НУКЛЕОЗИДНЫЕ АНАЛОГИ 1,3-ОКСАТИОЛАНА, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Описывается применение соединения по формуле (I) или его фармацевтически приемлемой производной для изготовления лекарства для лечения вирусного гепатита В.



Настоящее изобретение относится к применению нуклеозидных аналогов при лечении вирусных инфекций. В частности, оно касается применения нуклеозидных аналогов 1,3-оксатиолана при лечении гепатита, в частности, гепатита В.

Настоящее изобретение относится к применению нуклеозидных аналогов при лечении вирусных инфекций. В частности, оно касается применения нуклеозидных аналогов 1,3-оксатиолана при лечении гепатита, в частности, гепатита В.
Гепатит В представляет собой вирусное заболевание, передаваемое орально или парен-терально через зараженный материал, такой как кровь и кровепродукты, грязные иглы, по-ловым путем и вертикально, от инфицированных или вирусоносительных матерей к плоду. В тех регионах мира, где это заболевание является обычным, вертикальное заражение на ранних стадиях определяет большую долю инфицированных лиц, становящихся хрониче-скими носителями гепатита В. Во всем мире количество носителей гепатита В оценивается в 280,000,000 человек. В настоящее время отсутствуют эффективные химиотерапевтические средства лечения инфекционного гепатита В.
Описано, что некоторые нуклеозидные производные противодействуют вирусу гепати-та В.
ЕРА 0206497 описывает некоторые 2’, 3’-дидеокси пуриновые и пиримидиновые нук-леозиды, обладающие антивирусным действием, включая противодействие вирусу гепатита В.
ЕРА 0302760 описывает применение 2’, 3’-дидеокси пуриновых нуклеозидов для лече-ния инфекционного гепатита В.
WO 90/14079 описывает лечение гепатита В путем назначения 2’, 3’-дидеоксицитидина.
WO 90/14091 описывает лечение гепатита В путем назначения 2’, 3’-дидеоксигуанозина, 2’, 3’-дидеокси аденозина или 2’, 3’-дидеоксиино-зина.
В публикации европейской заявки на патент № 0 382 526 описывается ряд нуклеозид-ных аналогов 1,3-оксатиолана, проявляющих антивирусное действие, в частности, действие против HIV-возбудителя СПИДа.
В публикации РСТ заявки на патент № 91/17159 описывается соединение (2R, cis)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-ил)-(1Н)-пиримидин-2-один (известное также как ЗТС) и его применение при лечении HIV инфекций. ЗТС представляет собой (-)-энантомер одного из соединений (ВСН-189), описанных в ЕРА 0382526. В настоящее время мы обна-ружили, что ВСН-189 и его отдельные энантомеры, включая ЗТС, противодействуют вирусу гепатита В как в условиях in vitro (в лабораторных условиях), так и в условиях in vivo (в жи-вом организме).
Таким образом, изобретение прежде всего касается способа лечения животных, включая человека, инфицированных или чувствительных к заражению вирусом гепатита В, состоя-щего в назначении эффективного количества соединения по формуле (I)

или его фармацевтически приемлемой производной.
Изобретение относится также к применению соединения по формуле (I), приведенной выше, или его фармацевтически приемлемой производной для изготовления лекарственного средства для лечения гепатита В.
Как заявляют специалисты, перечисленные в тексте, лечение распространяется на про-филактику, а также на лечение выявленных инфекций или симптомов.
Как утверждают специалисты, соединение по формуле (I) представляет собой cis - со-единение и содержит два хиральных центра (см. в формуле (I) знак *). Таким образом, со-единение существует в виде двух энантомеров, соответствующих соединениям по формуле (Ia) и (Ib).

Соединение по формуле (I) носит химическое название cis-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил) (1Н)-пиримидин-2-он. Оно известно под названием ВСН-189. (-)-энантомер имеет химическое название (-)-cis-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-окситиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-од и абсолютно совпадает по стереохимии с соединением по формуле (Ib), которое называется (2R, cis)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он. Оно называется также ЗТС.
Рекомендуется, если используется (-)-энантомер, чтобы он был существенно свободен от соответствующего (+) энантомера, что означает присутствие (+)-энантомера в количестве не выше примерно 5 масс. %, предпочтительно, не более примерно 2 масс. %, в частности, ме-нее примерно 1 масс. %.
Термин “фармацевтически приемлемая производная” означает любую фармацевтически приемлемую соль, эфир или соль этого эфира, соединения по формуле (I) или любое другое соединение, которое при его назначении пациенту, позволяет получить (прямо или косвен-но) соединение по формуле (I) или антивирусно действующий метаболит или его радикал.
Специалистам известно, что соединения по формуле (I) могут модифицироваться в функциональных группах как на щелочном участке, так и на гидроксиметиловой группе оксатиоланового кольца, давая в результате фармацевтически приемлемые производные. Модификация всех таких функциональных групп охватывается настоящим изобретением. Однако особый интерес представляют фармацевтически приемлемые производные (напри-мер, эфиры), получаемые модификацией 2-гидроксиметиловой группы окситиоланового кольца.
Рекомендуемые эфиры соединений по формуле (I) включают соединения, в которых ОН
замещена карбоксильной группой , в которой
не-карбонильный участок R эфирной группы выбирается из водорода, алкила с прямой или разветвленной цепочкой (например, метила, этила, n-пропила, t-бутила, n-бутила), алкокси-алкила (например, метоксиметила), аралкила (например, бензила), арилоксиалкила (напри-мер, феноксиметила), арила (например, фенила, вариантно замещенного галогеном, С1-4 ал-килом или С1-4 алкокси); замещенного дигидро пиридинила (например, N-метилдигидро пиридинила); эфиров сульфокислоты, таких как алкил- или аралкилсульфонил (например, метансульфонила); эфиров серной кислоты, эфиров аминокислот (например, L-валила или L-изолейцила) или эфиров моно-, ди- или три-фосфорных кислот.
Кроме того, в группу указанных эфиров попадают эфиры, получаемые из полифункци-ональных кислот, таких как карбоновые кислоты, содержащие больше одной карбоксильной группы, например, дикарбоновые кислоты НО2С(СН2) СО2, где n - целое число от 1 до 10 (например, янтарная кислота, или фосфорные кислоты). Способы получения подобных эфи-ров широко известны. См. например, Hahn et al., “Nucleotide Dimmers as Anti Human Immu-nodeficiency Virus Agents”, Nucleotide Analogues, pp. 156-159 (1989) and Busso et al., “Nucleo-tide Dimers Suppress HVI Expression in Vitro” AIDS Research and Human Retroviruses, 4(6), pp.449-455 (1988).
В отношении вышеописанных эфиров, если не предусматривается иного, то любой имеющийся алкильный участок должен преимущественно содержать от 1 до 16 атомов угле-рода, в частности, от 1 до 4 атомов углерода, и может содержать одну или больше двойных связей. Любой арильный участок, присутствующий в таких эфирах, предпочтительно со-держит фенильную группу.
В частности, эфиры могут соответствовать С1-16 алкильному эфиру, незамещенному эфиру бензоиловой кислоты или эфиру бензоиловой кислоты, с одним, по крайней мере, замещенным галогеном (бромом, хлором, фтором или иодом), С1-6 алкилу, насыщенным или ненасыщенным С1-6-алокси-, нитро- или трифторметил-группам.
Фармацевтически приемлемые соли соединений по формуле (I) включают соли, получа-емые из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примерами подходящих кислот могут служить соляная, бромистоводородная, серная, азот-ная, перхлорная, фумаровая, малеиновая, фосфорная, гликолевая, молочная, салициловая, янтарная, толуол-р-сульфоновая, виннокаменная, уксусная, лимонная, метансульфоновая, муравьиная, бензойная, малоновая, нафталин-2-сульфоновая и бензинсульфоновая кислоты. Другие кислоты, такие как щавелевая, хотя и не является сама по себе фармацевтически приемлемой, может быть использована для получения солей, применяемых в качестве про-межуточных продуктов для получения соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых кислых дополнительных солей.
Соли, полученные из соответствующих оснований, включают щелочной металл (напр., натрий), щелочноземельный металл (напр., магний), аммоний и соли NR4+(где R - является С1-4 алкилом).
Нижеприведенные ссылки в отношении соединений по настоящему изобретению каса-ются как соединения по формуле (I), так и его фармацевтически приемлемых производных.
Соединение по формуле (I) и его собственные энантомеры могут быть получены любым способом, известным специалистам по получению соединений с аналогичной структурой, например, способами, описанными в ЕРА 0 382 526 или WO 91/17159, на которые есть ссылки в данном описании.
Как оказалось, соединение по формуле (I), как в виде рацемической смеси, так и в виде собственных энантомеров, подавляет вирус гепатита В и в условиях in vitro, и в условиях in vivo.
Замечательно то, что количество соединения по изобретению, требуемое при лечении, может меняться не только в зависимости от типа выбранного соединения, но и от схемы назначения, условий, при которых проводится лечение, и возраста и состояния пациента, и, в конечном счете, остается на усмотрение лечащего врача или ветеринара. Однако, в общем случае подходящей дозой будет примерно от 0.1 до 750 мг/кг веса тела в день, предпочти-тельно, от 0.5 до 60 мг/кг/день, при наиболее предпочтительном назначении от 1 до 20 мг/кг/день.
Требуемую дозу удобно представлять в однократной дозировке или делить назначение на удобные интервалы, например, на два, три, четыре или более раз в день.
Соединение удобно назначать в форме единой дозы, содержащей от 10 до 1500 мг, удоб-но от 20 до 1000 мг, предпочтительнее всего - от 50 до 700 мг активного ингредиента на од-ну дозу.
В идеале, активный ингредиент должен назначаться таким образом, чтобы пиковая кон-центрация в плазме активного соединения составляла примерно от 1 до 75 М, предпочти-тельно, примерно от 2 до 50 М, а наиболее предпочтительно, примерно от 3 до 30 М. Это-го можно достичь, например, путем внутривенной инъекции 0.1 - 5%-ного раствора актив-ного ингредиента, можно на физрастворе, или орально, в виде капсулы, содержащей при-мерно 1 - 100 мг активного ингредиента. Желаемый уровень в крови может поддерживаться непрерывным вливанием, обеспечивающим примерно 0.01 - 5.0 мг/кг/час или путем отдель-но проводимых вливаний, содержащих примерно 0.4 - 15 мг/кг активного ингредиента.
Хотя допускается, чтобы при терапевтическом лечении соединение по изобретению могло назначаться в виде чистого химического сырья, все же предпочтительно, чтобы ак-тивный ингредиент имел вид фармацевтического состава.
Фармацевтический состав должен включать соединение по формуле (I), или его прием-лемую фармацевтическую производную, вместе с одним или больше применяемых в фарма-цевтике носителем и, по желанию, с другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами. Носитель(и) должны быть “приемлемыми” в смысле их совместимости с другими ингредиентами состава, не ухудшая состояния реципиента.
Фармацевтические составы включают составы, подходящие для орального, ректального, назального, вагинального или парентерального (включая, внутримышечное, подкожное и внутривенное) назначения или в форме, соответствующей назначению через ингаляцию или инсуффляцию. Составы можно, если это допустимо, представить в дискретной дозировке и изготавливать любыми способами, известными специалисту-фармацевту. Все способы включают этап смешивания активного соединения с жидкими носителями или тонкое раз-мельчение твердых носителей или оба этих этапа, с последующим, если это необходимо, формованием продукта в виде требуемого лекарственного средства.
Фармацевтические составы, подходящие для орального назначения удобно выполнять в виде дискретных единиц, таких как капсулы, крахмальные облатки или таблетки, каждая из которых содержит предусмотренное количество активного ингредиента; в виде порошков или гранул; в виде раствора, суспензии или эмульсии. Активный ингредиент можно выпол-нить также в виде болюса, электуария или мази. Таблетки и капсулы для орального назначе-ния могут содержать обычные наполнители, такие как связующие вещества, наполнители, смазывающие вещества, дизинтеграторы или смачивающие вещества. Таблетки можно по-крывать оболочкой по обычной технологии. Жидкие оральные препараты могут иметь фор-му, например, водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликси-ров, или же могут представлять собой сухое вещество, подлежащее перед принятием раство-рению в воде или другом подходящем носителе. Такие жидкие препараты могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие вещества, эмульгирующие вещества, не-водные носители (которые могут включать съедобные масла) или консерванты.
Соединения по настоящему изобретению могут также приготавливаться для паренте-рального назначения (напр., для инъекций, таких как болюсные инъекции ил непрерывные вливания) и могут быть представлены в единичной дозировке в форме ампул, предвари-тельно наполненных шприцов или емкостей для вливаний малого объема или многоразо-вых, куда добавлены консерванты. Составы могут быть представлены в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и могут содержать формирую-щие вещества, такие как суспндирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В другом случае, активный ингредиент можут быть в форме порошка, получаемого путем асептического выделения стерильного твердого материала или путем лиофилизации из рас-твора, с закреплением перед употреблением соответствующим носителем, напр., стериль-ной, свободной от пирогена, водой.
Фармацевтические составы, подходящие для ректального назначения, в которых носи-телем является твердое вещество, предпочтительнее всего представлять в виде суппозитори-ев одноразового применения. Соответствующие носители включают масло какао и другие вещества, известные специалистам, а также суппозитории удобно приготавливать путем смешивания активного компонента с размягчающим или расплавляющим носителем (носи-телями) с последующим охлаждением и формованием.
Составы, пригодные для вагинального назначения, могут быть представлены в виде пессариев (вагинальных суппозиториев), тампонов, мазей, кремов, вспенивающихся или разбрызгивающихся масс, содержащих, кроме активного ингредиента, подходящие носите-ли, известные специалистам в этой области.
Для интра-назального (в нос) назначения соединения по настоящему изобретению могут применяться в виде жидкого разбрызгивателя или дисперсного порошка или в форме ка-пель.
Капли могут приготавливаться на водной или не-водной основе, включая, кроме того, в свой состав одно или больше диспергирующих веществ, растворяющие вещества или сус-пендирующие вещества. Жидкие разбрызгиватели удобно поставлять в упаковке под давле-нием.
Для ингаляционных назначений соединения по настоящему изобретению удобно по-ставлять в виде инсуффляторов (вдуватель порошка), распылителей или упакованными под давлением или другими удобными средствами аэрозольного типа. Упаковки под давлением могут включать подходящий движитель, такой как дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, двуокись углерода или другие подходящие газы. Для аэрозоля, упако-ванного под давлением, однократную дозу можно выделить путем соответствующей граду-ировки баллончика.
В другом случае, для ингаляционного или инсуффляторного назначения соединение по настоящему изобретению может иметь форму сухой порошкообразной смеси, например, по-рошкообразной смеси из данного соединения и подходящего порошка-основы, такого как лактоза или крахмал. Порошкообразный состав может быть выполнен в однократной дози-ровке, например, в виде капсул или гильз или, напр., иметь желатиновую или пластыреоб-разную упаковку, из которой порошок можно принимать с помощью ингалятора или ин-суффлятора.
При желании вышеописанные составы видоизменяются таким образом, чтобы можно было использовать высвобождаемый из них активный ингредиент.
Фармацевтические составы для применения по настоящему изобретению могут содер-жать также и другие активные ингредиенты, такие как антимикробные вещества или кон-серванты.
Подходящие составы для применения по изобретению описаны, например, в ЕРА 0382526 и WO 91/17159.
Соединения по изобретению можно использовать также в сочетании с другими терапев-тическими средствами, например, с другими противоинфекционными средствами. В част-ности, соединения по изобретению можно применять вместе с известными антивирусными средствами.
Вышеуказанные сочетания удобно применять в форме фармацевтического состава и, та-ким образом, фармацевтические составы, содержащие вышеуказанное сочетание и фарма-цевтически приемлемый носитель, являются следующим аспектом настоящего изобретения.
Отдельные компоненты таких сочетаний могут назначаться либо поочередно, либо од-новременно, в виде раздельных или сложных фармацевтических составов.
Когда соединение по формуле (I) или его фармацевтически приемлемое производное применяются в сочетании со вторым терапевтическим средством, действующим против того же самого вируса, доза каждого соединения может быть либо одинаковой, либо отличаться от той, когда это соединение используется само по себе. Соответствующие дозировки хоро-шо известны специалистам.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые нельзя толковать как ограничивающие область изобретения.

Пример 1
Биологическое действие
(А) Новорожденных утят заражали DHBV. Через 5-7 дней после заражения у утят брали пробы крови и исследовали ДНК на DBHV, способом точечной гидридизации с помощью специального ДНК зонда (Mason et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3997-4001 (1982)). У утят с положительной реакцией на точки-окрашивание удалялась печень и использовалась затем для получения первичных гепатоцитных культур, зараженных вышеупомянутым DBHV (Tuttleman et al., J. of Virology, 58, 17-25). Через два дня нахождения в культуре к культурной среде добавлялись антивирусные средства. Среда менялась каждые 2 дня и через определенные промежутки времени клетки забирались и выделялась вся ДНК.
ДНК наносилась на нитроцеллюлозную бумагу и исследовалась зондом, несущим ДНК DHВV, меченую радиоактивным изотопом 32Р, в соответствии с описанной далее процеду-рой. ДНК, взятая из гепатоцитов, зараженных DHВV, выделялась и наносилась на нитро-целлюлозный фильтр. Использовался вышеупомянутый зонд, наконечник которого перено-сил ДНК DHВV, меченую 32Р (рDH-010= DHBV). ДНК извлекалась из 6 см-овых лотков с клеточной культурой через различные промежутки времени после высевания. В группе VC клетки собирались на 2,6,8,10,14,18 и 20 день. Дублирующие образцы окрашивались для 14,18 и 20-дневных образцов. В группах, где применялись лекарственные средства, клетки собирались на 14,18 и 20 день. Лекарственные средства добавлялись к культуре на 2-ой день после высевания, и среда постоянно целиком заменялась каждые 2 дня. Вся внутриклеточная ДНК извлекалась из клеток стандартным методом фенольной экстракции. Клетки в 6 см-овой чашке Петри (приблизительно, 5 х 10 клеток) лизировались в лизисном буфере, содер-жащем 0.2% SDS (додецил сульфат натрия), 150 мМ TrisHCI pH 8.0, 10 мМ EDTA (ЭДТК-этилендиаминтетрауксусная кислота) и 150 мМ NaCI. Клеточный лизат сжигался с 0.5 мг/мл проназы Е (поставляемой фирмой Sigma) при 37С в течение 2 часов и протеинизировался путем экстрагирования равным объемом фенола, насыщенного 20 мМ Tris HCI, pH 7.5, 0.5 мМ ЭДТК и 0.1% 8-гидроксихинолином. Концентрированный ацетат аммония (рН 7.0 (2.5 М)) добавлялся к водяной фазе для получения 0.25 М раствора ацетата аммония, а нуклеино-вые кислоты осаждались 2-мя объемами 100%-ного этилового спирта. Капля нуклеиновой кислоты промывалась этиловым спиртом и высушивалась. ДНК растворялась в растворе, содержащем 12.5 мМ Tris HCI, pH 7.5, 10 мМ ЭДТК, 30%-ный глицерин и 0.01%-ный бром-фенол голубой. Одна двенадцатая часть образца ДНК намазывалась на нитроцеллюлозу для проведения точечно-окрашивающего анализа.
Проверяемые лекарства оценивались по шкале от 0 (отсутствие активности) до ++++ (высокая активность).
Тестированные соединения представляли собой cis-2-амино-1-(-2-гидрокси-метил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-один (Соединение по формули (I) как рацемическое, так и в виде (-)-энантомера) и два известных ингибитора вируса гепатита В, а именно: 2’,3’-дидеокси-гуанозин (ddG) и 2,6-диаминопурин-9--D-2’,3’-дидеоксирибофуранозид (ddDAPR) (Публикация заявки на Европейский патент № 0 302 760).
Результаты тестирования приведены, в Таблице 1.
(В) Результаты тестирования в отношении гепатита В у человека.
(i) Монослои клеток Нер G2, зараженных вирусом человеческого гепатита В приготав-ливали в 6-ячеистых лабораторных чашках, заполненных MEM с добавлением 380 мг/мл геницитина (GIBCO no. 860 18111J, G418 Sulfate) и 10%-ной сыворотки, взятой из икры эм-бриона, и такие монослои использовались после слияния 75% или более клеток.
Концентрированные растворы лекарств приготавливались в фосфатно-солевом буфер-ном растворе (РВS) при уровне концентрации 1 мг/мл. Для лекарств, неспособных раство-ряться до такой концентрации, либо нагревали суспензию до 42С с добавлением этилового спирта, либо лекарство растворяли до более низкой конечной концентрации.
Концентрированные растворы лекарств разбавлялись до получения окончательных кон-центраций порядка 10 мг/мл в MEM (с добавками, указанными выше).
Среда с клеточных монослоев удалялась и заменялась свежеприготовленной средой, со-держащей лекарства. Для каждого анализа использовались тройные ячейки по 2 мл/ячейку.
Среда удалялась и заменялась свежей, содержащей лекарства, через день, в течение 14 дней (т.е., 7 перемен лекарственных растворов).
Среда удалялась с каждой ячейки и клетки промывались 1 мл PBS. Добавлялся по 2 мл/ячейку RIPA буфер и клетки выскребались из ячеек каучуковой палочкой. Затем клетки переносились в контрольные пробирки.
1 мл хлороформа добавлялось в каждую пробирку и смешивалось с помощью вихревой мешалки. Затем 1 мл фенола (насыщенного 20 мМ Tris, 1 мМ ЭДТК и 0,1%-ным гидрокси-хинолином) добавлялся в каждую пробирку, пробирки центрифугировали и удаляли 1 мл водного слоя.
Ацетат аммония добавлялся до получения 0.2 М-концентрации, после чего проводили смешивание с 2,5 объемами этилового спирта, oxлажденного на льду. Смесь выдерживали при -20С всю ночь, чтобы осадилась ДНК. ДНК гранулировали методом центрифугирова-ния, еще paз промывали в ледяном этиловом спирте и высушивали.
Гранула (таблетка) растворялась в 200 мл буферного раствора, содержащего Tris (10 мМ) ЭДТК (1 мМ), в течение ночи при 4С, и быстро (в течение 20 секунд) обрабатывали ультра-звуком. 20л каждого образца наносилось в виде точки на нейлоновую мембрану, и точка гибридизировалась HBV ДНК зондом.
* - RIPA буферный раствор: 0,15 М NаСl, 1% деоксихолат натрия, 1% тритон х 100, 0.1% додецил сульфат натрия, 0.01 М Tris HCI, рН 7.4.
Результаты показаны в Таблице 2а.
(ii) Методика, использованная в проведении этого испытания, подробно описана в Korba еt аl., Antiviral Research 15, 217-228, 1992, и коротко говоря, заключается в следующем.
Клетки Hер G2, зараженные геномной ДНК человеческого вируса гепатита В (клетки 2.2.15), выращивались и сохранялись в культурной среде RPMI1640, содержащей 5% сыво-ротку из икры эмбриона, 2 мМ глютамина и 50 мг/мл сульфата гентомицина, при этом регу-лярно проверялись на сопротивление G418. Культуры клеток 2.2.15 выращивались до тех пор, пока не происходило слияние в 24-ячеистых чашек для выращивания тканевой культу-ры, и оставались в этих условиях в течение 2-3 дней до начала проведения лекарственного лечения.
Лекарства растворялись в стерильной воде или 50% диметилсульфоксиде, стерилизо-ванном в воде, до получения концентраций в 100 раз более высоких, чем наибольшая кон-трольная концентрация. Эти растворы разбавлялись при необходимости в культурной среде.
Культурная среда на слитых клетках менялась за 24 часа до взятия проб на испытание. В течение 10 дней лечения культурная среда менялась ежедневно. Через 10 дней лечения куль-турная среда собиралась и замораживалась при - 70С, чтобы проводить HBV ДНК анализ.
Чтобы проанализировать внутриклеточную HBV ДНК, 0.2 мл образцов культурной сре-ды инкубировалось в течение 20 минут при 2бС в 1 М NaOH/10X SSC (1X SSC представля-ет собой 0.15 М NaCI/0.015 М цитрата натрия, рН 7.2), а затем наносились на нитроцеллю-лозные мембраны, предварительно пропитанные 20Х SSC, используя приспособление для намазывания. Образцы нейтрализовались путем двукратной промывки в 0.5 мл 1 М Tris, рН 7.2/2 М NaCl и однократной - в 0.5 мл 20X SSC. Затем фильтры промывались в 2X SSC и высушивались при 80С в вакууме, в течение часа.
Очищенный HВV ДНК фрагмент 3,2 kb EcoRI метился [32P]dCTP путем трансляции в разрез и использовался в качестве пробы для выявления HBV ДНК в точечно-окрашивающем анализе, проводимом путем гибридизации ДНК. После промывки гибриди-зированный пласт высушивался, и с помощью бета-сканера Ambis оценивалось наличие 32Р.
Результаты приведены в Таблице 2b.

Таблица 1
Антивирусная активность соединений против гепатита В уток in vitro


Соединение Актив-ность IC50 мг/мл
Соединение по формуле (I) рацемического типа ++++
при 10 мг/мл
(-) энантомер <1 мг/мл
ddG 0.07 мг/мл
ddDAPR 0.07 мг/мл

Таблица 2А
Антивирусная активность соединений против человеческого гепатита В in vitro

HBV aктив-ность при 10 мг/мл
Соединение по формуле (I) рацемического типа
+++
ddG +++
ddDAPR +

Таблица 2В

IC50 М
ЗТС 5.6
ddG 2.2
araAMP 2.9
cdG 0.034

ddG = 2’,3’-дидеоксицитидин
cdG = карбоксильный деоксигуанозин
araAMP = аденозиларабинозид-5’-монофосфат

ЕР 0382526, кл. А 61 К 31/505, 1990