СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА “ФЕРУНОЛ”

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма животных, а также для лечения заболеваний, вызываемых недостатком железа в организме, характеризуется тем, что в его состав, кроме пептидов входят FeSO4 и валин вместо глутаминовой кислоты.
Препарат “Ферунол” получают путем конденсации N-оксисукцинимидного эфира карбо-бензоксивалина и метилового эфира триптофана, деблокирования защищенного пептида пер-воначально каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного Pd/C катализатора и омылением с помощью NaOH, очистки свободного дипептида экстракцией н-бутанолом и с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, лиофилиза-ции, приготовления водного раствора пептида, добавления к нему при рН-6,0 и температуре 110-1200С эквимолярное количества соли FeSO4.7H2O. Состав выдерживают в течение 1 часа при температуре 110-1200С и охлаждают его до комнатной температуры.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получе-ния биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма животных, а также для заболевания, вызываемых недостатком железа в организме.
1. Известен (1) димер гексапептида H-(Cys-Pro-Pro-Glu-Leu)2-OH, представляющий собой димер фрагмента 226-231 из “шарнирной” области иммуноглобулинов и обладающий имму-ностимулирующей активностью. Известен способ получения этого димера, заключающийся в его химическом синтезе. При последнем для блокирования -карбоксильной группы лейцина и -карбоксильной группы глутаминновой кислоты используют бензильную защиту, а SH-группу цистеина и -амингруппы лизина - карбобензоксизащиту, -аминогрупп аминокислот - трет-бутилоксикарбонильную защиту. В качестве конденсирующего реагента для соедине-ния аминокислот между собой применяют дициклогексилкарбодиимид и метод активирован-ных (п-нитро-фениловых) эфиров. Трет-бутилоксикарбо-нильная защитная группа с пептидов снимается действием НСl в этилацетате. Гексапептид получают наращиванием по одной аминокислоте с N-конца цепи. После удаления карбобензокси- и бензильной защитных групп действием натрия в жидком аммиаке, восстановленный пептид обессоливают на сефа-дексе G-10, затем фракционируют на колонке с биогелем Р-2. При окислении SH-группы ци-стеина пептид переходит в димерную форму.
Димер данного гексапептида в дозе 5 мкг значительно увеличивает число антителообра-зующих клеток селезенки кролика и титр гемагглютининов против эритроцитов барана.
Недостатком данного димера пептида и способа его получения является то, что из-за наличия в составе вышеназванного соединения серосодержащей аминокислоты цистеина вследствие отравления катализатора серой невозможно снимать защитные группы в мягких условиях каталитического гидрирования. В связи с этим используют действие натрия в жид-ком аммиаке (достаточно жесткие условия). Кроме того, условия проведения этой реакции являются взрывоопасными из-за использования металлического натрия. Для получения диме-ра гексапептида необходимо провести 5 стадий конденсации аминокислот друг с другом и стадию окисления SH-группы цистеина. Кроме того, для очистки димера используют такие трудоемкие процессы, как обессоливание на сефадексе G-10 и фракционирование на биогеле Р-2, в связи с чем себестоимость данного димера гексапептида становится достаточно высо-кой.
2. Известен тетрапептид с последовательностью H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH, называемый тафцином и обладающий иммуностимулирующей активностью (2). Известен способ его по-лучения, в котором применяется ступенчатое наращивание пептидной цепи методом активи-рованных (N-оксисукцинимидных) эфиров, где в качестве N-защитной группы используют трет-бутилоксикарбонильную, -аминогруппы лизина - карбобензокси- и ОН-группы треони-на - бензильную группы, а очистку полученного пептида проводят на “Aminex” в пиридино-вом буфере.
Недостатком тафцина и способа его получения является то, что для синтеза препарата необходимо провести три стадии конденсации, а также стадии введения и снятия защитных группировок с боковых функциональных групп треонина, лизина и аргинина. Кроме того, для очистки тафцина используют такой трудоемкий процесс, как ионообменная хроматогра-фия, в связи с чем себестоимость тетрапептида достаточно высокая.
3. Прототипом заявляемого вещества является дипептид с последовательностью H-Glu-Trp-OH, обладающий иммуностимулирующей активностью, а прототипом способа его полу-чения - способ, включающий конденсацию защищенных аминокислот методом активирован-ных эфиров, деблокирование защищенного дипептида, очистку полученного свободного пеп-тида с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и лио-филизацию (3).
Недостатком указанного прототипа является то, что в состав вещества входит глутамино-вая кислота, содержащая -карбок-сильную группу, вследствие чего возникает необходимость в получении производного глутаминовой кислоты с защищенными амино- и -карбоксильной группами, а также то, что не всегда достигает достаточно высокий выход вышеуказанного производного.
Целью настоящего изобретения является способ получения иммуностимулирующего пре-парата для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма животных, лечения заболеваний, вызванных недостатком железа в организме, а также разработка способа получения этого препарата.
Способ получения имуностимулирующего препарата “Ферунол” заключается в проведе-нии реакции по защите аминогруппы карбоксильного компонента, активации карбоксильной группы карбоксильного компонента, защите карбоксильной группы аминокомпонента, кон-денсации карбоксильного компонента с аминокомпонентом методом активированных эфи-ров, снятие защитных групп с амино- и карбоксильной групп, очистке и лиофилизации полу-ченного соединения. При конденсации используют в качестве карбоксильного компонента N-оксисукцинимидный эфир карбобензоксивалина и метиловый эфир триптофана. Полученный защищенный пептид деблокируют первоначально каталитическим гидрированием в присут-ствии 10%-ного Pd/C катализатора, затем омылением с помощью NaOH. Свободный дипеп-тид очищают пред-варительно экстракцией н-бутанолом, окончательно с помощью обращен-но-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, затем лиофилизируют, готовят его водный 0,0426%-ный раствор, к которому при рН=6,0 и температуре 110-1200С добавляют эквимолярное количетво соли FeSO4.7H2O. Состав выдерживают в течение 1 часа при темпе-ратуре 110-1200С и охлаждают его до комнатной температуры.
Применение иммуностимулирующего железосодержащего препарата “Ферунол” позволя-ет лечить заболевания, вызванные не только нарушениями функционирования иммунной си-стемы организма животных, но и недостатком железа в нем.
Применение предлагаемого способа получения иммуностимулирующего препарата “Фе-рунол” позволяет:
1. Исключить стадии введения и снятия дополнительной защитной группировки.
2. Снизить себестоимость препарата вследствие использования валина - более дешевого, чем глутаминовая кислота.
ПРИМЕРЫ:
1. 5,22 г (15 мМоль) N-оксисукцини-мидного эфира карбобензоксивалина, 3,8 г (15 мМоль) хлоргидрата метилового эфира триптофана растворяют в диметилформамиде, добав-ляют 1,65 мл (15 мМоль) N-метилморфолина и перемешивают в течение 15 ч при комнатной температуре. Диметилформамид упаривают, полученное масло растворяют в этилацетате и последовательно промывают 2%-ным раствором серной кислоты, 5%-ным раствором бикар-боната натрия и водой до нейтральной реакции промывных вод. Этилацетатный слой сушат безводным сульфатом натрия, этилацетат упаривают. Полученный аморфный остаток пере-кристаллизовывают из эфира, затем переосаждают гексаном. Выход метилового эфира карбо-бензоксивалил-триптофана составляет 5,6 г (89%). Значение хроматографической подвижно-сти Rf в системе пиридин-уксусная кислота-вода (80:24:44)=0,8; в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота (32:2:1)=0,57, Тпл. - 115-1180С
2. 2 г (4,4 мМоль) метилового эфира карбобензоксивалилтриптофана растворяют в смеси этанол-трифторэтанол-уксусная кислота и гидрируют в присутствуии 10%-ного Pd/C катали-затора до полного снятия карбобензоксигруппы (контроль тонкослойной хроматографией). По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получен-ный остаток растворяют в воде, рН доводят до 12,0 с помощью 1н раствора NaOH и переме-шивают при комнатной температуре до удаления сложноэфирной метильной группы. Затем рН реакционной смеси доводят до 7,5 с помощью концентрированной соляной кислоты и пептид экстрагируют н-бутанолом. Бутанол упаривают. Свободный валил-триптофан очи-щают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной обращенно-фазовым силикагелем Силасорб С18 в ацетатаммонийном буфере (рН=6,8) при градиенте ацетонитрила от 10 до 30% при скорости потока 14 мл/мин. Собирают фракции, содержащие основной продукт. После лиофилизации выход свободного валил-триптофана составил 1,12 г (93,2%). Время выхода - 6,25 мин. Значение хроматографической подвижно-сти Rf в системе н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (30:20:6:24) = 0,69, в системе ук-сусная кислота-вода-метанол-хлороформ (7:3:1:1) = 0,75, []d20 = -27,120 (c 1, MeOH).
3. 0,0426 г (1,133.10-4 Моль) свободного дипептида валил-триптофан растворяют в реак-ционном сосуде в 100 мл стерильной дистиллированной воды, нагретой до 1000С. К полу-ченному раствору при рН=6,0 и постоянном перемешивании добавляют 314,9.10-4 г FeSO4.7H2O. Реакционный сосуд герметично закрывают и нагревают до 110-1200С и выдер-живают при этой температуре в течение часа, затем охлаждают до комнатной температуры. Получают препарат желто-коричневого цвета, слегка мутноватый, при длительном хранении которого образуется осадок.
После стерилизации препарат проверяют на токсичность, иммуностимулирующую актвиность и влияние на естественную резистентность организма животных.
Токсичность препарата проверяют на кроликах. Его вводят внутримышечно в дозе 7 мл на кг живой массы тела. У животных не отмечается никаких изменений местного и общего характера. Иммуностимулирующие свойства препарата проверяют на 20 телятах, привитых противотейлориозной вакциной в дозе 1 мл по интенсивности образования противотейле-рийных антител. Контролем служат 10 иммунизированных телят, которые “Ферунол” не по-лучают.
Препарат “Ферунол” вводят подкожно в область средней трети шеи в дозе 1 мл в течение 3-5 дней с начала реакции на введение противотейлориозной вакцины.
Наличие и уровень антител в сыворотке крови определяют при постановке РДСК (реак-ция длительного связывания комплемента) и проведении ИФА (иммунофер-ментный анализ) на 35-й день после прививки и на 18-й день после введения “Феру-нола”. Титр антител в сы-воротке крови составляет 1:5-1:40 в РДСК и 1:100-1:1600 в ИФА, у неполучивших “Ферунол”, соответственно, 1:5-1:20 и 1:50-1:800.
Влияние “Ферунола” на естественную резистентность организма изучают на поросятах 3-5-дневного возраста. Препарат вводят внутримышечно в дозе 70 мкг на кг массы тела один раз в сутки в течение 7 дней. Прирост массы тела опытных поросят на 7-10%, сохранность - на 12% больше, чем у контрольной группы.
Препарат “Ферунол” применяют в ветеринарной практике в виде 0,0426%-ного водного раствора:
- для стимуляции выработки антител в дозе 1 мл на 100 кг живой массы подкожно в об-ласть средней трети шеи или внутримышечно в область крупа в течение 3-5 дней;
- для предотвращения заражения молодняка животных возбудителями желудочно-кишечных заболеваний в дозе 1 мл на 100 кг живой массы тела в течение 7 дней один раз в сутки, начиная с 3-5-дневного возраста.

1. Халиков Ш.Х. Синтез и структурно-функциональное исследование пептидов и полипепти-дов регулярного строения. Дис. на соиск. уч. ст. док. хим. наук.- М., 1991.- 49 с.
2. Najjar V.A. Therapeutically useful polypeptides. - United States Patent office. 3.778.426. 11 Dec. 1973, Int. C 07 C 1/52, C 07 G 7/00, C 08 H 1/00. Appl. 16 Dec. 1970.
3. Бобиев Г.М. Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина. Автореф. дис. на соиск. уч. ст. кан. хим. наук.- Душанбе, 1996.- 24 с.