СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОЖИРЕНИЯ ИЛИ ЕГО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ

В заявке описан способ лечения млекопитающих, страдающих ожирением, или предотвращения наступления ожирения у млекопитающих. Указан-ный способ включает введение млекопитающему эффективного количества гормона роста в комби-нации с эффективным количеством IGF-I. Предпо-чтительно гормон роста вводят таким образом, чтобы в крови обеспечивалось непрерывное нали-чие постоянного терапевтически эффективного его количества, например, с помощью непрерывной инфузии либо частых инъекций или путем приме-нения композиций с пролонгированным действием.

Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к спосо-бу восстановления строения тела, соответству-ющего идеальным параметрам для данной по-пуляции, у страдающих ожирением млекопита-ющих или предупреждения ожирения, прежде всего у людей.
Предпосылки создания изобретения и уро-вень техники
Ожирение представляет собой хроническое заболевание, широко распространенное в со-временном обществе, и приводящее не только к социальным стигматам, но также к снижению продолжительности жизни и многочисленным медицинским проблемам, включающим неблаго-приятное психологическое развитие, расстрой-ства репродуктивной системы, такие, как поли-кистозные заболевания яичников, дерматологи-ческие нарушения, такие, как инфекции, вари-козное расширение вен, Acanthosis nigricans, и экзема, неспособность к физической нагрузке, сахарный диабет, устойчивость к инсулину, гипертензию, гиперхолестеринемию, желчнока-менную болезнь, остеоартрит, ортопедические нарушения, тромбоэмболическую болезнь, рак и ишемическую болезнь сердца. См., например, Rissanen и др., British Medical Journal, 301: 835-837 (1990).
У страдающих ожирением особей имеется тенденция иметь низкие базальные уровни сома-тотропного гормона (или гормона роста (GH - growth hormone) и неспособность секретировать достаточные количества GH в ответ на различ-ные стимулы, включающие гормон, высвобож-дающий гормон роста (GHRH - growth hormone releasing hormone). См., например, Williams, New Engl. J. Med., 311:1403 (1984); Kopelman, Clin. Endocrinol., 23:87 (1985); Kopelman, Clin. Endo-crinol., 24:157 (1986); Loche, Clin. Endocrinol., 27:145 (1987); Ghigo и др., Methabolism, 41:560-563 (1992). Чувствительность GH к GHRH у страдающих ожирением крыс обладает половым диморфизмом. См., например, Cocci и др., Pharmacol. Res., 25: Suppl. 2, 336-337 (1992). Было установлено, что неспособность секрети-ровать GH является результатом нарушения функции гипоталамуса (Kopelman, 1986, см. выше), что приводит к хроническому состоянию гиперсекреции соматостатина. См., например, Cordido, J. Clin. Endocrinol. Metab., 68:290 (1989). Это нарушение в секреции GH, по-видимому, является скорее результатом, чем причиной ожирения, так как оно, по крайней мере частич-но, восстанавливается при снижении веса.
Хотя ранее предполагалось, что неспособ-ность страдающих ожирением особей высво-бождать GH является следствием ингибирования обратной связи, управляемой повышеннными уровнями в плазме инсулиноподобного фактора роста (IGF-I) (Loche и др., Clin. Endocrinol. 27:145-153 (1987)), в действительности не было обнаружено корреляции между IGF-I и индекса-ми избыточного веса. См., например, Cordido и др., Horm. Res. 36:187-191 (1991). Таким обра-зом, тучность не связана с уменьшением уровней IGF-I. См., например, Hochberg и др., Metabolism, 41: 106-112 (1992); Gama и др., Clin. Chim. Acta, 188: 31-38 (1990); Rosskamp и др., Eur. J. Pediatr., 146: 48-50 (1987). Кроме того, ослабленная стимуляция hGH у страдающих ожирением лю-дей не объясняется измененным соотношением hGH и IGF-I. См., например, Jungmann и др., Med. Klin., 86:237-240 (1991). Снижение уровней инсулина в крови не приводит к увеличению способности секретировать GН. См., например Chalew и др., Inter. J. Obesity, 16: 459-463 (1992).
Некоторые болезни, такие, как сахарный диабет, прежде всего юношеский диабет или диабет типа II, проявляются наиболее часто при ожирении. Было обнаружено, что низкие уровни IGFBP-l при ожирении связаны с повышенными уровнями инсулина, которые в свою очередь связаны с распределением жира в организме и устойчивостью к инсулину. Хронически подав-ленные уровни IGFBP-I могут стимулировать биологическую активность IGF, а также регуля-цию им по типу обратной связи секреции GH, таким образом способствуя метаболическим и митогенетическим последствиям ожирения. См., например, Conover и др., J. Clin. Endocrinol. Metab. 74:1355-1360 (1992).
Существующие способы лечения ожирения включают стандартные диеты и физические упражнения, диеты с очень низкой калорийно-стью, поведенческую терапию, лекарственную терапию, включающую вещества, подавляющие аппетит, лекарства, усиливающие термообразо-вание, ингибиторы абсорбции пищи, механиче-ские устройства, такие, как круговая фиксация челюстей, шнуровка талии и надувные пояса, и хирургические средства. См., например, Jung и Chong, Clinical Endocrinology, 35:11-20 (1991), Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55: 538S-544S (1992). В литературе сообщалось, что модифицированная диета с низким содержанием протеинов является эффективной для снижения веса в период поло-вого созревания. См., например. Lee и др., Clin. Pediatr., 31: 234-236 (апрель 1992). Ограничение калорийности в качестве лечения ожирения вы-зывает разложение запасов протеинов в орга-низме (катаболизм) и приводит к отрицательно-му азотному балансу. Поэтому диеты с добавле-нием протеина приобрели популярность в каче-стве средств уменьшения потерь азота за время питания с ограниченной калорийностью. По-скольку такие диеты дают только небольшую экономию азота, то необходим более эффектив-ный путь для сохранения худобы и запасов про-теина. Кроме того, лечение ожирения может быть улучшено, если бы такой режим приводил к ускоренной потере жира в организме. Различные подходы к такому лечению включают, напри-мер, описанные у Weintraub и Bray, Med. Clinics N. Amer., 73: 237 (1989); Bray, Nutrition Reviews, 49: 33 (1991).
5 286 6
GH играет важную роль в регуляции сома-тического роста и метаболизма. Метаболиче-ское воздействие GH подразделяются на первич-ные инсулиноподобные воздействия, связанные с повышением утилизации глюкозы и увеличением аминокислотного транспорта, и на анти-инсулиноподобные воздействия, связанные со стимуляцией липолиза и подавлением утилиза-ции глюкозы. GH усиливает сохранение азота. См., например. Bray и др., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33: 293 (1971).
На производство IGF-I доминирующее сти-мулирующее воздействие оказывает GH, GF также оказывает влияние на некоторые протеи-ны, связывающие IGF-I. Cм. у Tanner и др., Acta Endocrinol., 84: 681-696 (1977); Uthne и др., J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 548-554 (1974). Об-щий обзор по IGF-I см. у Baxter, Advances in Clinical Chemistry, 25: 49 (1986); Clemmons и Underwood, Clinics in Endocrin. and Metab., 15: 629 (1986). Применение IGF-I и GH путем инъек-ции с целью получения прибавления веса и для получения анаболических и усиливающих рост воздействий у млекопитающих, в том числе у больных диабетом пациентов, описано в патенте США 5126324, выданном 30 июня 1992 г.
Известно, что GH ускоряет липолиз у жи-вотных, а также у нормальных и у страдающих ожирением людей. См., например, Raben и Hollenberg, J. Clin. Invest. 38: 484 (1959); Mau-talen и Smith, J. Clin. Endocrinol. Metab., 25: 495 (1965); Felig и др., J. Clin. Invest,, 50: 411 (1971); Jorgenson, Endocr. Reviews, 12, (1991); Martin и др., Inter. J. Obesity, 13: 327-335 (1989); Pfadt и Angulo, Arch. Dis. Child., 66:1261 (1991); Jeevanandam и др., Surgery, 111: 495-502, (1992). GH применяли вместе с производным фенилэта-на для увеличения прибавления веса и анти-липогенной активности у животных. См., напри-мер, патент США 4792546, выданный 20 декабря 1988 г. Липолитическая композиция с использо-ванием фактора роста, такого, как фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста и фактор роста фибробластов, описана в международной заявке WO 92/11838, опубликованной 23 июля 1992 г. Возможность применения GH для лече-ния ожирения также описана у Rivlin, “The Use of Gormones in the Treatment of Obesity”, в Childhood Obesity, ред. Winick (John Willey & Sons: New York, 1975), стр. 151-162, и у Rivlin, Inter. J. Dermatol., 15: 446-449 (1976).
Примеры моделей, показывающих, что вве-дение GH страдающим ожирением особям может стимулировать липолиз, включают крыс с отсе-ченным гипофизом, с вентромедиальным пора-жением гипоталамуса, где GH препятствовал как гиперфагии, так и развитию ожирения (York и Bray, Endocrinology, 90: 885-894 (1972)), и гене-тически страдающих ожирением гомозиготных по гену fa/fa крыс линии Zucker, обладающих пониженным отложением липидов. См., напри-мер. Martin и Jeanrenaud, Int. J. Obesity, 9: 99-104 (1985). см. также у Williams и Frohman, Pharmacotherapy, 6: 311-3189 (1986) и у Rivlin, New Engl. J. Med., 292: 26 (1975).
Некоторые исследования введения GH де-тям с дефицитом GH, многие из которых страда-ют ожирением, показали, что одним из наиболее ранних и наиболее заметных изменений была потеря жировой ткани. См., например, Novak и др., Мауо clin. Proc., 47: 241-246 (1972); Clin и др., Metabolism, 22: 589-595 (1973); Parra и др., Metabolism, 28: 851-857 (1979). Кроме того, у страдающих ожирением людей повышалось содержание свободных жирных кислот, свиде-тельствующее об увеличении липолиза в ответ на инъекцию GH. См., например, Mautalen и Smith, J. Clin. Endocrinol., 25: 495-498 (1965); Blasse, Diabetologia, 4: 20-25 (1968); Bray, Metab)., 29:119-122 (1969).
Кроме того, инъекция GH страдающим ожирением пациентам, находящимся на диете с высоким содержанием углеводов, приводила к большей потере жиров в организме, чем инъек-ция наполнителем. См., например, Snyder и др., J. Clin. Endocrin. Metab., 69: 745 (1989). Также бы-ло обнаружено, что экзогенный GH снижал со-держание жира в организме и увеличивал массу тела, лишенную жира, у престарелых женщин с нарушением эндогенного высвобождения GH (Grist и др., Metabolism, 36:1115-1117 [1987]) и у физически здоровых взрослых людей с нормаль-ной секрецией. См., например. Grist и др., J. Appl. Physiol., 65: 579-584 (1988). Эти изменения про-исходили без модификации диеты или изменений в режимах физиологической активности. В лите-ратуре по крайней мере одной группой исследо-вателей сообщалось, что GH приводит к увели-чению окисления жира при нахождении на диете с ограниченной калорийностью. см. Bray, J. Clin. Endocrinol. Metab., 29:119 (1969). Однако другие исследователи (Clemmons и др., J. Clin. Endo-crinol. Metab., 64: 878-883 [1987]; Snyder и др., J. Clin. Endocrinol. Metab., 67: 54-61 [1988]; Snyder и др., Am. J. Clin. Nutr., 52: 431-437 [1990]) не обнаружили индуцируемое GH увеличение по-тери жира в организме, когда страдающим ожи-рением взрослым людям во время программы питания с ограниченной калорийностью назна-чали гормон. Было обнаружено, что экзогенный GH снижает содержание жира в организме у страдающих ожирением женщин при очевидном отсутствии значительного ограничения в кало-рийности пищи, а указанный эффект не связан с эндогенной секрецией GH или составом тела. См., например, Skaggs и Crist, Horm. Res., 35:19-24 (1991).
Было установлено, что некоторые проявле-ния старения, включающие разрастание массы жировой ткани, уменьшались в результате вве-дения GH три раза в неделю. См., например, Rudman и др., N. Eng. J. Med., 323:1-6 (1990); Crist и др., Metabolism, 36:1115-1117 (1987).
Имеются данные, что IGF-I снижает уровни глюкозы в крови у крыс и людей при использо-вании для лечения диабета и вторичных эффек-тов гиперинсулинемии, в том числе и у страда-ющих ожирением особей. См., например, Froesch и др., ТЕМ, май/июнь 1990, стр. 254-260, Guler и др., N. Eng. J. Med., 317:137-140 (1987); патент США 4988675, выданный 29 января 1991 г.; Carlsson и др., J. Edocrin., 122: 661-670 (1989); Zenobi и др., J. Clin. Invest, 89:1908-1913 (1992). В отличие от гормона роста GH инсулинопо-добный фактор роста IGF-I и инсулин имеют известный антилиполитический эффект. См., например, Zapf и др., J. Clin. Invest., 77:1768-1775 (1986); Guler и др., N. Eng. J. Med., 317:137-140 (1987); Zapf и др., Eur. J. Biochem., 87: 285-296 (1978); Bolinder и др., Clin. Endocrinol. Metab., 65: 732-737 (1987); Giacca и др., Diabetes, 39: 340-347 (1990). Кроме того, было обнаруже-но, что страдающие ожирением крысы линии Zucker устойчивы к воздействиям IGF-I и инсу-лина на метаболизм глюкозы и аминокислот. См., например, Jacob и др., Diabetes, 41: 691-697 (1992).
Наиболее современное исследование воз-действия IGF-l на состав организма проведено Cottam и др., (Endocrinology, 130: 2924-2930 [1992]), которые инъецировали рекомбинантный человеческий IGF-I (три раза в день в дозе 150 мкг/кг/день в течение 8 недель) кастрированному самцу овцы, которому была назначена диета, состоящая из пеллетированной и измельченной люцерны. Обработка вызывала увеличение уровней IGF-I в плазме, снижение инсулина в плазме и увеличение веса большой берцовой кости, селезенки и почек. Однако несмотря на выраженную эффективность IGF-I, не было об-наружено его заметного воздействия на содер-жание жира в организме. Эти авторы полагают, что полученные результаты согласуются с их более ранними исследованиями (Siddiqui и др., J. Endocrinol., 124:151-158 [1990]), показывающи-ми сходный состав тела при одинаковом весе тела у мышей, выбранных из групп с высокими и низкими концентрациями IGF-I в плазме. Они делают заключение, что воздействия GH на сни-жение жира в организме не медиируются только циркулирующим IGF-I.
В другом исследовании катаболическое со-стояние у молодых крыс вызывали диабетом, дексаметазоном или резекцией кишечника, а затем катаболических животных обрабатывали IGF-I или аналогами IGF-I. См., например, Bal-lard и др. в Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors, ред. Spencer, стр. 617-627 (1991). Авторы сообщают, что инсулиноподобные фак-торы роста IGF вызывали тенденцию к сниже-нию содержания жира в организме.
7 286 8
В продолжительном эксперименте (Guler и др., Acta Endo., 121: 456-464 [1990]) карликовых пуделей обрабатывали в течение 130 дней ре-комбинантным человеческим IGF-I дозами по 6 мг/день. Не было обнаружено изменения общих размеров тела, однако наблюдали снижение индекса массы тела, которое, по предположе-нию авторов, обусловлено IGF-I. Тем не менее, они утверждают, что это предположение может быть интерпретировано с большой осторожно-стью и что рекомбинантный человеческий IGF-I может сильно изменять углеводный и липидный метаболизм в направлении, противоположном действию GH.
В случае обработки крысы с отсеченным гипофизом дозами IGF-I, вызывающими суще-ственное увеличение веса организма и органов, не было обнаружено влияния на химический состав кожи или скелета. В частности, процент-ное содержание жира не изменялось под воздей-ствием обработки IGF-I. См., например, Clarc и Cronin, Abstracts D8, 2-ой International IGF Sym-posium, San Francisco, CA, 1991 г.
В современном обзоре Froesch и др., ТЕМ, 254-260 [май/июнь 1990], обобщающем накоп-ленные к данному моменту знания о воздействии инсулина и IGF-I на различные ткани, на стр. 256 утверждают, что можно ожидать, что не-большие дозы IGF-I не будут оказывать воздей-ствия на жировые ткани, и это наблюдали на крысах. Эти авторы также утверждают, что вве-дение крысе in vivo IGF-I оказывало намного более выраженное воздействие на мышечную ткань, чем на жировую ткань, см. Zapf и др., J. Clin. Invest,, 77:1768 [1986]. Авторы утверждают, что у людей гипоглицемический потенциал IGF-I значительно выше, чем его анти-липолитический потенциал по сравнению с инсулином, см. Culer и др., N. Engl. J. Med., 317:137 (1987).
Также было обнаружено, что хотя у обра-ботанных инсулином крыс с отсеченным гипо-физом потребление пищи возрастало в большей степени, чем у необработанных крыс с отсечен-ным гипофизом (Salter и др., Саn. J. Biochem. Physiol., 35: 913 [1957], на потребление пищи молодыми, нестрадающими ожирением карли-ковыми крысами не оказывали воздействия ин-фузии ни GH, ни IGF-I. Cм. Skottner и др., Endocrinology, 124: 2519-2526 (1989).
Данные свидетельствуют о том, что многие воздействия GH на грызунов зависят от режимов введения GH. См., например, Robinson и Clark в Growth Hormone-Basic and Clinical Aspects, ре-дакторы Isaksson и др., стр. 109-127 (1987). Жи-вотных обрабатывали с помощью многочислен-ных различных режимов дозировки GH. Было установлено, что непрерывная инфузия GH сни-жает содержание жира в организме у крыс линии Zucker с генетически обусловленным ожирением. Cм. Martin и др., апрель 1992, FASEB Meeting, Anaheim СА. У человека были изучены воздей-ствия на рост тела у детей с дефицитом GH ре-жимов введения GH дважды в день и ежедневно, и один раз, дважды и трижды в неделю и “пере-межающихся” режимов. Данные свидетельству-ют о том, что частые инъекции GH (ежедневно) являются предпочтительным режимом (в насто-ящее время он является принятым режимом при-менения в клинике). Данные, полученные на крысах, также показывают, что частые инъекции GH вызывают больший рост костей и прибавле-ние веса, чем редкие инъекции GH, и что непре-рывное подвергание воздействию GH путем ин-фузии не является столь же эффективным, как частые перемежающиеся инъекции GH. Однако в литературе было опубликовано, что инфузия GH индивидуально или в комбинации с IGF-I в количествах, поддерживающих непрерывную эффективную концентрацию GH в плазме, необ-ходима для стимуляции иммунной системы (лимфоидной ткани, чувствительной к GH) хозя-ина-млекопитающего или птицы. см. междуна-родную заявку WO 93/00109, опубликованную 7 января 1993 г.
Принимая во внимание широкое распро-странение ожирения в современном обществе и серьезные последствия, связанные с ним, кото-рые представлены выше, любое терапевтическое лекарство, потенциально пригодное для сниже-ния веса у страдающих ожирением людей, должно оказывать выраженное положительное воздействие на их здоровье. В данной области техники существует потребность в лекарстве, которое должно снижать общий вес тела у стра-дающих ожирением людей, приводя к идеально-му весу тела, без существенных вредных побоч-ных эффектов и должно помогать страдающему ожирением человеку поддерживать пониженный уровень веса тела.
Следовательно, целью настоящего изобре-тения является обеспечение режима лечения, приемлемого для возвращения веса тела стра-дающих ожирением индивидов к нормальному, т.е. идеальному весу тела.
Другой целью изобретения является обес-печение терапии при ожирении, приводящей к поддержанию пониженного веса тела в течение продолжительного периода времени.
Еще одной целью изобретения является предупреждение ожирения и в том случае, если лечение уже начато, прекращение развития или предотвращение наступления болезней, которые являются следствием ожирения или вторичны по отношению к ожирению, таких, как атеросклероз и поликистозное заболевание яичников.
Эти и другие задачи и предметы изобрете-ния очевидны специалисту в данной области техники.
Краткое изложение сущности изобрете-ния
9 286 10
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ лечения ожирения или преду-преждения ожирения у млекопитающих, вклю-чающий введение млекопитающему эффективно-го количества IGF-I и GH. В оптимальном вари-анте GH вводят таким образом, чтобы в крови млекопитающего непрерывно поддерживалась его терапевтически эффективная концентрация на протяжение всего периода его введения. Та-кое введение собственно включает использова-ние GH с продолжительным действием либо за счет пролонгирования присутствия GH в крови, либо за счет медленного высвобождения GH из места инъекции. Такое непрерывное введение GH также включает введение с помощью про-должительной инфузии или путем инъекций с большей частотой, чем один раз в день.
В одной из предпочтительных форм для введения GH ковалентно связывают с помощью максимально десяти аминокислотных остатков, предпочтительно с N - концевыми остатками метионина или лизина, человеческим GH (hGH), с высшими заместителями, обычно увеличиваю-щими циркуляторную жизнь протеина. Предпо-чтительно такие фрагменты связывают с GH через амидную связь, полученную из 4-гидрокси-3-нитробензолсульфонатного эфира или N-гидроксисукцинимидного (NГС) эфира полиэти-ленгликоля (ПЭГ), монометил-замещенного го-мополимера ПЭГ или полиоксиэтиленглицерин-карбоновой кислоты. Наиболее предпочтитель-ным полимером по настоящему изобретению является ПЭГ, присоединенный максимально к 10 остаткам, предпочтительно 2-8 молекулы ПЭГ на молекулу hGH.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано прибавление веса тела у молодых (6-9-недельного возраста) нестрадаю-щих ожирением самок dw/dw-крыс в течение восьми дней, когда им вводили эксципиент (неза-крашенный столбец), делали инъекции GH один раз в день (широкие диагональные линии), дела-ли инъекции GH дважды в день (узкие диаго-нальные линии) и вводили GH путем инфузии с помощью мини-насоса (закрашенный столбец). На всех чертежах и в тексте приведены средние значения ± стандартные отклонения с уровнями статистической достоверности, указанными в описании.
На фиг. 2 показаны уровни IGF-I в сыворот-ке у крыс, которых в течение 8 дней обрабаты-вали аналогично описанному для фиг. 1, все обозначения соответствуют фиг. 1.
На фиг. 3 показаны ежедневные совокупные прибавления веса тела у страдающих ожирени-ем dw/dw-крыс в течение 14 -дневного периода обработки. Незакрашенные кружочки обозна-чают результаты, полученные с эксципиентом, закрашенные кружочки - с hGH - насосом, за-крашенные квадраты - с дозой hGH 500 мкг один раз в день и незакрашенные квадраты - с дозой hGH 250 мкг дважды в день.
На фиг. 4 показаны окончательные прибав-ления веса у страдающих ожирением dw/dw-крыс после 14 -дневного периода обработки, где незакрашенный столбец обозначает результаты, полученные с эксципиентом, закрашенный стол-бец - с дозой hGH 500 мкг, вводимой с помощью насоса, столбец со штриховыми линиями - с дозой hGH 500 мкг, вводимой один раз в день, и столбец с диагональными линиями - с дозой hGH 250 мкг, вводимой дважды в день.
На фиг. 5 показан вес ретроперитонеальной жировой подушки после 14-дневной обработки страдающих ожирением dw/dw-крыс, где обо-значения для каждого из столбцов соответству-ют таковому по фиг. 4.
На фиг. 6 показано изменение веса тела са-мок dw/dw-крыс после 14-дневной обработки. Приведены данные для следующих групп крыс: жировая/жировая диета - контроль (незакрашен-ный столбец), жировая/жировая диета - инъекция hGH (штриховые линии), жировая/жировая дие-та - hGH-насос (закрашенный столбец), жиро-вая/зерновая диета - контроль (широкие диаго-нальные линии), жировая/зерновая диета - инъ-екция hGH (узкие диагональные линии), жиро-вая/зерновая диета - hGH-насос (продольные линии) и зерновая/зерновая диета - контроль (точки).
На фиг. 7 показан вес ретроперитонеально-го жирового депо у dw/dw-крыс после 14 -дневной обработки, где обозначения соответ-ствуют фиг. 6.
На фиг. 8 показаны совокупные изменения веса тела после 14 -дневной обработки страда-ющих ожирением самок dw/dw-крыс. Приведены данные для следующих групп крыс: контроль (незакрашенные квадраты), ежедневная инъек-ция hGH (закрашенные кружочки) и инфузия hGH с помощью мининасоса (закрашенные квадраты).
На фиг. 9 показано ежедневное потребление пищи страдающими ожирением самками dw/dw-крыс после 14 -дневной обработки, где обозна-чения соответствуют фиг. 8.
На фиг. 10 показан вес жирового депо в граммах у страдающих ожирением самок dw/dw-крыс после 14 -дневной обработки. Вес опреде-ляли в следующих группах: контроль (незакра-шенный столбец), ежедневная инъекция hGH (диагональные линии) и инфузия hGH с помо-щью мини-насоса (закрашенный столбец).
На фиг. 11 показаны средние совокупные прибавления веса десяти групп страдающих ожирением самок dw/dw-крыс после 14 -дневной обработки. Приведены данные дkz следующих групп крыс (слева направо): страдающий ожи-рением контроль (незакрашенный столбец), hGH 300 мг - насос (продольные линии), hGH 100 мг - насос (штриховые длинные диагональные ли-нии), hGH 300 мг - инъекция (широкие диаго-нальные линии), hGH 100 мг - инъекция (гори-зонтальные линии), IGF-I (чередующиеся сплошные и штриховые диагональные линии), hGH с помощью насоса/IGF-I (закрашенный столбец), hGH с помощью инъекции/IGF-I (штриховые короткие диагональные линии), ПЭГ-GH (узкие диагональные линии), худой контроль (точки).
11 286 12
На фиг. 12 показаны совокупные дневные изменения веса страдающих ожирением самок dw/dw-крыс после 14 -дневной обработки. При-ведены данные для следующих групп: контроль (незакрашенные квадраты), IGF-I (закрашенные квадраты), ежедневная инъекция GH (незакра-шенные кружки), инфузия GH (закрашенные кружки) и инфузия GH плюс IGF-I (закрашенные квадраты).
На фиг. 13 показан вес ретроперитонеаль-ной жировой подушки после 14-дневной обра-ботки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обо-значения такие же, как и на фигуре 11 выше.
На фиг. 14 показано отношение веса ретро-перитонеальной жировой подушки к весу тела (х 10) после 14 -дневной обработки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обозначения такие же, как и на фиг. 11 выше.
На фиг. 15 показан вес гонадной жировой подушки после 14 -дневной обработки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обозначения такие же, как и на фиг. 11 выше.
На фиг. 16 показаны уровни сывороточного инсулина после 14 -дневной обработки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обозначения такие же, как и на фиг. 11 выше.
На фиг. 17 показаны уровни сывороточного IGF-I после 14 -дневной обработки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обозначения такие же, как и на фиг. 11 выше.
На фиг. 18 показаны уровни (мг/дл) глюко-зы, холестерина и триглицеридов в сыворотке после 14 -дневной обработки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обозначения такие же, как и на фиг. 11 выше.
На фиг. 19 показаны уровни (мг/дл) азота мочевины, кальция и фосфора в сыворотке после 14 -дневной обработки десяти групп самок dw/dw-крыс, где обозначения такие же, как и на фиг. 11 выше.
На фиг. 20 показано воздействие IGF-I, GH и комбинации GH и IGF-I на массу жира при введении подкожно пациентам, больным СПИ-Дом. Закрашенный столбец обозначает плацебо, столбец с продольными линиями обозначает GH, столбец со штриховыми линиями обозначает IGF-I и столбец с диагональными линиями обо-значает GH и IGF-I. Количество пациентов, под-вергнутых лечению в каждой группе, обозначено числами под каждым столбцом, по оси ординат отложены изменения массы жира (кг) по отно-шению к исходному уровню.
Описание предпочтительных примеров осуществления
А. Определения
Используемое в настоящем описании поня-тие “ожирение” относится к состоянию, когда млекопитающее имеет индекс массы тела (МТИ), который вычисляют как отношение веса (кг) к росту2 (м), равный по меньшей мере 25,9. Обыч-но особи с нормальным весом имеют показатель МТИ около 19,9, но менее 25,9.
Согласно настоящему описанию ожирение может быть вызвано любой причиной, как гене-тической, так и связанной с окружающей средой. Примеры нарушений, которые могут привести к ожирению или быть причиной ожирения, вклю-чают переедание и булимию, поликистозную болезнь яичников, краниофарингиому, синдром Прадера-Билли, синдром Фролиха, диабет типа II, дефицит GH, обычные отклонения, связанные с малым ростом, синдром Тернера и другие патaлогические состояния, характеризующиеся пониженной метаболической активностью или уменьшенным расходом остаточной энергии в процентах от общей массы тела без учета жира, например, у детей с острым лейкоцитарным лейкозом.
Понятие “лечение” относится к снижению МТИ у млекопитающего до значения меньше приблизительно 25,9 и к поддержанию этого веса в течение по крайней мере 6 месяцев. Лече-ние обычно приводит к уменьшению потребле-ния млекопитающим пищи или калорий.
Понятие “предупреждение” относится к предупреждению наступления ожирения, если лечение применяют до начала проявления со-стояния ожирения. Более того, если лечение начинают в отношении уже страдающих ожире-нием особей, то можно ожидать, что такое лече-ние предотвратит или будет препятствовать развитию медицинских осложнений, таких, как атеросклероз, диабет типа II, поликистозное заболевание яичников, сердечно-сосудистые заболевания, остеоартриты, кожные заболева-ния, гипертензия, устойчивость к инсулину, ги-перхолестеринемия, глицеридимия и желчнока-менная болезнь.
Таким образом, один предмет настоящего изобретения относится к ингибированию и/или полному подавлению липогенеза у страдающих ожирением млекопитающих, т.е. избыточного накопления липидов в жировых клетках, что является одой из основных особенностей ожире-ния человека и животного, а также уменьшения общего веса тела. Другой предмет изобретения относится к улучшению состояний, являющихся следствием болезни, в том числе к предупрежде-нию или прекращению развития поликистозной болезни яичников таким образом, что пациент перестает страдать бесплодием, и к увеличению чувствительности к инсулину и/или снижению или исключению потребности или употребления инсулина пациентом, больным диабетом, например, в случае юношеского диабета или диабета типа II.
13 286 14
Понятие “млекопитающее” включает жи-вотных, имеющих важное с экономической точки зрения значение, таких, как быки, овцы и свиньи, прежде всего тех, которые используются для производства мяса, а также домашних живот-ных, спортивных животных, животных в зоопар-ках, и преимущественно людей. Понятие “не-взрослый” относится к млекопитающим, начиная с перинатального возраста и заканчивая стадией половой зрелости, к последним относятся также таковые, которые еще не достигли полного по-тенциала роста. К группе склонных к ожирению людей, которые имеют “дефицит GH”, относятся таковые, у которых нарушена функция GH, в том числе таковые, которые имеют гипофизный де-фицит, а также те, которые имеют дефицит GH - рецептора или связывающего GH протеина.
Используемое в настоящем описании поня-тие “GH” относится к гормону роста, получен-ному из любых видов, включая быков, овец, сви-ней, лошадей и предпочтительно человека, с естественной последовательностью или в вари-антной форме, и из любого источника, в том числе к естественному, синтетическому или ре-комбинантному. В предпочтительном варианте для животного применяют форму GH, получен-ную из тех видов, которые подлежат лечению, так, например, GH из свиней применяют для лечения свиней, овечий GH - для лечения овец, бычий GH - для лечения крупного рогатого скота и т.д.
Для лечения человека предпочтительно ис-пользуют человеческий с естественной последо-вательностью зрелый GH с метионина или без него на его N -конце. Также предпочтительным является рекомбинантный hGH, т.е. полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Более предпочтительным является метиониль-ный человеческий гормон роста (met-hGH), по-лученный в E.coli, например, способом, описан-ным в патенте США 4755465, выданном 5 июля 1988 г., и у Goeddel и др., Nature, 282: 544 (1979). Met-hGH, который поставляет на рынок под товарным знаком Pritropin® фирма Genentech, Inc., идентичен естественному полипептиду, за исключением присутствия N - концевого остатка метионина. Эта дополнительная аминокислота образуется в результате процесса синтеза про-теина в бактерии. Также предпочтительным является рекомбинантный hGH, производимый для клинического использования и научных исследований фирмой Genentech, Inc., под то-варным знаком Nutropin® и поставляемый на рынок фирмой Eli Lilly. В указанном последнем hGH отсутствует этот остаток метионина, и он имеет аминокислотную последовательность, идентичную таковой естественного гормона. см. Gray и др., Biotechnology, 2:161 (1984). Метио-нильный hGH, равно как и hGH имеют одинако-вую эффективность и фармакокинетические па-раметры. см. Моore и др., Endocrinology, 122: 2920-2926 (1988). Другим приемлемым для ис-пользования hGH является вариант hGH, кото-рый представляет собой плацентарную форму GH с чистой соматогенетической, а не лактоге-нетической активностью, как описано в патенте США 4670393, выданном 2 июня 1987 г. Сюда же включены также варианты GH, описанные в Международной заявке WO 90/04788, опублико-ванной 3 мая 1990 г., и в Международной заявке WO 92/09690, опубликованной 11 июня 1992 г.
Используемое в настоящем описании поня-тие “IGF-I” относится к инсулиноподобному фактору роста, выделенному из любых видов, включая быков, овец, свиней, лошадей, птиц и предпочтительно человека, с естественной по-следовательностью или в вариантной форме и из любого источника, в том числе к естественному, синтетическому или рекомбинантному. IGF-I выделяли из сыворотки человека и получали рекомбинантным путем. См., например, ЕР 123228 и128733.
В предпочтительном варианте для живот-ного применяют форму IGF-I, полученную из тех видов, которые подлежат лечению, так, напри-мер, IGF-I, выделенный из свиней, применяют для лечения свиней, овечий IGF-I - для лечения овец, бычий IGF-I - для лечения крупного рога-того скота и т.д. Для лечения человека предпо-чтительно используют человеческий с есте-ственной последовательностью зрелый IGF-I, более предпочтительно без метионина на его N-конце, полученный, например, с помощью спо-соба, описанного в ЕР 230869, опубликованном 5 августа 1987 г.; ЕР 128733, опубликованном 19 декабря 1984 г.; или ЕР 288451, опубликованном 26 октября 1986 г. Более предпочтительно этот IGF-I с естественной последовательностью по-лучают рекомбинантным путем, и для клиниче-ских исследований его поставляет фирма Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Кали-форния. Также для применения предпочтителен IGF-I, имеющий удельную активность выше при-близительно 14000 единиц/мг, что определяют с помощью радиорецепторного анализа с исполь-зованием плацентарных мембран, таких, как поставляемые фирмой KabiGen АВ, Стокгольм, Швеция.
Предпочтительными вариантами IGF-I яв-ляются таковые, описанные в патенте США 5077276, выданном 31 декабря 1991 г., в заявке РСТ WO 87/01038, опубликованной 26 февраля 1987 г., и в РСТ WO 89/05822, опубликованной 29 июня 1989 г., т.е. такие, в которых по крайней мере в положении 3 от N -конца зрелой молеку-лы отсутствует остаток глутаминовой кислоты, или с делецие до пяти аминокислот на N - конце. В наиболее предпочтительном варианте отсут-ствуют первые три от N - конца аминокислоты (названные в настоящем описании с целью раз-личения как мозговой IGF, tIGF-I, des(l-3)-IGF-I или des-IGF-I).
Предпочтительный вариант применения GH, при котором “его терапевтически эффектив-ную концентрацию постоянно поддерживают в крови млекопитающего на протяжении всего периода его применения” относится к такому применению GH, независимо от пути введения, композиции, режима, формы, схемы или других факторов, которое приводит к достижению тера-певтически эффективной концентрации GH в плазме или сыворотке в течение времени, когда GH вводят млекопитающему. В соответствии с этим определением GH присутствует в концен-трации, достаточной и эффективной для лечения ожирения, как это определено в настоящем опи-сании.
Б. Варианты выполнения изобретения
15 286 16
GH в комбинации с IGF-I непосредственно вводят млекопитающему любым приемлемым способом, в том числе парентерально, интра-назально, орально или с помощью абсорбции через кожу. Нет необходимости применять их одинаковым путем, и они могут быть введены локально или системно. Конкретный путь введе-ния каждого агента зависит, например, от анамнеза болезни пациента, включающего лю-бые известные или предполагаемые побочные или пониженные анаболические влияния при применении по отдельности hGH или IGF-I. Примеры парентерального введения включают подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное и внутрибрюшинное введе-ние.
GH и IGF-I вводят таким образом, чтобы обеспечить их эффективное количество. GH можно вводить дискретным образом, например, в определенное время (в т.ч. один раз в день) в виде инъекции конкретной дозы, при этом во время инъекции должно быть увеличение кон-центрации GH в плазме, а затем снижение кон-центрации GH в плазме до момента следующей инъекции. Другой метод дискретного введения осуществляется при применении многочислен-ных имплантируемых устройств, пригодных для обеспечения прерывистого высвобождения ак-тивного ингредиента, например, начального выброса, и последующего запаздывания перед выбросом активного ингредиента. См., напри-мер, патент США 4767628, столбец 2, строки 19-37.
Однако в более предпочтительном варианте GH вводят таким образом, чтобы он постоянно присутствовал в крови для поддержания его наличия на протяжении всего периода примене-ния GH. Наиболее предпочтительно это осу-ществляют с помощью методов непрерывной инфузии, например, через мини-насос, такой, как осмотический мини-насос. В другом варианте это можно осуществить с помощью применения частых инъекций GH (т.е. более одного раза в день, например, дважды или трижды в день).
Еще в одном примере выполнения изобре-тения GH может быть введен с использованием композиций GH с продолжительным действием, которые либо задерживают очищение крови от GH, либо вызывают медленное высвобождение GH, например, из места инъекции. Композиция с продолжительным действием, удлиняющая очистку плазмы от GH, может иметь вид ком-плексного соединения GH или ковалентно свя-занного (с помощью обратимой или необрати-мой связи) с макромолекулой, например, с одним или более связывающим его протеинами (Меж-дународная заявка WO 92/08985, опубликован-ная 29 мая 1992 г.) или с водорастворимым по-лимером, выбранным из гомополимеров ПЭГ и полипропиленгликоля (ППГ) и полиоксиэтиле-новых полиполов, т.е. такими, которые раство-римы в воде при комнатной температуре.
Одним из детально охарактеризованных связывающих GH протеинов является связыва-ющий гормон роста протеин (GHBP) с высоким сродством к GH, образующему внеклеточный домен GH - рецептора, который циркулирует в крови и функционирует в качестве GHBP у неко-торых видов (Ymer и Herington, Mol. Cell. Endo-crinol., 41:153 [1985]; Smith и Talamantes, Endo-crinology, 123: 1489-1494 [1988]; Emtner и Roоs, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296-302 [1990]), включая человека. См., например, Bau-mann и др., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62:134-141 (1986); EP 366710, опубликованный 9 мая 1990 г.; Herington и др., J. Clin. Invest,, 77:1817-1823 (1986); Leung и др., Nature, 330: 537-543 (1987). Также был описан второй связывающий протеин (ВР - binding protein) с низким сродством к GH, который, по-видимому, не является структурно связанным с GH-рецептором. См., например, Baumann и Shaw, J. Clin. Endocrinol. Metab. 70: 680-686 (1990).
И, наоборот, GH может входить в комплекс или быть связанным с полимером для увеличе-ния его периода полураспада в крови. Примеры приемлемых для этой цели полиэтиленполиолов и полиоксиэтиленполиолов включают полиокси-этиленглицерин, полиэтиленгликоль, полиокси-этиленсорбит, полиоксиэтиленглюкозу и т.п. Глицериновая основная цепь полиоксизти-ленглицерина является такой же основной це-пью, которая встречается в моно-, ди- и тригли-церидах у животных и людей.
Для полимера не требуется, чтобы он имел какую-либо определенную молекулярную массу, однако предпочтительно, чтобы молекулярная масса составляла от приблизительно 3500 до 100000, более предпочтительно от 5000 до 40000. Предпочтительно, чтобы гомополимер ПЭГ был незамещенным, но он может быть так-же замещен алкильной группой на одном конце. Предпочтительно алкильная группа представля-ет собой С1-С4 алкильную группу и наиболее предпочтительно метильную группу. Наиболее предпочтительно полимер представляет собой незамещенный гомополимер ПЭГ, монометилза-мещенный гомополимер ПЭГ (мПЭГ) или поли-оксиэтиленглицерин (ПОГ) и имеет молекуляр-ную массу приблизительно от 5000 до 40000.
17 286 18
GH ковалентно связывают через один или более аминокислотных остатков GH с концевой реакционноспособной группой полимера, в ос-новном в зависимости от условий реакции, моле-кулярной массы полимера и т.д. Полимер с реак-ционноспособной(ыми) группой(ами) в настоя-щем описании назван активированным полиме-ром. Реакционноспособная группа избирательно взаимодействует со свободной аминогруппой или другими реакционноспособными группами GH. Однако очевидно, что для получения опти-мальных результатов тип и количество выбран-ных реакционноспособных групп, так же как и тип применяемого полимера должны зависеть от конкретного применяемого GH, чтобы избежать взаимодействия имеющейся реакционноспособ-ной группы со слишком большим количеством очень активных групп GH. Поскольку этого не-возможно избежать полностью, рекомендуется применять обычно приблизительно от 0,1 до 1000 молей, предпочтительно от 2 до 200 молей активированного полимера на моль протеина в зависимости от концентрации протеина. Окон-чательное количество активированного полиме-ра на моль протеина представляет собой баланс для поддержания оптимальной активности, в то же время оно позволяет оптимизировать, если возможно, период полувыведения протеина из крови.
Хотя у протеина могут быть остатки любых реакционноспособных аминокислот, например, один или два цистеина или N-концевая амино-кислотная группа, предпочтительно, чтобы ре-активная аминокислота являлась лизином, свя-занным с реактивной группой активированного полимера через его свободную эпсилон - амино-группу, или глутаминовой или аспарагиновой кислотой, связанной с полимером через амидную связь.
Ковалентная реакция модификации может осуществляться с помощью любого приемлемого способа, обычно используемого для взаимодей-ствия биологически активных материалов с инертными полимерами, предпочтительно при значении рН около 5-9, более предпочтительно при 7-9, если реакционноспособные группы GH являются группами лизина. Обычно процесс включает подготовку активированного полиме-ра (по крайней мере с одной терминальной гид-роксильной группой), подготовку активного субстрата из этого полимера и последующее взаимодействие GH с активным субстратом для получения GH, пригодного для изготовления композиции. Вышеуказанная реакция модифика-ции может быть проведена несколькими спосо-бами, которые могут включать одну или более стадий. Примеры модифицирующих агентов, которые могут быть использованы для получе-ния активированного полимера в одностадийной реакции, включают хлорид циануровой кислоты (2,4,6-трихлор-S-триазин) и фторид циануровой кислоты.
Согласно одному из примеров выполнения изобретения реакция модификации происходит в две стадии, причем полимер сначала взаимодей-ствует с ангидридом кислоты, таким, как янтар-ный или глутаровый ангидрид для образования карбоновой кислоты, а затем карбоновую кисло-ту подвергают взаимодействию с соединением, способным взаимодействовать с карбоновой кислотой для образования активированого по-лимера с реакционноспособной эфирной груп-пой, способной взаимодействовать с GH. Приме-ры таких соединений включают N-гидроксисукцинимид, 4-гидрокси-3-нитробензолсульфоновую кислоту и т.п. и пред-почтительно применяют N-гидроксисукцинимид или 4-гидрокси-3-нитробензолсульфоновую кислоту. Например, монометилзамещенный ПЭГ может быть подвергнут взаимодействию с глу-таровым ангидридом при повышенных темпера-турах, предпочтительно приблизительно при 100-110°С в течение 4 часов. Полученную таким образом монометил-ПЭГ-глутаровую кислоту затем подвергают взаимодействию с N-гидроксисукцинимидом в присутствии карбоди-имидного реагента, такого, как дициклогексил- или изопропилкарбодиимид, для получения ак-тивированного полимера, метоксиполиэти-ленгликолил-N-сукцинимидилглутарата, кото-рый далее подвергают взаимодействию с GH. Этот способ подробно описан у Abuchowski и др., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984). В другом примере монометилзамещенный ПЭГ может быть подвергнут взаимодействию с глу-таровым ангидридом с последующим взаимо-действием с 4-гидрокси-3-нитробензолсульфоновой кислотой (ГНСК) в присутствии дициклогексилкарбодиимида для получения активированного полимера. ГНСК описана у Bratnagar- и др., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich и др. (редак-торы) (Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1981), cтp.97-100 и у Nitecki и др., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Mi-crobiology: 1986), имеющей название “Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and its Applications”.
Конкретные способы получения hGH, конъюгированного с ПЭГ, включают способы, описанные в патенте США 4179337 в отношении ПЭГ-hGH и в патенте США 4935465, в котором описан ПЭГ, обратимо, но ковалентно связан-ный с hGH. Другие специфические способы по-лучения ПЭГ-hGH включают следующие.
ПЭГилирование с метоксиполиэтиленгли-колевым альдегидом (Ме-ПЭГ альдегид) путем восстановительного алкилирования, а очистку выполняют, добавляя к 2 мг/мл hGH в забуфе-ренном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР) при рН 7,0 5 мМ Ме-ПЭГ альдегида-5000 (молекулярная масса 5000 Да) и 20 мМ NaCNBH3 и осторожно смешивая при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем к 50 мМ добавляют этаноламин для восстановительного амидирования непрореагировавшего Ме-ПЭГ. Смесь разделяют на анионообменной колонке типа Моno Q посредством жидкостной экспресс - хроматографии белков (ЖЭХБ). Избыточный непрореагировавший Ме-ПЭГ не “садится” на колонку и может быть выделен из смеси. Полу-чают две основные фракции ПЭГилированного hGH с точными молекулярными массами 30 кДа и 40 кДа с помощью редуцированного электро-фореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН) по срав-нению с молекулярной массой 20 кДа непрореа-гировавшего hGH. Комплекс hGH с hGH-связывающим протеином ПЭГилируют таким же образом, получая с помощью гель-фильтрации производное с молекулярной массой 150 кДа.
19 286 20
ПЭГилирование с N-гидроксисукциними-дилом-ПЭГ (NГС-ПЭГ) и очистку выполняют, добавляя NГС-ПЭГ в молярной концентрации, в 5 раз превышающей общую концентрацию ли-зина в hGH, к раствору, содержащему 2 мг/мл hGH в 50 мМ натрий - боратного буфера при рН 8,5 или в ЗФР при рН 7, и смешивая при комнат-ной температуре в течение 1 часа. Продукты разделяют на колонке для разделения по разме-рам с Superose 12 и/или на колонке типа Моno Q для ЖЭХБ. Размеры ПЭГилированного hGH варьируются в зависимости от значения рН ре-акции от приблизительно 300 кДа в случае реак-ции, протекающей при рН 8,5, до 40 кДа для рН 7,0, что было измерено с помощью гель-фильтрации. Комплекс hGH с hGH -связывающим протеином ПЭГилируют таким же образом, получая с помощью гель-фильтрации величину молекулярной массы 400-600 кДа.
ПЭГилирование цистеиновых мутантов hGH с ПЭГ-малеимидом выполняют, получая одиночный цистеиновый мутант hGH с помощью сайтнаправленного мутагенеза, выделяя его из штамма E.coli 16С9 (W3110 delta tonA phoA delta Е15 delta (argF-lac)169 deoC2, который не обла-дает способностью производить deoC протеин и описан в заявке на патент США 07/224520, по-данной 26 июля 1988 г., в настоящее время абандонированной, содержание которой вклю-чено в настоящее описание в качестве ссылки) и очистки его на анионообменной колонке. ПЭГ-малеимид получают путем взаимодействия мо-нометокси-ПЭГ-амина с сульфоМBs в 0,1М натрий-фосфатном буфере с рН 7,5 в течение одного часа при комнатной температуре и заме-ной буфера на фосфатный буфер с рН 6,2. Затем hGH со свободным дополнительным цистеином смешивают в течение одного часа и конечную смесь разделяют на колонке Моno Q, так же как и в случае ПЭГилированного Me-ПЭГ-альдегидом hGH.
Поскольку сложноэфирные связи являются в химическом и физиологическом отношении ла-бильными, может оказаться предпочтительным применять в реакции конъюгации ПЭГ-реагент, который не содержит сложноэфирную функцио-нальную группу. Например, карбаматная связь может быть получена путем взаимодействия ПЭГ-монометилового эфира с фосгеном для по-лучения ПЭГ-хлорформиата. Этот реагент затем может быть использован аналогичным образом, как и эфир NГC для функционализации амино-групп боковых цепей лизина. В другом примере мочевинная связь может быть получена путем взаимодействия амино-ПЭГ-монометилового эфира с фосгеном. Это приводит к получению ПЭГ-изоцианата, который будет взаимодейство-вать с аминогруппами лизина.
Предпочтительный способ получения ПЭГ-hGH, не включающий использование отщепляе-мого сложного эфира в ПЭГ- реагенте, состоит в следующем. Метоксиполиэтиленгликоль пре-вращают в карболовую кислоту путем титрова-ния с натрийнафталином для получения алкок-сида, последующей обработки бромэтилацета-том для образования этилового эфира, последу-ющего гидролиза с помощью обработки гидрок-сидом натрия и водой до соответствующей кар-боновой кислоты, как описано у Buckmann и др., Macromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981). Обра-зовавшуюся карбоновую кислоту затем превра-щают в ПЭГ-N-гидроксисукцинимидиловый эфир, пригодный для ацилирования hGH путем взаимодействия образовавшейся карбоновой кислоты с дициклогексилкарбодиимидом и NГC в этилацетате.
Образовавшийся реагент NГC-ПЭГ затем подвергают взаимодействию с 12 мг/мл GH, ис-пользуя 30-кратное молярное превышение над GH, в натрий-боратном буфере с рН 8,5 при ком-натной температуре в течение одного часа и вносят на Q-сефарозную колонку в трис-буфере и элюируют с помощью солевого градиента. Затем его вносят на вторую колонку (фенил Toyopearl, уравновешенную в 0,3 М натрий-цитратном буфере с рН 7,8. ПЭГилированный hGH затем элюируют с помощью обратного солевого градиента, объединяют в пул и осу-ществляют замену буфера с помощью обессоли-вающей колонки G25 в манните, глицине и натрий-фосфатном буфере с рН 7,4 для получе-ния соответствующей композиции ПЭГ7-hGH.
ПЭГилированные молекулы hGH и ком-плекс hGH с hGH -связывающим протеином мо-жет быть охарактеризован с помощью ПААГ-ДСН, гель-фильтрации, ЯМР, триптического картирования, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии и биологического исследования in vitro. Степень ПЭГилирования целесообразно сначала определять с помощью ПААГ-ДСН и гель-фильтрации, а затем анализировать с по-мощью ЯМР, который имеет специфический резонансный пик для метилированного водорода ПЭГ.
21 286 22
Количество ПЭГ-групп в каждой молекуле может быть подсчитано на основе ЯМР -спектра или масс-спектрометрии. Электрофорез в по-лиакриламидном геле в присутствии 10%-ного ДСН проводят соответственно в 10 мМ трис-HCL-буфере с рН 8,0, с использованием в каче-стве элюирующего буфера 100 мМ NaCl. Для определения того, какой остаток ПЭГилирован, можно использовать триптическое картирова-ние. Так, ПЭГилированный hGH разлагают с помощью трипсина при соотношении (в мг) про-теина и фермента 100:1 при 37С в течение 4 часов в растворе, содержащем 100 мМ ацетата натрия, 10 мМ трис-НСl, 1 мM хлорида кальция, при рН 8,3 и подкисляют до рН<4 для прекраще-ния разложения перед разделением с помощью ЖХBД с использованием колонки Nucleosil С-18 (4,6 мм х 150 мм, 5 мкм, 100 Е). Хроматограмму сравнивают с таковой для неПЭГилированного исходного материала. Затем каждый пик анали-зируют с помощью масс-спектрометрии для определения размера фрагмента в пике. Фраг-мент(ы), имеющий(е) ПЭГ-группы, обычно не остаются на колонке для ЖХВР после введения и исчезают из хроматографа. Такое исчезновение из хроматографа свидетельствует о ПЭГилиро-вании этого конкретного фрагмента, который должен содержать по крайней мере один остаток лизина. ПЭГилированный hGH затем может быть исследован на способность связываться с hGH-связывающим протеином (hGHBP) обыч-ными способами.
Различные использованные способы ПЭГи-лирования давали различные виды ПЭГилиро-ванного hGH дикого типа с точными молекуляр-ными массами 35 кДа, 51 кДа, 250 кДа и 300 кДа, устанавливаемыми с помощью гель-хроматографии, которые должны быть близки к их нативному гидродинамическому объему. Они были обозначены как ПЭГ1-hGH, ПЭГ2-hGH, ПЭГ3-hGH и ПЭГ7-hGH соответственно. По результатам триптического картирования ПЭГ1-hGH и ПЭГ2-hGН оба имели N-концевой 9-аминокислотный фрагмент, отсутствующий на хроматограмме, и вероятно ПЭГилированный, что можно подтвердить масс-спектрометрией больших молекулярных продуктов, обнаружен-ных в проходящем потоке жидкостного хромато-графа. На основе молекулярной массы, полу-ченной с помощью ПААГ-ДСН, ПЭГ1-hGH мо-жет иметь одну молекулу ПЭГ на N-концевом амине, а ПЭГ2-hGH может иметь две молекулы ПЭГ на N-концевом амине, образуя третичный амид. На основании данных ЯМР установлено, что ПЭГ3-hGH имеет приблизительно 5 ПЭГ-групп на молекулу, а на триптической карте отсутствуют по крайней мере пять пептидных фрагментов, что позволяет предположить, что они ПЭГилированы. На основании данных масс-спектрометрии можно предположить, что моле-кула ПЭГ7-hGH имеет 6-7 ПЭГ-групп на моле-кулу.
Сайтами для включения ПЭГ- групп в hGH являются N-концевой метионин или фенилала-нин, лизин 38, лизин 41, лизин 70, лизин 140, лизин 145, лизин 158 и лизин 168, и они являются предпочтительными остатками для такой конъ-югации. Два лизина, которые, по-видимому, не ПЭГилировались, представляли собой лизин 115 и лизин 172.
GH также целесообразно вводить с помо-щью систем с непрерывным высвобождением. Примерами композиций с непрерывным высво-бождением, приемлемыми для данного случая, являются полупроницаемые полимерные матри-цы в виде изделий определенной формы, напри-мер, пленок или микрокапсул. Матрицы с непре-рывным высвобождением включают полилакти-ды (патент США 3773919; ЕР 58481), сополиме-ры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman и др., Biopolimers, 22: 547-556 [1983]), поли(2-гидроксиэтилметакрилата) (Langer и др., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981], и Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), этиленвинилацетата (Langer и др., см. выше) или поли-D-(-)-3-гидроксимасляной кислоты (ЕР 133988), или микросферы PLGA. Композиции с непрерывным высвобождением GH также вклю-чают захваченный липосомой GH. Липосомы, содержащие GH, получают известными спосо-бами: DE 3218121; Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 134949; EP 142641; заявка на патент Японии 83-118008; патенты США 4485045 и 4544545 и ЕР 102324. Обычно липосомы являются малыми (примерно 200-800Е) однослойными образованиями, в ко-торых содержание липидов выше, чем приблизи-тельно 30 мол. процентов холестерина, причем выбранные пропорции можно соответствующим образом откорректировать для оптимальной терапии. Кроме того, биологически активная композиция с непрерывным высвобождением может быть получена из аддукта GH, ковалент-но связанного с активированным полисахари-дом, как описано в патенте США 4857505, вы-данном 15 августа 1989 г. Кроме того, в патенте США 4837381 описана микросферическая ком-позиция из жира или воска или их смеси, а также GH с медленным высвобождением.
IGF-I может быть введен с помощью любых способов, включая инъекции (однократные или многократные, например, 1-4 раза в день) или инфузии. Так же как и в случае с GH, IGF-I может включен в фармацевтическую композицию таким образом, чтобы обеспечивалось непрерывное присутствие в крови в течение курса лечения, как описано выше для GH. В этом случае он межей быть ковалентно присоединен к полимеру или включен в композицию с непрерывном высво-бождением, как описано выше.
Кроме того, IGF-I вводят соответственно вместе с одним любым или несколькими из свя-зывающих его протеинов, например, с известны-ми в настоящее время, т.е. IGFBP-l, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 или IGFBP-6. Для введения IGF-I также может быть связан с рецеп-тором или антителом или фрагментом антитела. Предпочтительным связывающим протеином для IGF-I в настоящем изобретении является IGFBP-3, который описан в Международной заявке WO 89/09268, опубликованной 5 октября 1989 г. и у Martin и Bахter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986). Этот гликозилированный протеин IGFBP-3, как было установлено с помощью нередуци-рованного электрофореза в ПААГ-ДСН, является кислотоустойчивым компонентом с молекуляр-ной массой приблизительно 53 кДа гликопроте-инового комплекса с молекулярной массой 125-150 кДа, обнаруженного в плазме человека и несущего большую часть эндогенных IGF, и также регулируется GH.
23 286 24
Введение IGF-связывающего протеина вме-сте с IGF-I может быть осуществлено с помощью способа, описанного в патенте США 5187151, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. Вкратце IGF-I и IGFBP вводят в эффективных количествах с по-мощью быстрой подкожной инъекции большого объема в молярном соотношении от приблизи-тельно 0,5:1 до приблизительно 3:1, предпочти-тельно приблизительно 1:1.
IGF-I, равно как и GH предпочтительно вводить путем непрерывной инфузии с использо-ванием, например, внутривенного или подкожно-го способов введения. Более предпочтительно подкожное введение как для IGF-I, так и для GH.
Для применения в терапии GH в комбина-ции с IGF-I должен быть приготовлен в виде композиции и дозирован в форме, согласующей-ся с проверенной медицинской практикой, с уче-том клинического состояния конкретного паци-ента (прежде всего побочных эффектов лечения с применением по отдельности GH или IGF-I или замедления роста после непрерывного лечения с помощью GH), мест введения композиций) IGF-I и GH, способов введения, графика введения и других факторов, известных практикующим врачам. “Эффективные количества” каждого компонента по настоящему изобретению, таким образом, определяются с учетом этих обстоя-тельств и представляют собой количества, кото-рые снижают ожирение индивида в большей степени, чем этого достигают с применением такого же количества IGF-I или GH по отдельно-сти, или прежде всего предотвращает наступле-ние ожирения или связанных с ожирением состо-яний.
В качестве общей рекомендации можно предложить, чтобы вводимое парентерально суммарное фармацевтически эффективное коли-чество как IGF-I, так и GH на дозу составляло от приблизительно 1 мкг/кг веса тела пациен-та/день до 10 мг/кг веса тела пациента/день, хотя, как, отмечалось выше, это в основном должно определяться терапевтической целесо-образностью. Более предпочтительно эта доза составляет по крайней мере 0,01 мг/кг/день и для людей более предпочтительно она составляет для каждого гормона приблизительно 0,01-1 мг/кг/день. В случае непрерывного введения IGF-I и GH обычно применяют со скоростью дозиро-вания приблизительно от 1 мкг/кг/час до прибли-зительно 50 мкг/кг/час, либо с помощью 1-4 инъ-екций в день, либо с помощью непрерывных подкожных инфузий с использованием, напри-мер, мини-насоса. Можно также применять внутривенный баллон с раствором. Ключевым фактором при выборе приемлемой дозы является результат, полученный при измерении снижения общего веса тела или отношения количества жира к массе тела без жира либо другие крите-рии, позволяющие оценивать степень контроля или предотвращение ожирения или предупре-ждения состояний, связанных с ожирением, как это представляется целесообразным лечащему врачу.
Следует отметить, что при назначении ле-чащими врачами определенных дозировок как IGF-I, так и GH, необходимо принимать во вни-мание известные побочные эффекты лечения этими гормонами. Для hGH такие побочные эф-фекты включают задержку натрия и увеличение внеклеточного объема (Ikkos и др., Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 [1959]; Biglieri и др., J. Clin. Endocrinol. Metab. 21: 361-370 [1961]), равно как гиперинсулинемию и ги-пергликемию. Одним из основных побочных эффектов IGF-I является гипогликемия. См., например, Guler и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989). Поэтому комбинация IGF-I и GH может привести к снижению нежелатель-ных побочных эффектов обоих агентов (напри-мер, гипогликемии в случае IGF-I и гиперинсу-линизма в случае GH) и к восстановлению уров-ней GH в крови, секрецию которого подавляет IGF-I.
Согласно одному из примеров выполнения изобретения для парентеральнoго введения обычно готовят композиции IGF-I и GH путем смешения каждого компонента необходимой степени чистоты в виде стандартной дозируемой пригодной для инъекции формы (раствора, сус-пензии или эмульсии) с фармацевтически прием-лемым носителем, т.е. с нетоксичным для реци-пиентов в применяемых дозах и концентрациях и совместимым с другими ингредиентами компо-зиции. Например, предпочтительно композиция не должна включать окислители и другие соеди-нения, известные своей способностью разрушать полипептиды.
Обычно композиции получают путем сме-шения каждого из IGF-I и GH до однородности с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с ними обоими. Затем при необходимости продукт формируют в виде требуемой композиции. Предпочтительно носи-тель представляет собой парентеральный носи-тель, более предпочтительно раствор, изотонич-ный с кровью реципиента. Примеры таких носи-телей-наполнителей включают воду, физиологи-ческий раствор, раствор Рингера и раствор декс-трозы. Также применимы по изобретению невод-ные наполнители, такие, как нелетучие масла и этилолеаты, а также липосомы.
25 286 26
Носитель может содержать небольшие ко-личества добавок, таких, как вещества, повы-шающие изотоничность и химическую стабиль-ность. Такие материалы нетоксичны для реципи-ентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие, как фосфатный, цит-ратный, сукцинатный, на основе уксусной кис-лоты и других органических кислот или их со-лей; антиокислители, такие, как аскорбиновая кислота; полипептиды с низкой молекулярной массой (менее, чем приблизительно десять остатков), например, полиаргинины или трипеп-тиды; протеины, такие, как сывороточный аль-бумин, желатин или иммуноглобулины; гидро-фильные полимеры, такие, как поливинилпирро-лидон; аминокислоты, такие, как глицин, глута-миновая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды, в том числе целлюлозу и ее про-изводные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие, как ЭДТК; сахар-ные спирты, такие, как маннит или сорбит; про-тивоионы, такие, как натрий; и/или неионоген-ные поверхностно-активные вещества, такие, как полисорбаты, полоксамеры или ПЭГ.
Обычно каждый из IGF-I и GH включают в композицию по отдельности с такими носителя-ми в концентрации приблизительно от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл, предпочтительно 1-10 мг/мл при значениях рН приблизительно от 4,5 до 8. Пол-номасштабный IGF-I обычно стабилен при зна-чениях рН не выше приблизительно 6,0; des(1-3)-IGF-I стабилен при значениях рН приблизитель-но от 3,2 до 5; hGH стабилен при более высоких значениях рН, например, при 7,4-7,8. Очевидно, что применение определенных вышеупомянутых эксципиентов, носителей или стабилизаторов будет приводить к образованию солей IGF-I или GH.
Кроме того, IGF-I и GH, предпочтительно полномасшабный IGF-I, могут быть включены в композицию вместе с приемлемым носителем-наполнителем для образования фармацевтиче-ской композиции, которая в предпочтительном варианте не содержит клеток. В одном из приме-ров выполнения изобретения выбор буфера, применяемого для композиции, будет зависеть от того, будет ли композиция использована сразу после смешения либо будет храниться для по-следующего применения. При использовании сразу после смешения смесь полномасштабного IGF-I и GH может быть включена в композицию с маннитом, глицерином и фосфатным буфером с рН 7,4. Если эта смесь подлежит хранению, ее включают в композицию с буфером, рН которого приблизительно равен 6, таким, как, цитратный буфер, с поверхностно-активным веществом, увеличивающим растворимость GH при таком значении рН, таким, как 0,1%-ный полисорбат 20 или полоксамер 188. Конечный препарат может представлять собой жидкость или лиофи-лизированный твердый продукт.
IGF-I и GH, применяемые для терапевтиче-ского введения, предпочтительно должны быть стерильными. Стерильность легко достигают путем фильтрации через стерильные фильтрую-щие мембраны (например, мембраны с размера-ми пор 0,2 мкм). Терапевтические композиции IGF-I и GH обычно помещают в контейнер со стерильным приемником, например, в баллон с раствором для внутривенного применения или в пузырек с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций.
Обычно IGF-I и GH должны храниться в контейнерах в виде стандартной дозы или мно-гократной дозы, например, в запечатанных ам-пулах или пузырьках, в виде водного раствора или лиофилизированной композиции для восста-новления. В примере приготовления лиофилизи-рованной композиции пузырьки объемом 10 см3 наполняют 5-ю мл простерилизованных с помо-щью фильтрации 1%-ных (в отношении массы к объему) водных растворов IGF-I и GH и образо-вавшуюся смесь подвергают лиофилизации. Раствор для инфузии получают путем восста-новления лиофилизированных IGF-I и GH, при-меняя бактериостатическую воду для инъекций.
Лечение с помощью GH и IGF-I может осу-ществляться без использования ограниченного рациона питания либо с ним, таким, как ограни-чение ежедневного потребления пищи или кало-рий, в той мере, как это требуется для конкретно-го пациента.
27 286 28
Кроме того, GH и IGF-I применяют соответ-ственно в комбинации с другими методами лече-ния, предназначенными для борьбы или преду-преждения ожирения. Пригодные для этой цели вещества включают, например, гормоны (ка-техоламины, глюкагон, адренокортикотропный гормон (АСТН)); клофибрат; галогенат; цин-хокаин; хлорпромазин; лекарства, подавляющие аппетит путем воздействия на норадренергиче-ские нейромедиаторы, например, мазиндол или производные фенэтиламина, такие, как, фе-нилпропаноламин, диэтилпропион, фентермин, фендиметразин, бензфетамин, амфетамин, ме-тамфетамин и фенметразин; лекарства, оказы-вающие воздействие на нейромедиаторы серо-тонина, например, фенфлурамин, триптофан, 5-гидрокситриптофан, флуокситин и сертралин; лекарства центрального действия, например, налоксон, нейропептид-Y, галании, кортикотро-пин - высвобождающий гормон и холецистоки-нин; холинергический агонист, такой, как пири-достигмин; сфинголипид, такой, как лизосфинго-липид или его производные (ЕР 321287, опубли-кованный 21 июня 1989 г.); термогенные лекар-ства, такие, как тироидный гормон; эфедрин; бета-адренергические агонисты, лекарства, вли-яющие на желудочно-кишечный тракт, такие, как ингибиторы ферментов, например, тетрагид-ролипостатин, неперевариваемую пищу, такую, как полиэфир сахарозы, и ингибиторы опорож-нения желудка, такие, как треохлорлимонная кислота или ее производные; -адренергические агонисты, такие, как изопротенерол и йохимбин; аминофиллин для усиления эффектов йохимби-на, схожих с действием -адренергического нейромедиатора, лекарство, являющееся 2 ад-ренергическим блокатором, такое, как клонидин либо индивидуально, либо в комбинации с гор-моном роста, высвобождающим пептид (патент США 5120713, выданный 9 июня 1992 г.); ле-карства, которые оказывают влияние на абсорб-цию в кишечнике, такие, как бигуаниды, напри-мер, метформин и фенформин; наполнители, такие, как метилцеллюлоза; лекарства, блоки-рующие метаболизм, такие, как гидроксицитрат; прогестерон; агонисты холицистокинина; ма-ленькие молекулы, имитирующие кетокислоты; агонисты гормона, высвобождающего корти-котропин; схожее с алкалоидами спорыньи со-единение, ингибирующее пролактин, для сниже-ния накопления жира в организме (патент США 4783469, выданный 8 ноября 1988 г.); бета-3-агонисты; бромкриптин; антагонисты опиодных пептидов; антагонисты нейропептида Y; антаго-нисты глюкокортикоидного рецептора; агонисты гормона роста, их комбинации и т.д. Они вклю-чают все лекарства, описанные у Bray и Greenway, Clinics in Endocrinol. and Metabol., 5: 455 (1976).
Эти вспомогательные агенты могут приме-няться одновременно, до или после введения GH и IGF-I и могут применяться тем же самым или другим способом по сравнению с введением GH и IGF-I.
Ниже изобретение более подробно поясня-ется с помощью примеров. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Все литературные источники и патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок.



Пример I
Разработка новой модели вызванного дие-той ожирения на животных и исследование вли-яния схемы введения GH на липолитическое уменьшение веса
Введение
Предметом данных исследований является разработка новой модели вызванного диетой ожирения у животных и сравнение на такой мо-дели воздействий различных схем введения GH на состав организма, прежде всего на количе-ство жира в организме. Современные обзоры данных, касающихся человека (Jorgenson, см. выше, стр. 190), показывают, что инъекции GH могут вызывать снижение количества жира в организме. Однако для человека не было сдела-но систематических попыток (сходных с иссле-дованиями по оптимизации стимулирующих рост воздействий GH) определить оптимальные режимы доз для липолитических воздействий GH.
Недавно была обнаружена мутантная ли-ния крыс Dwarf (dw/dw), для которой было уста-новлено, что характеризуется недостатком ги-пофизного GH, но, по-видимому, имеет нормаль-ные количества других гипофизных гормонов. См., например, Charlton и др., J. Endocr., 119: 51-58 (1988); Skottner и др., Endocrinology, 124: 2519-2596 (1989). Основной интерес при этом представляло определение, будет ли диета с высоким содержанием жира вызывать ожирение у крыс линии Dwarf (dw/dw). Кроме того, пред-ставляло интерес определение, было ли ожире-ние связано с индукцией устойчивости к инсули-ну и/или IGF-I. Кроме того, страдающие ожире-нием крысы линии dw/dw могут служить моде-лью болезни человека, прежде всего диабета типа II, который связан с устойчивостью к инсу-лину и ожирением.
Линия крыс Dwarf (dw/dw) была выбрана вследствие врожденного недостатка у нее GH, а также потому, что дефицит GH связан с ожире-нием у животных и человека. Линия крыс dw/dw не является линией с естественной склонностью к ожирению подобно классической модели - склонной к ожирению линии мышей ob/ob. См., например, Mayer и др., Endocrinology, 52: 54-61 (1953). Крысы линии dw/dw имеют низкое со-держание GH в крови и, следовательно, низкое содержание в крови IGF-I, поэтому они потенци-ально являются хорошими животными-моделями для изучения воздействий GH и IGF-I. См., например, Skottner и др., 1989 выше.
Были выбраны самки крыс, т.к. у них под-держивается более высокое процентное содер-жание жира в организме, и они обычно более склонны к ожирению, чем самцы крыс. См., например, Shemmel и др., Anal. Rec., 166: 437-446 (1969). Традиционные диеты, обычно ис-пользуемые для кормления лабораторных жи-вотных, основаны на использовании зерна и, следовательно, имеют очень низкое содержание жира (приблизительно 5 масс.% жира). Диета с более высоким содержанием жира (и, следова-тельно, более близкая к диете людей в западных странах) была выбрана для того, чтобы попы-таться вызвать ожирение у dw/dw-крыс.
Целью настоящих экспериментов было:
1) попытаться вызвать ожирение у dw/dw-крыс или у нормальных крыс с помощью диеты;
2) изучить устойчивость к инсулину у стра-дающих ожирением животных;
3) изучить эффективность GH в отношении снижения количества жира в организме страда-ющих ожирением животных;
4) изучить влияние схемы (доза-режим) вве-дения GH на снижение количества жира в орга-низме страдающих ожирением животных;
5) изучить влияние совместного режима пи-тания (возвращение от диеты с высоким содер-жанием жира к диете с низким содержанием жира) в сочетании с различными режимами вве-дения GH, т.е. изучить эффективность GH во время вызванного диетой снижения веса.
Эксперименты I и II
Методы и результаты
В эксперименте I сравнивали воздействие диеты с высоким содержанием жира на вес тела у dw/dw-крыс (с дефицитом GH) и нормальных крыс (с достаточным содержанием GH), а в экс-перименте II подтверждали влияние диеты на вес тела и ожирение у dw/dw-крыс. Степень ожи-рения оценивали по массе выбранных, хорошо выраженных жировых отложений и по наличию устойчивости к инсулину.
Эксперимент I
29 286 30
В первом эксперименте использовали 12 самок крыс линии Dwarf (dw/dw, Simonsen Labs, Gilroy, CA) и 12 самок крыс линии Sprague-Dawley (SD, Charles River, Portagel). Крысы линии Dwarf имели установившийся вес тела (100-140 г) и возраст 120 дней. Вес крыс линии SD соот-ветствовал таковому у крыс линии Dwarf. Крысы линии SD были 40 -дневного возраста, не имели установившегося веса и весили 100-140 г.
Крыс случайным образом разделяли на че-тыре группы по шесть особей в каждой и их веса выравнивали для устранения неравномерности в средних начальных весах. Одну группу каждой линии кормили ad libitum (по желанию) в течение 29 дней обычными лабораторными кормовыми гранулами (4,5 масс.% жира и 9,6% жира по калорийности). Для двух других групп была установлена диета без ограничения потребления пищи с высоким содержанием жира (36,3 масс.% жира и 56,2 % жира по калорийности) также в течение 29 дней. Корм для диеты с высоким со-держанием жира готовили путем смешения од-ной части растительного жира с двумя частями измельченных кормовых гранул, получая гомо-генную пасту. Крыс взвешивали по крайней мере 5 раз в неделю.
В ходе первого эксперимента у крыс как линии SD, так и линии Dwarf обнаружено суще-ственное прибавление веса. В процессе исследо-вания у обеих групп крыс линии SD обнаружено увеличение веса тела. Однако неожиданно не было обнаружено статистически значимого различия в конечных весах тела у крыс линии SD, находившихся на жировой диете и зерновой диете (жировая диета 102,6±20,2 г, зерновая диета 108,1±18,3 г, t=0,83 по критерию Дункана (Duncan’s Multiple Range test); критическое зна-чение 2,90). Поскольку в начале эксперимента крысы линии SD не достигли зрелости или уста-новившегося веса тела, наблюдаемый значимый прирост веса почти наверняка являлся результа-том нормального роста, а не просто накопления жировой ткани.
Вес тела в обеих группах крыс линии Dwarf также возрастал в процессе исследования, одна-ко в отличие от крыс линии SD было обнаружено четкое и постояное различие между группами крыс линии Dwarf, питавшимися кормом для жировой и зерновой диеты. Это различие стало очевидным уже в первый день при использова-нии различных диет (жировая диета 3,2±1,7 г, зерновая диета -1,0±3,3 г, t=4,42 по критерию Дункана; критическое значение 2,90) и сохраня-лось через 15 дней (жировая диета 23,3±12,5 г, зерновая диета 10,4±5,3 г, t=4,12 по критерию Дункана; критическое значение 2,90) и до ко-нечного, 29-го дня эксперимента (жировая диета 37,0±18,7 г, зерновая диета 13,3±6,4 г, t=3,7 по критерию Дункана; критическое значение 2,90). Поскольку крысы линии Dwarf имели устано-вившийся вес тела к началу эксперимента, наиболее вероятно, что прибавление их веса тела было следствием накопления жировой тка-ни.
Эксперимент II
Во втором эксперименте использовали че-тыре группы по шесть крыс линии Dwarf в каж-дой для того, чтобы повторить и подтвердить полученные выше результаты и измерить чув-ствительность к инсулину и массу жира. Крысы, находившиеся на жировой диете, снова начина-ли сразу же прибавлять в весе. После нахожде-ния на диетах в течение 28 дней крысы, которых держали на жировой диете, имели существенно (p<0,001) больший вес (155,7±6,2 г), чем крысы, которых держали на зерновой диете (128,4±11,5 г). После нахождения в течение 7 дней на раз-личных диетах половину подопытных крыс под-вергали тесту на толерантность к инсулину, применяя внутривенную инъекцию инсулина (0,4 ед./кг). К этому моменту не было обнаружено различия между двумя группами в отношении содержания глюкозы в крови в ответ на инъек-цию инсулина.
Ожиревшим, равно как и худым крысам на 28 день вновь делали внутривенную инъекцию инсулина (0,4 ед./кг) в качестве теста на толе-рантность к инсулину. Для измерения содержа-ния глюкозы в крови брали образцы крови до и после инъекции. Содержание глюкозы в крови у животных, питавшихся кормом для зерновой диеты, оказалось существенно пониженным после первой инъекции инсулина, через 20 минут оно понизилось от начального уровня 162,7±22 мг% до 94,0±25,0 мг%, что составило 56,9% начального содержания. Максимальное падение содержание глюкозы в крови наблюдали через 20 минут, и ее уровни начали подниматься через 40 минут. Животные, питавшиеся кормом для жировой диеты, оказались устойчивыми к ука-занной дозе инсулина. У них концентрация глю-козы в крови снизилась только до 89,4±2% начальной концентрации (210±23 мг%), причем максимальное падение отмечали к 20-й минуте. Эти различия в реакциях на инсулин между дву-мя группами оказались статистически значимы-ми, показывая, что у крыс, питавшихся кормом для жировой диеты, индуцировали выраженную устойчивость к инсулину не к 7-му, а к 28-му дню нахождения на диетах. Таким образом, по-видимому, устойчивость к инсулину зависит не от диеты, а скорее от развития ожирения.
31 286 32
Степень ожирения измеряли непосред-ственно после умерщвления животных (спустя 29 дней после нахождения на диетах с высоким или низким содержанием жира); отсекали пара-метриальные и ретроперитонеальные жировые подушки, взвешивали и сравнивали полученные значения между группами. Жировые подушки животных, находившихся на жировой диете, были существенно крупнее, чем жировые по-душки животных, находившихся на зерновой диете. Средний вес параметриальных жировых подушек (среднее значение ± среднеквадратич-ное отклонением) составил 2,3±0,6 г для живот-ных, питавшихся кормом для зерновой диеты, и 5,2±1,4 г для животных, питавшихся кормом для жировой диеты. Односторонний анализ расхож-дения для этих данных дал значение F, равное 25,57, с 1/17 степенями свободы, т.е. очень зна-чительное различие (р<0,001). Аналогичным образом средний вес ретроперитонеальных жи-ровых подушек составил 0,9±0,4 г для животных, питавшихся кормом для зерновой диеты, и 2,39±0,7 г для животных, питавшихся кормом для жировой диеты. Односторонний анализ рас-хождения дал значение F, равное 24,67, с 1/14 степенями свободы, что снова представляет собой статистически очень большое различие.
Выводы по экспериментам I и II
Целью первого эксперимента было сравне-ние тенденции к развитию ожирения у крыс ли-нии Dwarf и крыс линии SD. У крыс линии Dwarf выраженно развивалось ожирение, а у крыс ли-нии SD нет. Вероятно, нормальные эндогенные уровни GH у крыс линии SD препятствовали развитию ожирения, а низкие его уровни у dw/dw-крыс позволяли развиться ожирению. Следовательно, можно предположить, что про-филактическое лечение крыс с помощью GH будет препятствовать развитию ожирения.
Целью второго эксперимента было пока-зать, что страдающие ожирением dw/dw -крысы со временем становились устойчивыми к инсу-лину вследствие развития ожирения.
Калорийность жира в диете с высоким со-держанием жира была выбрана на уровне 56%, поскольку это представлялось приемлемым мак-симумом. По-видимому, более высокий уровень мог бы привести к нарушению белкового пита-ния вследствие недостатка протеина в диетиче-ском корме. Консистенция диеты при соотноше-нии жира к зерну 1:2 также позволяла получить смесь, удобную для приготовления и питания.
Вышеприведенные исследования показали, что дефицит GH делает животных склонными к развитию ожирения. В следующей серии экспе-риментов исследовали, может ли GH оказать обратное воздействие на это ожирение.
Эксперименты III и IV
Условия опытов
Перед исследованием воздействия различ-ных режимов лечения с помощью GH на стра-дающих ожирением dw/dw-крыс изучали воздей-ствия такого лечения на нестрадающих ожире-нием dw/dw/-крыс. В первом опыте использовали молодых самок dw/dw-крыс; во втором опыте использовали более взрослых зрелых самцов dw/dw-крыс.
Молодые самки крыс
У молодых ( 6 - 9 - недельного возраста) не страдающих ожирением самок dw/dw-крыс схе-ма введения GH определяет анаболическую реакцию на GH. На фиг. 1 показано прибавление веса тела в течение 8 дней у таких крыс (n=5 особей в группе), получавших рекомбинантный hGH марки Nutropin® (5 мг на пузырек, с концен-трацией 2 мг/мл в 18 мг/мл маннита, 0,68 мг/мл глицина и 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,4) в дозе 240 мкг/день, подкожно в трех различных режимах, или получавших эксципиент для hGH (буфер на основе маннита без hGH). При данной дозе GH режим, включающий две инъекции GH в день, оказал наиболее сильное анаболическое действие, непрерывные инфузии были следую-щим по эффективности режимом лечения, а еже-дневные однократные инъекции обладали наименьшим анаболическим действием. Уровни 20 IGF-I в сыворотке этих молодых крыс (фиг. 2), определенные через 24 часа (однократные еже-дневные инъекции) или 16 часов (двукратные ежедневные инъекции) после последней инъек-ции GH, оказались либо подавленными (одно-кратные ежедневные инъекции), либо увеличен-ными (двукратные ежедневные инъекции и инфу-зия с помощью мини-насоса).
Следовательно, наибольшие прибавления веса (фиг.1) были получены с помощью инфузий или двукратных ежедневных инъекций GH и сопровождались увеличением содержания IGF-I в сыворотке.
Зрелые самцы крыс
Существенно более старших, 30 - недельно-го возраста, самцов dw/dw-крыс использовали для изучения воздействия схемы применения hGH на прибавление веса тела и вес жирового депо. Половое созревание крыс происходит на 5-6-й неделях, и вес тела устанавливается прибли-зительно к 15 - недельному возрасту, так что к 30-й неделе крыса уже достигает половой зрело-сти и имеет пропорции тела, присущие зрелому животному. 30-недельный самец крысы также имеет большие запасы жира в организме по сравнению с 8 - 10 - недельной крысой. Поэтому трем группам 30 - недельных самцов dw/dw-крыс вводили hGH (hGH марки Nutropin®, 5 мг на пу-зырек) либо путем ежедневной инъекции, либо с помощью мини-насоса или вводили эксципиент для hGH. Всех крыс кормили кормом для стан-дартной гранулированной зерновой диеты с низким содержанием жира. Не было обнаружено подтверждения того, что режимы лечения оказы-вали влияние на потребление пищи у этих моло-дых или более взрослых, не страдающих ожире-нием крыс.
Результаты (таблицы I и II) в отношении этих более взрослых, находившихся на зерновой диете не страдающих ожирением самцов крыс были сходными с таковыми для молодых крыс, т.е. инфузия GH вызывала более сильное увели-чение веса, чем ежедневные инъекции GH (преж-де всего на ранних стадиях после начала инфу-зии). Обработка с использованием GH не оказы-вала существенного влияния на жировые депо (эпидидимальные и ретроперитонеальные). Средние веса депо фактически увеличились в количественом отношении после лечения с по-мощью GH, но статистически значимых разли-чий не было достигнуто. см. патент США 5126324 выше.
Следовательно, у зрелых, но не страдаю-щих ожирением животных, находившихся на диете с низким содержанием жира, GH при вве-дении с помощью инъекции или инфузии приво-дил к прибавлению веса без изменения массы жировой ткани, причем при обеих схемах введе-ния GН, вызывающих прибавление веса, не наблюдали различного влияния на состав тела.
33 286 34
Кроме того, как видно из таблицы II, инфу-зии GH приводили к увеличению концентраций GHВP и IGF-I в сыворотке по сравнению с инъ-екциями GH. Содержание глюкозы в сыворотке осталось без изменения, но концентрации холе-стерина и триглицеридов существенно возросли после инфузии GH по сравнению с контрольны-ми или инъецированными GH животными.

Таблица I
Параметры тела взрослых самцов dw/dw-крыс: обработка эксципиентом, hGH (500 мкг, подкожно) путем ежедневной инъекции или ин-фузии


Группа Прибав-ление веса тела (г) (день 4) Прибав-ле-ние веса тела (г) (день 14) Все ре-тропери-то-неально-го жира (г) Вес эпи-диди-мального жира (г)
Экципиент -7,85,6 -3,72,5 3,11,2 2,61,0
Инъекция hGH 4,03,4 28,19,2 3,51,8 2,91,1
Инфузия hGH 12,94,4* 31,213,0 4,01,8 3,31,2

Таблица II
Параметры крови взрослых самцов dw/dw-крыс: обработка эксципиентом, hGH (500 мкг, подкожно) путем ежедневной инъекции или ин-фузии


Группа Сыво-ро-точный IGF-I (нг/мл) Сыво-ро-точный GHBP (нг/мл) Сыво-ро-точная глюкоза (мг/дл) Сыво-ро-точный холес-терин (мг/дл) Сыво-ро-точный тригли-церид (мг/дл)
Эксци-пиент 15443 111 1309 758 11819
Инъек-ция hGH 20231 143 1305 8310 11925
Инфу-зия hGH 28541* 7817* 1346 13327* 18547*

Данные в обеих таблицах представляют собой средние значения  среднеквадратичные отклонения, n=7-8 особей в группе.
*р<0,05 в сопоставлении с hGH при введе-нии путем инъекции.
Введение
В двух следующих исследованиях (экспри-менты III и IV) самки dw/dw-крыс находились на диете с высоким содержанием жира в течение 8 недель. Оказалось, что диета с высоким содер-жанием жира вызывала быстрое первоначаль-ное прибавление веса, и крысы после нахожде-ния на жировой диете приобретали стабильное, но характеризующееся ожирением строение тела. Это заключение было сделано на основе относительно небольшого прибавления веса между 6-й и 8-й неделями с использованием дие-ты с высоким содержанием жира, а не на основе детального анализа состава тела. В этих иссле-дованиях предполагается, что изучение живот-ных, характеризующихся стабильным ожирени-ем, а не животных, находящихся в динамической фазе возрастающего ожирения, может отражать характерное для человека состояние продолжи-тельного стабильного ожирения (когда, как мож-но ожидать, будет использоваться липолитиче-ское действие лечения с применением GH).
35 286 36
37 286 38
Следовательно, в двух последующих ис-следованиях получали страдающих ожирением крыс и затем обрабатывали их hGH для того, чтобы оценить его воздействие на прибавление веса тела, вес органов и размер жирового депо. Схему применения GH изучали для того, чтобы определить, является ли она важным фактором при определении липолитической активности GH.
На начальной стадии эксперимента стра-дающим ожирением dw/dw - крысам давали GH путем инфузии или с помощью одной или двух инъекций в день. Полагают, что так же, как в случае анаболического действия GH, липолити-ческое действие различных схем применения GH будет иметь сходную относительную эффектив-ность, т.е. что две инъекции GH в день должны обладать более высокой эффективностью по сравнению с инфузией GH, которая должна быть более эффективной, чем одна инъекция GH в день. На следующей стадии изучения была сде-лана попытка продублировать начальную ста-дию (обрабатывая крыс GH и выдерживая на диете с высоким содержанием жира), а также изучить воздействие совместного режима пита-ния (возвращая крыс к диете с низким содержа-нием жира) и режимов обработки с применением GH.
Эксперимент III
Шестьдесят самок dw/dw-крыс (весом 105-150 г, 90 -дневного возраста) размещали груп-пами и кормили ad libitum диетой с высоким содержанием жира в течение 8 недель, вода так-же была доступна ad libitum. Через 8 недель выдерживания на этой диете наиболее тяжелых (наиболее ожиревших) 40 крыс (средний вес 185 г) выбирали для использования в последующих опытах. Затем крыс анестезировали (с помощью кетамина/ксилазина, внутрибрюшинно) и вводи-ли подкожно два осмотических мини-насоса типа Alza® (2002, скорость накачивания 0,46 мкл/час, фирма Alza Corporation, Palo Аlto, Ка-лифорния). Насосы наполняли либо рекомби-нантным hGH (5 мг/пузырек, марка Nutropin®), либо эксципиентом для hGH. Разбавляли hGH до 22,6 мг/мл таким образом, чтобы 2 насоса могли бы поставлять 22 мкл/день с концентрацией 22,6 мкг/мкл или приблизительно 500 мг hGH в день. Для введения hGH путем инъекций готовили растворы с концентрацией hGH 5 мг/мл и 2,5 мг/мл, так что ежедневно можно было инъециро-вать по 100 мкл раствора с концентрацией 5 мг/мл (500 мкг/день) или можно было инъециро-вать дважды в день по 100 мкл раствора с кон-центрацией 2,5 мг/мл (2 раза по 250 мкг, также получая дозу 500 мкг/день).
Обработку нижеприведенных групп про-должали в течение 14 дней, после чего крыс умерщвляли (n=10 особей в группе):
1) насосы с эксципиентом, инъекции эксци-
пиента
2) насосы с hGH, инъекции эксципиента
3) насосы с эксципиентом, одна инъекция
hGH (500 мкг/день)
4) насосы с эксципиентом, две инъекции
hGH (2х250 мкг/день)
Эксперимент IV
Самок dw/dw-крыс 70 -дневного возраста размещали группами и давали корм для диеты с высоким содержанием жира ad libitum в течение 7 недель, вода также была доступна ad libitum. Отдельную группу, состоящую из 10 крыс, вы-держивали на их обычной зерновой диете. Через 7 недель выдерживания на диете с высоким со-держанием жира выбирали самых тяжелых (наиболее ожиревших) 42 крысы для использо-вания в последующих опытах. Затем крыс ане-стезировали (с помощью кетамина/ксилазина, внутрибрюшинно) и вводили подкожно осмоти-ческий мини-насос типа Alza® (2ML2, скорость накачивания 5,12 мкл/час, фирма Alza Corporation, Palo Alto, СА). Насосы наполняли либо рекомбинантным hGH (5 мг/пузырек, марка Nutropin®), либо эксципиентом для hGH. Разбав-ляли hGH до 4,1 мг/мл. Насос 2ML2 поставлял 5,12 мкл/час или 5,12x24=122,88 мкл/день, так что при концентрации hGH 4,1 мкг/мкл количе-ство поставляемого hGH составляло 122,88x4,12= приблизительно 500 мкг/день. Для введения hGH путем инъекций готовили раствор с концентрацией hGH 5 мг/мл, так что ежедневно можно было инъецировать по 100 мкл раствора с концентрацией 5 мг/мл (500 мкг/день).
Обработку нижеприведенных групп про-должали в течение 14 дней (n=7 особей в груп-пе):
Диета с высоким содержанием жира в тече-ние 7 недель и последующее содержание на диете с высоким содержанием жира:
1) насосы с эксципиентом, инъекции эксци-
пиента
2) насосы с hGH, инъекции эксци-
пиента
3) насосы с эксципиентом, одна инъекция hGH
в день
Диета с высоким содержанием жира в тече-ние 7 недель и последующий перевод на диету с низким содержанием жира (зерновую):
4) насосы с эксципиентом, инъекции эксци-
пиентом
5) насосы с hGH, инъекции эксци-
пиента
6) насосы с эксципиентом, одна инъекция
hGH в день
Зерновая диета в течение 7 недель и после-дующее содержание на зерновой диете:
7) насосы с hGH, инъекции эксципиента
Умерщвление и вскрытие трупов произво-дили через 14 дней, при этом отделяли органы, включая жировые подушки, взвешивали и брали анализ крови для измерения количества метабо-литов и гормонов.
Результаты экспериментов III и IV
Эксперимент III
На фиг. 3 и 4 и в таблице III показаны при-бавления веса страдающих ожирением dw/dw-крыс через 14 дней. На фиг. 3 показаны прибав-ления веса в зависимости от времени; на фиг. 4 и в таблице III показаны окончательные прибав-ления веса. Статистическая значимость полу-ченных данных указана в таблице III. Обрабо-танные эксципиентом крысы сохраняли свой вес (-5 г); если крыс ежедневно подвергали инъекци-ям GH, то они прибавляли в весе (21 г). Однако если GH вводили путем инфузии или с помощью двух инъекций в день, то наблюдали снижение веса (-34 или -24 г соответственно). Эти выра-женные различия в весе тела в ответ на различ-ные схемы применения GH оказались неожидан-ными. В частности, потеря веса тела при обра-ботке GH оказалась противоположной ожидае-мым результатам, показанным на фиг. 1 и табли-це I.
На фиг. 5 и в таблице III показан вес ретро-перитонеальной жировой подушки у dw/dw-крыс. Введение GH путем ежедневных инъекций в течение 14 дней в дозе 500 мкг/день/на особь несущественно снижало количество жира в ор-ганизме, в том числе в ретроперитонеальном, мезентериальном или овариальном/гонадном депо, однако если крыс обрабатывали GH путем инфузии или с помощью двух инъекций GH в день, то во всех трех депо наблюдали снижение количества жира (таблица III). Такое резкое снижение количества жира в организме также отличается от результатов, показанных в табли-це I для нестрадающих ожирением крыс. Следо-вательно, изменения в жировых депо организма проявили такие же тенденции, как и изменения веса тела в ответ на различные схемы примене-ния GH у страдающих ожирением dw/dw-крыс.
Уровни IGF-I, GHBP, глюкозы, холестерина и триглициридов в сыворотке dw/dw-крыс при умерщвлении приведены в таблице IV. Сыворо-точные уровни IGF-I у страдающих ожирением крыс возрастали в результате ежедневных одно-кратных инъекций GH, но не изменялись в ре-зультате инфузиий или двукратных ежедневных инъекций GH. Содержание GHBP в сыворотке в результате обработки осталось без изменения. Инфузии GH или ежедневные двукратные инъек-ции GH по сравнению с ежедневными однократ-ными инъекциями GH оказали различные воз-действия на концентрации глюкозы и триглице-ридов в сыворотке.
39 286 40
Представляет интерес сравнить результаты обработки с помощью GH нестрадающих ожи-рением dw/dw-крыс (таблицы I и II) с результа-тами обработки страдающих ожирением крыс (таблицы III и IV). У нестрадающих ожирением крыс (таблица I) GH независимо от схемы до-ставки увеличил прибавление веса тела и не оказал влияния на запасы жира в организме. У страдающих ожирением крыс (таблица III) наблюдали либо прибавление веса, либо потерю веса. У нестрадающих ожирением крыс инфузия hGH увеличила уровни IGF-I, GHBP, холестери-на и триглициридов по сравнению с инъекцией hGH (таблица II). Однако у страдающих ожире-нием крыс уровни IGF-I и глюкозы под воздей-ствием инфузии GH снизились по сравнению с инъекцией GH и не происходило повышения уровней GHBP, холестерина или триглицеридов (таблица IV). Очевидно, что разные режимы применения hGH оказывают различные воздей-ствия на ряд параметров у не страдающих ожи-рением и страдающих ожирением крыс.

Таблица III
Параметры тела у страдающих ожирением, находящихся на жировой диете самок dw/dw-крыс, обработанных: эксципиентом, hGH (500 мкг, подкожно) путем либо инфузии, либо одно-кратными или двукратными ежедневными инъ-екциями


Группа Прибав-ление веса тела (г) (день 14) Вес ре-тропери-то-неально-го жира (г) Веc ме-зентери-ального жира (г) Вес ова-риально-го жира (г)
Экципиент -58 4,91,6 2,50,9 4,52,0
Инфузия hGH -3421* 1,10,7* 1,60,9* 2,11,1
Инъекция (1 раз в
день) hGH 2113 4,51,7 2,80,9 4,62,1
Инъекция (2 раза в день) hGH -2422* 1,80,6* 2,10,9 2,61,0*

Таблица IV
Параметры крови у страдающих ожирени-ем, находящихся на жировой диете самок dw/dw-крыс, обработанных: эксципиентом, hGH (500 мкг, подкожно) путем либо инфузии, либо одно-кратными или двукратными ежедневными инъ-екциями


Группа Сыво-роточ-ный IGF-I (нг/мл) Сыво-роточ-ный GHBP (нг/мл) Сыво-роточ-ная глюкоза (мг/дл) Сыво-роточ-ный холес-терин (мг/дл) Сыворо-точный тригли-церид (мг/дл)
Эксци-пиент 14324 144 15827 8213 9330
Инфузия hGH 12472* 169* 9330* 7322 9043*
Инъек-ция hGH (1 раз в
день) 21066 1713 16429 766 13018
Инфузия hGH (2
раза в
день) 10358* 103 13821* 8819 11828

Данные в обеих таблицах представляют собой средние значения ± среднеквадратичные отклонения, n=10 особей в группе.
*р<0,05 в сопоставлении с hGH при введе-нии путем инъекции.
Эксперимент IV
На фиг. 6 показаны совокупные прибавле-ния веса у dw/dw-крыс через 14 дней. Первые три группы (жировая/жировая диета) выдерживали на диете с высоким содержанием жира в течение всего опыта, три следующие группы переводили с диеты с высоким содержанием жира на зерно-вую диету в момент времени, когда начинали обработку GH (жировая/зерновая диета) и седь-мую группу (зерновая/зерновая диета) выдержи-вали на зерновой диете в течение всего опыта. GH вводили путем ежедневной инъекции или инфузии с помощью мини-насоса в течение 14 дней в дозе 500 мкг/день/особь. Крысы, которым давали корм для диеты с высоким содержанием жира или для зерновой диеты на протяжении всего эксперимента, сохранили свой вес тела в течение 14 дней, однако если крыс, которых держали на жировой диете, переводили на зер-новую диету, они теряли вес (как и ожидалось). Если крыс обрабатывали с помощью ежеднев-ных инъекций GH, то они набирали вес незави-симо от диеты. Следовательно, эффект перехода от диеты с высоким содержанием жира к зерно-вой терялся, если GH применяли путем инъекции. Однако если GH применяли при помощи инфу-зии, то потерю веса наблюдали независимо от диеты.
У крыс, находившихся на жировой/жировой диете и подвергавшихся инъекциям GH, вес тела увеличился (14±25 г), в то время как крысы, под-вергавшиеся инфузии GH, теряли вес (-44±18 г, р<0,001 по сравнению с инъецированными GH). У крыс, находившихся на жировой/зерновой диете и подвергавшихся инъекциям GH, вес тела также увеличился (27±17 г), а крысы, подвер-гавшиеся инфузии GH, теряли вес (-21±36 г, р<0,01 по сравнению с инъецированными GH). В данном случае также обнаружены выраженные различия в весе тела в ответ на различные режи-мы применения GH у страдающих ожирением крыс даже в том случае, когда имел место сов-местный режим питания.
На фиг. 7 показан вес ретроперитонеальной жировой подушки у dw/dw-крыс. Ожирение у крыс, находившихся на жировой диете, можно обнаружить при сравнении столбцов 1 и 7; сред-ний вес депо крыс, находившихся на жировой диете, составляет 5806 мг, в то время как вес депо крыс, находившихся на зерновой диете, составляет в среднем 1137 мг (5-кратная разница в ожирении). Реакции на обработку GH оказа-лись особенно неожиданными. Применение GH путем ежедневных инъекций в течение 14 дней в дозе 500 мкг/день/особь несущественно снижает количество жира в организме, однако если крыс обрабатывали GH путем инфузии, то происхо-дило статистически значимое уменьшение коли-чества жира независимо от диеты.
41 286 42
При жировой/жировой диете веса ретропе-ритонеальных подушек у подвергавшихся инъ-екциям GH крыс (6110±3400 мг) были суще-ственно больше (p<0,001), чем веса подушек при жировой/жировой диете у крыс, подвергавшихся инфузии GH (15421168 мг). При жиро-вой/зерновой диете веса ретроперитонеальных подушек у подвергавшихся инъекциям GH крыс (4444±2570 мг) был также больше (p<0,05), чем веса подушек при жировой/зерновой диете у крыс, подвергавшихся инфузии GH (20401075 мг). Как и в отношении изменения веса тела, обнаружены выраженные различия в количестве жира в организме в ответ на различные режимы применения GH у страдающих ожирением крыс.
Вывод
Первый вывод, вытекающий из этих иссле-дований, состоит в том, что воздействие GH на состав тела неожиданно оказалось зависящим от режима применения GH. Эти исследования поз-воляют предположить, что у людей только не-прерывное присутствие GH в крови может быть эффективным для снижения количества жира в организме и для достижения потери веса у стра-дающего ожирением человека, что может быть достигнуто, например, с помощью частых (два-жды в день или больше инъекций GH, а также с помощью непрерывной инфузии или других спо-собов, позволяющих пролонгировать присут-ствие GH в крови (включая инкапсулирование GH в композицию с непрерывным высвобожде-нием, присоединение полимера к GH, для того, чтобы пролонгировать его активность, или при-менение GH, соединенного со связывающим его протеином).
Выраженная реакция сывороточного IGF-I на инфузию GH, обнаруженная у не страдающих ожирением крыс, отсутствовала у страдающих ожирением крыс. Кроме того, уровни сыворо-точного GHBP не увеличивались при инфузии GH. Следовательно, по-видимому, у страдающей ожирением крысы при непрерывном введении GH должна быть некоторая степень устойчиво-сти к GH (при использовании IGF-I и сывороточ-ного GHBP в качестве маркеров). Однако липо-литическая реакция на GH показывет, что устойчивость к GH не является всеобщей.
Насколько известно заявителю, данные ис-следования влияния кормления крыс с наслед-ственным дефицитом GH (GHD) пищей для диеты с высоким содержанием жира выполнены впер-вые. Люди с GHD имеют измененную конститу-цию тела с увеличенным содержанием жира. См., например, Rudman, J. Amer. Geriatr. Soc., 33: 800-807 (1985). Питание кормом определенных диет страдающих ожирением самок крыс (dw/dw) представляет собой полезную модель для изучения дефицита GH, в определенной сте-пени схожую со страдающим ожирением чело-веком с GHD. Следует также отметить, что с возрастом у людей развивается дефицит GH (см. Rudman, [1985], стр. 804), поэтому можно пред-положить, что использованная в данном случае модель с применением грызунов, может быть близка к человеку с избыточным весом, имею-щим дефицит GH. Неизвестно, связано ли ожире-ние у людей или с относительным дефицитом GH (вследствие снижения секреции GH), или с отно-сительной недостаточностью реактивности GH (сокращение количества GH-рецепторов или способности связывания GH-рецептора). В настоящем описании показано, что животное с генетической предпосылкой к ожирению может быстро потерять вес при соответствующем лече-нии с применением GH. Можно предположить, что и другие млекопитающие, которые имеют организацию генома, обусловливающую их ожирение, также могут реагировать на соответ-ствующее лечение с применением GH уменьше-нием количества жира в организме.

Пример II
Исследование влияния различных схем вве-дения GH на липолитическое уменьшение веса
Введение
Данное исследование было проведено для определения того, могут ли различные схемы применения hGH влиять на потребление пищи страдающими ожирением самками dw/dw-крыс.
Методы
Девяносто пяти самкам dw/dw-крыс 12 - 16 - недельного возраста (Simonsen Labs, Gilroy, Ка-лифорния) давали корм для диеты с высоким содержанием жира, состоящей из одной части растительного жира Crisco™ и 2-х частей из-мельченного корма для грызунов Purina®. Крыс держали на этой диете с высоким содержанием жира в целом в течение 11 недель до начала данного эксперимента. В исследовании, описан-ном ниже в примере III, использовали пятьдесят четыре крысы. Из оставшихся животных 23 кры-сы, которые приобрели наибольший вес, исполь-зовали в данном исследовании.
За 3 дня (день -3) до первой обработки (день 0) крыс сажали на диету из измельченного корма для грызунов и помещали в метаболические садки NALGE для акклиматизации перед обра-боткой. В данном исследовании не использовали худых контрольных животных. В день О крыс анестезировали с применением кетами-на/ксилазина, внутрибрюшинно (125:25 мг/кг), делали дорзальный подкожный разрез и поме-щали подкожно один осмотический мини-насос типа Alza™ 2002 (фирма Alza Corporation, Palo Alto, Калифорния), содержащий либо hGH, либо эксципиент. Вторую группу крыс инъецировали подкожно либо hGH, либо эксципиентом, поме-щали на подушку с подогревом до появления способности передвигаться и затем перемещали в их исходный садок. После этого крыс инъеци-ровали ежедневно, взвешивали ежедневно и умерщвляли на 14 день.
Использовали следующие группы: *
Группы Инъекции Насос
1 эксципиент эксципиент N=7
2 hGH300mкг эксципиент N=7
3 эксципиент hGH300mкг N=8

*Дозы представляют собой суммарные дневные дозы
Применяли следующие реагенты: hGH мар-ки Nutropin®, 5 мг на пузырек, и эксципиент для hGH (буфер, применяемый в hGH марки Nutropin®, эквивалент 5 мг/мл).
На 15-й день крыс умерщвляли с использо-ванием СО2 и собирали сыворотку и жировые депо для дальнейшего анализа и установления сырого веса.
Результаты
Вес тела
Всех крыс переводили на зерновую диету в день -3, когда их помещали в метаболические садки, что могло позволить объяснить потерю веса у контрольных животных. Изменение веса тела, как видно на фиг. 8, оказалось постоянным до дня 5. В этот момент времени крысы, которым вводили hGH путем инъекций, начинали прибав-лять в весе, а те, которым вводили путем инфу-зии, начинали терять вес. Группа животных, которым вводили GH путем инфузий, теряла вес до приблизительно 9 дня и затем начинала снова прибавлять в весе. На 14 день контрольные кры-сы имели потерю веса (-12±11 г). И опять инъек-ции GH приводили к прибавлению веса (18,8±15 г) по сравнению с потерей веса крысами, кото-рым вводили GH путем инфузии (-530 г, р<0,05 по отношению к инъекции GH).
Потребление пищи
Потребление пищи группой, подвергавшей-ся инфузии, как показано на фиг. 9, имеет одина-ковый характер с изменением веса тела, заклю-чающийся в том, что эти животные, как видно на чертеже, до 8 дня потребляют существенно меньше пищи, чем животные, подвергавшиеся инъекции, и животные контрольной группы. На 8 день контрольные крысы съели 8,6±3,1 г. Крысы, подвергавшиеся инъекции GH, съели существен-но (р<0,05) больше пищи (9,4±4,3 г), чем крысы, подвергавшиеся инфузии GH (2,6±3,8 г). С этого момента времени крысы, подвергавшиеся инфу-зии GH, начали потреблять корм и к 15 дню съе-ли количество пищи, равное таковому для груп-пы, подвергавшейся инъекции. Следовательно, обнаружено выраженное различие между двумя режимами обработки hGH у страдающих ожи-рением крыс: hGH, вводимый путем инфузии, уменьшал потребление пищи, тогда как hGH, вводимый с помощью ежедневных инъекций, приводил к увеличению потребления пищи.
Жировое депо
Веса жировых депо, показанные на фиг. 10, свидетельствуют о том, что потеря веса влед-ствие инфузий GH, вероятно, обусловлена поте-рей жира. Веса жировых подушек у контроль-ных крыс (2,91,2 г) были существенно выше (p<0,05), чем таковые у крыс, подвергавшихся инфузии GH (1,51,2 г), но не отличались от та-ковых у крыс, подвергавшихся инъекции GH (2,60,6 г).
Физические проявления
Крысы, подвергавшиеся инфузиям hGH, быстро теряли вес, и у них снижалось потребле-ние пищи, воды, мочеиспускание и дефекация в течение ряда дней. По-видимому, некоторые крысы были подвержены воздействию в большей степени, чем другие, но не было обнаружено выраженной зависимости между степенью пер-воначального ожирения или весом тела и степе-нью снижения аппетита или потерей веса.
Вывод
Данные об изменении веса тела показыва-ют, что схема доставки hGH оказывает сильное воздействие на прибавление веса тела, жировых депо и потребление пищи. Ежедневные инъекции hGH вызывали прибавление веса тела, а инфузии hGH вызывали потерю веса. Инфузия hGH также приводила к уменьшению потребления пищи до тех пор, пока вес тела и/или жировых запасов тела не достигал нового уровня, после чего воз-обновлялось потребление пищи. Количество потребляемой пищи животными, подвергавши-мися инфузии, было значительно более низким до 8 дня. С этого момента времени крысы, под-вергавшиеся инфузии GH, начали потреблять корм и к 15 дню съели количество пищи, равное таковому для группы, подвергавшейся ежеднев-ной инъекции и незначительно отличавшееся от такового для контрольной группы. Такой же характер изменения был обнаружен для данных по прибавлению веса тела.
В противоположность сниженному поглощению пищи крысами, подвергавшимися инфузиями GH, у крыс, подвергавшихся инъекциям GH, не обна-ружено изменения в потреблении пищи по срав-нению с контрольными (обработанными эксци-пиентом) крысами. В этом случае жировые депо также уменьшались в результате инфузии GH, но не в результате инъекции GH. В целом, инфузии GH привели к снижению веса тела, анорексии и снижению количества жира в организме, в то время как ежедневные инъекции GH (при такой же дозе GH) привели к увеличению веса тела и не оказали воздействия на потребление пищи или запасы жира в организме.
Пример III
Применение GH, IGF-I или GH и IGF-I для лечения ожирения у крыс
Введение
Данное исследование было проведено с це-лью подтверждения воздействий различных схем применения GH и изучения их зависимости от дозы. Кроме того, данное исследование выпол-няли для выявления воздействий IGF-I при его применении индивидуально или совместно с GH на строение организма, общий вес тела и орга-нов, химический состав сыворотки и уровни эндокринных гормонов у страдающих ожирени-ем dw/dw-крыс.
Методы
Дозируемые растворы
43 286 44
ПЭГ7-hGH, как он определен в настоящем описании ранее, получали следующим образом. Метоксиполиэтиленгликоль) превращали в со-ответствующий этиловый эфир путем титрова-ния натрийнафталином для получения соответ-ствующего алкоксида с последующим взаимо-действием с этилбромацетатом. Сложный эфир обрабатывали гидроксидом натрия и водой, получая соответствующую карбоновую кислоту, -карбоксиметил-омега-карбоксиметоксиполи(оксиэтилен). Этот процесс подробно описан у Bückmann и др., см. выше.
Очистку карбоновой кислоты осуществляли путем растворения в теплом этаноле (20 мл/г) и кристаллизации при 4С. Продукт выделяли с помощью фильтрации, промывали эфиром (три-жды) и сушили под вакуумом. Степень функцио-нализации определяли с помощью титрования образца в водном растворе с раствором 1Н КОН и фенолфталеина в качестве индикатора. Тонко-слойную хроматографию проводили в следую-щих условиях: элюирование с помощью метано-ла/СН2CI2 (3:17) и визуализация в парах йода. Соединение проявлялось в виде полосы с Rf от 0 до 0,3.
Кислоту (15 г, 3 ммоля) растворяли в этила-цетате (150 мл) при нагревании. Добавляли N-гидроксисукцинимид (0,86 т, 7,5 ммоля) и дицик-логексилкарбодиимид (1,55 г, 7,5 ммоля) и рас-твор перемешивали при 30С в течение ночи (18 часов). Продукт иногда мог осаждаться в ходе реакции, в таком случае плотную белую суспен-зию нагревали до тех пор, пока в растворе не оставалась только хлопьеобразная дициклогек-силмочевина. Реакционную смесь фильтровали через материал для фильтрации типа Celite® для удаления мочевины и раствор выдерживали при 4°С до следующего утра, когда продукт собира-ли путем фильтрации, промывали холодным этилацетатом (трижды) и сушили под вакуумом, получая омега-метоксиполи(оксиэтилен)оксиэтил-N-гидроксисукцинимид (14,7 г, 98%).
Образовавшийся в результате NГС-ПЭГ до-бавляли в 30 - кратном молярном избытке по сравнению с hGH к раствору, содержащему 12 мг/мл hGH в 50 мМ натрий-боратном буфере с рН 8,5, и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем реак-ционную смесь вносили в Q-сефарозную колонку (фирма Pharmacia) в 30 мM триc-буфере с рН 7,8 и элюировали с помощью градиента NaCl. Затем полученный продукт вносили в колонку типа фенил - Toyopearl 650S, уравновешенную 0,3 М натрий-цитратным буфером с рН 7,8. ПЭГили-рованный hGH элюировали из колонки с помо-щью обратного солевого градиента от 0,3 мо-лярного цитрата натрия с рН 7,8 до 0 молярного цитрата натрия и собирали в пул фракции, со-держащие ПЭГилированный hGH соответству-ющего размера. Затем пул подвергали замене буфера, используя обессоливающую колонку типа G25, меняя на буфер, содержащий 0,25 М маннита, 0,02 М глицина и 5 мM фосфата натрия с рН 7,4 так, чтобы получить концентрацию 1,75 мг/мл. Далее ПЭГ7-hGH растворяли в маннит-ном буфере таким образом, чтобы получить окончательную концентрацию 1 мг/мл, которую использовали для крыс в данном исследовании.
Рекомбинантный человеческий GH пред-ставлял собой hGH марки Nutropin®, 5 мг на пу-зырек. Во всех экспериментах с IGF-I, подробно описанных в примерах, применяли рекомби-нантный человеческий IGF-I [поставляемый на рынок фирмой KabiGen АВ, Стокгольм, Швеция (удельная активность > 14000 ед./мг по данным радиорецепторного анализа с использованием плацентарных мембран) или поставляемого для клинических исследований фирмой Genetech, Inc., Южный Сан-Франциско]. В этом примере IGF-I растворяли, доводя до концентрации 18 мг/мл, в 10 мМ цитратном буфере и 126 мМ NaCI с рН 6,0, в то время как эксципиентом для hGH служил 5 мM фосфатный буфер.
Животные
Девяносто пять самок dw/dw-крыс 12-16-недельного возраста (Simonsen Labs, Gilroy, Ка-лифорния) сажали на диету с высоким содержа-нием жира, состоящую из одной части расти-тельного жира Crisco™ и 2 частей измельченно-го корма для грызунов Purina®. Десять подо-бранных по возрасту крыс оставляли на диете из корма для грызунов с низким содержанием жира для того, чтобы они служили в качестве кон-трольных худых животных. Все крысы находи-лись на своих соответствующих диетах на про-тяжении всего эксперимента. Животных взвеши-вали еженедельно. Через 8 недель отбирали 54 животных, наиболее прибавивших в весе.
План эксперимента: *
Группы Ежедневные
инъекции hGH-насос IGF-l-нacoc
1 эксципиент эксципиент эксципиент
2 эксципиент hGH, 300 мкг эксципиент
3 эксципиент hGH, 100 мкг эксципиент
4 hGH 300 мкг эксципиент эксципиент
5 hGH 100 мкг эксципиент эксципиент
6 эксципиент эксципиент IGF-I, 216 мкг
7 эксципиент hGH, 300 мкг IGF-I, 216 мкг
8 hGH 300 мкг эксципиент IGF-I, 216 мкг
9 ПЭГ7- hGH,
100 мкг эксципиент эксципиент
худые 10

* Дозы указаны в мкг/день
В день -1 крыс случайным образом разде-ляли на 9 групп по шесть особей в каждой. В день 0 страдающих ожирением крыс анестези-ровали с использованием кетамина/ксилазина, внутрибрюшинно (125:25 мг/кг). Дорзальную лопаточную область выстригали и готовили к хирургическому вмешательству, используя там-пон, смоченный 70%-ным изопропиловым спир-том. Делали небольшой подкожный дорзальный разрез и вводили подкожно два осмотических мини-насоса типа Alza 2002, содержащие hGH, IGF-I или эксципиент. Рану зажимали с исполь-зованием 9-миллиметрозых автоматических зажимов.
45 286 46
Животным инъецировали подкожно либо hGH, либо эксципиент, помещали на подушки с подогревом до появления способности передви-гаться и затем возвращали в их исходный садок. Крыс инъецировали, взвешивали ежедневно и умерщвляли на 14 день. Худых контрольных крыс анестезировали и подвергали имитацион-ному хирургическому вмешательству, но не вво-дили мини-насосы и не подвергали инъекциям.
На 14-й день всех крыс умерщвляли с ис-пользованием СО2 и отбирали сыворотку, селе-зенку, почку, печень, сердце, овариальные и ретроперитонеальные жировые подушки и большую берцовую кость. Сыворотку, печень, овариальные жировые подушки, кожу и тушку сохраняли и замораживали. Сердце и большую берцовую кость помещали в формалин для ги-стологического исследования. Химический со-став сыворотки определяли с помощью клиниче-ского химического анализатора типа Monarch. Содержание сывороточного инсулина измеряли с помощью радиоиммуного анализа. Общее со-держание IGF-I в сыворотке измеряли с помо-щью радиоиммуного анализа после экстракции образцов с использованием кислоты/этанола.
Результаты
Вес тела
Крысы, которым давали корм для диеты с высоким содержанием жира, быстро прибавляли в весе в течение первых четырех недель с момен-та начала кормления пищей для диеты с высо-ким содержанием жира, однако затем прибавле-ние веса тела имело тенденцию выходить на постоянный уровень. После 8 недель нахожде-ния на диете с высоким содержанием жира dw/dw - крысы значительно прибавили в весе, что позволило отобрать 54 животных, которые прибавили в весе на 42-83% от их первоначаль-ного веса, в среднем на 59%, по сравнению с соответствующим диапазоном для крыс, питав-шихся кормом для зерновой диетой, составляв-шим 18-32%, в среднем 23%, от их первоначаль-ного веса.
На фиг. 11 показаны средние значения при-бавления веса 10-ти групп крыс на 14-й день. Крысы, обработанные эксципиентом, сохранили свое состояние ожирения при отсутствии при-бавки в весе или его потери (1,5±9,0 г), После 14-дневной обработки hGH путем инфузии и в ком-бинации с IGF-I был обнаружен очень стойкий и очень выраженный катаболический эффекта сопровождавшийся средней потерей веса в тече-ние 14 дней, составлявшей 50,2±10,0 г, что зна-чительно больше (p<0,05), почти в два раза, чем в группе, получавшей путем инфузии 300 мкг только hGH (-23,8±31,1 г). IGF-I не оказал суще-ственного воздействия на прибавление веса, хотя через 14 дней наблюдали скорее прибавление веса (10,0±4,5 г), чем потерю веса. В этом вари-анте инфузии низкой дозы hGH, равной 100 мкг/день, также давали прибавление веса, несу-щественно отличающееся от контроля, но кото-рое было незначительным (13,2±16,1 г) по срав-нению с большим прибавлением веса при введе-нии 100 мкг/день hGH путем инъекции (30,1±18,1 г). Две дозы hGH, вводимые путем инъекции, не отличались друг от друга, но оказывали анабо-лический эффект, значительно отличающийся (p<0,05) от такового для контрольных животных. На 14-й день прибавление веса крысами, полу-чавшими ежедневные инъекции по 100 мкг/день ПЭГ7-hGH (2,6±20 г) было значительно ниже (р<0,05), чем таковое у крыс, получавших еже-дневные инъекции hGH.
47 286 48
На фиг. 12 показано прибавление веса в за-висимости от времени для некоторых из этих групп. На этом чертеже заметны резкие различия между двумя режимами применения hGH и меж-ду воздействием одного GH и GH, применяемого вместе с IGF-I.
Вес органов
А. Вес сердца: Не обнаружено существен-ного различия между группами ни в абсолютной величине веса сердца, ни в весе сердца, выра-женном в процентах от веса тела (относитель-ный вес).
Б. Вес почек: Инфузии высоких доз hGH об-наружили тенденцию к увеличению абсолютно-го веса почек и резкому увеличению относитель-ного веса почек по сравнению с контролями или животными, обработанными GH путем инъек-ции. Крысы, обработанные IGF-I, имели значи-тельно более крупные почки, чем таковые у страдающих ожирением контрольных живот-ных, но не отличались значительно от таковых у худых контрольных животных. Была обнаруже-на зависимость эффекта от дозы в отношении относительного размера почек у группы, подвер-гавшейся инфузии hGH. ПЭГ7-hGH не оказывал существенного влияния на размер почек.
В. Вес печени: Крысы, получавшие 300 мкг hGH путем инфузии, имели значительно более крупную печень по сравнению с контрольными. IGF-I не оказывал значительного воздействия по сравнению с контролем и не обладал дополни-тельным эффектом при введении в комбинации с hGH по сравнению с группой, обрабатываемой высокой дозой hGH путем инфузии. Инъекция hGH не оказывала значительного воздействия на размер печени.
Г. Вес селезенки: Веса селезенок крыс, по-лучавших только IGF-I, были значительно выше, чем таковые у животных, получавших IGF-I в комбинации с инфузией hGH. Это позволяет предположить, что рост селезенки, вызванный IGF-I, блокировали путем инфузии hGH. Эти данные оказались неожиданными, поскольку ранее не было обнаружено, что воздействия IGF-I могут так резко блокироваться с помощью ин-фузии hGH.
Д. Вес жировых подушек: На чертежах представлены данные об абсолютном весе ре-троперитонеальной жировой подушки (фиг. 13), относительном весе (фиг. 14) и абсолютном весе гонадной жировой подушки (фиг. 15). Крысы, получавшие 300 мкг hGH путем инфузии, резко теряли вес и имели значительно меньшие (р<0,01) запасы жира в депо по сравнению с контролем. Инфузия 100 мкг hGH оказывала меньшее воздействие на массу жира, а жировые подушки весили существенно больше (р<0,01), чем жировые подушки при инфузии высокими дозами. В противоположность этому крысы, получавшие GH путем инъекции в дозе либо 100, либо 300 мкг/день, не имели изменений в абсо-лютном весе ретроперитонеальных или гонад-ных депо.
Индивидуально IGF-I и ПЭГ7-hGH не ока-зывали существенного воздействия на массу жировых подушек.
Инфузия IGF-I, когда она проводилась в комбинации с инъекциями hGH, приводила к значительно (р<0,05) большей потере массы жировых подушек, чем в контроле, а наиболее сильное воздействие на состав тела наблюдали при совместных инфузиях GH и инфузиях IGF-I. В этой последней группе жировая масса резко снизилась по сравнению с таковой у контроль-ных, питавшихся зерном крыс и была понижен-ной (p<0,05) по сравнению с группой, получав-шей только инфузию GH.
Е. Химический состав сыворотки:
1. Крысиный инсулин: В соответствии с данными, полученными с помощью дисперсион-ного анализа, уровни инсулина не различались статистически во всех случаях. Cм. фиг. 16. Од-нако следует заметить, что в группе, подвергав-шейся совместной обработке hСН-инфузия/IGF-I, большинство животных имело концентрации инсулина 0,2 нг/мл, что находилось на уровне разрешающей способности данного метода. Следовательно, представляется вероятным, что IGF-I снижал уровни инсулина и что инфузии GH плюс инфузии IGF-I снижали уровни инсу-лина даже в большей степени.
2. Сывороточный IGF-I: Инфузии GH не оказывали воздействия на концентрации сыво-роточного IGF-I у страдающих ожирением крыс (что подтверждают данные, приведенные в таб-лице IV). Cм. фиг.17. Как и ожидалось, инфузии IGF-I увеличивали концентрации сывороточного IGF-I. Но эти концентрации снижались при сов-местном введении GH.
3. Глюкоза: Уровни глюкозы были суще-ственно более низкими в группе, подвергавшейся hGH/IGF-I-инфузии (59,6 мг/дл±6,3) по сравне-нию с уровнями глюкозы в группе, подвергав-шейся инфузии с высокой дозой hGH (98,2 мг/дл±48,9). Cм. фиг. 18. В соответствии с дан-ными примера II потребление пищи в группе, подвергавшейся инфузии GH, вернулось к норме к 14-му дню, но уровни глюкозы остались пони-женными. ПЭГ7-hGH не оказывал воздействия на сывороточную глюкозу.
4. Триглицириды Содержание сывороточ-ных триглицеридов оказалось существенно сни-женным при совместной инфузии hGH и IGF-I. Инфузия IGF-I или только hGH не оказывали существенного воздействия на сывороточные триглицериды. Ежедневные инъекции hGH суще-ственно повысили содержание сывороточных триглицеридов; однако когда IGF-I вводили пу-тем инфузии совместно с инъекциями hGH, со-держание сывороточных триглицеридов незна-чительно отличалось от такового в контроле. Cм. фиг. 18. ПЭГ7-hGH не оказывал воздействия на сывороточные триглицериды.
5. Холестерин: Не обнаружено существен-ного различия между группами. Cм. фиг. 18.
6. Азот мочевины: Страдающие ожирением крысы имели пониженные уровни азота мочеви-ны крови (АМК). Cм. фиг. 19. Этих крыс выдер-живали на диете с высоким содержанием жира, поэтому худые крысы поглощали больше проте-ина с точки зрения калорийности. Группы, полу-чавшие IGF-I, имели более низкие уровни АМК, по сравнению с группами, получавшими только hGH.
7. Кальций: Содержание кальция возраста-ло при инфузии hGH и под воздействием ПЭГ7-hGH, но понижалось, если IGF-I давали отдель-но или в комбинации с hGH. Cм. фиг. 19.
8. Фосфор: Содержание фосфора было вы-соким у всех страдающих ожирением крыс. У худых контрольных животных оно было суще-ственно более низким. Cм. фиг. 19.
Вывод
Результаты, полученные в этих исследова-ниях, подтверждют данные примеров I и II о том, что непрерывное ведение hGH животным, стра-дающим ожирением в результате определенной диеты, обладает липолитическим действием и приводит к резкой потере веса тела. В противо-положность этому такая же доза GH, вводимая путем ежедневной инъекции, приводит к увели-чению веса тела и не обладает чисто липолити-ческим действием. Данные исследования пока-зывают, что эффект зависит от дозы.
Кроме того, IGF-I применяли в комбинации с hGH, чтобы определить, будет ли IGF-I обла-дать антагонистическим действием по отноше-нию к липолитическому эффекту инфузий hGH. Неожиданно было обнаружено, что указанная комбинация оказалось даже более эффективной с точки зрения липолитического действия, чем только GH, прежде всего при применении GH путем инфузии.
На не страдающих ожирением животных инфузии IGF-I и инъекции GH оказывают адди-тивное анаболическое действие, но комбинация IGF-I с инфузиями GH не обладает аддитивным анаболическим действием. Cм. патент США 5126324 выше. Следовательно, оказалось неожиданным, что комбинация IGF-I и GH (ин-фузии IGF-I и инфузии GH или инъекции GH) вызывала липолитическое действие у страдаю-щих ожирением млекопитающих. Особенно неожиданным оказалось выраженное синерги-стическое действие инфузии GH и инфузии IGF-I на потерю веса и массу жировой ткани, обнару-женное у страдающих ожирением крыс.
49 286 50
В примере I показано, что страдающие ожирением dw/dw - крысы становятся устойчи-выми к инсулину. GH считается “диабетоген-ным”, т.е. приводящим к устойчивости к инсули-ну. Следовательно, введение GH, прежде всего вместе с IGF-I, страдающим ожирением живот-ным, у которых падает уровень глюкозы в крови (а не поднимается) и падает уровень инсулина (а не поднимается), оказывает противоположное воздействие по сравнению с ожидаемым для лечения болезни.
Иходя из полученных в данном случае неожиданных результатов, можно ожидать, что снижение количества жира в организме до уров-ня, близкого к уровню, предшествующему ожи-рению, восстановит чувствительность к инсули-ну, так что страдающим ожирением людям, под-вергающимся лечению инсулином, соответству-ющее введение GH и IGF-I, как описано в насто-ящей заявке, может позволить уменьшить или прекратить введение инсулина. Следовательно, можно ожидать, что лечение с помощью GH и IGF-I будет предупреждать или предотвращать развитие человеческого диабета типа II у стра-дающего ожирением пациента.
Правомерно предположить, что данные, полученные в данном случае на крысах, можно экстраполировать на лошадей, коров и других млекопитающих, корректируя вес тела этих мле-копитающих в соответствии с признанными ве-теринарными и клиническими характеристика-ми. Используя стандартные протоколы и мето-дики, ветеринар или лечащий врач должен быть способен регулировать дозы, режимы и способ введения IGF-I и GH и их вариантов, чтобы до-стичь максимальных эффектов у конкретного подлежащего лечению млекопитающего. Веро-ятно, люди должны реагировать подобным же образом и проявлять реакцию, аналогичную описанной ниже в примере IV.
Пример IV
Применение GH, IGF-I или GH и IGF-I для лечения пациентов-людей
Клинические данные были получены на больных СПИДом мужчинах, средний возраст которых составлял 39 лет, при использовании только IGF-I, только GH и совместно GH и IGF-I по сравнению с контролем. В этих исследовани-ях IGF-I, полученный и приготовленный анало-гично описанному в примере III, вводили под-кожно пациентам, больным СПИДом, в дозе по 5 мг дважды в день (примерно 80 мкг/кг дважды в день в расчете на средний вес 60 кг). GH, полу-ченный и приготовленный аналогично описан-ному в примере I, вводили подкожно пациентам, больным СПИДом, в дозе по 1,4 мг в день (при-мерно 23 мкг/кг/день в расчете на средний вес 60 кг). Пациентов лечили в соответствии с этим протоколом в течение 6-12 недель.
После лечения изменения массы жира (кг) по сравнению с исходным состоянием каждого пациента измеряли с использованием метода двойной энергетической абсобциометрии в рент-геновских лучах (сокр. англ. DEXA), хорошо зарекомендовавшего себя метода измерения состава тела человека. Вначале в каждой группе было по 15 больных, однако количество пациен-тов, оставшихся на лечении спустя 12 недель, уменьшилось до 9 в контрольной группе, до 6 в GH-группе, до 4 в IGF-I-группе и до 6 в GH/IGF-I-группе.
Это исследование показало, что после 12-ти недель лечения комбинацией IGF-I и GH оно привело к увеличению в среднем массы тела без учета жира приблизительно на 7 фунтов при одновременной потере жира. В наиболее выра-женном случае пациент прибавил 3 кг к массе тела без учета жира, но потерял 1 кг жира. Лече-ние с помощью только IGF-I не привело к изме-нениям по сравнению с плацебо, в то время как лечение с помощью только GH привело к не-большому увеличению массы тела без потери жира. Результаты, приведенные на диаграмме на фиг. 20, и необработанные данные, представ-ленные в таблице 5, показывают, что при ис-пользовании комбинированного лечения полу-чали наибольшую потерю массы жира, что поз-воляет предположить наличие синергистическо-го эффекта в отношении потери веса, когда hGH и IGF-I применяют совместно в течение 12 недель. Подобный эффект наблюдали после 6 недель лекарственой терапии.

Таблица V
Масса жира после 12 - недельного гормо-нального лечения

ПлацебоСО* GHCO IGF-ICO GH-IGF-ICO
0,000,81 0,000,83 -0,200,80 -1,81,94

* СО обозначает среднеквадратичное отклонение.

US 5126324, 30.06.92
US 4792546, 20.12.88