СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА “ТИМОФЕР”

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Целью изобретения является разработка способа получения железосодержащего препарата для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма животных. Указанная цель достигается тем, что проводят конденсацию пентахлорфенилового эфира карбобензоксиизолейцина и метилового эфира триптофана, деблокируют защищенный дипептид в присутствии палладиевого катализатора и обработкой 1 н. раствора NaOH, очисткой свободного дипептида экстракцией нбутанолом, переосаждением из метанола эфиром, получают координационное соединение его с железом взаимодействием разбавленных водных растворов дипептида изолейцилтриптофан и FeSO4 7H2O.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммун-ной системы организма животных.
Известен /1/ тетрапептид с последовательно-стью треонил - треонил - лизил - аспарагиновая кислота, обладающий иммуностимулирующим действием. Способ его получения заключается в ступенчатом наращивании пептидной цепи мето-дом активированных эфиров с использованием для присоединения остатка лизина п- нитрофени-лового, треонина - пентахлорфенилового эфиров. В качестве N- защитной группы используют кар-бобензоксигруппу, Е-аминогруппу лизина защи-щают трет-бутилоксикарбонильной группой, кар-боксильные группы аспарагиновой кислоты за-щищают солеобразованием с гидроксидом натрия.
Недостатком данного способа получения иммуностимулирующего пептида является необ-ходимость проведения трех стадий конденсации и стадий введения и снятия защитных групп с остат-ков треонина и лизина.
Известен /2/ способ получения триптофансо-держащих дипептидов формулы Х-триптофан, где X - глутаминовая кислота, глутамин, лейцин и изолейцин, обладающих иммуностимулирующей активностью. Способ заключается в проведении конденсации защищенных аминокислот методом активированных (1- гидроксибензотриазоловых) эфиров, деблокировании защищенного пептида, очистке свободного дипептида с помощью обра-щение - фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Недостатком данного способа является ис-пользование высокоэффективной жидкостной хроматографии, как метода, требующего специ-ального оборудования.
Прототипом заявляемого способа является метод получения иммуностимулирующего препа-рата ферунол /З/, заключающийся в получении методом активированных эфиров дипептида ва-лил - триптофан, получении его координационно-го соединения с ионом железа, приготовлении 0,07%-ного водного раствора координационного соединения.
Дипептид валил-триптофан получают кон-денсацией N- оксисукцинимидного эфира карбо-бензоксивалина и метилового эфира триптофана. Деблокирование полученного защищенного ди-пептида осуществляют каталитическим гидриро-ванием в присутствии 10%-ного палладия на ак-тивированном угле и обработкой 1 н. раствором гидроксида натрия с последующей очисткой с помощью высокоэффективной жидкостной хрома-тографии и лиофилизацией. Координационное соединение получают взаимодействием дипепти-да и сульфата железа при рН=6,0, 110-120С в течение часа в темноте.
Недостатком данного способа является ис-пользование для получения координационного соединения дипептида валил-триптофан, неактив-ного в тесте Е- розеткообразования клетки, в ре-зультате чего получается препарат с невысокой иммуностимулирующей активностью.
Целью изобретения является разработка спо-соба получения железосодержащего препарата для регуляции и стимуляции деятельности иммун-ной системы организма животных.
Указанная цель достигается тем, что прово-дят конденсацию пентахлорфенилового эфира карбобензоксиизолейцина и метилового эфира триптофана, полученный защищенный дипептид деблокируют каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного палладия на активирован-ном угле и обработкой 1 н. раствором NaOH, сво-бодный дипептид предварительно очищают экс-тракцией н-бутанолом, а затем с помощью высо-коэффективной жидкостной хроматографии, затем лиофилизуют, готовят его 0,01%-ный водный рас-твор, к которому при рН=6,0 и температуре 110-120С добавляют эквимолярное количество соли FeSO47Н2О, выдерживают при этой температуре в течение часа без доступа воздуха и охлаждают его до комнатной температуры.
Применение предлагаемого способа получе-ния иммуностимулирующего перепарата тимофер позволяет получить перепарат, обладающий бо-лее высокой иммуностимулирующей активностью, вследствие использования дипептида изолейцил-триптофан, обладающего 100%-ной активностью в тесте Е - розеткообразования клетки.

ПРИМЕР
7, 6 г (15 ммоль) пентахлорфенилового эфира карбобензоксиизолейцина, 3, 8 г (15 ммоль) хлор-гидрата метилового эфира триптофана растворя-ют в диметилформамиде, добавляют 1, 65 мл (15 ммоль) N - метилморфолина и перемешивают в течение 15 ч при комнатной температуре. Диме-тилформамид упаривают, полученное масло рас-творяют в этилацетате и последовательно промы-вают 2%-ным раствором серной кислоты, 5%-ным раствором бикарбоната натрия и водой до нейтральной реакции промывных вод. Этилаце-татный раствор сушат безводным сульфатом натрия, этилацетат упаривают. Полученный аморфный остаток перекристаллизовывают из эфира, затем переосаждают гексаном. Выход ме-тилового эфира карбобензоксиизолейцил - трип-тофана составляет 6,07 г (87%).
2 г (4,3 ммоль) метилового эфира карбобен-зоксиизолейцил-триптофана растворяют в смеси метанол - трифторэтанол - уксусная кислота и гидрируют в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле до полного снятия карбобен-зоксигруппы (контроль тонкослойной хромато-графией). По окончании гидрирования катализа-тор отфильтровывают, фильтрат упаривают. По-лученный остаток растворяют в воде, рН доводят до 12, 0 с помощью 1 н. раствора NaOH и переме-шивают при комнатной температуре до удаления сложноэфирной метильной группы. Затем рН ре-акционной смеси доводят до 7,5 с помощью кон-центрированной соляной кислоты и пептид экс-трагируют н-бутанолом. Бутанол упаривают. Свободный изолейцил-триптофан очищают с по-мощью высокоэффективной жидкостной хромато-графии на колонке, заполненной обращенно - фа-зовым силикагелем Силасорб C18 в ацетат-аммонийном буфере (рН 6,8) при градиенте ацето-нитртла от 10 до 30% при скорости потока 14 мл/мин. Собирают фракции, содержащие основ-ной продукт. После лиофилизации выход свобод-ного изолейцил-триптофана составил 98%. Время выхода 15,31 мин. Значение хроматографической подвижности (Rf) в системе н-бутанол-пиридин- уксусная кислота-вода (30:20:6:24) равно 0,44, в системе уксусная кислота-вода-метанол-хлороформ (7: 3: 1: 1) равно 0,71,  20 = -31, 14 (С 1, МеОН).
0,01 г (0,0315 ммоль) свободного дипептида изолейцил-триптофан растворяют в реакционном сосуде в 200 мл стерильной дистиллированной воды, нагретой до 100С К полученному раствору при рН 6,0 и постоянном перемешивании добав-ляют 0,008757 г FeSO4 7Н2O. Реакционный сосуд герметично закрывают и нагревают до 110-120C и выдерживают при этой температуре без доступа воздуха в течение часа, затем охлаждают до ком-натной температуры. Получают препарат желто-коричневого цвета, слегка мутноватый при дли-тельном хранении которого образуется осадок.
После стерилизации препарат проверяют на токсичность и иммуностимулирующую актив-ность. Острую токсичность тимофера проверяют на белых мышах, кроликах, овцах и телятах по сравнению с 0,9%-ным физиологическим раство-ром хлорида натрия. Препарат при внутримышеч-ном введении в дозах 100, 20 и 15 мл/кг не вызыва-ет у белых мышей, кроликов, овец и телят, соот-ветственно, отрицательных изменений местного и общего характера. Хроническую токсичность препарата проверяют на белых мышах и кроли-ках. Препарат при внутримышечном введении в дозах 25 и 10 мл/кг в течение 10 дней не вызывает у белых мышей и кроликов, соответственно, при-знаков отравления. Иммуностимулирующую ак-тивность препарата проверяют по усилению анти-телообразования у телят, иммунизированных жи-вой противотелейлериозной вакциной ВИЭВ в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток). Наличие и уро-вень противотейлерийных антител определяют реакцией длительного связывания комплемента (РДСК) и иммуноферментным анализом (ИФА). Введение тимофера в дозе 2 мл на 100 кг живого веса животного приводит к увеличению титра специфических антител в РДСК с 1:5-1:10 до 1:10-1:40 и в ИФА с 1:50-1:200 до 1:200-1:1600, т.е. в 4-8 раз. Ферунол (прототип) увеличивает титр анти-тел в 2 раза. Препарат тимофер применяют в вете-ринарной практике в виде 0,0426%-ного водного раствора:
- для стимуляции выработки антител при внутримышечном введении один раз в сутки в течение 3 дней в дозе 0,03 мл/кг при комплексном применении с различными вакцинами;
- для повышения эффективности лечения пневмоэнтерита телят при подкожном введении в дозе 0,02-0,03 мл/кг один раз в сутки в течение 5 дней при комплексном применении с химиотера-певтическими препаратами.

Патент TJ 227, С 07 К 5/062, А 61 К 38/05, 1999.
1. Белокрылов Г.А., Сорочинская Е.И., Леон-тьева Л.И. Тетрапептид, обладающий иммуно-стимулирующим действием. А.с. СССР №1287532.
2. Бобиев Г.М. Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактив-ных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина: Автореф. дис...канд.хим.наук.-Душанбе, 1996. - 24с.
3. Бобиев Г.М., Бобиев Х.А., Сатторов И.Т., Нораев Р.Х., Исупов С.Д. Способ получения иммуностимулирующего препарата ферунол. Патент Республики Таджикистан №227 TJ