СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА “ТИМОГАР” И ЕГО СОСТАВ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма человека и животных. Целью изобретения является создание иммуностимулирующего препарата и разработка оптимального спо-соба его получения. Указанная цель достигается тем, что в качестве препарата используется дипептид изолейцил-триптофан в виде водного раствора с концентрацией дипептида 100 мкг/мл. Дипептид получают методом активированных (пентафтор-фениловых) эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната и натриевой соли трип-тофана. Защищенный дипептид очищают обработкой бисульфатом натрия и колоночной хроматографией на силикагеле L-100/160, деблокируют каталитическим гидрированием в присутствии палладиевого катализатора. Свободный дипептид очищают экстракцией нбутанолом и переосаждением из метанола эфиром, готовят его 0,01%-ный водный раствор.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для стимуляции деятельности иммунной системы организма животных.
Известен (1) тетрапептид с последовательно-стью треониллизил-пролил-аргинин, называемый тафцином и обладающий иммуностимулирующей активностью. Известен способ его получения, при котором применяется ступенчатое наращивание пептидной цепи методом активированных (N-оксисукцинимидных) эфиров, где в качестве N-защитной группы используют трет-бутилоксикарбонильную, Е-аминогруппы лизина - карбобензокси- и ОН-группы треонина - бензиль-ную группы, а очистку полученного пептида про-водят ионообменной хроматографией в пиридино-вом растворе.
Недостатком тафцина и способа его получе-ния является то, что для синтеза препарата необ-ходимо провести три стадии конденсации, а также снятия и введения защитных группировок с боко-вых функциональных групп треонина, лизина и аргинина. Кроме того, для очистки тафцина ис-пользуют такой трудоемкий процесс, как ионооб-менная хроматография.
Известен тетрапептид с последовательностью треонил-треонил-лизил-аспарагиновая кислота, обладающий иммуностимулирующим действием (2). Известен способ его получения, заключаю-щийся в ступенчатом наращивании пептидной цепи методом активированных эфиров с использо-ванием для присоединения остатка лизина п-нитрофенилового, треонина - пентахлорфенилово-го эфиров. В качестве N-защитной группы исполь-зуется карбобензокси- группа, Е-аминогруппа лизина защищается трет-бутилоксикарбонильной группой, карбоксильные группы аспарагиновой кислоты защищены солеобразованием с гидрокси-дом натрия.
Недостатком данного пептида является мно-гостадийность синтеза.
Прототипом заявляемого препарата служит композиция триптофансодержащих дипептидов формулы Х-триптофан, где Х-глутаминовая кисло-та, глутамин, лейцин и изолейцин в концентрации от 10 до 200 мкг/мл, оказывающая иммуномоду-лирующее действие (3). Известен (4) способ полу-чения таких пептидов, включающий конденсацию защищенных аминокислот методом активирован-ных (1-гидроксибензотриазоловых) эфиров дебло-кирование защищенного дипептида, очистку сво-бодного дипептида с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хрома-тографии и лиофилизацию.
Недостатком прототипа, как лекарственного препарата является то, что в его состав входит четыре дипептида, а способа его получения - ис-пользование для очистки обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии как метода, требующего специального оборудо-вания.
Целью изобретения является создание имму-ностимулирующего препарата и разработка оп-тимального способа его получения.
Указанная цель достигается тем, что в каче-стве препарата используется дипептид изолейцил-триптофан в виде водного раствора с концентра-цией дипептида 100 мкг/мл. Дипептид получают методом активированных (пентафторфениловых) эфиров, получаемых с помощью дипентафторфе-нилкарбоната взаимодействием пентафторфени-лового эфира карбобензоксиизолейцина и натрие-вой соли триптофана. Полученный защищенный пептид очищают обработкой бисульфатом натрия и колоночной хроматографией на силикагеле L-100/160, деблокируют каталитическим гидриро-ванием в присутствии 10%-ного палладия на акти-вированном угле. Свободный дипептид предвари-тельно очищают экстракцией н-бутанолом, окон-чательно - переосаждением из метанола эфиром, готовят его 0,01%-ный водный раствор.
Применение иммуностимулирующего препа-рата тимогар позволяет повысить эффективность вакцинации крупного рогатого скота против тей-лериоза за счет повышения уровня гуморального иммунного ответа.
Применение предлагаемого способа получе-ния иммуностимулирующего препарата тимогар позволяет:
1. Провести синтез дипептида без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных соединений.
2. Исключить использование для очистки свободного дипептида обращенно-фазовой высо-коэффективной жидкостной хроматографии.

Пример
К 2,65 г (1 ммоль) карбобензоксиизолейцина и 1,45 мл (10,5 ммоль) триэтиламина в 20 мл эти-лацетата добавляют 4,0 г (10,5 ммоль) дипен-тафторфенилкарбоната и перемешивают при ком-натной температуре в течение 30 мин. Этилацетат упаривают, остаток растворяют в 20 мл диметил-формамида и к полученному раствору добавляют 2,26 г (10 ммоль) натриевой соли триптофана, перемешивают при комнатной температуре в те-чение 3 часов. Диметилформамид упаривают, остаток растворяют в смеси 40 мл этилацетата и 40 мл 3%-ного раствора бисульфата натрия, со-держащего 1,2 г (10 ммоль) соли, перемешивают 5 мин., водный слой отделяют. Этилацетатный слой промывают 20 мл (3 х 6,5 мл) 0,3%-ного раствора бисульфата натрия (5%-ный избыток соли по пеп-тиду). Этилацетатный раствор пептида сушат безводным сульфатом натрия, этилацетат упари-вают. Окончательную очистку защищенного пеп-тида осуществляют колоночной хроматографией на силикагеле L-100/160. Колонку (2,0 х 50 см) элюируют вначале хлороформом, затем смесью этилацетат-бензол (3:2). Собирают фракции по 5 мл. Каждую фракцию на наличие основного про-дукта контролируют тонкослойной хроматогра-фией. Фракции, содержащие основной продукт, объединяют, упаривают. Значение хроматографи-ческой подвижности (Rf) в системе хлороформ-метанол-32%-ная уксусная кислота (60:45:20) равно 0,81, в системе хлороформ-этилацетат-метанол-уксусная кислота (90:30:10:3) равно 0,65. Остаток растворяют в 50 мл метанола и гидриру-ют в течение 4 ч в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле. По окончании гидриро-вания катализатор отфильтровывают. Фильтрат упаривают. Остаток растворяют в смеси н-бутанол-вода, водный слой отделяют, н-бутанол упаривают. Остаток после упаривания растворя-ют в метаноле и осаждают эфиром. Осадок от-фильтровывают, промывают эфиром, сушат под вакуумом. Выход свободного дипептида состав-ляет 82,2%. Значение хроматографической по-движности (Rf) в системе н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (30:20:6:24) равно 0,44, в системе уксусная кислота-вода-метанол-хлороформ (7:3:1:1) равно 0,71, = -31,14 (С 1, МеОН).
Токсичность тимогара определяют на белых мышах. Пяти белым мышам вводят по 0,5 мл 0,4%-ного водного раствора тимогара (2 мг иммуноак-тивного пептида). Терапевтическая доза тимогара составляет 1 мл 0,01%-ного раствора на 100 кг живого веса животного. (100 мкг иммуноактивного пептида на 100 кг). Так как средний вес белых мышей составляет 20 г, то терапевтическая доза препарата для одной мыши составляет 0,0002 мл (0,02 мкг). Следовательно однократная терапевтическая доза препарата при определении токсич-ности увеличена в 100000 раз. За животными устанавливают клиническое наблюдение в тече-ние 8 дней. Контролем служат животные, не полу-чавшие тимогар. У опытных и контрольных жи-вотных не было отмечено отклонений от физиоло-гической нормы.
Иммуностимулирующую активность тимога-ра (дипептида изолейцил-триптофан) изучают по усилению антителообразования у телят иммуни-зированных противотейлериозной вакциной. Для этого пять опытных и пять контрольных телят иммунизируют живой противотейлериозной вак-циной ВИЭВ в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток) на голову. Через 3-5 дней с начала поствакцинальной реакции на введение вакцины (через 15-17 дней после иммунизации) опытным животным вводили тимогар (дипептид изолейцил-триптофан) в дозе 1 мл 0,01%-ного водного раствора (100 мкг дипеп-тида) на 100 кг живого веса животного. Через 35 дней после вакцинации у опытных и контрольных животных определяют в сыворотке крови наличие и уровень противотейлерийных антител реакцией длительного связывания комплемента (РДСК) и иммуноферментным анализом (ИФА).
В сыворотке крови опытных телят титр про-тивотейлерийных антител в РДСК составлял 1:5-1:40 и в ИФА - 1:100-1:1600. В сыворотке крови контрольных животных титр противотейлерийных антител составлял 1:5-1:20 и в ИФА - 1:50-1:800.
Таким образом, тимогар (дипептид изолей-цил-триптофан) вызывает двукратное увеличение титра противотейлерийных антител у животных, иммунизированных противотейлериозной вакциной, что свидетельствует о наличии у препарата иммуностимулирующей активности.

1. Najjar V.A. Therapeutically useful poly-peptides. United States Patent Office. 3.778.426. 11 Dec/ 1973. Int. C 07 C 1/52, C 07 G 7/00, C 08 H 1/00. Appl. 16 Dec. 1970.
2. Авт. св-во СССР № 1287532.
3. Khavinson V.Kh., Morozov V.G., Sery S.V., Green L., Sinackevich N.V., Kozheshyakin A.L., Phar-maceutical tryptophen containing dipeptide composi-tiors and of use thereof. PCT/WO/ 94/20063.
4. Бобиев Г.М. Синтез и структур-но/функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина: Автореф, дис.канд.хим.наук. - Душанбе, 1996. - 24с.