СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА “ТИМОЦИН”

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма животных. Целью изобретения является разработка способа получения препарата для регуляции и стимуляции деятельности иммун-ной системы организма животных. Указанная цель достигается тем, что проводят конденсацию карбо-бензоксиизолейцина и триптофана карбодиимид-ным методом с использованием: пентахлорфенола в качестве конденсирующего реагента дициклогек-силкарбодиимида и нуклеофильной добавки 1-гидроксибензотриазола, для защиты -карбоксильной группы триптофана триэтиламина, деблокированием защищенного пептида каталити-ческим гидрированием над 10%-ным палладием на активированном угле, очисткой свободного дипеп-тида экстракцией н-бутанолом и высокоэффектив-ной жидкостной хроматографией, получении его координационного соединения с цинком путем взаимодействия дипептида и ацетата цинка в раз-бавленных водных растворах при рН 6,0 110-120С в течение часа без доступа воздуха.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности им-мунной системы организма животных.
3 282 4
Известен (1) способ получения трипто-фансодержащих дипептидов формулы Х-триптофан, где Х-глутаминовая кислота, глута-мин, лейцин, изолейцин и др. Способ заключает-ся в проведении конденсации защищенных ами-нокислот методом активированных (1-гидроксибензот-риазоловых) эфиров, деблоки-ровании защищенного пептида, очистке свобод-ного дипептида с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Недостатком данного способа является ис-пользование для очистки свободных пептидов высокоэффективной жидкостной хроматографии как метода, требующего специального оборудо-вания.
Известен (2) способ получения иммуности-мулирующего препарата ферунол, заключаю-щийся в получении методом активированных эфиров дипептида валил-триптофан, получении его координационного соединения с ионом желе-за (II), приготовлении 0,07%-ного водного рас-твора координационного соединения. Дипептид валил-триптофан получают конденсацией N-оксисукцинимидного эфира карбобензоксивали-на и метилового эфира триптофана. Деблокиро-вание полученного защищенного дипептида осуществляют каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного палладия на активиро-ванном угле и обработкой 1 н. раствором гид-роксида натрия с последующей очисткой с по-мощью высокоэффективной жидкостной хрома-тографии и лиофилизуют полученный свобод-ный дипептид. Координационное соединение получают взаимодействием эквимолярных коли-честв дипептида и сульфата железа (II) в раз-бавленных водных растворах при рН 6,0, 110-120С в течение часа в темноте.
Недостатком данного способа является ис-пользование остатка триптофана с защищенной карбоксильной группой в результате чего для получения свободного дипептида необходимо проводить дополнительную стадию деблокиро-вания карбоксильной группы. К недостаткам также можно отнести использование для полу-чения координационного соединения дипептида валил-трифтофан, неактивного в тесте Е-розеткообразования клетки, в результате чего получается препарат с относительно невысокой иммуностимулирующей активностью.
Прототипом заявляемого является способ получения иммуностимулирующего препарата тимофер (3), являющегося координационным соединением дипептида изолейцил-триптофан с ионом железа (II). Способ заключается в полу-чении методом активированных эфиров дипеп-тида изолейцил-триптофан, получении коорди-национного соединения его с ионом железа (II), приготовлении водного раствора полученного координационного соединения. Синтез дипепти-да изолейцил-триптофан проводят конденсацией пентахлорфенилового эфира карбобензоксиизо-лецина и метилового эфира триптофана. Дебло-кирование защищенного дипептида осуществ-ляют каталитическим гидрированием в присут-ствии 10%-ного палладия на активированном угле и обработкой 1н. раствором гидроксида натрия. Очистку свободного дипептида осу-ществляют с помощью обращенно-фазовой вы-сокоэффективной жидкостной хроматографии, затем лиофилизуют. Координационные соедине-ния получают взаимодействием эквимолярных количеств разбавленных водных растворов ди-пептида и сульфата железа (II) при 110-120С и рН 6,0.
Недостатком данного способа также явля-ется использование остатка триптофана с защи-щенной карбоксильной группой, что требует проведения дополнительной стадии деблокиро-вания. К недостаткам также можно отнести ис-пользование для комплексообразования железа, как металла, непосредственно не участвующего в иммунологических реакциях организма, что приводит к получению препарата с несколько меньшей, чем у тимоцина, иммуностимулирую-щей активностью.
Целью изобретения является разработка способа получения препарата для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма животных.
Указанная цель достигается тем, что прово-дят конденсацию карбобензоксиизолейцина и триптофана карбодиимидным методом с исполь-зованием: пентахлорфенола в качестве конден-сирующего реагента дициклогексилкарбодии-мида и нуклеофильной добавки -1-гидроксибензот-риазола; для защиты -карбоксильной группы триптофана триэтилами-на. Полученный защищенный пептид деблоки-руют каталитическим гидрированием в присут-ствии 10%-ного палладия на активированном угле, свободный дипептид очищают предвари-тельно экстракцией н-бутанолом, окончательно - высокоэффективной жидкостной хроматографи-ей, лиофилизуют, готовят его водный 0,02%-ный раствор к которому при рН 6,0 и 110-120С до-бавляют эквимолярное количество ацетата цин-ка, состав выдерживают в течение часа при 110-120С без доступа воздуха и охлаждают до ком-натной температуры.
Применение предлагаемого способа полу-чения иммуностимулирующего препарата тимо-цин позволяет:
1. Исключить стадии введения и снятия за-щитной группы с карбоксильной группы трип-тофана.
2. Провести синтез дипептида без выделе-ния из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных соединений.
5 282 6
3. Получить препарат с более высокой, чем у прототипа, иммуностимулирующей активно-стью.
Приме. 2,65 г (10 ммоль) карбобензоксиизо-лейцина растворяют в 25 мл диметилформамида, охлаждают до -5-0С, добавляют 2,06 г (10 ммоль) дициклогексилкарбодиимида 2931 г (11 ммоль) пентахлорфенола и 1,265 г (11 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, перемешивают 1 ч при -5-0С. Добавляют 2,04 г (10 ммоль) триптофана и 1,2 мл (10 ммоль) триэтиламина, перемешива-ют при комнатной температуре в течение 16 часов. Диметилформамид упаривают, остаток растворяют в 200 мл этилацетата, промывают 2%-ной серной кислотой и водой до нейтральной реакции промывных вод. Степень чистоты кон-тролируют тонкослойной хроматографией. Зна-чение хроматографической подвижности карбо-бензоксиизолейцил-триптофана (Rf) в системе хлороформ-метанол-32%-ная уксусная кислота (60:45:20) равно 0,81, в системе хлороформ-этилацетат-метанол-уксусная кислота (90:30:10:3) равно 0,65. Этилацетатный раствор сушат безводным сульфатом натрия. Этилацетат упаривают. Остаток растворяют в 200 мл мета-нола, гидрируют над 10%-ным палладием на активированном угле. Через 4 часа катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяют в смеси н-бутанол-вода, водный слой отделяют, н-бутанол упари-вают. Остаток после упаривания растворяют в 0,05 М ацетатаммонийном буфере (рН 6,8) и очищают с помощью высокоэффективной жид-костной хроматографии на колонке 1,6 х 25 см, заполненной обращенно-фазовым силикагелем Силасорб С18 при градиенте ацетонитрила от 10 до 30% при скорости потока 14 мл/мин и детек-тировании при длине волны 220 нм. Собирают фракции, содержащие основной продукт, лиофи-лизуют. После лиофилизации выход свободного изолецил-триптофана составляет 98%. Значение хроматографической подвижности (Rf) в системе н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (30:20:6:24) равно 0,44, в системе уксусная кис-лота-вода-метанол-хлоро-форм (7:3:1:1) равно 0,71, = -31,14 (C 1, МеОН).
0,0317 г (0,1 ммоль) свободного дипептида изолейцил-триптофан растворяют в реакцион-ном сосуде в 40 мл стерильной дистиллирован-ной воды, нагретой до 100С. К полученному раствору при рН 6,0 и постоянном перемешива-нии
добавляют 0,0173 г (0,1 ммоль) ацетата цинка. Реакционный сосуд герметично закрыва-ют и нагревают до 110-120С и выдерживают при этой температуре в течение часа без досту-па воздуха, затем охлаждают до комнатной температуры. Получают препарат в виде бес-цветного прозрачного раствора.
После стерилизации препарат проверяют на токсичность и иммуностимулирующую ак-тивность.
Острую токсичность тимоцина проверяют на белых мышах, кроликах, овцах и телятах по сравнению с 0,9%-ным физиологическим раство-ром хлорида натрия. Препарат при внутримы-шечном введении в дозах 100, 20 и 15 мл/кг не вызывает у белых мышей, кроликов, овец и те-лят, соответственно, отрицательных изменений местного и общего характера.
Хроническую токсичность препарата про-веряют на белых мышах и кроликах. Препарат при внутримышечном введении в дозах 25 и 10 мл/кг в течение 10 дней не вызывает у животных признаков отравления.
Иммуностимулирующую активность пре-парата проверяют по усилению антителообра-зования при вакцинации крупного рогатого ско-та ассоциированной гидроокисьалюминиевой формолвакциной против рота-коронавирусных энтеритов и колибактериоза против каждого вакцинного антигена. Наличие и уровень анти-тел к ротавирусу определяют иммунофермент-ным анализом, к коронавирусу - реакцией тор-можения гемагглютинации и к эшерихии коли - реакцией агглютинации. Введение тимоцина в дозе 0,03 мл/кг в виде 0,02%-ного водного рас-твора один раз в сутки в течение 3 дней должно увеличить титр специфических антител к рота-, коронавирусу и эшерихии коли на 47, 44 и 100%, соответственно. Для прототипа (иммуностиму-лирую-щего препарата тимофер) эти показатели составляют, соответственно, 47,41 и 100%.4).
Препарат тимоцин применяют в ветеринар-ной практике в виде 0,02%-ного водного раство-ра:
- для стимуляции выработки антител при внутримышечном введении один раз в сутки в течение 3 дней в дозе 0,03 мл/кг при комплекс-ном применении с различными вакцинами;
- для повышения эффективности лечения пневмоэнтеритов телят при подкожном введении в дозе 0,02-0,03 мл/кг один раз в сутки в течение 5 дней при комплексном применении с химиоте-рапевтическими препаратами.

1. Бобиев Г.М. Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина. Автореф. дис. на соиск. уч. ст. канд. хим. наук. - Душанбе, 1996. - 24с.
2. TJ, патент, 227, С 07 К 5/062, А 61 К 38/05, 1999.