СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО ОПОСРЕДОВАННОЙ ФАКТОРОМ VII АКТИВНОСТЬЮ В СВЕРТЫВАНИИ КРОВИ

Описан способ получения белков, имеющих биологическую активность по отношению к свертыванию крови, проявляемую Фактором VIIа или Фактором IX. Белки получают с помощью клетокхозяев млекопитающих, стабильно трансформированных ДНК-конструкцией, содержащей нуклеотидную последовательность, по крайней мере частично кодирующую либо Фактор VII, либо Фактор IX. Нуклеотидная последовательность содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую домен связывания кальция, соединенную со второй нуклеотидной последовательностью, расположенную ниже первой последовательности. В частно-сти, первая нуклеотидная последовательность может быть получена из геномного клона или к-ДНК-клона Фактора VII. Вторая последовательность кодирует каталитический домен, ответственный за активность либо Фактора VIIа, либо Фактора XI как сериновых протеаз. Соединенные последовательности кодируют белки, имеющие практически такую же биологическую активность по отношению к свертыванию крови, как либо Фактор VIIa, либо Фактор IX.

Описан способ получения белков, имеющих биологическую активность по отношению к свертыванию крови, проявляемую Фактором VIIа или Фактором IX. Белки получают с помощью клетокхозяев млекопитающих, стабильно трансформированных ДНК-конструкцией, содержащей нуклеотидную последовательность, по крайней мере частично кодирующую либо Фактор VII, либо Фактор IX. Нуклеотидная последовательность содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую домен связывания кальция, соединенную со второй нуклеотидной последовательностью, расположенную ниже первой последовательности. В частно-сти, первая нуклеотидная последовательность может быть получена из геномного клона или к-ДНК-клона Фактора VII. Вторая последовательность кодирует каталитический домен, ответственный за активность либо Фактора VIIа, либо Фактора XI как сериновых протеаз. Соединенные последовательности кодируют белки, имеющие практически такую же биологическую активность по отношению к свертыванию крови, как либо Фактор VIIa, либо Фактор IX.

Область техники
Данное изобретение в целом относится к факторам свертывания крови, а более конкретно к экспрессии белков, обладающих биологической активностью по отношению к свертыванию крови.
Уровень техники
Свертывание крови представляет собой процесс, состоящий из сложных взаимодействий различных компонентов крови или факторов, что в результате последовательных реакций приводит к образованию фиб-ринового сгустка. Как правило, компоненты крови, принимающие участие в процессе, называемом “каскад” свертывания, представляют собой проферменты или зимогены, которые представляют собой ферментативно неактивные белки, превращаемые в протеолитические ферменты действием активатора, который, в свою оче-редь, является активированным фактором свертывания. Факторы свертывания, подвергшиеся такому превра-щению, как правило, называют “активированными факторами” и обозначаются добавлением символа “а” (например VIIa).
Существуют две отдельные системы, инициирующие свертывание крови и вследствие этого участвую-щие в нормальном гемостазе, эти системы называют внутренней и внешней системами свертывания крови. Внутренняя система относится к тем реакциям, которые приводят к образованию тромбина с участием тех факторов, которые присутствуют только в плазме крови. Промежуточной стадией внутренней системы свер-тывания является активирование Фактора IX в Фактор IXа, и эта реакция катализируется Фактором XIa и ионами кальция. Затем Фактор IХа принимает участие в активации Фактора Х в присутствии Фактора VIIIa, фосфолипида и ионов кальция. Внешняя система свертывания включает в себя факторы плазмы крови, а так-же компоненты, присутствующие в тканевых экстрактах. Один из указанных выше проферментов, Фактор VII, участвует во внешней системе свертывания крови, превращая (после его активирования в VIIa) Фактор Х и Ха в присутствии тканевого фактора и ионов кальция. Фактор Ха, в свою очередь, превращает затем про-тромбин в тромбин в присутствии Фактора Va, ионов кальция и фосфолипида. Так как активация Фактора Х в Фактор Ха представляет собой стадию, входящую как во внешнюю, так и во внутреннюю системы свертыва-ния, то Фактор VIIa можно использовать для лечения пациентов, страдающих дефицитом ингибиторов Фак-тора VIII (Томас, патент США № 4382083). Есть также некоторые основания предполагать, что Фактор VIIа может принимать участие во внутренней системе свертывания, играя роль также в активации Фактора IX (Зюр и Немерсон, J. Biol. Chem. 253: 2203-2209, 1978).
Экспериментальный анализ показывает, что человеческий Фактор VII представляет собой одноцепо-чечный гликопротеин с молекулярным весом около 50000 дальтон. В этой форме фактор, циркулирующий в крови, является неактивным зимогеном. Активация Фактора VII в VIIа может катализироваться несколькими различными протеазами плазмы, такими, как Фактор ХIIа. Активация Фактора VII приводит к образованию двух полипептидных цепочек, а именно тяжелой цепочки (с молекулярной массой 28000) и цепочки меньшего размера (с молекулярной массой 17000), которые связаны друг с другом по меньшей мере одной дисульфид-ной связью. Фактор VII может также активироваться в VIIа in vitro, например по методике, описанной Тома-сом в патенте США № 4456591.
Фактор IХ циркулирует в крови в форме одноцепочечного предшественника фермента и имеет молеку-лярный вес 57000, превращаясь в активную сериновую протеазу (Фактор IХа) под действием Фактора ХIа в присутствии Фактора VII. Фактор IVа состоит из маленькой и большой цепей молекулярного веса соответ-ственно 16000 и 29000.
Обычное лечение пациентов, страдающих нарушениями свертывания (например, дефицитом Фактора VIII и IX), как правило, включает в себя замещающую терапию с использованием криопреципитата или дру-гих фракций плазмы человека, обогащенных нужным фактором. Эти препараты могут быть получены из сборной человеческой плазмы, однако получение криопреципитатов требует использования относительно большого количества плазмы человека в качестве сырья.
Фактор VII терапевтически используется при лечении индивидуумов, страдающих дефицитом Фактора VII, а также групп людей, страдающих дефицитом Фактора VII и IX и пациентов с болезнью Виллебранда. Если говорить подробнее, то пациенты, подвергающиеся терапевтическому лечению введением Факторов VIII и IX, часто вырабатывают антитела на эти белки. Длительное лечение становится крайне сложным из-за присутствия этих антител. Пациентов, у которых наблюдается это осложнение, обычно лечат активирован-ным протромбиновым комплексом, который, как известно, состоит из смеси активных и неактивных сверты-вающих ферментов, включающих Фактор VIIа. Кроме того, последние исследования указывают на то, что небольшое количество (40-50 мкг) введенного Фактора VIIа эффективно при подавлении серьезных случай-ных кровотечений у пациентов, страдающих дефицитом Фактора VII и имеющих в крови высокую концен-трацию антител (Гендер и Кисиел, J. Clin. Invist, 71: 1836-1841, 1983).
Так как при получении криопреципитатов используются различные источники плазмы, то трудно про-водить испытания препаратов на отсутствие в них вирусных загрязнений. Например, практически у всех па-циентов, принимающих криопреципитат, обнаруживается положительная реакция при испытании на гепатит. Последние сообщения указывают на то, что некоторые страдающие гемофилией пациенты, принимающие преципитат, имеют развивающийся приобретенный синдром иммунодефицита (СПИД). Кроме того, очистка больших количеств этих факторов крайне сложна и дорога.
Следовательно, в данной области существует потребность в разработке способа получения относитель-но больших количеств очищенных препаратов Фактора VIIа и Фактора IX. Данное изобретение удовлетво-ряет эту потребность за счет использования технологии рекомбинантной ДНК, которая с успехом устраняет проблему вирусного загрязнения и одновременно представляет концентрированный и гомогенный источник активного Фактора VIIа для лечения пациентов, страдающих дефицитом Фактора VII и Фактора IX и болез-нью Виллебранда, а также дает источник очищенного Фактора IX для использования в замещающей тера-пии.
Описание изобретения
Говоря коротко, в данном изобретении описывается ДНК-конструкция, содержащая нуклеотидную по-следовательность, по крайней мере, частично кодирующую Фактор VII. Нуклеотидная последовательность включает в себя первую нуклеотидную последовательность, кодирующую домен связывания кальция, соеди-ненную со второй нуклеотидной последовательностью, расположенную за первой последовательностью. Вторая нуклеотидная последовательность кодирует каталитический участок, обеспечивающий активность Фактора VIIа как сериновой протеазы. Соединенные последовательности кодируют белок, который после активации обладает практически такой же биологической активностью по отношению к свертывание крови, как Фактор VIIа. Первая нуклеотидная последовательность может быть практически такой же, как ген, коди-рующий Фактор VII, Фактор IX, Фактор Х, Протеин С, протромбин или протеин S. Кроме того, первая нук-леотидная последовательность может также кодировать главный пептид, кодируемый соответствующим геном.
В частности, первая нуклеотидная последовательность может быть получена из геномного клона или клона к-ДНК или Фактора VII, и может кодировать главный пептид и аминоконцевую последовательность Фактора VII. Первая нуклеотидная последовательность может также включать в себя двунитевый олигонук-леотид. Особенно предпочтительна такая первая нуклеотидная последовательность, которая кодирует ли-дерный белок и аминоконцевую последовательность Фактора IX.
Кроме того, в данном изобретении описываются рекомбинантные плазмиды, способные интегрироваться в ДНК клетки-хозяина млекопитающего. Одна из плазмид включает в себя промотор, расположенный после набора расщепляющих РНК центров, и за центрами расщепления РНК расположена нуклеотидная последо-вательность, по крайней мере частично кодирующая Фактор VII. Нуклеотидная последовательность включа-ет в себя первую нуклеотидную последовательность, кодирующую домен связывания кальция, соединенную со второй нуклеотидной последовательностью, расположенной за первой последовательностью. Вторая нуклеотидная последовательность кодирует участок, отвечающий за активность Фактора VIIа как сериновой протеазы. Соединенные последовательности кодируют белок, который после активации обладает практиче-ски такой же биологической активностью по отношению к свертыванию крови, как Фактор VIIа. После нук-леотидной последовательности расположен сигнал полиаденилации.
Аналогично указанной выше рекомбинантной плазмиде в данном изобретении описывается также вто-рая плазмида, включающая в себя промотор, за которым следует набор сайтов расщепления РНК, а за сай-тами расщепления РНК идет нуклеотидная последовательность, кодирующая, по крайней мере, частично, Фактор IX. Нуклеотидная последовательность включает в себя первую нуклеотидную последовательность, кодирующую домен связывания кальция, соединенную со второй нуклеотидной последовательностью, рас-положенной за первой последовательностью. Вторая нуклеотидная последовательность кодирует участок, ответственный за активность Фактора IX как серийной протеазы. Соединенные последовательности кодиру-ют белок, обладающий практически такой же биологической активностью по отношению к свертыванию крови, как Фактор IX. За нуклеотидной последовательностью следует сигнал полиаденилации.
Третий аспект данного изобретения касается клеток млекопитающих, стабильно трансформированных таким образом, что они вырабатывают белок, обладающий после активации практически такой же биологи-ческой активностью, как Фактор VIIа. Клетки трансформируют с помощью ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, по крайней мере частично кодирующую Фактор VII. Нуклеотидная по-следовательность включает в себя первуют нуклеотидную последовательность, кодирующую домен связы-вания кальция и соединенную со второй нуклеотидной последовательностью, расположенной после первой последовательности. Вторая нуклеотидная последовательность кодирует участок, ответственный за актив-ность Фактора VIIа как сериновой протеазы. Соединенные последовательности кодируют белок, который, после активации, проявляет практически такую же биологическую активность по отношению к свертыванию крови, как Фактор VIIа.
В данном изобретении описывается также клетки млекопитающих, стабильно трансформированные та-ким образом, чтобы вырабатывать белок, имеющий практически такую же биологическую активность, как Фактор IX. Клетки трансформируют с помощью ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последова-тельность, по крайней мере частично кодирующую Фактор IX. Нуклеотидная последовательность включает в себя первую нуклеотидную последовательность, кодирующую участок связывания кальция и соединена со второй нуклеотидной последовательностью, расположенной за первой. Вторая нуклеотидная последова-тельность кодирует участок, ответственный за каталитическую активность Фактора IX как сериновой проте-азы. Соединения последовательностией кодируют белок, имеющий практически такую же биологическую активность по отношению к свертыванию крови, как Фактор IX.
В данном изобретении предлагается также способ получения белка, обладающего кровосвертывающей активностью Фактора VIIа, путем создания клетки-хозяина млекопитающего, содержащей ДНК-конструкцию, содержащую, в свою очередь, нуклеотидную последовательность, по крайней мере частично кодирующую фактор VII. Нуклеотидная последовательность включает в себя первую нуклеотидную после-довательность, кодирующую домен связывания кальция и соединенную с расположенной за ней второй по-следовательностью. Вторая последовательность кодирует участок, ответственный за каталитическую актив-ность Фактора VIIа как сериновой протеазы. Соединенные последовательности кодируют белок, который, после активации, обладает практически такой же биологической кровосвертывающей активностью, как Фак-тор VIIа. Последовательные операции состоят в том, что клетку-хозяина млекопитающего выращивают в подходящей среде и выделяют белковый продукт, кодируемый ДНК-конструкцией и вырабатываемый клет-кой-хозяином млекопитающего. Белковый продукт затем активируют с получением Фактора VIIа.
Еще одним аспектом данного изобретения является способ получения белка, обладающего биологиче-ской кровосвертывающей активностью Фактора IX. Способ включает в себя создание клетки-хозяина млеко-питающего, содержащей ДНК-конструкцию, включающую в себя нуклеотидную последовательность, коди-рующую, по крайней мере, частично, Фактор IX. Нуклеотидная последовательность состоит из первой нук-леотидной последовательности, кодирующей участок связывания кальция, соединенной со второй нуклео-тидной последовательностью, расположенной за первой. Вторая нуклеотидная последовательность кодирует участок, обеспечивающий каталитическую активность Фактора IX как сериновой протеазы. Соединенные последовательности кодируют белок, обладающий практически такой же биологической кровосвертываю-щей активностью, как Фактор IX. Клетку-хозяина млекопитающего сначала выращивают в подходящей сре-де и затем выделяют белковый продукт, закодированный в клетке-хозяине. Описываются также белковые продукты, получаемые описанными выше способами.
В данном изобретении описывается также ДНК-конструкция, содержащая последовательность ДНК, кодирующую Фактор VII. В предпочтительном варианте послеодовательность ДНК включает в себя после-довательность к-ДНК по рисунку 1b, от по (пары оснований) 36 до по 1433. В другом предпочтительном ва-рианте последовательность ДНК содержит последовательность к-ДНК по рисунку 1b от по 36 до по 99, рас-положенную перед последовательностью, соответствующей участку от по 166 до по 1433. Описываются также рекомбинантные плазмы, способные интегрироваться в ДНК клетки-хозяина млекопитающего, вклю-чающие в себя только что описанные последовательности ДНК.
Описаны также клетки млекопитающих, стабильно трансформированные с помощью рекомбинантной плазмиды, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Фактор VII. В предпочтительных вариантах последовательность ДНК содержит последовательность к-ДНК по рисунку 1b от по 36 до по 1433, или по-следовательность к-ДНК по рисунку 1b от по 36 до по 99, расположенную перед последовательностью от по 166 до по 1433.
Описан также способ получения белка, обладающего биологической кровосвертывающей активностью Фактора VIIа путем стабилизации клетки-хозяина млекопитающего, содержащей ДНК-конструкцию, опи-санную выше. Клетку-хозяина млекопитающего выращивают в подходящей среде и выделяют белковый про-дукт, кодируемый ДНК-конструкцией. Белковый продукт активируют для получения Фактора VIIа.
Другие аспекты данного изобретения поясняются с помощью представленного ниже подробного описа-ния и прилагаемых рисунков.
Краткое описание рисунков
Рисунок 1а иллюстрирует частичную последовательность к-ДНК Фактора VII, получаемую соединени-ем к-ДНК клонов  VII2115 и  VII1923.
Рисунок 1ь иллюстрирует к-ДНК последовательность Фактора VII  VII2463. Стрелки обозначают раз-мер делеции в последовательности  VII565. Цифры над последовательностью обозначают аминокислоты. Числа, расположенные ниже, обозначают нуклеотиды.
На рисунке 2а иллюстрируются аминоконцевые участки нескольких факторов свертывания.
На рисунке 2b представлено сравнение аминокислотной последовательности Фактора VII, полученной из деструктивного анализа белка, с последовательностью, кодируемой к-ДНК.
На рисунке 3 представлено соединение основных аминокислот последовательности Фактора IX в по-следовательность, кодирующую домен связывания кальция.
На рисунке 4 показано соединение гибридных подобных Фактору IX последовательностей в частичную к-ДНК Фактора VII с получением структурной кодирующей последовательности.
На рисунке 5 показано конструирование плазмида, содержащего последовательность, кодирующую слитый белок Фактора IX/Фактор VII.
На рисунке 6 представлен экспрессивный вектор F IX/ VII/pD2. Использованы следующие обозначения: Аd2 MLP - основной промотор из аденовируса 2; L1-3 - состоящая из трех частей лидерная последователь-ность аденовируса 2; 5’ SS - сайт 5’ расщепления; 3’ SS - сайт 3’ расщепления; рА - сигнал полиаденилации из SV 40.
На рисунке 7 показана нуклеотидная последовательность слитой к-ДНК Фактор IX/Фактор VII.
На рисунке 8 показан экспрессивный вектор рМ7135. Использованы следующие обозначения: Е - усили-тель SV 40; ori - единицы структуры 0-1 Ао5; рА - сигнал ранней полиадениляции из SV 40;
 - участок делеции “отравляющей” последовательности рBR322; другие обозначения такие же, как в рисунке 6.
На рисунке 9 показано субклонирование 2463 по к-ДНК Фактора VII.
На рисунке 10 показано субклонирование 565 по к-ДНК Фактора VII.
На рисунке 11 показано соединение 5’-окончания рVII565 и 3’-участка рVII2463 в р C18 с образовани-ем рVII2397.
На рисунке 12 иллюстрируется конструирование экспрессионных плазмид F VII/2463/ /рDX и FVII/565+2463//рDX.pA. Обозначает сигнал полиадениляции из SV 40 в ранней или поздней ориентации, как описано в Примере 9. Другие обозначения такие, как описано в рисунке 8.
Лучший вариант осуществления изобретения
Перед рассмотрением данного изобретения может быть полезно ознакомиться с обозначениями некото-рых терминов, используемыми ниже.
Комплементарная ДНК или к-ДНК: молекула или последовательность ДНК, ферментативно синтезиро-ванная из последовательностей, присутствующих в матрице м-РНК.
ДНК-Конструкция: молекула ДНК или клон таких молекул, как однонитевых, так и двунитевых, которые в частичной форме могут быть выделены из природного гена или модифицированные и содержащие сегменты ДНК, скомбинированные и соединенные таким способом, который отсутствует в природе.
Плазмида или вектор: ДНК-конструкция, содержащая генетическую информацию, которая вызывает ре-пликацию при введении в клетку-хозяина. Плазмида, как правило, содержит по крайней мере одну генную последовательнось, экспрессия которой происходит в клетке-хозяина, а также последовательности, облегча-ющие экспрессию такого гена, включая промоторы и инициирующие транскрипцию сайты. Они могут быть линейными или замкнутыми в кольцо молекулами.
Соединенный: имеются в виду последовательности ДНК, соединяемые при присоединении 5’- и 3’-окончаний одной последовательности соответственно к 3з - и 5’ - окончаниям присоединяемой последова-тельности через фосфодиэфирные связи. Соединение может достигаться такими способами, как связывание липких концов, синтезом соединенных последовательностей клонированием к-ДНК или удалением или вве-дением последовательностей способом прямого мутагенеза.
Лидерный пептид: аминокислотная последовательность, имеющаяся на N-окончаниях некоторых белков и, как правило, отщепляемая от белка в ходе последующей переработки и секретирования. Лидерные пепти-ды включают в себя последовательности, направляющие белок в клетке на секретирование. Используемое здесь выражение “Лидерный пептид” может также обозначать часть природного лидерного пептида.
Домен: терхмерная, самоорганизующаяся структура из особых аминокислот в белковой молекуле, со-держащая все или часть структурных элементов, необходимых для обеспечения определенной биологиче-ской активности белка.
Биологическая активность: функция или набор функций, осуществляемых молекулой в биологическом процессе (например, в организме или in vitro). Биологические активности белков могут подразделяться на каталитическую и эффекторную активности. Каталитические активности факторов свертывания, как прави-ло, включают в себя активацию других факторов путем специфического расщепления предшественников. Эффекторные активности включают в себя специфическое связывание биологически активных молекул каль-цием или другими малыми молекулами, макромолекулами, такими как белки, или клетками. Эффекторная активность часто необходима или существенна для каталитической активности в биологической среде. Ка-талитическая и эффекторная активности могут в некоторых случаях обеспечиваться одним и тем же доменом белка.
Биологическая активность Фактора VIIа характеризуется участием во внешней системе свертывания крови. Фактор VIIа активирует Фактор Х с образованием Фактора Ха, который в свою очередь превращает протромбин в тромбин, инициируя образование фибринового сгустка. Так как активация Фактора Х обычно происходит как во внешней, так и во внутренней системе свертывания крови, то Фактор VIIа может быть ис-пользован для лечения пациентов с сильной недостаточностью активных факторов IX и VII или больных болезнью Виллебранда.
Биологическая активность Фактора IX характеризуется участием в свертывании крови во внутренней системе свертывания. Фактор IХа активируется в Фактор Iхa Фактором XIа. Затем Фактор XIа активирует Фактор Х в Фактор Ха в присутствии Фактора VIIIa, фосфолипида и ионов кальция. Затем Фактор Ха участ-вует в превращении протромбина в тромбин, инициируя образование фибринового сгустка.
Как отмечалось выше, выделение Фактора VII из человеческой плазмы занимает много времени и доро-го стоит, так как фактор является редким белком, присутствующим в концентрации лишь около 300 мкг на литр крови. Кроме того, его тяжело отделять от протромбина, Фактора IX и Фактора Х и он чувствителен к протеолитическому действию в ходе очистки (Кисиел и Мак-Маллен). Хотя одноцепочечный человеческий Фактор VII и был очищен до гомогенного состояния (Кисиел и Мак-Маллен), однако опубликованные спосо-бы очистки ограничены, как правило, низким выходом и/или загрязнением другими факторами свертывания.
Факторы VII и IX вырабатываются в печени и требуют витамина К для своего биосинтеза. Витамин К необходим для образования особых остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты в факторах. Эти не-обычные аминокислотные остатки, образующиеся пост-трансляционной модификацией, связываются с иона-ми кальция и ответственны за взаимодействие белка с фосфолипидными носителями. Кроме того, каждый из факторов VII и IX содержит один остаток бета-оксиаспарагиновой кислоты, который также образуется после трансляции белков. Однако роль этой аминокислотной последовательности неизвестна.
Учитывая тот факт, что активности Факторов VII и IX зависят от пост-трансляционных модификаций, включающих в себя гамма-карбоксилирование особых остатков глутаминовой кислоты, и могут также зави-сеть от гидроксилирования особого остатка аспарагиновой кислоты, маловероятно, что активный продукт может быть получен клонированием и экспрессией Факторов VII и IX в микроорганизме.
В данном изобретении, соответственно, предлагается способ получения белка, имеющего кровосверты-вающую биологическую активность фактора VIIа, с использованием стабильно трансформированных клеток млекопитающих. Кроме того, в данном изобретении предлагается также способ получения белка, обладаю-щего биологической активностью по отношению к свертыванию крови, аналогичной активности Фактора IX.
Как отмечалось выше, Факторы VII и IX требуют для своего биосинтеза витамина К. Кроме того, такие плазменные белки, как протромбин, Фактор Х, Протеин С и Протеин S также требуют для своего биосинтеза витамин К. Аминоконцевые участки этих белков, содержащие остатки гамма-карбоксиглутаминовой кисло-ты, аналогичны как по аминокислотной последовательности, так и по биологической функции (рисунок 2а). Кроме того, карбоксиконцевые участки Фактора VII, протромбина, Фактора IX, Фактора Х и Протеина С определяют их специфическое действие как сериновых протеаз.
Фактор VII является белком, присутствующим в плазме в следовых количествах и считается, что редкой является м-РНК, кодирующая Фактор VII. Следовательно, очистка Фактора VII из плазмы в количествах, достаточных для проведения подробного анализа последовательности и определения свойства остается трудной. Разложение Фактора VII в ходе очистки, даже в присутствии ингибиторов протеаз, было отмечено Кисиелом и Мак-Малленом (см.). В силу этих трудностей Фактор VII был плохо охарактеризован по сравне-нию с другими компонентами свертывающей системы крови, присутствующими в больших количествах. Дей-ствительно, в работе Кисиела и Мак-Маллена (см.) была получена информация о последовательности только для 10 остатков каждой цепи Фактора VII и в каждой последовательности идентификация двух остатков является предварительной. Данные по частичной аминокислотной последовательности бычьего Фактора VII также были опубликованы (Дискипио и др., см.).
Предполагаемая редкость м-РНК Фактора VII является одной из причин плохого значения гена Фактора VII. Успех обычной техники клонирования к-ДНК зависит от наличия достаточного количества м-РНК, ис-пользуемой в качестве матрицы. Преждевременная терминация обратной транскрипции приводит к получе-нию клонов к-ДНК, лишенных 5’-окончания, и этому способствует низкая концентрация м-РНК. Были разра-ботаны несколько общих подходов для клонирования к-ДНК веществ, имеющихся в низкой концентрации (Maniatis и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), но недостаток знания аминокислотной последовательности интересующего продукта делает невозможным предсказание ДНК-последовательности и разработку подходящих олигонуклеотидных проб. Хотя можно относительно прямо получать частичный клон к-ДНК гена, кодирующего редкий белок, с помощью этих разработанных подходов, однако клоны к-ДНК полной длины гена, кодирующего редкие белки, такие как Фактор VII, полу-чать по-прежнему исключительно трудно.
По сравнению с Фактором VII Фактор XI является относительно нередким белком, и известна последо-вательность клона к-ДНК гена человеческого Фактора IX (Kurachi and Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6461-6464, 1982; и Anson и др., ЕМВО J, 3: 1053-1060, 1984). Была охарактеризована структура гена Факто-ра IX и была определена аминокислотная последовательность белка на основании известной нуклеотидной последовательности. Были опубликованы также некоторые данные по белковой последовательности для человеческого и бычьего Фактора IX и анализируемые последовательности (Дискипио и др., см.). Аминокон-цевой участок белка содержит 12 остатков глутаминовой кислоты, которые превращаются в зрелом белке в остатки гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (Gia). Были также определены сайты расщепления, участву-ющие в активации Фактора IX (Kurachi и Davie, см.). Последовательность 5’-окончания клона к-ДНК Фактора IX кодирует сигнальный пептид, типичный для сигнальных пептидов, обнаруженных в большинстве секрети-руемых белков (Kurachi и Davie, см.). Ранее описывалась экспрессия гена Фактора IX методами рекомбинант-ной ДНК.
Так как трудно получить клон к-ДНК полной длины гена Фактора VII, то были разработаны три новых подхода для получения 5’-окончания кодирующей последовательности, включая участок, кодирующий ли-дерный пептид. По первому способу частичный клон к-ДНК Фактора VII соединяют с фрагментом, кодиру-ющим лидерный пептид и 5-окончание Фактора IX. Этот подход основан на том наблюдении, что аминокон-цевые участки двух молекул ответственны за связывание кальция соответствующими белками, и на открытии того, что относящаяся к связыванию кальция активность Фактора IX аналогична активности Фактора VII. Результирующий полипептид сохраняет биологическую активность нативного Фактора VII, так как за спе-цифическую активность факторов свертывания как сериновых протеаз отвечают карбоксиконцевые участки молекул. Второй подход сочетает клон частичной к-ДНК с последовательностью ДНК, кодирующей лидер-ную и аминоконцевую последовательности Фактора VII. Частичная последовательность к-ДНК и аминокис-лотная последовательность Фактора VII, описанные здесь, способны выбирать из библиотеки геномной ДНК или библиотеки к-ДНК клоны, включающие 5’-окончание гена Фактора VII. В третьем способе соединяют клон частичной к-ДНК с гибридными кодирующими последовательностями, содержащими фрагмент к-ДНК, кодирующий лидерный пептид Фактора IX и сегмент синтетического гена, кодирующий согласованный до-мен связывания кальция или предсказанную аминоконцевую последовательность Фактора VII, которая была установлена с помощью описываемых здесь ранее не опубликованных данных по аминокислотной последо-вательности. Согласованную последовательность определили из данных по Фактору VII, и из данных, опуб-ликованных по последовательности других плазменных белков, зависящих от витамина К.
В соответствии с описанным выше способом отбора клонов, содержащих 5’-окончание гена Фактора VII, авторы данного изобретения успешно получили полномерную, правильную к-ДНК, пригодную для экс-прессии.
Среди полученных клонов к-ДНК клон, обозначенный “VII2463”, содержит наибольшую вставку к-ДНК Фактора VII. Было установлено, что она содержит полную кодирующую последовательность Фактора VII. Этот клон содержит 35 нуклеотидов нетранслированного участка 5’, 180 нуклеотидов, кодирующих лидерный участок из 60 аминокислот, 1218 нуклеотидов, кодирующих 406 аминокислот зрелого белка, стоп-кодон, 1026 нуклеотидов нетранслируемой 3’-последовательности и 20 оснований конца poly (A) (начиная с позиции 2463). Две нити этой к-ДНК не подвергались полному анализу последовательности. Сравнение ее с двумя вставками к-ДНК, выделенными ранее из клонов VII2115 и VII1923, свидетельствует, что VII2463 содержит, в индивидуальном фрагменте Есо RI, к-ДНК Фактора VII, кодирующую лидерную последователь-ность Фактора VII и последовательности зрелого белка.
Был выделен второй клон, VII565, содержащий вставку к-ДНК, идентичную к-ДНК клона VII2463 от нуклеотида 9 до нуклеотида 638, за исключением того, что отсутствуют нуклеотиды от 100 до 165 (рисунок 1b). При сравнении к-ДНК с геномной ДНК Фактора VII установлено, что отсутствующая последователь-ность точно соответствует одному экзоноподобному участку. Следовательно, получены две к-ДНК Фактора VII, отражающие различные стадии сплайсинга м-РНК.
Лидерная последовательность, кодируемая VII2463, является исключительно длинной (60 аминокис-лот) и имеет гидрофобный характер, отличающийся от Фактора IX, Протеина С и протромбина. Эта лидер-ная последовательность содержит два метионовых остатка, в положениях -60 и -26. Иницирование наиболее вероятно начинается на первом met, так как гидрофобный участок, типичный для сигнальных пептидов, сле-дует за met в положении -60, а не met в положении -26. Интересно, что отсутствующая последовательность в VII565, соответствующая точно экзоноподобному участку в геномном клоне, приводит к аминокислотной лидерной последовательности из 38 аминокислот, гидрофобные характеристики которой более похожи на Фактор IX, Протеин С и протромбин.
Так как неясно, насколько описанные выше лидерные последовательности соответствуют нативным, то были приложены усилия для анализа 5’-концевой последовательности. Вкратце этот способ включал в себя конструирование и отбор библиотеки человеческой геномной ДНК и идентифицирование геномных клонов, содержащих последовательности гена Фактора VII. Участок 5’ геномной последовательности присоединяли затем к к-ДНК для конструирования полномерного клона.
При дополнительном конструировании 5-фрагмент к-ДНК Фактора VII VII565, содержащий участок, полностью кодирующий лидерный участок, и последовательность, кодирующую 29 аминокислот зрелого белка, связывали с фрагментом к-ДНК VII2463 (содержащим остальную часть зрелого белка и нетрансли-руемые 3-последовательности). Эта “565-2463” - последовательность кодирует полный Фактор VII, к-ДНК-последовательность является индивидуальным Есо RI-фрагментом.
Описанные выше последовательности ДНК вставляли затем в подходящий вектор экспрессии, который в свою очередь использовали для трансформирования клетки млекопитающего. Вектор экспрессии, используе-мый для осуществления данного изобретения, включает в себя промотор, способный направить транскрип-цию чужеродного гена в трансформированной клетке млекопитающего. Предпочтительны вирусные промо-торы из-за их эффективности при прямой транскрипции. Таким особенно предпочтительным промотором является основной поздний промотор аденовируса 2. Такой вектор экспресии будет также содержать набор сайтов сплайсинга РНК, расположенный за промотором и выше сайта вставки гена, кодирующего белок, имеющий биологическую кровосвертывающую активность. Предпочтительные последовательности сайта сплайсинга РНК могут быть получены из сденовируса и/или из генов иммуноглобулина. В векторах экспрес-сии содержится также сигнал полиадениляции, расположенный за сайтом вставки. Предпочтительны вирус-ные сигналы полиадениляции, такие как сигналы ранней или поздней полиадениляции из SV 40 или сигнал полиадениляции из участка аденовируса 5:Eio. В особенно предпочтительном варианте вектор экспрессии содержит также вирусную лидерную последовательность, такую как состоящий из трех частей лидер адено-вируса 2, расположенную между промотором и сайтами сплайсинга РНК. Предпочтительные векторы могут также содержать усиливающие последовательности, такие как усилитель SV 40.
Последовательности клонируемой ДНК можно также вводить в культивируемые клетки млекопитающих с помощью трансформации, вызываемой фосфатом кальция. (Wigler и др., Cell, 14: 725, 1978; Corsaro и Pear-son, Somatic Cell Genetics 7: 703, 1981; Graham и Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Получают осадок, обра-зованный ДНК и фосфатом кальция, и этот осадок наносят на клетки. Часть клеток поглощает ДНК и удер-живает ее внутри клетки в течение нескольких дней. Небольшая часть клеток (обычно 10-4) стабильно инте-грирует ДНК в геном. Для идентификации этих стабильных интегрантов вместе с интересующим геном обыч-но вводят ген, придающий отличительный фенотипический признак (отличительный маркер). Предпочти-тельными отличительными маркерами являются гены, придающие устойчивость к лекарствам, таким как G-418 и метотрексат. Отличительные маркеры можно вводить в клетки на отдельной плазмиде одновременно с интересующим геном или их можно вводить в той же самой плазмиде. Предпочтительным отличительным маркером является ген устойчивости к лекарству G-418, содержащийся в плазмиде рКО-neo (Southern Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341, 1982). Может оказаться желательным прибавление дополнительной ДНК, из-вестной как “несущая ДНК”, в смесь, вводимую в клетки. После того, как клетки поглотили ДНК, их оставля-ют расти в течение определенного времени, обычно 1-2 дней, для начала экспрессии интересующего гена. Затем проводят отбор лекарством для отбора тех клеток, которые обнаруживают стабильную экспрессию отличительного маркера. Для экспрессии интересующего белка могут быть отобраны клоны таких клеток.
Факторы VII и IX, вырабатываемые трансформированными клетками, могут быть выделены из клеточ-ной культуральной среды адсорбцией на цитрате бария. Среду перемешивают с цитратом натрия и хлори-дом бария и собирают осадок. Осадок затем можно проанализировать на присутствие соответствующего фактора свертывания. Дальнейшую очистку можно провести с помощью иммуноадсорбции. Предпочтитель-но, чтобы иммуноадсорбиционная колонка содержала высокоспецифическое моноклональное антитело. Кроме того, очистка адсорбированного на цитрате бария продукта может проводиться более общеприняты-ми биохимическими способами или с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.
Превращение одноцепочечного Фактора VII в активный двухцепопочечный Фактор VIIa может прово-диться с помощью Фактора XIIа, как описано Hender и Kisiel (J. Clin Invest. 71: 1836-1841, 1983) или другими протеазами, имеющими трипсиноподобную специфичность (Kisiel и Fujikawa, Behring Inst. Mitt, 73: 29-42, 1983).
Итак, в данном изобретении предлагается способ получения белков, имеющих активность, зависящую от витамина К факторов свертывания крови, с помощью трансформированных клеток млекопитающих. Генные последовательности, кодирующие специфические домены сериновых протеаз факторов свертывания, выде-ляют из библиотек к-ДНК. Последовательности, кодирующие лидерные пептиды и домены связывания каль-ция выделяют из библиотек к-ДНК или генома или конструируют из синтезированных олигонуклеотидов. Затем последовательности соединяют с получением соответствующего вектора экспрессии, кодирующего белок, имеющий нужную биологическую кровосвертывающую активность. Результирующий вектор и плаз-миду, содержащую маркер устойчивости к лекарству совместно вводят в культивируемые клетки ткани под-ходящего млекопитающего. Трансформированные клетки отбирают затем добавлением соответствующего лекарства, такого как G-418. Затем белковые продукты очищают из среды клеточного роста и оценивают на биологическую активность анализом на свертывание крови и перекрестным иммунологическим анализом с использованием антител, полученных против аутентичных факторов свертывания.
Кратко суммируем представленные ниже примеры: в примере 1 описывается клонирование полномер-ной последовательности к-ДНК Фактора VII. В примере 2 описывается частичная аминокислотная последо-вательность человеческого Фактора VII, включающая в аминоокончании последовательность из приблизи-тельно 30 аминокислот. В примере 3 описывается конструирование и отбор библиотеки человеческой геном-ной ДНК и идентификация геномных клонов, включающих последовательности гена Фактора VII. В примере 4 описано конструирование двух сегментов гибридного гена, каждый из которых содержит фрагмент к-ДНК, кодирующий лидерный пептид Фактора IX и синтезированный двунитевый фрагмент, кодирующий согласо-ванный домен связывания кальция. Гибридные последовательности соединяют затем в клоны частичной к-ДНК Фактора VII. С использованием мутагенеза in vitro согласованную последовательность затем изменяют так, чтобы она соответствовала данным по белковой последовательности Фактора VII. В примере 5 описы-вается конструирование генной последовательности, кодирующей слитый белок, включающий связывающий кальций домен Фактора IX и специфический домен сериновой протеазы Фактора VII. В примере 6 описано конструирование вектора рD2 для использования в экспрессии белков, обладающих биологической крово-свертывающей активностью, в трансформированных клетках млекопитающих. Слитый ген, описанный в примере 5, экспрессируют с использованием этого вектора. В примере 7 описано использование вектора рD2 для экспрессии гена Фактора IX в линии трансформированных клеток млекопитающих. В примере 8 описы-вается конструирование вектора рМ7135, содержащего последовательности ДНК, кодирующие продукт первичной трансляции, содержащий лидерную последовательность Фактора IX, слитую с Фактором VII. Этот вектор может быть использован для получения белка, имеющего активность Фактора VII, в линии трансформированных клеток млекопитающего. В примере 9 описана экспрессия Фактора VII с использова-нием последовательностей к-ДНК и экспрессии Фактора VII из гибридной последовательности геномной к-ДНК.
Представленные ниже примеры служат для иллюстрации и не ограничивают данного изобретения.

Примеры
Расщепляющие ферменты были получены из Bithisda Research Laboratories /BRL/ и New England Biolab, за исключением специально указанных случаев, использовались так, как рекомендует поставщик. Олигонук-леотиды синтезировали на ДНК- синтезаторе Applied Biosystems Model 380 A и очищали на денатурирован-ных гелях электрофорезом на полиакриламидном геле. E.coli - Клетки трансформировали так, как описано Maniatis и др. (Malecular Claning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982). Клонирующие векторы М13 и puC и штаммы - хозяева получали из BRL. Фактор VII получали из человеческой плазмы так, как описано Kisiel и McMullen (см).

Пример 1. Клонирование частичной к-ДНК- фактора VII
А. Конструирование библиотеки к-ДНК человеческой печени.
Библиотеку к-ДНК получали из м-РНК печени человека в соответствии со стандартными способами. Препарат к-ДНК седиментировали через градиент щелочной сахарозы и собирали фракции, содержащие частицы большие, чем приблизительно 1000 нуклеотидов. Первый препарат делали двунитевым с помощью ревертазы, обрабатывали S1-нуклеазой и оставшиеся концы заполняли с помощью ДНК - полимеразы 1 (фрагмент Klenow) в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. к-ДНК с тупыми концами обрабатывали Есо RI-метилазой и связывали с фосфорилированным и линкерами Есо RI с помощью Т - ДНК - лигазы. Связанный препарат ДНК подвергали интенсивному расщеплению с помощью Есо RI для удаления избыточных линкерных последовательностей, и двунитевые ДНК большие, чем приблизительно 1000 пар оснований по длине, очищали центрифугированием в градиенте нейтральной сахарозы. Нативную ДНК gt 11 связывали в конкатемеры, расщепляли для завершения с помощью Есо RI и 5- концевые фосфаты удаляли обработкой бактериальной щелочной фосфатазой. Соединенные к-ДНК печени человека связывали с ДНК фазе, наносили in vitro и использовали для заражения E.coliy 1088. В этой библиотеке генерируется приблизи-тельно 14 х 106 первичных фаговых пятен, состоящих из 7 библиотек по приблизительно 2 х 106 пятен каждая. Более чем 90% из них являются рекомбинантами, содержащими вставки человеческой ДНК, на что указывает потеря у них бета- галактозидазной активности и анализ 20 случайных клонов расщеплением с помощью Есо RI с последующим электрофорезом на агарозном геле. Библиотеку к-ДНК в форме частиц фага очищают центрифугированием в градиенте хлорида цезия и хранят в буфере SM.
В. Отбор библиотеки к-ДНК печени человека для клонов Фактора VII.
Описанную выше библиотеку экспрессивной к-ДНК из печени человека отбирают на специфический ан-тиген, с использованием 125 1-печеного моноклонального антитела Фактора VII, полученного с использова-нием очищенного Фактора VII. Отбор 6 х 10 пятен фага идентифицирует один изолят, обозначаемый как VII2115, дающий положительную реакцию на антитело.
Клон фага VII2115 испытывают по отношению к двум другим моноклональным антителам анти-фактору VII и кроличьему поликлональному антителу к Фактору VII. Изолят VII2115 дает положительную реакцию на все эти антитела анти-фактора VII.
ДНК получают из лизата пятен VII2115. Расщепление этой ДНК с помощью ЕсоRI освобождает встав-ку длиной 2139 по. Эту вставку субклонируют в векторы фага М13 для терминации цепи дидезокси - ДНК секвентирования. Эта вставка к-ДНК содержит сайты Pst 1 в положениях 214, 839 и 1205 (обозначены на рисунке 1а соответственно Pst Ia, Pst Ib и Pst Ic) и сайт Sma I, расположенный в положении 611. Секвентиру-ют следующие матрицы М13:
1) полномерный /2139 оснований/фрагмент EcoRIa  EcoRIb в М13mp18 (обозначает клон F7-1);
2) фрагмент Pst Ia  EcoRIa, длиной 214 оснований, в М13mp19 (F7-2);
3) фрагмент в М13mp18 (F7-3) длиной 625 оснований, Pst Ia  Pst 1;
4) фрагмент в М13mp18 (F7-7), Pst Ib Pst Ia, 625 оснований;
5) фрагмент в M13mp10 (F7-8), SmaIPst Ib, 228 оснований;
6) фрагмент в М13mp18 (F7-9), Pst I  Pst Ic, 366 оснований;
7) фрагмент в М13mp18 (F7-10), Pst Ic  Pst Ib, 366 оснований;
8) фрагмент в М13mp19 (F7-11), Pst Ic  Eco RIb, 950 оснований;
9) полномерный фрагмент в М13mp18 (F7-12), Eco RIb Eco RIa;
(рестрикционные сайты обозначены так же, как на рисунке Ia). Данные подтверждают последовательность у обеих нитей для 91% кодирующего участка и 15% некодирующего 3 - участка, и дают информацию по одной нити для остальных 9% кодирующего участка и 85% некодирующего участка.
Сравнение аминокислотной последовательности, предсказанной из последовательности к-ДНК, с из-вестной аминокислотной последовательностью (пример 2) указывает на наличие аномалии, которую можно объяснить отсутствием трех нуклеотидов в последовательности ДНК около положения 400. Для получения дополнительных данных по последовательности VII2115 расщепляют ЕсоRI и фрагмент, кодирующий Фак-тор VII, вводят в pUC 13, обозначенную EcoRI. Результирующую рекомбинантную плазмиду, обозначенную pUCVII2115, расщепляют XbaI по положению 328. Расщепленный образец делят пополам: половину метят с помощью 32Р dCTP и ДНК - полимеразы I (фрагмент Klenow), другую половину метят с помощью 32р АТР и полинуклеотидкиназы. Меченые плазмиды расщепляют затем с помощью Pst I и получают фрагменты дли-ной 113 и 509 пар оснований. Обе нити каждого из этих фрагментов секвентируют по методу Maxam Gilbert. Фрагмент длиной 113 пар оснований секвентируют полностью а в фрагменте длиной 509 пар оснований се-квентируют 210 пар оснований. В результате секвентирования обнаруживают три дополнительных основа-ния (один С и два G), что приводит данные по последовательности ДНК в согласие с данными по последова-тельности белка и указывает на то, что предыдущие аномальные результаты возникают в результате сжатия в секвентирующем геле, обусловленного вторичной структурой, включающей в себя G и С. Подтверждается также последовательность последних 9% кодирующего участка для обоих нитей.
Дополнительный анализ вставки PUCVII2115 подтверждает, что часть этого клонированного фрагмента кодирует последовательность из 11 аминокислот, которая известна как расщепляющий сайт Фактора VII. Сравнение этой последовательности а с аминокислотными последовательностями фактора IX и Фактора Х свидетельствует о том, что клон, содержащий последовательность Фактора VII, начинается (приблизитель-но) с нуклеотидов, кодирующих аминокислоту 36 природного белка Фактора VII и продолжается через при-близительно 1000 кодирующих и 1100 некодирующих нуклеотидов и последовательность poly А. Кроме того, было установлено, что этот клон имеет мутационный сдвиг структуры в кодирующем 3-участке.
Для получения правильного кодирующего 3-участка все 14 миллионов клонов семи библиотек к-ДНК gt11 подвергают отбору гибридизацией пятен с помощью транслируемой с меткой к-ДНК VII2115.
Семь положительных изолятов отбирают затем с помощью дидезокси- секвентирования плазмид pUC, в которых субклонированы вставки к-ДНК. Клоны gt 11 расщепляют с помощью ЕсоRI и фрагменты фактора VII вставляют в pUC13, которую расщепляют ЕсоRI. Как было установлено, за одним исключением все остальные начинают с позиции, соответствующей основанию 212 вставки в VII2115, в одном случае - ис-ключении имеется только некодирующая 3-последовательность. Один из клонов, начинающийся с основания 212, был выбран для анализа и обозначен как клон pUCVII1923.
Так как анализ pUCVII2115 указывает на присутствие мутационного сдвига между позициями 657 и 815, то pUCVII1923 сначала анализировали по этом участку секвентированием по Makam-gilbert. Плазмиду pUCVII1923 расщепляют с помощью Nar I (позиция 779 на рисунке 1а). Расщепленную ДНК метят 32р dСТР с использованием ДНК- полимеразы 1 (фрагмент Klenow) и последовательно расщепляют с помощью Ava I (проводящей расщепление по тому же сайту, что Sma I на рисунке 1) и Taq I (сайт при 1059), получая фрагмент Nar I-Ava I длиной 166 и по и фрагмент Nar I-Taq I длиной 200 по. Каждый из них секвентируют. С, недостающий в pUCVII2115, обнаруживается в положении 697 и другой С, также отсутствующий в pUCVII2115, обнаруживается в положении 798.
Было установлено, что остальная последовательность кодирующего участка pUCVII1923 является пра-вильной по данным секвентирования по дидезокси- методу субклона М13 полной вставки pUCVII1923. Праймер Lac ZC87 (таблица 1) используют для последовательности от положения 212 (рисунок 1а) до 512, праймер ZC218 (CTCTGCCTGCCGAAC) используют для последовательности от 715 до 1140 и праймер ZC217 (ATGAGAAGCGCACGAAG) используют для последовательности от 720 до 350. Так как вставка pUCVII2115 правильна от положения 13 (позиции 1-12 содержат искусственный линкер), а pUCVII1923 пра-вильна от позиции 212 до конца, то соединенные вместе они дают молекулу с правильной структурой начи-ная с позиции 13 (рисунок 1а) и до конца. Обычно используемый для этого соединения участок представляет собой сайт Xba I в позиции 328. Последовательность правильной составной молекулы показана на рисунке 1а.
Так как клонированием к-ДНК трудно получить полномерный клон Фактора VII, то использовали три подхода для получения отсутствующей кодирующей последовательности и необходимых лежащих выше процессорной и сигнальной последовательности. Первый подход заключается в том, что необходимую по-следовательность получают из библиотеки человеческой геномной ДНК или дополнительным отбором биб-лиотек к-ДНК. Второй подход заключается в синтезировании необходимой кодирующей 5-последовательности на основе данных по аминокислотной последовательности фактора VII (пример 2) и опубликованных последовательностей генов, кодирующих зависимые от витамина К факторы свертывания (Kurachi и Davie см.; Davie и др., см.) и в присоединении ее к части последовательности фактора IX. Третий подход основан на функциональной гомологичности аминоконцевых участков фактора VII и Фактора IX. Конструируют последовательность, содержащую кодирующую участки лидерной последовательности и аминоконцевой участок Фактора IX. Затем ее в нужной ориентации присоединяют к частичной к-ДНК Фак-тора VII.
Для получения последовательностей ДНК, содержащих полную последовательность ДНК Фактора VII, были предприняты попытки выделить оставшуюся 5-последовательность ДНК. Это достигается использова-нием 5-концевого фрагмента EcoRI-XbaI длиной 0,3 килобазы из к-ДНК вставки  VII 2115 для отбора биб-лиотеки к-ДНК, содержащей 2 х 10 фагов. Библиотеку конструируют с использованием poly (A) - мРНК из клеток HepG2 с последующим применением вышеописанных способов. РНК ретранскрибируют для получе-ния первой нити к-ДНК, а вторую нить синтезируют с помощью ДНК-полимеразы I и РНК-азы. После мети-лирования EcoRI и пропускания через колонку с сефарозой 6В концы ДНК затупляют с помощью Т4 - ДНК - полимеразы. Добавляют линкеры EcoRI и избыточные линкеры удаляют отщеплением с помощью EcoRI и хроматографией на Сефарозе CL 2В. ДНК, находящуюся в мертвом объеме, собирают и связывают с gt 11, расщепленной EcoRI и обработанной кишечной бычьей фосфатазой. ДНК наносят и вводят в E.coli Y1088. Обнаруживают несколько положительных результатов и фрагменты EcoRI затем субклонируют в векторы фазы М13 для дидезокси -секвентирования с использованием либо универсального праймера М13 либо спе-цифических олигонуклеотидов Фактора VII.
Таким образом, получают три новых к-ДНК - клона Фактора VII с полностью определенными последо-вательностями. Как было установлено, большая часть этих к-ДНК из клона, обозначенного VII2463, содер-жит полную кодирующую последовательность Фактора VII. Этот клон включает в себя 35 нуклеотидов не-транслируемого 5-участка, 180 нуклеотидов, кодирующих 60 аминокислот лидерного участка, 1218 нуклео-тидов кодирующих 406 аминокислот нативного белка, стопкодон, 1026 нуклеотидов нетранслируемой 3-последовательности и 20 оснований poly (A) - конца (начиная с позиции 2463). Обе нити этой к-ДНК - полно-стью секвентировали. Сравнение ее с двумя к-ДНК, выделенными ранее из клонов VII2115 и VII1923, пока-зывает, что клон VII2463 содержит дополнительно 321 нуклеотид выше вставки в VII2115 и 519 нуклеоти-дов выше вставки в VII1923. Перекрывающиеся последовательности VII2463 Фактора VII и эти две предыдущие к-ДНК совпадают, за исключением того, что к-ДНК VII2463 не содержит делецию одного ос-нования в позиции 1005 и 1106, обнаруженную в к-ДНК, VII2115. Таким образом, VII2463 содержит в од-ном фрагменте EcoRI к-ДНК Фактора VII, кодирующую лидерный участок Фактора VII и последовательно-сти зрелого белка.
Была выделена дополнительная к-ДНК, VII565, которая, как было установлено, содержит 5-концевые последовательности Фактора VII, но усечена в кодирующих последовательностях. Ее 5 - окончание соответ-ствует нуклеотиду 9 (рисунок 1).
По сравнению с полномерной VII2463, VII565 лишена, как было установлено, последовательности, соответствующей одному экзоноподобному участку в лидерной последовательности. В VII565, отсутству-ют основания 100-165 (рисунок 1b). Отсутствующие последовательности точно соответствуют одному экзо-ноподобному участку по данным геномной последовательности (как описано в примере III). Таким образом, структура VII565 может быть следствием альтернативных стадий сплайсинга в лидерной последовательно-сти.
Лидерная последовательность, закодированная в VII2463, является исключительно длинной (60 ами-нокислот) и имеет совершенно другой гидрофобный профиль, чем Фактор IX, протеин С и протромбин. Эта лидерная последовательность содержит два остатка метионина, в положениях - 60 и - 26. Наиболее вероятно, что инициирование начинается с первого остатка метионина, так как гидрофобный участок, типичный для сигнальных пептидов, начинается с метионина в положении - 60, а не с метионина с положении - 26. Интерес-но, что последовательности, отсутствующие в VII565 и точно соответствующие экзоноподобному участку в геномном клоне, дают лидерную последовательность из 38 аминокислот с гидрофобной структурой, более близкой к структурам вышеуказанных белков.

Пример 2. Аминокислотная последовательность человеческого Фактора VII.
Расшифровка аминокислотной последовательности человеческого Фактора VII нужна для подтвержде-ния идентичности полученных к-ДНК - клонов, правильности последовательности к-ДНК Фактора VII, для получения информации, позволяющей синтезировать специфические олигонуклеотидные пробы для отбора к-ДНК и геномных библиотек для клонов, содержащих 5-последовательность для конструирования синтетиче-ского фрагмента, кодирующего аминоконцевой участок Фактора VII.
Очищенный человеческий Фактор VIIа восстанавливают и карбоксиметилируют. Малую и большую полипептидные цепи карбоксиметилированного Фактора VIIa разделяют жидкостной хроматографией высо-кого давления (ЖХВД) на колонке с обращенной фазой Micro Pack C18 (Varian Corp), создавая градиент 0,1% TFA в дистиллированной воде (А) и 0,1% TFA в ацетонитриле (В), 0-40% В в течение 5 мин, 40-80% В в тече-ние 25 мин и 80-100% B в течение 5 мин. Приблизительно 300 пикомолей каждой пептидной цепи анализиру-ют автоматизированным разложением по Эдману с использованием Gas Phase Protein Seguencer (Applied Biosystems Inc.). В аминоконцевом участке большой и малой полипептидных цепей идентифицируют соот-ветственно 18 и 29 остатков. Аминоконцевая последовательность большой цепи фактора VIIa согласуется с последовательностью, кодируемой клоном к-ДНК pUCVII2115 (рисунок 2b). Аминокислотные остатки обо-значены в рисунках 2а и 2b одной буквой следующим образом, А-аланин, С-цистеин, D-аспарагиновая кис-лота, Е-глутаминовая кислота, F-фенилаланин, М-метионин, N-аспарагин, Р-пролин, О-глутамин, R-аргинин, S-сенин, Т-треонин, V-валин, W-триптофан, Y-тирозин, X-неизвестный остаток, G-глицин, H-гистидин, I-изолейцин, K-лизин, L-лейцин  указывает на то, что остатки Gla () предполагаются на основании гомоло-гичности структур других известных факторов свертывания и отсутствия каких-либо других фенилтиогид-рантоинаминокислот в этих позициях. Прочерки (-) введены для лучшего сопоставления последовательно-стей. Кроме того, информация указывает на то, что аминокислоты в положениях 5 и 9 являются лизинами, а не треонином и аргинином, соответственно, как докладывалось ранее (Кисиел и Мак-Маллен, см.). Анализ последовательности малой цепи фактора VIIa, происходящей из аминоконцевого участка Фактора VII, огра-ничен приблизительно 6 остатками до перекрывания со структурой, кодируемой 5-окончанием к-ДНК клона рUCVII2115.
Для получения дополнительных данных по последовательности, два наномоля карбоксиметилирован-ной малой цепи расщепляли 12 час бычьим химотрипсином (1:100 вес/вес, фермент: субстрат) в 0,1 М бикар-бонате аммония при рН = 7,8 и 37 С. Получение фрагменты очищают ЖХВД на колонке с обращенной фазой Micro Pack C18 с использованием указанных выше растворителей в градиенте 0-30% в течение 5 минут, 30-60% B в течение 25 мин. и 60-80% B в течение 10 мин. Пептиды идентифицируют по их УФ-поглощению при 220 и 280 нм. Лиофилизованные пептиды (приблизительно по 1 наномолю каждого) анализируют разложени-ем по Эдману. Результаты (рисунок 2b) подтверждают большую часть к-ДНК последовательности в соответ-ствующем участке клоне pUCVII2115. В целом идентифицировано 113 из 152 остатков (75%) малой цепи Фактора VIIa. Эта последовательность идентична последовательности, кодируемой известной структурой к-ДНК. Косвенные признаки указывают на то, что Аsn 145 является сайтом присоединения углевода.

Пример 3. Клонирование геномной последовательности Фактора VII
В одном подходе получения 5-концевой последовательности из к-ДНК, библиотеку лябда-фага, содер-жащую ДНК плодной печени человека, отбирают с помощью мечено-ранслируемой к-ДНК Фактора VII. Часть геномной библиотеки помещают на E.coli E392 (АТСС 33562) с получением общего количества пятен 7,2 х 10. Пятна фага адсорбируют с пластинок на нитроцеллюлозу и гибридизуют 32р меченной к-ДНК. По-лучают 8 клонов и пятна очищают.
С использованием фрагмента ДНК (EcoRIa-XbaI, рисунок 1) из 5-окончания к-ДНК фактора VII (VII2115) и стандартных методик идентифицируют эти геномные клоны, содержащие 5-концевые последо-вательности. Эти фаги обозначают как 7m, 1,7m 2 и 7m 3. Из этих рекомбинантных фагов получают ДНК и проводят предварительный анализ последовательности рестрикционными эндонуклеазами. Фаг 7m 1, имею-щий самый сильный сигнал гибридизации, используют для получения более подробной рестрикционной кар-ты и помещения на эту карту последовательностей к-ДНК EcoRI-XbaI внесением по Southern.
Для того, чтобы определить, содержит ли фаг 7m1 последовательности ДНК, кодирующие аминоконце-вые аминокислоты белка Фактора VII, пятна Southern ДНК фага после рестрикции гибридизуют смесями олигонуклеотидов, чьи последовательности рассчитывают из аминоконцевой аминокислотной последова-тельности фактора VII. Олигонуклеотиды ZC188 ZС360 и ZС401 (таблица 1) радиоактивного метят Т4 - по-линуклеотидкиназой и гибридизуют в пятна ДНК фага при температуре, на несколько градусов более низкой, чем их Тm. Результаты этого анализа показывают, что фрагмент 7m1 Sst 1 длиной 3,7 кидобазы содержит последовательности, гибридизованные этими олигонуклеотидами. Этот фрагмент Sst 1 субклонируют в М13 для анализа последовательности ДНК. Результаты, полученные с использованием ZC360 в качестве прайме-ра секвентирования, идентифицируют область длиной приблизительно 60 нуклеотидов, что соответствует данным по аминоконцевой последовательности белка.
Таблица 1

Олигонуклеотид Последовательность
ZC87 ТСС СAG TCA CGA CGT
ZC188 GCC GGG CTCA CTC CTC CA GAA GGG GTTGG

ZC212 GAC CTG CAG GAT CCA TGC AGC TGA ACA TGA GCG CTG
ZC213 GAG GCC TGG TGA TTC TGC CAT GAT CAT GTT CAG GCG CTG
ZC217 ATG AGA AGC GCA CGA AG
ZC218 CTC TGC CTG CCG AGC
ZC235 GAT CCA TGC AGC GC
ZC249 AGA ACA GCT TTG TTC TTT CA
ZC275 GCC CCC ATT CTG GCA
ZC286 CCA AAG AGG GCC AAC GCC TTC CTG GAG GAG AGA CCT GGG
AGC CTG GAG AGA GAG TGT ATT GAG G
ZC287 AAT ACA CTC TCT CTC CAG GCT CCC AGG TCT CTC CTC CAG
GAA GTT GGC CCT CTT TGG
ZC288 AGC AGT GTA GCT TCG AGG AGA ACA GAG AGG TTT TCG AGG
CCA GCG ACG
ZC289 AAT TCG TCG CTG GCC TCG AAA ACC TCT CTG TTC TCC TCG
AAG CTA CAC TGC TCC
ZC333 CAG CTT CGT CCT GTC GCT GGC CTC
ZC336 CCT CTT CGG GCC TGG TGA
ZC360 CA TC TC TC TT CA

ZC401 CGT AGC GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG GGC
CTC CTC GAA GCT ACA C

Так как известно, что геномный клон 7m1 содержит последовательности длиной 7 килобаз выше экзона 2, то этот клон участвует в кодировании нетранслируемых 5-последовательностей фактора VII и лидерных последовательностей до аминокислотной позици - 17. Для подтверждения того, что экзон 1 закодирован в геномном клоне 7m1, используют информацию о лидерной последовательности из клонов VII2463 и VII5656 для расчетов олигонуклеотидов ZC528 и ZC529 (см.ниже).
ZC528 5TCA ACA GGC AGG GGC AGC ACT GCA GAG ATT3
ZC529 5TTC CAC GGC ATG TCC CGT GTT TCT CCT CCT3
Это используют для пробы ДНК 7m1 и, как установлено, сублкон 7SD гибридизован обоими этими оли-гонуклеотидами. Устанавливают, что экзон 1 состоит из двух экзонных последовательностей: экзона 1а, гибридизованного ZC528 (соответствует нуклеотидам 1-30 в VII2463) и экзона 1b гибридизованного ZC528 (соответствует нуклеотидам 119-148 в VII2463). Секвентируют последовательности интрона, примыкающие к обоим экзонам 1а и 1b : 1а содержит согласованную донорную последовательность сплайсинга в 3-окончании экзона, а к каждому концу 1b примыкает акцептор согласованного сплайсинга (выше 1b) или до-норная последовательность (ниже 1b). Точно определяют положение экзона 1а в геномной клоне 7m1, и определяют наличие экзона 1b в определенном участке. Последовательности экзона 1b присутствуют в VII2463, а VII565, как оказалась, происходит из РНК, помещенной между экзоном 1а и экзоном 2, с внеш-ней петлей последовательности экзона 1b.
Получают различные 7m1 - субклоны в рUC и М13 - векторах для облегчения секвентирования осталь-ных экзонов. Соответствующие олигонуклеотиды получают из последовательностей к-ДНК, соответствую-щих экзонам 1-7 и используют их для последовательностей всех экзонов кроме последнего экзона. Геномная последовательность точно соответствует последовательностям к-ДНК на этих участках. Кроме того, были определены связывающие участки интрон/экзон для экзонов 1-7, и в настоящее время для большинства из них точно определено место в клоне 7m1. Размеры и положение интронов в гене Фактора VII перечислены в таб-лице 2.
Таблица 2

Интрон Аминокислотная позиция Размер нитрона
(килобаз)
А -39 0,2
B -17 1,0
C 37/38 1,92
D 46 0,068
E 84 ~2
F 131 ~1
G 167/168 0,56
H 209 1,31


Как известно, фаг 7m1 лишен 3-окончания Фактора VII, включающего в себя экзон 8. Для получения этих последовательностей и 12-13 килобаз - обогащенную библиотеку Bam HI в L 47,1, полученную из пер-вичных фибробластов кожи человека вводят пробу с двумя транслируемыми с меткой фрагментами Pst I к-ДНК фактора VII (соответствует последовательностям экзона 7 и нетранслируемым 3-последовательностям). Клон, обозначенный как 7DCI, определяют по обеим пробам. Последующим анализом с помощью рестрикционных эндонуклеаз и анализом пятен по Southern устанавливают, что клон 7CDI пере-крывается и простирается на приблизительно 3 килобазы за окончание клона 7m1 и что он содержит экзон. Фрагмент длиной 3,9 килобазы (ХbaI-BamHI) из ДНК 7DCI, содержащей экзон 8, субклонируют в М13 и проводят анализ последовательности с помощью олигонуклеотидов, комплементарных окончаниям 5 и 3. В этом клоне присутствует полная экзонная последовательность.
Пример 4. Гибридные гены фактор IX - фактор VII, содержащие синтезированную кодирующую после-довательность
А. Конструирование последовательности: гибридный лидерный участок Фактора IX - синтетическая по-следовательность, кодирующая 5-участок Фактора VII.
Вторым подходом для получения 5-кодирующей последовательности Фактора VII является синтез со-ответствующего двунитевого фрагмента с использованием нуклеотидной последовательности, рассчитанной на основании аминоконцевой аминокислотной последовательности Фактора VII, аминокислотных последо-вательностей других зависимых от витамина К факторов свертывания и известных нуклеотидных последова-тельностей генов других зависимых от витамина К факторов свертывания. Для получения нужных сигналов секретирования и переработки для секреции аналога зрелого фактора VII, этот синтетический фрагмент (со-гласованная последовательность) соединяют с одним из двух лидерных участков, полученных из клона к-ДНК фактора IX. Этот подход иллюстрируется на рисунке 3.
к-ДНК, кодирующую человеческий фактор Х, получают из бибилиотеки м-РНК из печени человека. По-следовательность фактора IX выделяют из вектора рBR - 322 расщеплением Pst I и вводят в сайт Pst I pUC13. Эту плазмиду обозначают FIX-рUC13. Для удаления G-обогащенного участка, присутствующего в 5-окончании вставки Фактора IX в результате клонирования к-ДНК, в 5-окончание клонированного фрагмента вводят синтетический олигонуклеотидный адаптер. Олигонуклеотиды ZC212 и ZC213 (таблица 1) синтези-руют и ренатурируют с получением перекрывания в 22 пары оснований, концы фрагмента заполняют и раз-резают подходящими рестрикционными эндонуклеазами, и результирующий фрагмент присоединяют к по-следовательности Фактора IX.
Для конструирования адаптера по 100 микомолей каждого из ZC212 и ZC213 линофилизуют и повторно суспендируют в 10 мкл 10 х киназа/лигаза буфера (600 мМ Трис, рН = 8,0 100 мМ хлорида магния, 100 нано-молей DTT) плюс 86 мкл воды. Реакцию ренатурации проводят при 65С в течение 10 мин, смесь медленно охлаждают до комнатной температуры и помещают на лед. К этой смеси прибавляют 4 мкл смеси 2,5 мМ dNTP и 1 мкл (8 единиц) Т4 - ДНК полимеразы. Реакцию проводят в течение 45 минут при 14С. Прибавляют 10 мкл 5М ацетата аммония и ДНК экстрагируют один раз смесью фенол/хлороформ и дважды хлорофор-мом, и осаждают этанолом. ДНК центрифугируют и суспендируют в 100 мкл среднего солевого буфера (Maniatis и др., см., р.100) расщепляют 9 ед. Pst I и 8 ед. Cfo I и экстрагируют так, как описано выше.
Затем конструируют модифицированную последовательность Фактора IX соединением 0,16 пикомоля синтетического адапторного фрагмента Pst I - Cfo I 0,14, пикомоля фрагмента Cfo I - BamHI Фактора IX дли-ной 1,4 килобазы из FIX-pUC13 и 0,14 пикомоля векторного фрагмента Bam HI - Pst I pUC13 длиной 2,7 кило-базы в 20 мкл реакционной среды, содержащей 60 мМ трис TCI, pH=7,5; 10 мМ, хлорида магния, 10 мМ DTT и 0,9 ед. Т4 - лигазы. Реакционную смесь инкубируют 3 часа при комнатной температуре и используют для трансформирования Е.coli JM83. Клетки помещают на пластинки с 50 мкл 2% X-gal (5-бром-4-хлор-3-индонил--D-галактозид) в L - бульен, содержащий 40 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37С в течение ночи. Белые колонии отбирают на другую пластинку, содержащую ампициллин и выращивают при 37С в течение ночи. Колонии помещают на бумагу Ватман 540, и бумагу готовят для гибридизации. Бумагу инку-бируют при 44С в течение 2 час в 0,9 М NaCI, 0,09 M Трис - HCI, рН = 7,5 6 мМ ЭДТУК, 0,5% Nonidet P-40, 150 мкг/мл т-РНК. E.coli. Бумагу метят 32р меченным ZС235 (Таблица 1), 14-мером, специфическим для изме-ненной 5-концевой последовательности. Гибридизацию с 1-2 х 106 имп/мин на фильтр проводят при 44С в течение ночи в буфере предгибридизации. Затем фильтры промывают 3 раза в 6 х SSC, 0,1% SDS при 4С и 3 раза в 2 х SSC, 0,1% SDS 44С и помещают на рентгеновскую пленку. Обнаруживают два положительных клона. Один из этих клонов обозначают FIX (-G)  pUC13.
Для подтверждения последовательности измененного участка Фактора IX, входящего в конструкцию FIX (-G)  pUC13, проводят секвентирование непосредственно плазмиды с использованием обратного прай-мера BRL и с использованием конца праймера, меченого полинуклеотидкиназой и 32 Р АТР. Последователь-ность соответствует предсказанной.
Результирующая рекомбинантная плазмида содержит три сайта расщепления Нае III, первый в положе-нии 39 последовательности Фактора IX (нумерация основана на последовательности, опубликованной Anson и др., (см.), начиная с первого ATG), второй в положении 130 и третий в полилинкере pUC13. Сайт в положе-нии 130 является одной парой оснований выше кодонов для сайта расщепления Lys-Arg молекулы Фактора IX. В результирующей конструкции гибрида Фактор IX - Фактор VII лидерная последовательность Фактора IX, оканчивающаяся в положении 39 или 130, соединена с синтетическим двунитевым фрагментом, содержа-щим предсказанную согласованную последовательность и последние 3 кодона лидерной последовательно-сти фактора IX.
Синтетический согласованный фрагмент получают соединением олигонуклеотидов ZC286 - ZC289 (таб-лица 1) с образованием двунитевого фрагмента. По 100 пикомолей каждого олигонуклеотида лиофилизуют и суспендируют в 10 мкл 1 х киназного буфера и инкубируют в течение ночи при 4С, затем нагревают при 65С в течение 10 мин. Обработанные киназой олигонуклеотиды делят на две части. Первая часть содержит ZC286 + ZC287, часть 2 содержит ZC288 + ZC289. Соединенные пары ренатурируют 10 мин при 65С, охла-ждают до комнатной температуры в течение 2 час и помещают на лед на 30 мин.
Фрагмент модифицированного Фактора IX удаляют из FIX(-G) pUC13 в виде фрагмента Hind III-EcoRI. Приблизительно 20 мкг плазмиды расщепляют 30 ед каждого из Hind III и EcoRI в 100 мкл буфера Hind III (BRh), содержащего 4 мкг РНК-азы А, при 37С, в течение ночи. Реакцию обрывают нагревом при 65С в те-чение 10 мин, и вектор и фрагменты фактора IX подвергают электрофорезу на 10% агарозном геле и очища-ют электроэлюированием. Фрагмент Фактора IX осаждают этанолом, суспендируют в буфере, содержащем РНК-азу А в концентрации 400 нкг/мкл и расщепляют 9 ед. Hae III в течение ночи при 37С. Фрагмент Hind III - Нае III Фактора IХ длиной 39 пар оснований выделяют из этого перевара электрофорезом на 1,5% ага-розном геле с последующим электроэлюированием. Для получения фрагмента Фактора IX Hind III - Hае III длиной 130 пар оснований FIX - pUC13 расщепляют с помощью EcoRI и Hind III и фрагмент Фактора IX вы-деляют так, как описано выше. Приблизительно 3 мкг этого фрагмента Hind III - EcoRI расщепляют 6 ед. Hае III при 37С и в раствор, содержащий 50 мМ ЭДТУК, отбирают аликвоты с интервалами 5 мин в течение 30 мин. Аликвоты соединяют и фрагмент Hind III и Hае III длиной 130 пар оснований очищают электрофорезом на 5% акриламидном геле с последующем электроэлюированием.
Результирующие гибридные согласованные последовательности фактора IX получают соединением че-тырех частей, олигонуклеотидных частей 1 и 2, фрагмента Hind III - Hае III фактор IX (длиной 39 или 130 пар оснований) и фрагмента Hind III - EcoRI и pUC13. Результирующие плазмиды используют для трансфор-мирования Е.coli HB101 ATCC 33684). Колонии отбирают расщеплением ДНК с помощью EcoRI и Hind III. Последовательность, содержащую участок фактора IX длиной 39 пар оснований, соединяют с синтетической согласующей последовательностью и эту конструкцию далее называют мини-FIX-FVII. Плазмиду, содержа-щую такую конструкцию, обозначают рМ7200 (-с). Последовательность, содержащую последовательность фактора IX длиной 130 по, соединенную с синтетической согласующей последовательностью обозначают макси-FIX-VII. Плазмиду, содержащую эту конструкцию, обозначают рМ7100(-С). Согласующая последова-тельность кодирует полипептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность:
Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-Gla-Gla-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-Gla-Arg-Gla-Cys-Lys-Gla-Glu-Cys-Ser-Phe-Gla-Gla-Ala-Arg-Gla-Ile-Phe-Gla-Gly-Leu-Asn-Arg-Thr-Lys-Leu.
B. Присоединение гибридного фрагмента согласованной последовательности фактора IX к клону к-ДНК фактора VII.
Гибриды согласованного участка Фактора IX (либо мини, либо макси) присоединяют к 5-участку к-ДНК фактора VII и вектору pUC13 связыванием трех частей (рисунки 4 и 5). Фрагмент вектора получают расщеплением 6 мкг pUC13 10 ед. каждого из XbaI и Hind III в Hind III - буфере, содержащем РНК-азу А (400 нг/мкл). Фрагмент мини-FIX-FVII получают расщеплением 2 мкг рМ7200 (-С) 10 ед. каждого из Hind III и EcoRI, как указано выше. Фрагмент макси-FIX-FVII аналогичным образом получают из рМ7100 (-С). 5-участок к-ДНК фактора VII получают из плазмиды (pUCC705), содержащей 5-фрагмент EcoRI-XbaI pUCVII2115, субклонированной в pUC13 расщеплением с помощью XbaI и EcoRI. Расщепление проводят при 37С в течение 2 час и продукты разделяют электрофорезом на 1,5% агарозном геле. Целевые фрагменты электроэлюируют, экстрагируют смесью фенол/хлороформ и хлороформом и осаждают этанолом. Три фраг-мента, а именно pUC13/XbaI-Hind III, Фактор IX - Фактор VII (мини или макси) (Hind III - EcoRI и 5-Фактор VII-/EcoRI-XbaI связывают затем в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 2 мкл 20 мМ АТР и 0,9 ед Т4 - ДНК - лигазы в течение ночи при 4С. Колонии отбирают рестрикционным анализом с помощью Hind III и XbaI. Рекомбинантные плазмиды, содержащие мини- и макси- FIX-FVII последовательности обозначают, соответ-ственно, рМ7200 и рМ7100 (рисунок 4).
Так как при получении к-ДНК Фактора VII использовалось прибавление линкера, то нужно провести модификации слитых последовательностей для получения правильной структуры кодирующих последова-тельностей. Как мини-, так и макси- стыки содержат сайт EcoRI в соединении между гибридом согласованной последовательности Фактора IX и к-ДНК Фактора VII, и это артефакт реакции клонирования к-ДНК. Кроме того, министык требует прибавления С для изменения последовательности в сайте Нае III от 5AGGCCA3 до 5AGGCCCA3 и установления правильной структуры считывания ниже этой последовательности. Эти коррек-тирующие изменения проводят нуклеотид-направленным сайт-специфическим мутагенезом Фрагмент мини-FIX-FVII удаляют из рМ7200 расщеплением с помощью Hind III и XbaI и вставляют в m13mp19. Фрагмент макси-FIX-FVII очищают от рМ7100 и субклонируют аналогичным образом. Мутагенные праймеры ZC333 и ZC336 (см. таблицу 1) используют для удаления сайта EcoRI и, соответственно, вставки основания. В каждом случае используют универсальный праймер ZC87 в качестве второго праймера. Мутагенные праймеры фос-форилируют, соединяя 40 пикомолей праймера и 60 пикомолей АТР с 1 ед. Т4 - ДНК - киназы на ночь при 60С. Для удаления сайта EcoRI из гибрида макси-FIX-FVII, 1 мкг однонитевой матрицы М13 соединяют с 20 пикомолями каждого из ZC333 и ZC87 в общем объеме 10 мкл. Праймеры ренатурируют на матрице в тече-ние 10 мин при 65С, охлаждают до комнатной температуры в течение 5 мин, затем помещают на лед на 5 мин. Праймеры увеличивают с помощью ДНК-полимеразы 1 (фрагмент Klenow). Для удаления сайта EcoRI и корректировки структуры считывания в гибриде мини-FIX-FVII, 1 мкг подходящей однонитевой матрицы М13 соединяют с 20 пикомолями каждого из ZC333, ZC336 и ZC87. Реакции ренатурации и увеличения праймера проводят так, как описано выше. Пятна отбирают с помощью 32Р - меченного праймера (ZC333 или ZC336) при 60С и подтверждают последовательности дидезокси - секвентированием. Результирующие конструкции, содержащие макси- и мини- FIX-FVII последовательности, обозначают соответственно рМ7111 и рМ7211.
Согласованная последовательность содержит несколько участков, не совпадающих с данными по по-следовательности белка, полученными для Фактора VII (рисунок 2). Для получения последовательности, кодирующей полипептид, обладающий большей гомологичностью к аминоконцевому участку Фактора VII, согласованную последовательность изменяют олигонуклеотиднаправленным сайт-специфическим мутагене-зом. Вводят изменения, заключающиеся во введении лейцина в положение 8, замене лизина на изолейцин в положении 18 (цифры соответствуют позиции аминокислоты после введения в позицию 8), аланина на аспа-рагин в позиции 26 и последовательности Gly-Leu-Asn на Ala-Ser-Asp в позициях 32-34 (на основании предва-рительных данных по аминокислотной последовательности).
Изменения последовательности в положениях 8 и 18 проводят с использованием рМ7111 (принимающая нить) в качестве матрицы. Праймеры ZС352 (5 ССС AGG TCT CAG CTC CTC CAG3) ZC353 (5 CTG CTC CTC CTT ACA CTC TCT 3) ренатурируют на матрице и расширяют так, как описано выше. Результирующий клон фага обозначают рМ7114. Последовательность вставки в рМ7114 подтверждают дидезокси-секвентированием.
Аналогичным образом вносят изменения в положения 26-34 в матрице рМ7114 (принимающая нить) с использованием мутагенного праймера ZC366 (5 СAG CTT CGT CCT GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG GGC CTC CTC GAA 3) и ZC87 (таблица 1) в качестве второго праймера. Результирующую конструкцию обо-значают рМ7115. Последовательность всех 550 по вставки в векторе М13 определяют дидезокси - секвенти-рованием и устанавливают, что она является правильной.
Пример 5. Конструирование слитой к-ДНК Фактор IX - Фактор VII
Слитую к-ДНК Фактора VII получают с использованием к-ДНК фактора IX, полученной из библиотеки к-ДНК печени человека и последовательности к-ДНК Фактора VII, описанной в примере 1.
Точка слития, выбранная для гибридного белка, находится между аминокислотой +38 (треонин) Факто-ра IX и первым лизином, закодированным последовательностью к-ДНК Фактора VII. Такой белок может быть закодирован последовательностью, состоящей из первых 252 по последовательности к-ДНК Фактора IX и всей последовательности к-ДНК Фактора VII pUCVII2115, за исключением первых двух кодонов. Для конструирования этой гибридной последовательности последовательность Фактора IX сначала сливают с pUCVII2115 с использованием обычных рестрикционных сайтов. Это связывание приводит к плазмиде FIX/VII/12 (описано выше), содержащей первые 310 по к-ДНК Фактора IX, соединенные с полной к-ДНК Фактора VII. Для достижения точной стыковки, нужной для гибридного белка, инвертированные пары осно-ваний удаляют олигонуклеотиднаправленным мутагенезом.
Соединение последовательности к-ДНК Фактора IX с последовательностью к-ДНК Фактора VII дости-гается связыванием фрагмента Hind III-Aha III длиной 0,3 килобазы из FIX (-G)  pUC13 (пример 4) с фраг-ментом Sma I-Hind III длиной 4,7 килобазы из pUCVII2115 (рисунок 5). Фрагмент Hind III - Aha III получают расщеплением 3 мкг FIX (-G)  pUC13 40 ед. Hind III в 40 мкл среднего солевого буфера (Maniatis и др., см) при 37С в течение 4 час. Объем затем увеличивают до 100 мкл солевого буфера и прибавляют 5 ед. Aha III и инкубирование продолжают при 37С в течение 18 час. Фрагменты ДНК отделяют электрофорезом на 1% агарозе и полосу 0,3 килобазы выделяют так, как описано выше. Частичное Sma I - расщепление pUCVII2115 проводят инкубированием 3 мкг pUCVII2115 при 25С в течение 1 час с 4,8 ед. Sma I в реакционном объеме 30 мкл. Реакцию обрывают инкубированием в течение 15 мин при 65С. Затем образец экстрагируют один раз равным объемом фенола и осаждают этанолом.
Осадок собирают 10 мин микроцентрифугированием, промывают 70% этанолом и сушат на воздухе. ДНК снова растворяют в 30 мкл среднего солевого буфера и разлагают 30 ед. Hind III при 37С в течение 3 час ДНК подвергают электрофорезу на 0,7% агарозе и фрагмент Hind III - Sma I длиной 4,7 килобазы выде-ляют так, как описано выше. Эквимолярные количества двух фрагментов (0,048 пикомоля) связывают в 10 мкл реакционной среды, содержащей 50 мМ Трис-HCI, рН-7,5,10 мМ хлорида магния, 1 мМ DTT, 1 мМ АТР и 3 ед. Т4 - ДНК лигазы при 14С в течение 3,5 час и затем используют для трансформирования E.coli RRI (АТСС 31343). Клетки выращивают на ампициллиновых пластинках и 12 из результирующих колоний отби-рают рестрикционным ферментативным расщеплением на присутствие целевой плазмидной конструкции. ДНК из колонии 12 (FIX/VII/12) дает ожидаемую модель рестрикционного ферментативного расщепления и используется в следующей стадии конструирования гибридного гена.
Олигонуклеотиднаправленный мутагенез проводят на матрице однонитевой ДНК. Таким образом, необ-ходимо клонировать слитые последовательности Фактора IX/ Фактора VII в М13 р19. Для получения удоб-ного небольшого фрагмента ДНК фрагмент Hind III - Xba I длиной 640 пар оснований выделяют из FIX/VII/12. Этот фрагмент содержит 310 пар оснований 5- конца - к-ДНК Фактора IX и 330 пар оснований последовательности Фактора VII. Получают вектор расщеплением 1 мкг ДНК М13 р19 RF с помощью 20 ед. Hind III и 20 ед. Xba I в 40 мкл среднего солевого буфера при 37С в течение 18 час. ДНК подвергают элек-трофорезу на 1,2% агарозе и из геля выделяют фрагмент длиной 6,4 килобазы, как описано выше. 5 мкг ДНК FIX/VII/12 расщепляют 10 ед. Xba I в 40 мкл среднего солевого буфера при 37С в течение 18 час. Добавляют 12 ед. Hind III и расщепление продолжают при 37С еще в течение 7 час. Результирующие фрагменты разде-ляют электрофорезом на 1,2% агарозе и фрагмент 640 по элюируют так, как описано выше. 10 нг линеаризо-ванного М13 mp19 и 1 нг фрагмента 640 по связывают при 14С в течение 1 час и затем используют для трансформирования E. coli JM101. Клетки покрывают X-gal и IPTG, и 8 синих пятен отбирают и используют для заражения 2,5 мл культуры E.coli JM103 при А600=0,3. После 18 час выращивания при 37С клетки соби-рают центрифугированием в клинической центрифуге при комнатной температуре и 20 мкл супернатанта, содержащего фаг М13, смешивают с 10 мкг/л этидий бромида. По сравнению с известными стандартами каж-дый из 8 клонов имеет вставку примерно нужного размера. Затем получают однонитевую ДНК из 1,5 мл су-пернатанта. Эту конструкцию затем секвентируют дидезоксиспособом с использованием олигонуклеотида ZC87 в качестве праймера для подтверждения того, что соединение вставки правильно. Один из правильных клонов (#4) используют в качестве матрицы в олигонуклеотиднаправленном мутагенезе для получения функ-ционального слития Фактор IX - Фактор VII.
Олигонуклеотид ZC249, 20-мер, состоящий из 10 по целевой последовательности Фактора IX и 10 по це-левой последовательности Фактора VII (таблица 1) используют в качестве мутагенного праймера. В каче-стве второго праймера используют олигонуклеотид ZC87, гибридизующий последовательность М13 mp19.
Использованная методика мутагенеза является модификацией методики Zoller и Smith (см.). Для ренату-рации 20 пикомолей С249 фосфорилируют инкубированием в течение ночи при 4С в 20 мкл 60 мК Трис-НСI, pH=8,0, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ DTT, 1 мМ АТР, 1 ед. Т4-киназы. Реакцию обрывают инкубированием при 65С в течение 15 мин и образец леофилизуют. Один пикомоль однонитевой матрицы клона #4 и 20 пи-комолей ZC87 прибавляют в 10 мкл ренатирурующего буфера (200 мМ Трис-HCI, pH=7,5, 100 мМ хлорида магния, 500 мМ хлорида натрия, 10 мМ DTT). Образец нагревают при 65С в течение 10 мин, инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин и затем помещают на лед. К образцу прибавляют 10 мкл следующего свежеприготовленного раствора: 20 мМ Трис-HCI, рН=7,5, 10 мМ хлорида магния 10 мМ DTT, 1 мМ dNTPs, 1 мМ АТР 0,15 ед/мкл Т4-ДНК-лидазы, 0,25 ед/мкл ДНК-полимеразы 1 E.coli (фрагмент Klenow). Затем реакци-онную смесь инкубируют при 15С течение 3 час и образец используют для трансформирования E.coli JM101.
Результирующие пятна наносят на нитроцеллюлозу и отбирают гибридизаций на 32р-меченном ZC249. Сухие фильтры ВА85 (0,45 мкм) наносят на пластинки агара, и фагу позволяют абсорбироваться в течение 5 мин. Фильтры удаляют, сушат в течение 5 мин, помещают на бумагу Ватман 3 мМ, насыщают в 0,5 М NaOH 1,5 M NaCI в течение 5 мин, сушат на воздухе 3 мин, помещают на бумагу Ватман, насыщают в 1 м Трис-HCI, pH=8. 1,5 M NaCI в течение 5 мин, и сушат на воздухе 3 мин. Стадию с Трис-HCI повторяют и фильтры промывают в 100 мл 6 х SSC в течение 2 мин при комнатной температуре. После высушивания на воздухе фильтры выдерживают при 80С в течение 2 час и предгибридизируют при 47С (Тm-4 для ZC249) в течение ночи в 6,7 х SSC, pH = 6,6, 2 мг/мл т-РНК E.coli и 0,2% (вес./объем) каждого из БСА Ficoll и поливинилпироли-дина.
После предгибридизации фильтры инкубируют при 2,5 х 106 имп/фильтр меченным ZC249 в том же са-мом буфере гибридизации SSC при 47С в течение ночи. После гибридизации фильтры промывают 3 раза по 5-10 мин при комнатной температуре в 6 х SSC и помещают на рентгеновскую пленку. Пятна с предваритель-ным положительным результатом снова помещают на пластинки и отбирают так, как описано выше. Затем отбирают индивидуальные пятна и получают однонитевую ДНК и секвентируют с использованием ZC275 в качестве праймера. Олигонуклеотид ZC275 соответствует последовательности 40 по в 5-направлении ZC249 в той же самой нити (таблица 1).
Идентифицируют 4 положительных пятна. Полную вставку в М13 mp19 для одного клона (FIX/VII-9) се-квентируют дидезоксиспособом с использованием олигонуклеотидов ZC87 и ZC275 и устанавливают ее пра-вильность. Подтвержденная последовательность представлена основаниями 10567 на рисунке 7. Затем PF ДНК из этого клона используют для заключительной стадии конструирования гибридного гена.
Используют три фрагмента для изготовления финальной конструкции: фрагмент 0,6 килобазы Hind III - Xba I из FIX/VII-9, содержащий слитые последовательности FIX/VII; фрагмент к-ДНК фактора VII Xba I - Bam HI длиной 1,7 килобазы из pUCVII1923, и фрагмент 2,7 килобазы Bam Hi-Hind III из pUC13.3 мкг FIX/VII-9 (RF-ДНК) расщепляют при 37С в течение 6 час с помощью 45 ед. XbaI в объеме 50 мкл ДНК. Оса-ждают этанолом, суспендируют и расщепляют при 37С в течение 4 час 50 ед. Hind III. Образец подвергают электрофорезу на 1% агарозе и полосу 0,6 килобазы электроэлюируют на бумаге NA45 (Schliecher & Schuell) ДНК. Элюирует из бумаги 1,5 М NaCI, 50 мМ Трис-HCI pH=8 1 мМ ЭДТУК, экстрагируют фенолом и оса-ждают этанолом.
Для получения оставшейся последовательности к-ДНК фактора VII 5 мкг pUCVII1923 расщепляют при 37С в течение 3 час 36 ед. XbaI в 40 мкл среднего солевого буфера. Затем прибавляют 8 мкл 10 х крепкого солевого буфера, 28 мкл воды и 4 мкл (40 ед) Bam HI в реакционную смесь инкубируют при 37С в течение 3 час. Фрагменты ДНК разделяют электрофорезом в 1% агарозе и выделяют фрагмент 1,7 килобазы, так как описано выше.
Фрагмент вектора получают расщеплением 1 мкг pUC13 10 ед. Hind III в 20 мкл среднего солевого бу-фера при 37С в течение 1 час. Затем прибавляют 1 мкл 10 х крепкого солевого буфера и 10 ед Bam HI и инкубирование продолжают еще в течение 2 час ДНК очищают на 1% агарозном геле так, как описано выше.
Эквимолярные количества (приблизительно 0,56 пикомоля) трех фрагментов связывают при комнатной температуре в течение 45 мин в 10 мкл 50 мМ Трис-HCI, pH=7,5, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ DTT, 1 мМ АТР и 3 ед. Т4 - ДНК - лигазы. Реакционную смесь используют для трансформирования E.coli JM 83. Клетки поме-щают на среду, содержащую 40 мкг/мл ампициллина с 50 мкл 2% X-gal, добавленными в каждую выемку. ДНК получают из 7 белых колоний и затем отбирают расщеплением рестрикционными ферментами. Один из клонов, обнаруживший правильную структуру, обозначается FIX/VIIpUC13.
Пример 6: Экспрессия биологически активных аналогов Фактора VII
Вектор pD2 экспрессии клеток млекопитающих был выбран для экспрессии гена FIX/VII в трансформи-рованных клетках животных. Его конструируют из плазмиды pDHFR-III следующим образом. Сайт Pst/I, примыкающий к D HFR-к-ДНК в pUHFR III превращают в сайт Bam HI обычным связыванием. ДНК pDHFR III инкубируют с 10 мМ трис с рН = 7,6, 6 мМ -MSH 6 мМ NaCI, 10 мМ хлорида магния и 2,5 ед. Pst I в тече-ние 10 мин при 37С с последующей экстракцией фенолоом и осаждением этанолом. Липкий конец Pst I за-тупляют с использованием Т4 - ДНК - полимеразы. После экстракции фенолом и диализа против 10 мМ трис-, рН = 8,0, 1 мМ ЭДТУК, 0,3 М NaCI, ДНК, осаждают этанолом. ДНК суспендируют в 20 мкл 1,4 мМ АТР 50 мМ Трис, рН=7,6, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола и затем инкубируют с 5 нг линкеров Bam HI, обработанных Т4 - полинуклеотидкиназой (New England Biolabs) и 200 ед. Т4 - полинуклеотидлигазы в тече-ние 12 час при 12С с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом. ДНК расщепляют 90 ед. Bam HI при 37С в течение 1 час и подвергают электрофорезу на 1,4% агарозном геле. Фрагмент ДНК 4,9 килобазы (соответствует ДНК рDHFR III, лишенной к-ДНК DHFR и сигнал полиадениляции SV40) электро-элюируют и рециркуляризуют с помощью полинуклеотидлигазы, после чего заражают им E.coli НВ101. Ко-лонии, чувствительные к ампициллину, отбирают экспресс-анализом, и правильный клон выращивают для получения большого количества препарата плазмидой ДНК.
Результирующую плазмиду расщепляют 20 ед. Bam HI и обрабатывают 2,5 мкг бычьей кишечной фос-фатазы, и подвергают электрофорезу на 1,4% агарозном геле. 25 мкг рSV40 (клон ДНК SV40, введенный в сайт Bam HI pBR322) расщепляют 25 ед. Bcl I в течение 1 час при 50С, затем дополнительно 25 ед. Bam HI и инкубируют еще в течение 1 час при 37С. Эту ДНК подвергают электрофорезу на 1,4% агарозном геле. Расщепленный Bam HI вектор (т.е. лишенный сигнала полиадениляции) соединяют с фрагментом ДНК SV40 (0,14-0,19 единиц карты), содержащим сигнал поздней полиалениляции инкубированием очищенных на геле фрагментов (0,1 мг каждого) в 20 мкл 50 мМ Трис, рН = 7,6, 10 мМ хлористого магния, 1 мМ дитио-треитола, 1,4 мМ АТР и 100 ед. Т4 - полинуклеотидлигазы в течение 4 час при 12С, с последующим трансформирова-нием в E.coli RRl. Положительные колонии идентифицируют экспресс-анализом и получают большое количе-ство плазмидного препарата правильной ДНК, рD2.
Для изготовления конструкции экспрессии фактора IX/VII, 1 мкг рD2 расщепляют при 37С в течение 1 час с 20 ед. Bam HI в 20 мкл крепкого солевого буфера. Добавляют 20 мкл 10 мМ Трис-HCI, pH=8, 1 мМ ЭДТУК и 0,1 ед. бычьей щелочной фосфатазы (Boeringer). Реакционную смесь инкубируют при 37С в течение 1 часа и реакцию обрывают нагревом до 75С в течение 10 мин 10 мкг FIX/VII pUC13. Расщепляют при 37С в течение 2 час с 150 ед. Bam HI в 150 мкл крепкого солевого буфера. Фрагменты ДНК разделяют электрофо-резом на 1,2% агарозе и выделяют фрагмент 2,3 килобазы. Эквимолярные количества (0,015 пикомоля) фраг-мента Bam HI, 2,3 килобазы и фрагмента вектора pD2 связывают при 14С в течение 2,5 час так, как описано выше. Реакционную смесь используют для трансформирования клеток E.coli RRl, которые затем помещают в среду, содержащую 10 мкг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК получают из 12 результирующих колоний и отбирают расщеплением рестрикционными ферментами. Один из клонов, имеющий правильную карту ре-стрикции, обозначается FIX/VII/pD2 (рисунок 6) E.coli RRl, трансформированные FIX/VII/pD2, депонированы в АТСС под номером 53068.
Методика, использованная для трансформирования клеток почек молодых хомяков (ВНК) (получено из Американской Коллекции типовых Культур) номер CCL10) с помощью FIX/VII/pD2 аналогична стандарт-ным методам. Клетки ВНК выращивают при 37С, 5% CO2, в среде Дульбекко (с добавкой 10 термоинактиви-рованной бычьей зародышевой сыворотки, глутамина и пенициллина-стрхептомицина) в чашке Петри диа-метром 60 мм для тканевых культур до заполнения 20%. В целом 10 мкг ДНК используют для заражения од-ной 60 мм чашки, 3,75 мкг FIX/VII/pD2 2, 1,25 мкг рКО-neo и 5 мкг ДНК из спермы лосося. ДНК осаждают в 0,3 М ацетата натрия, 75% этаноле, промывают 70% этанолом и снова растворяют в 20 мкл 10 мМ Трис-HCI, pH=8, 1 мМ ЭДТУК. ДНК соединяют с 440 мкл воды, 500 мкл 250 мМ NaCI, 1,5 мМ NaHPO4. 12 мМ декстро-зой и 50 мМ HEPES pH 7,12, 60 мкл 2 М CaCI2 по каплям добавляют при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем раствор прибавляют к клеткам и клетки выдерживают 4 час при 37С. Среду удаляют и в течение 2 мин при комнатной температуре прибавляют 5 мл 20% ДМСО в среде Дульбекко с сывороткой. Затем чаш-ку быстро промывают двумя сменами среды и инкубируют в свежей среде в течение ночи. Через 24 часа по-сле прибавления ДНК среду удаляют и прибавляют селективную среду (10 мг/мл G418, 498 мкг/мгб Gibco в среде Дульбекко с сывороткой). Через 10 и 13 дней индивидуальные клоны, представляющие собой клетки, имеющие введенный рКО - neo ген и вследствие этого устройства G 418, переносят на пластинки с 96 углуб-лениями (или с 24 углублениями) и вырашивают для анализа на белок.
Клетки выращивают в среде Дульбекко плюс 10% плодной телячьей сыворотки, содержащей 5 мкг/мл витамина К(Phytonadion Merck). Среду отделяют отклеток и клеточных остатков центрифугированием и ана-лизируют на полипептид Фактора VII (с помощью ELISA) и на биологическую активность. Клетки удаляют с пластинок трипсином, промывают свежей средой, центрифугируют и замораживают при - 20С. Клеточные гранулы затем оттаивают в РВS, гранулируют и суспендируют в PBS, содержащей 0,25% Тритона Х-100. Образцы разбавляют и анализируют на полипептид и активность.
ELISA - Анализ на Фактор VII проводят следующим образом. 200 мкл моноклонального антитела про-тив человеческого фактора VII (5 мкл/мо в 0,1 М карбонате натрия, рН = 9,6), инкубируют в каждом углубле-нии микротитровальной пластины с 96 углублениями в течение 2 час при 37С. Затем углубления инкубиру-ют с 220 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05% Tween в PBS pH = 7,2, 2 час при 37С. Пластинки промывают водой, сушат на воздухе и хранят при 4С. Для анализа образцов 200 мкл образца инкубируют 1 час при комнатной температуре в углублениях, покрытых антителом. Затем углубления про-мывают 4 раза 200 мкл PBS, содержащего 0,05 Tween 20. Затем углубления инкубируют в течение 1 час при комнатной температуре с 200 мкл IgG фракции кроличьей поликлональной антисыворотки против Фактора VII (5 мкг/мл в PBS, содержащим 1% БСА и 0,05% Tween 20). Затем проводят инкубирование с козьими анти-кроличьими IgG вместе с щелочной фосфатазой. Эти углубления промывают затем четыре раза PBS, содер-жащим 0,05% Tween 20. В углубления добавляют 200 мкл пара- нитрофенилфосфата (30 мг) растворенного в диэтаноламиновом буфере (96 мл в литре), рН = 9,8, содержащим 56 мг/л хлористого магния. Ферментатив-ную реакцию проводят при 37С и появление желтого цвета регистрируют при 405 нм с использованием мо-нитора пластины ELISA. Результаты, полученные для клеточных сред, представлены в таблице 3.
Фактор VII, полученный трансфецированными клетками, может быть извлечен из клеточных культу-ральных сред путем адсорбции к цитрату бария. Истощенную среду смешивают с цитратом натрия и хлори-дом бария, и преципитат собирают. Осажденное вещество затем можно исследовать на присутствие подхо-дящего коагулирующего фактора. Дальнейшую очистку можно осуществить посредством иммуноадсорбции. Предпочтительно, чтобы иммуноадсорбционная колонка содержала высокоспецифическое моноклональное антитело. Альтернативно, очистку барий-цитрат-осажденного вещества можно осуществить при помощи более традиционных биохимических методов или путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
D) Конверсию одноцепочечного Фактора VII в активный двухцепочечный Фактор VIIa можно осуще-ствить с использованием Фактора XIIa, что приводит к получению белка, который имеет такую же или, в основном, такую же биологическую активность относительно коагуляции крови, что и человеческий Фактор VIIa или другие протеазы, имеющие трипсин - подобную специфичность.
Биологическую активность Фактора VII анализируют с использованием одноэтапного анализа коагу-лирующей активности в соответствии с обычными способами. Результаты, полученные для клеточных сред, приведены в Таблице 3.
Таблица 3

День Клеток/мл
(х10-4) Полипептид фактора
VII нг/мл Активность фактора VII
(нг/мл)
1 2,9
2,7 25 6,0
2 1,9
2,8 47 15,9
3 1,96
2,26 160 93
4 4,71 550 300
4,14
5 8,79 725 531
11,28
6 5,1
8,4 975 600
Пример 7. Экспрессия фактора IX
14 мкг FIX (G)  pUC13 расщепляют 30 ед. Bam HI в 30 мкл крепкого солевого буфера в течение 3 час при 37С. Затем ДНК подвергают электрофорезу на 1% агарозе и из геля выделяют полосу 1,4 килобазы, содержащую последовательность Фактора IX.
3 мкг вектора pD2 расщепляют 30 ед. Bam HI в 30 мкл крепкого солевого буфера в течение 3 час при 37 ДНК подвергают электрофорезу на 1% агарозе и выделяют линейный фрагмент 1,5 килобазы. Затем ДНК обрабатывают 0,12 ед. бычьей щелочной фосфатазы в 30 мкл 10 мМ Трис-HCI с рН=8 1 мМ ЭДТУК в тече-ние 30 мин при 37С. Концентрацию соли доводят до 0,3 М ацетата натрия и образец дважды экстрагируют фенолом, один раз хлороформом и осаждают ДНК этанолом. Осадок промывают 70% этанолом, сушат и растворяют в 20 мкл 10 мМ Трис-HCI, рН=8, 1 мМ ЭДТУК. Эквимолярные количества (0,02 пикомоля) двух фрагментов связывают с помощью 10 ед. Т4-ДНК-лигазы, как описано выше. Реакционную смесь используют для трансформирования клеток E.coli RRl. ДНК из 12 результирующих устойчивых к ампициллину колоний отбирают разложением рестрикционными ферментами. Один из клонов, с фрагментом 1,4 килобазы, введен-ным в нужной ориентации, обозначают как FIX(-G)pD2. Клетки E.coli RRl, трансформированные FIX(-G)pD2 депонируют в АТСС под номером 53067.
Клетки БНК совместно трансформируют FIX(-G)pD2 и рКО-neo как описано выше. Устойчивые к лекар-ству клетки выбирают и готовят для анализа ELISA и активности так, как описано в примере 6.
Анализ на биологическую активность основан на способности Фактора IX уменьшать время свертыва-ния плазмы от пациентов с дефицитом Фактора IX до нормального значения. Это осуществляют так, как опи-сано Proctor и Rapaport (Amer. J. Clin. Path, 36: 212, 1961). Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4

День Клеток/мл
(х10-4) Полипептид Фактора IX (нг/мл) Суперна-тант Осадок Активность Фактора IX (нг/мл) в суперна-танте % Активности белка в суперна-танте
1 1.65 - - - -
2 2.66 57 20 27 50%
45 20 24
3 9.69 150 60 72 58%
120 60 84
4 14.79 475 160 198 50%
225 140 150
5 50.85 875 250 408 45%
1000 260 438


Количество полипептида Фактора IX определяют с помощью ELISA в основном так же, как описано в примере 6, с использованием поликлональной кроличьей антисыворотки к Фактору IX. После инкубирования углублений с образцами, содержащими Фактор IX, углубления промывают и инкубируют 1 час при комнат-ной температуре с 200 мкл афинно очищенного кроличьего поликлонального анти-фактора IX вместе с ще-лочной фосфатазой, с разбавлением 1:1000 в PBS, содержащем 1% БСА и 0,05% Tween 20. Затем углубления промывают четыре раза с PBS, содержащим 0,05% Tween 20 и прибавляют субстрат фермента так, как опи-сано выше. Инкубирование проводят при 4С в течение ночи или 2 час при 37С.
Как показано в таблице 4, 70-80% Фактора IX (полипептида) выделяется в среду, и приблизительно 50% этого количества биологически активно. В клеточном осадке активность Фактора IX отсутствует.
Наибольшее уровни активности достигаются при прибавлении и клеточной культуральной среде витамина К (фитонадион, Merck) к концентрации 1-10 мг/мл.
Несколько дополнительных анализов проводят для демонстрации того, что клетки вырабатывают аутентичный Фактор IX. Образцы, содержащие по данным описанного выше анализа активность Фактора IX, инкубируют с плазмой, лишенной Фактора VIII, при этом не наблюдают изменения времени свертывания, и это указывает на то, что активность обусловлена аутентичным Фактором IX, а не неспецифическим сверты-вающим агентом. Этот вывод может быть дополнительно подтвержден удалением активности Фактора IX из образцов с помощью специфического антитела. От 97% до 98% активности фактора IX иммуноосаждается из клеточных супернатантов кроличьим поликлональным антителом против Фактора IX. Это антитело также осаждает свыше 99% активности Фактора IX из нормальной плазмы. Активность Фактора IX не снижается в супернатантах прибавлением кроличьего поликлонального антитела на эритропротеин.
Пример 8. Конструирование вектора экспрессии Фактора VII.
Конструируют вектор экспрессии, содержащий 5-кодирующий участок синтетического Фактора VII, соединенный с частичной к-ДНК Фактора VII. Вектор, обозначенный как рМ7135, получают вставкой по-следовательности лидерный участок фактора IX - 5-участок Фактора VII из рМ7115 и 5-последовательности Фактора VII из FIX/VII/pD2 в плазмиду рD3, содержащую расширитель SV40 и основ-ной поздний промотор аденовируса 2, а также трехчленный лидерный участок.
Плазмиду рD3 получают из плазмиды рDHFRIII. Сайт PstI, расположенный непосредственно выше по-следовательности DHFR в pDHFRIII, превращают в сайт Bcl I расщеплением 10 мкг плазмиды 5 ед. Pst I в течение 10 мин при 37С в 100 мкг буфера А (10 мМ Трис, рН=8, 10 мМ хлорида магния, 6 мМ NaCI, 7 мМ -MSH). ДНК экстрагируют фенолом, осаждают этиловым спиртом и суспендируют в 40 мкл буфера В (50 мМ Трис рН=8, 7 мМ хлорида магния, 7 мМ -MSH), содержащего 10 мМ dCTP и 16 ед. Т4-ДНК-полимеразы и инкубируют при 12С в течение 60 мин. После осаждения этанолом ДНК связывают с обработанными кина-зой линкерами Bcl I (2,5 мкг) в 14 мкл буфера С (10 мМ Трис рН=8, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ DTT, 1,4 мМ АТР), содержащего 400 ед. Т4-полинуклеотидлигазы в течение 12 час при 12С. После экстракции фенолом и осаждения этанолом ДНК суспендируют в 120 мкл буфера D (75 мМ KCI, 6 мМ Трис рН=7,5, 10 мМ хлори-стый магний, 1 мМ DTT), расщепляют 80 ед. BcI в течение 60 мин при 50С и подвергают электрофорезу че-рез агарозу. Форму III плазмидной ДНК (10 мкг) выделяют из геля и связывают в 10 мкл буфера С, содержа-щего 50 ед. Т4-полинуклеотидлигазы в течение 2 час при 12С и используют для трансформирования E.coli НВ101. Положительные колонии идентифицируют быстрым ДНК-препаративным анализом и плазмидную ДНК (обозначаемую pDHFR) получают из положительных колоний и трансформируют в dAM E.coli.
Затем получают плазмиду pD2 расщеплением pDHFR (15 мкг) и рSV40 (25 мкг) в 100 мкл буфера D с 25 ед. Bcl I в течение 60 мин при 50С, с последующим добавлением 50 ед. Bam HI и дополнительным инкубиро-ванием при 37С в течение 60 мин. Фрагменты ДНК разделяют электрофорезом на агарозном геле и выделя-ют 4,9 килобазы фрагмент pDHFR и фрагмент SV40, 0,2 килобазы. Эти фрагменты (200 нг ДНК pDHFR и 100 нг ДНК SV40) инкубируют в 10 мкл буфера С, содержащего 100 ед. Т4-нуклеотидлигазы в течение 4 час при 12С и результирующую конструкцию (pD2) используют для трансформирования E.coli RRI.
Плазмиду pD2 модифицируют, удаляя “отравляющие” последовательности в участке pBR 322 (Lusky и Botcham, Nature, 293: 79-81, 1981). Плазмиды pD2 (6,6 мкг) и рМ -1 (Lusky и Botcham, см.) (4 мкг) инкубируют в 50 мкл буфера А с 10 ед. каждого из Eco RI и Nru I в течение 2 час при 37С, после чего подвергают элек-трофорезу на агарозном геле. Фрагмент 1,7 килобазы pD2 и фрагмент рML-l 1,8 килобазы выделяют и связы-вают друг с другом (по 50 нг каждого) в 20 мкл буфера С, содержащего 100 ед. Т4-полинуклеотидлигазы в течение 2 час при 12С и затем трансформируют в E.coli HB101. Колонии, содержащие целевую конструкцию (обозначенную  pD2) идентифицируют быстрым препаративным анализом. Затем 10 мкг  pD2 расщепляют 20 ед. каждого из EcoRI и Bgl II в 50 мкл буфера А в течение 2 час при 37С. ДНК подвергают электрофорезу на агарозе и выделяют целевой фрагмент 2,8 килобазы (фрагмент С), содержащий рВР 322, сайт сплайсинга 3 и последовательности poly A.
Для получения остальных фрагментов, используемых для конструирования pD3, pDHFR III модифици-руют для превращения сайта Sac II (Sst II) либо в сайт Hind III, либо в сайт Kpn I. Десять мкг pDHFR III рас-щепляют 20 ед. Sst II в течение 2 час при 37С, затем экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Ресус-пендированную ДНК инкубируют в 100 мкл буфера В, содержащего 10 мМ dCTP и 16 ед. Т4-ДНК-полимеразы в течение 60 мин при 12С, экстрагируют фенолом, диализуют и осаждают этанолом. ДНК (5 мкг) связывают с 50 нг обработанных киназой линкеров Hind III или КР I в 20 мкг буфера С, содержащего 400 ед. Т4-ДНК-лигазы, в течение 10 час при 12С, экстрагируют фенолом, и осаждают этанолом. После суспен-дирования в 50 мкл буфера А результирующие плазмиды расщепляют 50 ед. Hind III или Kpn I и подвергают электрофорезу на агарозе. Выделенную из геля ДНК (250 нг) связывают в 30 мкл буфера С, содержащего 400 ед. Т4-ДНК-лигазы, в течение 4 час при 12С, и используют для трансформирования E.coli PPI. Результирую-щие плазмиды обозначают как pDHFR III (Hind III) и pDHFR III (Kpn I). Затем фрагмент Kpn I - Bgl II, 700 по (фрагмент А), очищают от pDHFR III (Kpn I) расщеплением с помощью Bgl II и Kpn I электрофорезом на ага-розном геле.
Расширяющую последовательность SV40 вставляют затем в pDHFR III (Hind III) следующим образом: 50 мкг ДНК SV40 инкубируют в 120 мкл буфера А с 50 ед. Hind III в течение 2 час при 37С и фрагмент Hind III С SV40 (5089-968 по) очищают на геле. Плазмиду pDHFR III (Hind III) (10 мкг) обрабатывают 250 нг бы-чьей кишечной фосфатазы в течение 1 час при 37С, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Линеари-зованную плазмиду (50 нг) связывают с 250 нг Hind III SV40 в 16 мкл буфера С в течение 3 час при 12С, с использованием 200 ед. Т4-полинуклеотидлигазы и трансформируют в E.coli НВ101. Из этой плазмиды выде-ляют затем фрагмент Eco RI-Kpn I (фрагмент В), 700 пар оснований.
Для результирующего конструирования pD3 фрагменты А и В (по 50 нг каждого) связывают с 10 нг фрагмента С с помощью Т4-полинуклеотидлигазы в течение 4 час при 12С, и затем трансформируют E.coli RRI. Положительные колонии отбирают быстрым препаративным анализом и получают большое количество препарата pD3.
Затем конструируют вектор экспрессии рМ7135. Репликативную форму рМ7115 расщепляют Bam HI и XbaI и на геле очищают фрагмент 550 по, содержащий лидерный участок Фактора IX и 5-последовательность фактора VII. Плазмиду FIX/VII/pD2 расщепляют с помощью XbaI и Bam HI и на геле очищают фрагмент, 1700 по, содержащий 3-участок к-ДНК Фактора VII. Плазмиду pD3 расщепляют Bcl I, обрабатывают бычьей щелочной фосфатазой и соединяют три фрагмента тройным связыванием. Результи-рующие конструкции отбирают на присутствие фрагмента XbaI длиной 2000 пар оснований. Отбирают плазмиду, имеющую правильную ориентацию, и обозначают ее как рМ7135 (рисунок 8).
Пример 9: Экспрессия Фактора VII из клонов к-ДНК.
Для экспрессии к-ДНК Фактора VII, содержащей лидерную последовательность Фактора VII, ДНК из VII2463 или VII565 и VII2463 клонируют в вектор экспрессии, содержащий основной поздний промотор Ad2, расширитель SV40, трехчленную лидерную последовательность Ad2, набор сплайсинга и полиадениля-ционный сигнал SV40. Этот вектор содержит единственную последовательность Eco RI как сайт к-ДНК-вставки. Устанавливают экспрессию последовательностей из VII2463, кодирующей лидерную последова-тельность из 60 аминокислот и из VII565 и VII2463, которые лишены кодонов для аминокислот от - 18 до -39 и кодируют лидерную последовательность длиной 38 аминокислот. Так как структура лидерного участка Фактора VII идентифицируется только клонированием к-ДНК и так как имеется неясность, обусловленная получением двух различных 5-концевых к-ДНК, то авторы сконструировали также последовательность ге-номной к-ДНК Фактора VII. 3-участок VII2463 (от сайта Bgl II в экзоне 2 до сайта Eco RI, связывающего 3 с окончанием (А)) соединяют с субгеномным фрагментом клона 7 1, кодирующим экзоны 1а, 1b и оставшуюся часть экзона 2. Этот субгеномный фрагмент, реконструированный как фрагмент EcoRI-Bgl III, 4,4 килобазы, соединяют с к-ДНК VII2463 и клонируют в вектор экспрессии млекопитающих.
Говоря коротко, для конструирования субклона фрагмент EcoRI к-ДНК Фактора VII VII2463 клониру-ют в сайт EcoRI pUC18 и обозначают pVII2463. Аналогичным образом вставку к-ДНК EcoRI VII565 суб-клонируют в pUC18 и обозначают pVII565. Конструируют гибрид между 5-участком последовательности Фактора VII клона pVII565 и 3-сегментом ДНК Фактоа VII pVII2463 клонированием наибольшего 5-фрагмента EcoRI-Bgl II Фактора VII pVII565 и фрагмента Bgl II - Hind III Фактора VII (сайт Hind III в поли-линкере pVII2463) pVII2463 в pUC18, расщепленный EcoRI и Hind III. Эту конструкцию обозначают рVII2397. Вставки pVII2463 и pVII2397 удаляют расщеплением EcoRI и очищают на геле для вставки в век-торы экспрессии в клетках млекопитающих, как это описано ниже.
А. Экспрессия полномерной к-ДНК Фактора VII.
Экспрессия фактора VII достигается в векторе pDX. Этот вектор получают из pD3 (описано выше в при-мере 8) и pD3, вектора, идентичного pD3, за исключением того, что сигнал полиадениляции SV40 (т.е. фраг-мент от Bam HI SV40 /2533 по/ до Bcl I /2770 по/) находится в поздней ориентации. Таким образом pD3 со-держит сайт Bam HI в качестве сайта вставки гена.
Для получения pDX сайт Eco RI в pD3 превращают в сайт Bcl I расщеплением EcoRI, инкубированием с нуклеазой Sl и связыванием с линкерами Bcl I. Получают ДНК из положительно идентифицированной коло-нии и получают фрагмент XhoI-PstI, 1,9 килобазы, содержащий измененный рестрикционный сайт, электро-форезом на агарозном геле. Во второй модификации pD3, расщепленный Bcl I, связывают с обработанными киназой адапторами EcoRI-Bcl I (сконструированными из олигонуклеотидов ZC525, 5 GGAATTCT3 и ZC526, 5 GATCAGAATTCC3 (для получения сайта EcoRI как положения вставки гена в вектор экспрессии. Иденти-фицируют положительные колонии рестрикционным анализом и используют ДНК из них для выделения фрагмента XhoI-Pst I, 2,3 килобазы, содержащего модифицированный рестрикционный сайт. Два описанных выше фрагмента ДНК инкубируют вместе с Т4-ДНК-лигазой, трансформируют в E.coli HB101 и положитель-ные колонии идентифицируют рестрикционным анализом. Получают препарат такой ДНК, названной pDX (рисунок 12). Эту ДНК расщепляют EcoRI и затем и инкубируют с бычьей кишечной фосфатазой. Затем очи-щенную ДНК инкубируют с Т4-ДНК-лигазой и фрагментом к-ДНК EcoRI Фактора VII из pVII2463 или с фрагментом к-ДНК EcoRI Фактора VII из pVII2397. Результирующие клоны обозначают соответственно FVII(2463)/pDX и FVII(565+2463)/pDX (рисунок 12). После трансформирования в E.coli M83 и последующего идентифицирования рестрикционным анализом получают препараты плазмидной ДНК и проверяют усилен-ным рестрикционным расщеплением эндонуклеозами. Плазмиды FVII(2463)/pDX и FVII(565+2463)/pDX де-понируют в Коллекцию культур американского типа под номерами соответственно 40206 и 40205.
Каждую из FVII(2463)/pDX и FVII(565+2463)/pDX (10 мкг каждой) используют для трансформирования, вместе с 10 мкг несущей ДНК из спермы досося, либо клеток ВНК tkt13 (Floros и др., Exper. Cell Res. 132: 215-223, 1981), либо клеток COS, с использованием стандартного осаждения фосфата кальция. После заражения клетки культивируют в подходящей среде, содержащей 5 мкг/мл витамина К, в течение 2 дней. В это время суперпатенты анализируют на ELISA-положительные соединения с использованием моноклонального анти-тела против Фактора VII. Как FVII(2463)/pDX, так и FVII(565+2463)/pDX приводят к выработке полипептида Фактора VII, обнаруживаемого в супернатанте клеток COS, а в супернатанте клеток ВНК обнаруживается Фактор VII в результате введения FVII(565+2463)/pDX. Sham-трансформированные клетки ВНК или COS не вырабатывают заметных количеств Фактора VII (таблица 5).
Таблица 5


ДНК Линия
клеток Число
клеток ELISA-положительное соединение (нг/мл куль-туральной среды)
FVII (2463)/pDX COS 2 x 106 15
FVII (565+2463)/pDX COS 2 x 106 12
Контроль COS 2 x 106 2
FVII (2463)/pDX ВНК 9 x 106 62
FVII (565+2463)/pDX ВНК 9 x 106 6
Контроль ВНК 9 x 106 <2

Явная экспрессия Фактора VII наблюдается также у нескольких других линий клеток, перечисленных в таблице 6.
Таблица 6

Наименование Описание Ссылка (АТТС #)
1. Крысиная Hep I Крысиная гепатома Н4-II-E-C3 CRL 1600
2. Крысиная Hep II Крысиная гепатома Н4-II-E CRL 1548
3. TCMK Почки мыши, трансформация виру-сом SV40, ТМСК-1 CRL 139
4. Легкие человека WI-38 VA13 трасформированная вирусом SV40, сублиния 2RA CCL 75.1
5. Гепатома человека Аденокарцинома печени человека К-НЕР-1 НТВ-52
6. Нер 2 Человеческая гепатома, разработа-на Barbara Knowles/Wistar Institute НТВ-8065
7. Печень мыши ПСТС-Клон 1469 CCL 29.1
8. COS Клетки мыши СV-1, трансформиро-ванние SV40 CCL 1650
9. ВНК Почки молодого хомяка, ВНК-21 (С-13) CCL 10
10. 293 Ad-Трансформированные почки эмбриона человека CCL 1573
11. DUKX CHO-DHFR (Urlaub и Chasin, PNAS (USA) 77: 4216-4220, 1980)

Клетки совместно заражают 10 мкг либо FVII(2463)/pDX, либо FVII(565+2463)/pDX вместе с 1 мкг плаз-миды, содержащей хлорамфениколацетилтрансацетилазный ген (для идентификации совместно зараженных клеток) и 10 мкг ДНК спермы лосося. В качестве контроля используют Mock-трансформированные клетки. Истощенную среду анализируют через 6 дней с помощью ELISA. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7

Образец Линия клеток Плазмида Число клеток
х 10-6 ELISA
(нг/мл)
1. Крысиная Нер 1 Mock 11,6 2,4
2. Крысиная Нер 1 FVII(565+2463)/pDX 7,0 <2
3. Крысиная Нер 1 FVII(2463)/pDX 7,0 <2
4. Крысиная Нер 2 Mock 13,0 <2
5. Крысиная Нер 2 FVII(565+2463)/pDX 18,4 <2
6. Крысиная Нер 2 FVII(2463)/pDX 14,6 <2
7. TMCK Mock 18,8 <2
8. TMCK FVII(565+2463)/pDX 9,8 <2
9. TMCK FVII(2463)/pDX 12,8 <2
10. Легкие человека Mock 7,2 <2
11. Легкие человека FVII(565+2463)/pDX 3,4 16,5
12. Легкие человека FVII(2463)/pDX 3,4 12,5
13. Гепатома человека Mock 13,0 2
14. Гепатома человека FVII(565+2463)/pDX 11,0 3,5
15. Гепатома человека FVII(2463)/pDX 6,0 3,0
16. HepG2 Mock 13,0 2
17. HepG2 FVII(565+2463)/pDX 6,0 45,5
18. HepG2 FVII(2463)/pDX 6,0 28
19. Печень мыши Mock 3,8 2
20. Печень мыши FVII(565+2463)/pDX 4,0 2
21. Печень мыши FVII(2463)/pDX 3,6 2
22. CO Mock 5,6 2
23. CO FVII(565+2463)/pDX 5,6 15,5
24. CO FVII(2463)/pDX 4,4 14,5
25. BHK Mock 3,0 2
26. BHK FVII(565+2463)/pDX 5,0 25
27. BHK FVII(2463)/pDX 4,0 22,5
28. 293 Mock 5,8 94
29. 293 FVII(565+2463)/pDX 6,2 94
30. 293 FVII(2463)/pDX 8,2 100
31. KX Mock 11,6 2
32. KX FVII(565+2463)/pDX 13,0 2
33. KX FVII(2463)/pDX 13,6 2

Проводят совместную трансформацию либо FVII(2463)/pDX (10 мкг), либо FVII(565+2463)/pDX (10 мкг) с 10 мкг ДГК спермы лосося и 1 мкг плазмиды, кодирующей устойчивую форму дигидрофолатредуктазы (Si-monsen и Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2495-2499, 1983) в векторе экспрессии млекопитающих кле-ток ВНК tkt13. Через 2 дня клетки разделяют 1:14 и помещают в селективную среду, содержащую 250 мМ либо 1000 мМ метотрексата (МТХ) и 5 мкг/мл витамина К (фитадион, Merck). Через две недели колонии вы-деляют и выращивают до заполнения 50-90%. Затем супернатантную срезу анализируют на полипептид Фактора VII с помощью ELISA. Из 25 положительных клонов подвергают дальнейшему анализу. Клетки в количестве 5 х 104 (группа 1) или 1 х 105 (группа II) помещают в 10 см - чашки, содержащие 5 мкг/мл витами-на К, и либо 250 нМ, либо 1000 нМ метотрексата. Через 5 дней быстрее растущие клоны (помеченные звез-дочкой в таблице 8) делят 1:2 и через 24 час среду меняют во всех чашках. Через 23 час (группа I) или 20 час (группа II) собирают супернатантную среду и считают клетки в каждом клоне. Среду анализируют так с помощью ELISA, так и одностадийным испытанием на свертывание. Результаты представлены в таблице 8.
Таблица 8


Клон
Плазмида Число
клеток,
х 10-5 ELISA (нг/клетку/
день) ELISA
(нг/мл) Свертыва-ние (нг/мл) % Актив-ности
В4-А1* FVII(565+2463)/pDX 2 6,5 130 206 158
В4-B1* FVII(565+2463)/pDX 27 1,9 513 360 70
В4-C1 FVII(565+2463)/pDX 16 2,5 393 480 122
В4-C2* FVII(565+2463)/pDX 9 <0,2 <20 21 -
В4-C3 FVII(565+2463)/pDX 52 1,5 800 910 114
В4-D1* FVII(565+2463)/pDX 27 2,0 553 570 103
В4-D2* FVII(565+2463)/pDX 13 1,2 150 154 103
В4-Е1 FVII(565+2463)/pDX 29 2,2 870 1160 133
В4-Е2* FVII(565+2463)/pDX 8 2,5 205 240 117
В4-Е3 FVII(565+2463)/pDX 23 1,2 275 320 116
В4-Е4 FVII(565+2463)/pDX 31 1,3 410 300 73
В4-5.3* FVII(2463)/pDX 5 8,2 410 290 70
В3-2.2 FVII(2463)/pDX 41 2.5 1043 500 48
В3-2.3 FVII(2463)/pDX 19 3,0 580 610 105
В3-3.2 FVII(2463)/pDX 13 1,5 197 216 110
В3-4.2 FVII(2463)/pDX 41 1,8 760 620 82
В3-5.1 FVII(2463)/pDX 14 3,3 460 400 87
В3-5.2 FVII(2463)/pDX 9 2,7 257 184 72
В6-D FVII(2463)/pDX 54 3,0 1700 780 46
В6-E FVII(2463)/pDX 101 1,6 1640 970 59
В6-G FVII(2463)/pDX 31 5,7 1853 1080 58
В6-M FVII(2463)/pDX 75 2,2 1743 940 54

В. Экспрессия гибрида геномной к-ДНК Фактора VIII.
Вектор экспрессии, содержащий геномные последовательности, являющиеся геномным 5-окончанием Фактора VII и последовательности к-ДНК из 3-окончания гена Фактора VII получают следующим образом. Для реконструирования 5-окончания используют три субклона геномной плазмиды 7m1, 7Bam, 7SD и 7SE. Плазмида 7Ва представляет собой фрагмент EcoRI-BamHI, 3,6 килобазы, содержащий экзон 1а, субклониро-ванный в pUC12. Из этого субклона выделяют фрагмент EcoRI-XbaI, 0,7 килобазы, содержащий экзон 1а, и называют его фрагментом а. Плазмида 7SE представляет собой фрагмент Sst 1,3, 7 килобазы, содержащий экзон 1b, субклонированный в pUC18. Из этого субклона выделяют фрагмент XbaI-Sst I, 3,1 килобазы, содер-жащий экзон 1с, и называют его фрагментом о. Плазмида 7SE представляет собой фрагмент Sst 1,3, 9 кило-базы, содержащий экзон 2-4, субклонированный М13mp 19. Из геля выделяют фрагмент Sst I - Bgl II (0,6 ки-лобазы), содержащий 5-участок экзона 2, и называют его фрагментом с. Остальную часть к-ДНК 3-Фактора VII (фрагмент d) получают как фрагмент Bgl II - EcoRI из pUVII2463. Фрагмент а-d связывают с pDX, рас-щепленной EcoRI и обработанной бычьей кишечной фосфатазой и затем трансформируют в клетки E.coli JM83 или НВ101. Положительные колонии идентифицируют рестрикционным анализом и получают из них плазмидную ДНК.
Для экспрессии Фактора VII плазмидную ДНК используют для совместного заражения клеток ВНК или COS, как описано выше. Трансформированные клетки культивируют в среде, содержащей витамин К, в тече-ние 2 дней, и среду анализируют на присутствие Фактора VII с помощью ELISA.
Из изложенного выше можно сделать вывод о том, что хотя с иллюстративной целью здесь и описаны конкретные варианты осуществления данного изобретения, однако могут быть разработаны различные мо-дификации, не выходящие за рамки объема и сути данного изобретения. В соответствии с этим данное изоб-ретение не ограничено ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.