меристемы. Это приводит к нормальному развитию данных клеток, которые должны разрываться, в л результате чего будет происходить деление ядер без деления кле-ток. Таким путем происходит образование много-ядерных клеток, известных как “гигантские клет-ки”. Образованию этих гигантских клеток сопут-ствует расширение окружающих клеток, извест-ных под названием гипертрофических клеток, на которые нематоды не воздействуют при непосред-ственной пенетрации через зонд. Эти гигантские клетки и окружающие их гипертрофические клетки совместно друг с другом образуют питающий сайт яванских галловых нематод. Наблюдаемый узе-лок, образующийся на зараженном корне, состоит их таких гигантских клеток и сопутствующих им гипертрофических клеток, которые являются ре-зультатом множественности заражения нематода-ми. Механизмы образования гигантских клеток одинаковы у всех высокочувствительных разно-видностей растений.

После индуцирования гигантских клеток яванская галловая нематода теряет двигательную способность по мере того, как происходит питание нематодой на гигантской клетке, и нематода ста-новится связанной, препятствуя питанию, разви-тию и воспроизведению на питающем сайте.
В Международной патентной заявке WO 92/04453 описывается способ борьбы с корневыми кистевыми нематодами. В статье под названием “Gene Expression in Nematode-Infected Plant Roots”, авторов Gurr et al., (1991 г.), описывается способ, имеющий отношение к картофельным кистовым нематодам, получения комплементар-ной ДНК (кДНК) из информационной РНК (мРНК), которая находится в синцитиуме растения, кото-рое было заражено корневой кистевой нематодой.
Предметом настоящего изобретения является способ продуцирования стойких к яванской гал-ловой нематоде растений, где в растении, зара-женном яванской галловой нематодой, идентифи-цируется ген, который выражен в гигантских клет-ках и/или сопутствующих им гипертрофических клетках корневых наростов растений, выбирается промотор указанного гена и сливается с кодиру-ющей последовательностью, давая химерный ген, который кодирует молекулу, неблагоприятную для одной или нескольких клеток (нематод) из числа следующих: 1. гигантские клетки корневых утолщений, 2. гипертрофические клетки корневых утолщений и 3. яванские галловые нематоды, и затем растение трансформируется указанным химерным геном.
Растения, которым может сообщаться стой-кость к яванской галловой нематоде, согласно настоящему изобретению, включают: овощные культуры, бобовые растения, табак, съедобные фруктовые растения, съедобные ореховые расте-ния и хлопок. Так например, что касается овощ-ных культур, то данное изобретение может быть применимо для корнеплодов, и что касается фрук-товых растений, то оно может быть применимо для томатов.
Поскольку механизм продуцирования гигант-ских клеток одинаков у всех высокочувствитель-ных видов растений, то способ данного изобрете-ния фактически применим для всех таких видов, которые могут трансформироваться в соответ-ствии с трансформационным этапом по способу данного изобретения.
Способ данного изобретения применим для растительных видов Meloidogyne, включая, но не ограничиваясь растительными видами М.incognita, M.javanica, M.arenaria и M.hapla.
Идентифицированный ген, выбранный из за-раженного растения, является предпочтительно таким геном, экспрессия которого происходит не ранее того, как нематода теряет свою двигатель-ную способность.
Последовательности (в химерном гене), ко торые должны быть выражены под контролем указанного промотора, включают одну или более, чем одну из числа следующих:
1. Кодирующая последовательность молеку-лы, которая вызывает некроз гигантских клеток и/или гипертрофических клеток.
2. Кодирующая последовательность молеку-лы, которая вызывает некроз яванской галловой нематоды.
3. Кодирующая последовательность любого из ряда ферментов, которые обладают активно-стью, отрицательно влияющей на метаболизм.
4. Антисенс специфическому гену питающего сайта.
5. Антисенс кодирующей последовательности фермента, являющегося критическим для клеточ-ного метаболизма растения.
Необходима гарантия того, чтобы был вы-бран такой ген, который выражается лишь в ги-гантских клетках и/или сопутствующих им-гипертрофических клетках, поскольку если ген выражается на другом сайте, то продукт экспрес-сии химерного гена, продуцированный на другом сайте, может оказывать отрицательное воздей-ствие на трансформированное растение.
Преимуществом настоящего изобретения яв-ляется то, что растению может придаваться устойчивость к яванской галловой нематоде без необходимости продуцирования антинематодно-го инфекционного продукта, перечисленного выше в п.п. 1-5.
Предпочтительный способ осуществления данного изобретения не описывается.

РОСТ И ИНФЕКЦИОННОЕ ЗАРАЖЕНИЕ ТАБАЧНЫХ РАСТЕНИЙ
Семена табачного растения С319 проращи-вали на компосте Fisons F1 при нижеследующих условиях. Сила света от 4500 до 5000 Люкс, 16 - часовые периоды светового освещения, чередую-щиеся с 8 - часовыми периодами темноты, темпе-ратура от 20С до 25С. Через три недели сажен-цы слегка промывали водопроводной водой для удаления почвы, и растения переносили в мешоч-ки (по два растения на мешочек, Northrup-King) и выращивали еще в течение недели при 25С при воздействии света силой 5500 Люкс, с 16-часовыми периодами освещения, чередующимися с 8 -часовыми периодами темноты. Корни выни-мали со дна мешочка и поддерживали их по краям бумагой из стекловолокна Whatman GF/A. Затем нематоды трехдневного возраста (M.javanica) подавали к концам этих корней в виде 10 мкл аликвот (50 нематод), и сверху накладывали на концы корней второй лист бумаги GF/A для пол-ной инкапсуляции корневого конца. Через 24 часа после инфекционного заражения бумагу GF/A удаляли для гарантии синхронного инфекционйо-го заражения. Через три дня после заражения кор-ни отсекали (оставляя сзади здоровый корень и ткань корневого конца) и тотчас замораживали в жидком азоте. С 80 инокулированных растений можно было собрать от 0,5 до 1 г инфекционно зараженной корневой ткани.

5 287 6
ОКРАШИВАНИЕ С ЦЕЛЬЮ ВИЗУАЛИЗА-ЦИИ НЕМАТОД В ЗАРАЖЕННЫХ КОРНЯХ
Для определения качества инфекционного за-ражения определяли число нематод (инфицирую-щих) на корневой конец. Корни собирали через три дня после заражения растений и погружали на 90 секунд в лактофенол, содержащий 0,1%. Хлопковый синий при температуре 95С. После пятиминутной промывки в воде корни помещали в лактофенол при комнатной температуре сроком на 3-4 дня для осветления. Окрашенные нематоды визуализировались с помощью оптического мик-роскопа.

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ ЗДОРОВОЙ И ИН-ФЕКЦИОННО ЗАРАЖЕННОЙ КОРНЕВОЙ ТКА-НИ
Корневую ткань измельчали в тонкий поро-шок с помощью ступки и пестика с одновремен-ным охлаждением (жидким азотом). Затем аликво-ты объемом примерно 100 мг переносили в анало-гичным образом охлажденные пробирки Эппен-дорфа и вводили 300 мкл горячего фенольного экстракционного буфера (50% фенола, 50% экс-тракционного буфера: 0,1 Мол, хлорид лития, 0,1М трис-HCI, pH=8,0 (Комнат.темп.), 10 мM ЭДТУ, 1% додецилсульфата натрия), и осуществ-ляли термостатирование в течение 5 минут при 80. Затем вводили равный объем хлороформа, и гомогенат подвергался микроцентрифугированию в течение 15 минут при 4С. Водную фазу затем экстрагировали 600 мкл фенола/хлороформа и подвергали микроцентрифугированию, как указа-но выше. После этого водную фазу снова удаляли, и затем РНК осаждали равным объемом хлорида лития при 4°С в течение ночи. Осадок уплотняли микроцентрифугированием в течение 15 минут при комнатной температуре и промывали в 70%-ном этаноле. Уплотненный осадок затем лиофилизи-ровали, повторно суспензировали в DEPC, обра-ботанном водой, и анализировали с помощью спектрофотометра. Качество РНК определяли посредством денатурирующего гель-электрофореза. (Данный метод принят Shirzadegan et al., 1991 г.).

СУБТРАКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ИН-ФЕКЦИОННО СПЕЦИФИЧЕСКИХ кДНКаз
Поли(А) + РНК (мРНК) выделяли из 200 мкг образцов РНК (суммарно) от здоровой и заражен-ной С319 корневой ткани с использованием маг-нитных олиго dT Динасфер согласно инструкциям изготовителя. Синтез первой нити ДНК осуществ-лялся непосредственно в зоне процесса на связан-ной Динасферами фракции поли (А)+ от здоровой ткани. Это драйверная ДНК. Синтез первой и вто-рой нити осуществляли в месте основного процес-са на связанной Динасферами фракции поли (А)+ от инфекционно зараженной ткани. Это мишене-вая ДНК. Все реакции кДНК осуществлялись с использованием комплекта синтеза кДНК Pharmacia и согласно инструкциям изготовителя. Три олигонуклеотида, SUB21 (5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’), SUB25 (5’TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3’) (по-следовательность от Duguid и Dinauer, 1990г.) и LDTI5 (5’GACAGAAGCGGATCCd(T)153’) (O’Reilly et al., 1991г.) киназировались полинуклеотидоки-назой Т4 согласно Maniatis и др. 1992г. Затем SUB21 и SUB25 гибридизировались, образуя лин-кер, который затем сшивался с мишеневой ДНК лигазой Т4 ДНК согласно King и Blakesley (1986г.). После этого несущие мишень сферы интенсивно промывались с ТЕ, и вторую нить кДНК элюиро-вали при 95С в 5xSSC.
РНК, связанная с драйверной ДНК, которая связана Динасферами, удалялась путем нагрева-ния и элюированная мишеневая ДНК гибридизи-ровалась с драйверной ДНК при 55°С в 5xSSC в течение пяти часов. Негибридизирующаяся мише-невая ДНК отделялась от связанной сферами ги-бридизирующейся мишеневой ДНК при комнатной температуре согласно инструкциям изготовителя, после чего гибридизирующаяся мишеневая ДНК аналогичным образом отделялась от связанной сферами драйверной ДНК при 95С. Элюирован-ная при комнатной температуре мишеневая ДНК затем снова добавлялась к драйверной ДНК, и гибридизация повторялась. Этот процесс повто-рялся до тех пор, пока количество мишеневой ДНК, гибридизирующей с драйверной ДНК, уже больше не превышало то количество, которое не гибридизируется. Концентрации ДНК устанавли-вались с использованием погружного измерителя ДНК согласно инструкции пользователя.
Аликвоты конечной, элюированной при ком-натной температуре, фракции использовались для усиления PCR (Eckert et al., 1990г.) для генерации двухниточной кДНК, служащей для клонирования в плазмидный вектор. Усиление мишеневой ДНК достигалось с использованием праймеров SUB21 и LDTI5, и Термического циклизатора, согласно условиям, описанным Frohman et al., 1988г. Про-дукты PCР затем вшивались в вываренный Smal вектор pBluescript согласно King и Blakesley (1986 г).

ОТБОР СУБТРАКТИВНОЙ БИБЛИОТЕКИ ПУТЕМ ОБРАТИМОГО АНАЛИЗА Northern
7 287 8
Рекомбинанты идентифицировались колони-ей PCR (Gussow и Clackson, 1989г). Усиленные вставки подвергались блотированию Southern в трех воспроизведениях на мембранах Pan Biodyne, как описано изготовителем мембран. Предвари-тельную гибридизацию и гибридизацию осу-ществляли при одинаковой температуре, состав-ляющей 42С, и с использованием одинакового буфера, представляющего собой 5xSSPE, 0,05% BLOTTO, 50% формамида. Они гибридизирова-лись по отдельности с пробами кДНК (смотри ниже) от здоровой и от зараженной ткани и с про-бой, состоящей из усиленной мишеневой ДНК от конечного субтракта. Клоны, показывающие сиг-нал гибридизации с зараженной пробой кДНК (исключительно) или показывающее сигнал ги-бридизации с субтрактивной пробой, но не с про-бами кДНК, отбирались для дальнейшего анализа.

ГЕНЕРАЦИЯ ПРОБЫ кДНК
Для получения высокой удельной активности проб для дифференциального отсева, проводили “холодный” синтез кДНК на общей РНК, и затем продукты синтеза подвергали мочению методом олигомечения. Образцы общей РНК в количестве 10 мкг от здоровой и зараженной ткани сначала обрабатывали 2,5 ед. ДНКазы 1 при 37С в тече-ние 15 минут. ДНКаза затем денатурировалась при 95С в течение 10 минут до синтеза кДНК (согласно стандартной процедуре Pharmacia). Затем РНК удаляли в присутствии 0,4М гидрата окиси натрия в течение 10 минут при комнатной температуре, и ДНК очищали, пропуская через колонку со спряденным Сефакрилом 400HR. Вы-ход кДНК и его концентрацию определяли, ис-пользуя погруженные устройства (Инвитроген). Продукты ДНК затем подвергали мочению, как осуществляется процедура стандартного олиго-мечения Pharmacia (концентрация 35 нг/проба).

БЛОТИРОВАНИЕ Northern
Для определения профиля экспрессии кДН-Казы, выбранной путем обратимого анализа Northern в различных тканях растения, в качестве проб использовались клоны в анализах Northern как общей, так и поли (A) + РНК от здоровых и от зараженных корней, стеблей, листьев и цветов. Общие блаты РНК включали 25 мкг ДНК на раз-вод, в то время как поли (А) + блоты включают от 0,5 до 1 мкг РНК на развод. РНК подвергались электрофорезу на формальдегидных гелях и бло-тировались в мембрану Pall Biodyne В, как описа-но Fourney et а1. (1988г.). Пробы подвергались мочению и гибридизировались с блатами, как описано выше.

БЛОТИРОВАНИЕ Southern
Для определения того, являются ли кДНКазы растительного или нематодного происхождения, приготавливали С319 и M.javanica ДНК, как опи-сано Gawel и Jarret (1991г.). Приготавливали бло-ты Southern, включающие 10 мкг ДНК, выварен-ной с EcoRI и HindIII, на развод. Блаты гибриди-зировались с олигомеченными пробами, как опи-сано выше.

ГИБРИДИЗАЦИЯ in situ
Для определения локальности экспрессии вы-зывающей интерес ДНКазы в питающем сайте, осуществляли гибридизацию in situ. Ткани от за-раженных и здоровых корней погружали в пара-фин, секционировали и гибридизировали с проба-ми, как описано Jackson (1991г.).

ВЫДЕЛЕНИЕ 5’ - КОНЦЕВЫХ ЗВЕНЬЕВ мРНКазы
5’-концевые звенья РНКазы, представляющей интерес, определяли до выделения их промотор-ных последовательностей. Это осуществляли с использованием 5’ RACE, как описано Frohman et al., 1988г.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОМОТОРНЫХ ЗОН
9 287 10
Промоторные зоны генов, представляющих интерес, выделяли способом, носящим название Векторно-Сшитые PCR. Сто нанограммов образ-цов вываренной с эндонуклеазой рестрикции С319 геномной ДНК сшивались в течение четырех ча-сов при комнатной температуре (King и Blakesley, 1986г.) с 100 нг образцов pBluescript (вываренных с ферментом рестрикции, продуцирующим сопо-ставимое корневое звено). Обычно использовались ферменты EcoRI, BamHI, HindIII, BGlII, XhoI, ClaI, SalI, KpnI, PstI и SstI. Затем был получен PCR на сшивках с использованием векторного прайме-ра, такого, как -40. Секвенсирующий праймер, и праймера, комплементарного 5’-концевому звену мРНК. Продукты PCR затем клонировались и се-квенсировались. Если необходимо, данная проце-дура повторялась с новым праймером комплемен-тарным 5’-концевому звену промоторного фраг-мента, который гарантирует, чтобы были выделе-ны контрольные последовательности промоторов.
ПОСТРОЕНИЕ ХИМЕРНЫХ ГЕНОВ В БИ-НАРНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТРАНСФОРМАЦИ-ОННЫХ ВЕКТОРАХ
Выделенные промоторы пришивались 5’ к последовательности, представляющей собой по-следовательность одного из классов 1.-5., как по-дробнее изложено выше, примером является ан-тичувствительность самого гена (класса 4) или гена барназы (Hartley et al., 1972г.) (класс 1 и/или 3). Они являются постреенными бинарными векто-рами (Bevan, 1984г.).

ПРОДУЦИРОВАНИЕ ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ
Трансгенные растения, например, табак, мо-гут быть продуцированы методом стандартного листового диска, подвергнутого воздействию Agrobacterium, как описано Horsch et al. (1985 г.), венду чего растение устойчиво к яванской галло-вой нематоде. Семена или побеги растения, явля-ющиеся продуктом, отвечающим данному изобре-тению, могут заразиться для будущего использо-вания.
Как должно быть ясно специалистам в дан-ной области, в случае некоторых классов расте-ний, может быть желательным или необходимым трансформация растения способом иным чем ме-тод с применением Agrobacterium. Кроме того, как должно быть ясно специалистам в данной обла-сти, при заражении растений яванской галловой нематодой продукт данного изобретения - расте-ния уже больше не поддаются указанным вредным воздействиям такого заражения и репродуцирую-щая способность яванских галловых нематод ухудшается, так что популяция таких яванских галловых нематод в почве в месте нахождения растения снижается до экономически незначи-тельного значения.
Устойчивость к яванской галловой нематоде может сообщаться согласно данному изобретению всем чувствительным к яванской галловой нема-тоде однодольным, двудольным, травяным и дре-весным видам растений.

1. WO 92/04453, AI, THE UNIVERSITY OF LEEDS, 19.03.92.
2. Gene Expression in Nematode- Infected Plant Roots /GURR S.J., McPHERSON M.J.; SCOLLAN S. & others.//Mol. Gen. Genet. - 1991. - 226. - p.361-366.
(54) СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ЯВАНСКОЙ ГАЛЛОВОЙ НЕМАТОДЕ РАСТЕ-НИЙ