КРИСТАЛЛ БЕЛКА, СШИТОГО МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫМ СШИВАЮЩИМ АГЕНТОМ (ВАРИАНТЫ), УСТРОЙСТВО, СОДЕРЖАЩЕЕ ЭТОТ КРИСТАЛЛ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АСПАРТАМА
(51) МПК: 6 С12N 11/00, C12P 21/02
Сведения о документе ▾
- (11) Номер документа
- 210
- (13) Код типа документа
- P
- (51) МПК
- 6 С12N 11/00, C12P 21/02
- (45) Дата публикации
- 14.11.1998
- Статус
- Прекратил действие
Заявка ▾
- (21) Рег. номер заявки
- 94000012
- (22) Дата подачи заявки
- 11.04.1994
- (31) Конвенционный приоритет
- 562.280
- (32) Дата подачи конв. заявки
- 03.08.1990
- (33) Страна приоритета
- US
PCT ▾
- (86) Дата заявки PCT
- 20.02.1992
- (86) Номер заявки PCT
- РСТ/WO 92/02617
Лица ▾
- (71) Заявитель(и)
- Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед (US)
- (72) Автор(ы)
- Мануэль А.Нэвиа (US), Нэнси Л.Ст. Клэр (US)
- (73) Патентообладатель(и)
- Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед (US)
Реферат
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к области иммобилизации ферментов. Растворимую форму белка переводят в форму сшитого кристалла действием мно-гофункционального сшивающего агента. В качестве белка обычно используют фермент, предпочтительно гидролазу. Сшитый кристалл может быть использован в качестве основы устройств, преимущественно предназначенных для использования в качестве биосенсора. Сшитые кристаллы могут быть использованы в биотехнологическом синтезе для иммобили-зации фермента, использующегося в реакции. Использование сшитых подобным образом кристаллов позволяет белкам повысить срок их активности относительно несшитых форм белка. 7 с. и 33 з.п. ф-лы, 11 ил., 19 табл.
Формула изобретения
1. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, отличающий-ся тем, что он обладает устойчивостью к экзогенному протеолизу, такой, что указанный белковый кристалл сохраняет по меньшей мере 91% его исходной активности после инкуби-рования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии проназы (PronaseTM) в концентрации, вызывающей у растворимой формы белка, кристаллизующейся с образованием этого белко-вого кристалла, который сшивается, потерю по меньшей мере 94% его исходной активности в тех же условиях.
2. Кристалл по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
3. Кристалл по п.2, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидрола-за.
4. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использован термоли-зин.
5. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована уреаза.
6. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована аспара-гиназа.
7. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использован лизоцим.
8. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована эстераза.
9. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована эластаза.
10. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована липаза.
11. Кристалл по п.1 или 2, отличающийся тем, что молярное соотношение белок : Про-назаТМ составляет 1 : 40.
12. Кристалл по п.1 или 2, отличающийся тем, что он имеет поперечное сечение разме-ром около 10-1 мм или менее.
13. Кристалл по п.4, отличающийся тем, что является кристаллическим сшитым термо-лизином, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый термолизин сохраняет 98% его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере часа в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у растворимой несшитой формы термолизина, из которой образован кристаллический сшитый термолизин, потерю по меньшей мере 97% ее исходной активности в тех же условиях.
14. Кристалл по п.6, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой аспара-гиназой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая аспарагиназа сохраняет по меньшей мере 91% ее исходной активности после инкуби-рования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, кото-рая вызывает у растворимой несшитой формы аспарагиназы, из которой образована кристал-лическая сшитая аспарагиназа, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
15. Кристалл по п.7, отличающийся тем, что является кристаллическим сшитым лизо-цимом, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый лизоцим сохраняет по меньшей мере 91% его исходной активности после инкубиро-вания в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у растворимой несшитой формы лизоцима, из которой образован кристаллический сшитый лизоцим, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
16. Кристалл по п.8, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой эстера-зой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сши-тая эстераза сохраняет по меньшей мере 91% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызы-вает у растворимой несшитой формы эстеразы, из которой образована кристаллическая сши-тая эстераза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
17. Кристалл по п.9, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой эласта-зой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сши-тая эластаза сохраняет 100% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у раство-римой несшитой формы эластазы, из которой образована кристаллическая сшитая эластаза, потерю по меньшей мере 98% ее исходной активности в тех же условиях.
18. Кристалл по п.10, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой липа-зой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристалл сшитой липа-зы сохраняет по меньшей мере 91% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у рас-творимой несшитой формы липазы, из которой образована кристаллическая сшитая липаза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
19. Кристалл по п.2, отличающийся тем, что является кристаллическим сшитым фер-ментом, обладающим по меньшей мере 50% каталитической активности растворимой несши-той формы этого фермента, которую сшивают и кристаллизуют для получения указанного кристаллического сшитого фермента.
20. Кристалл по п.19, отличающийся тем, что в качестве указанного фермента исполь-зован фермент термолизин, аспарагиназа, лизоцим, уреаза, эстераза или липаза.
21. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает большим полупериодом активности, чем раствори-мая несшитая форма белка, из которой образован указанный кристалл, после инкубирования в 50% смеси органического растворителя с водой в течение по меньшей мере часа.
22. Кристалл по п.21, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
23. Кристалл по п.22, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидро-лаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
24. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает такой стабильностью в 50% смеси органического растворителя с водой, что сохраняет по меньшей мере 40% его исходной активности после инкубирования в указанном растворителе в течение по меньшей мере часа.
25. Кристалл по п.24, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
26. Кристалл по п.25, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидро-лаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
27. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает улучшенным рН-профилем активности по сравне-нию с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кристалл.
28. Кристалл по п.27, отличающийся тем, что он обладает большей стабильностью при щелочном рН, чем растворимая несшитая форма белка, из которой образован указанный кри-сталл.
29. Кристалл по п.27 или 28, отличающийся тем, что в качестве белка использован фер-мент, выбранный из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
30. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает большей стабильностью при высокой температуре по сравнению с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кри-сталл.
31. Кристалл по п.30, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
32. Кристалл по п.31, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидро-лаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
33. Кристалл по п.30, отличающийся тем, что указанная высокая температура составляет приблизительно по меньшей мере 55С.
34. Кристалл по п.30, отличающийся тем, что указанная высокая температура составляет приблизительно по меньшей мере 65С.
35. Устройство, содержащее этот кристалл, отличающееся тем, что содержит кристалл сшитого фермента по п.2 или 3 и средство для удерживания указанного кристалла сшитого фермента, причем удерживающее средство состоит из материала, который допускает контакт между указанным кристаллом сшитого фермента с жидкостью, содержащей субстрат, на кото-рый действует фермент.
36. Устройство по п.35, отличающееся тем, что в случае его использования в качестве биосенсора для детектирования интересующего аналита в жидкости указанный фермент об-ладает действием на интересующий аналит или реагент в реакции, в которой принимает уча-стие интересующий аналит, а указанный субстрат является интересующим аналитом или реа-гентом в реакции, в которой принимает участие интересующий аналит.
37. Устройство по п.35, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит средство для определения активности действия указанного фермента на данный аналит или реагент.
38. Устройство по п.35, отличающееся тем, что оно содержит кристалл сшитой люцифе-разы.
39. Устройство по п.35, отличающееся тем, что в случае его использования в качестве экстракорпорального устройства для изменения компонента жидкости указанный субстрат является этим компонентом или реагентом в реакции, в которой участвует данный компо-нент.
40. Способ получения аспартама, предусматривающий стадии объединения двух соеди-нений, из которых первое имеет формулу Z-(L-Asp), где Z - бензилоксикарбонильная группа, а второе соединение имеет формулу (L-Phe)-OMe с термолизином в иммобилизированной форме, поддержания полученной комбинации в условиях, подходящих для конденсации этих двух соединений под действием указанного термолизина, с образованием частично защищен-ного соединения формулы Z-(L-Asp)-(L-Phe)-OMe, и удаления бензилоксикарбонильной группы у образовавшегося частично защищенного соединения с получением при этом аспар-тама, отличающийся тем, что в качестве термолизина в иммобилизированной форме ис-пользуют кристалл сшитого термолизина по п.4.
2. Кристалл по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
3. Кристалл по п.2, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидрола-за.
4. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использован термоли-зин.
5. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована уреаза.
6. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована аспара-гиназа.
7. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использован лизоцим.
8. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована эстераза.
9. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована эластаза.
10. Кристалл по п.3, отличающийся тем, что в качестве гидролазы использована липаза.
11. Кристалл по п.1 или 2, отличающийся тем, что молярное соотношение белок : Про-назаТМ составляет 1 : 40.
12. Кристалл по п.1 или 2, отличающийся тем, что он имеет поперечное сечение разме-ром около 10-1 мм или менее.
13. Кристалл по п.4, отличающийся тем, что является кристаллическим сшитым термо-лизином, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый термолизин сохраняет 98% его исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере часа в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у растворимой несшитой формы термолизина, из которой образован кристаллический сшитый термолизин, потерю по меньшей мере 97% ее исходной активности в тех же условиях.
14. Кристалл по п.6, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой аспара-гиназой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сшитая аспарагиназа сохраняет по меньшей мере 91% ее исходной активности после инкуби-рования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, кото-рая вызывает у растворимой несшитой формы аспарагиназы, из которой образована кристал-лическая сшитая аспарагиназа, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
15. Кристалл по п.7, отличающийся тем, что является кристаллическим сшитым лизо-цимом, обладающим такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллический сшитый лизоцим сохраняет по меньшей мере 91% его исходной активности после инкубиро-вания в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у растворимой несшитой формы лизоцима, из которой образован кристаллический сшитый лизоцим, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
16. Кристалл по п.8, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой эстера-зой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сши-тая эстераза сохраняет по меньшей мере 91% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызы-вает у растворимой несшитой формы эстеразы, из которой образована кристаллическая сши-тая эстераза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
17. Кристалл по п.9, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой эласта-зой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристаллическая сши-тая эластаза сохраняет 100% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у раство-римой несшитой формы эластазы, из которой образована кристаллическая сшитая эластаза, потерю по меньшей мере 98% ее исходной активности в тех же условиях.
18. Кристалл по п.10, отличающийся тем, что является кристаллической сшитой липа-зой, обладающей такой устойчивостью к экзогенному протеолизу, что кристалл сшитой липа-зы сохраняет по меньшей мере 91% ее исходной активности после инкубирования в течение по меньшей мере 3 ч в присутствии такой концентрации ПроназыТМ, которая вызывает у рас-творимой несшитой формы липазы, из которой образована кристаллическая сшитая липаза, потерю по меньшей мере 94% ее исходной активности в тех же условиях.
19. Кристалл по п.2, отличающийся тем, что является кристаллическим сшитым фер-ментом, обладающим по меньшей мере 50% каталитической активности растворимой несши-той формы этого фермента, которую сшивают и кристаллизуют для получения указанного кристаллического сшитого фермента.
20. Кристалл по п.19, отличающийся тем, что в качестве указанного фермента исполь-зован фермент термолизин, аспарагиназа, лизоцим, уреаза, эстераза или липаза.
21. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает большим полупериодом активности, чем раствори-мая несшитая форма белка, из которой образован указанный кристалл, после инкубирования в 50% смеси органического растворителя с водой в течение по меньшей мере часа.
22. Кристалл по п.21, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
23. Кристалл по п.22, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидро-лаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
24. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает такой стабильностью в 50% смеси органического растворителя с водой, что сохраняет по меньшей мере 40% его исходной активности после инкубирования в указанном растворителе в течение по меньшей мере часа.
25. Кристалл по п.24, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
26. Кристалл по п.25, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидро-лаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
27. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает улучшенным рН-профилем активности по сравне-нию с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кристалл.
28. Кристалл по п.27, отличающийся тем, что он обладает большей стабильностью при щелочном рН, чем растворимая несшитая форма белка, из которой образован указанный кри-сталл.
29. Кристалл по п.27 или 28, отличающийся тем, что в качестве белка использован фер-мент, выбранный из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
30. Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом, причем ука-занный кристалл сшитого белка обладает большей стабильностью при высокой температуре по сравнению с растворимой несшитой формой белка, из которой образован указанный кри-сталл.
31. Кристалл по п.30, отличающийся тем, что в качестве белка использован фермент.
32. Кристалл по п.31, отличающийся тем, что в качестве фермента использована гидро-лаза, выбранная из группы, состоящей из термолизина, эластазы, аспарагиназы, лизоцима, уреазы, эстеразы и липазы.
33. Кристалл по п.30, отличающийся тем, что указанная высокая температура составляет приблизительно по меньшей мере 55С.
34. Кристалл по п.30, отличающийся тем, что указанная высокая температура составляет приблизительно по меньшей мере 65С.
35. Устройство, содержащее этот кристалл, отличающееся тем, что содержит кристалл сшитого фермента по п.2 или 3 и средство для удерживания указанного кристалла сшитого фермента, причем удерживающее средство состоит из материала, который допускает контакт между указанным кристаллом сшитого фермента с жидкостью, содержащей субстрат, на кото-рый действует фермент.
36. Устройство по п.35, отличающееся тем, что в случае его использования в качестве биосенсора для детектирования интересующего аналита в жидкости указанный фермент об-ладает действием на интересующий аналит или реагент в реакции, в которой принимает уча-стие интересующий аналит, а указанный субстрат является интересующим аналитом или реа-гентом в реакции, в которой принимает участие интересующий аналит.
37. Устройство по п.35, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит средство для определения активности действия указанного фермента на данный аналит или реагент.
38. Устройство по п.35, отличающееся тем, что оно содержит кристалл сшитой люцифе-разы.
39. Устройство по п.35, отличающееся тем, что в случае его использования в качестве экстракорпорального устройства для изменения компонента жидкости указанный субстрат является этим компонентом или реагентом в реакции, в которой участвует данный компо-нент.
40. Способ получения аспартама, предусматривающий стадии объединения двух соеди-нений, из которых первое имеет формулу Z-(L-Asp), где Z - бензилоксикарбонильная группа, а второе соединение имеет формулу (L-Phe)-OMe с термолизином в иммобилизированной форме, поддержания полученной комбинации в условиях, подходящих для конденсации этих двух соединений под действием указанного термолизина, с образованием частично защищен-ного соединения формулы Z-(L-Asp)-(L-Phe)-OMe, и удаления бензилоксикарбонильной группы у образовавшегося частично защищенного соединения с получением при этом аспар-тама, отличающийся тем, что в качестве термолизина в иммобилизированной форме ис-пользуют кристалл сшитого термолизина по п.4.
Описание
Изобретение касается иммобилизации ферментов, а также использования иммобилизо-ванных ферментов. В частности, изобретение касается белковых кристаллов, сшитых мно-гофункциональным сшивающим агентом, а также устройства, содержащего этот кристалл, и способа получения аспартама, использующего сшитый белковый кристалл.
Данное изобретение выделено из заявки США Сер. №07/562280, поданной 3 августа 1990 г.6 с названием “Структурированные кристаллы в качестве нового вида ферментной иммоби-лизации”.
Ферменты используются в качестве промышленных катализаторов для широкомасштаб-ного и лабораторного производства чистых и специальных коммерческих химикатов (Jones J.B., Tetrahedron, 42: 3351-3403 (C986), для производства пищевых веществ (Zaks и др., Trends in Biotechnology, 6: 272 - 275 (1988), а также в качестве средств для синтеза органических со-единений (Wong, C.-H. Science 244: 1145 - 1152 (1969), Chemtrasts-Org. Chem. Res. 23: 114 - 120 (1990); Klidanov A.M., Acc. Chem. Res. 23: 114 - 120 (1990)).
Ферментативное производство может существенно уменьшить загрязнение окружающей среды снятием бремени широкомасштабного производства неиспользуемых иным образом промежуточных химикалиев, таких как нитрил-гидратаза в производстве акриламида (Nagacawa, T., и Yamada, H., Trends in Biotechology 7 : 153 - 158 (1989).
Ферменты используют также в качестве биодатчиков для обнаружения различных ве-ществ, представляющих клинический, промышленный и проч. интерес (Hall, E., “Biosensors”, Open University Press, 1990). В области медицины ферменты могут использоваться для экстра-корпоральной терапии, такой как гемодиализ и гемофильтрация, при которых ферменты се-лективно удаляют из крови выделяемые и токсические вещества (Klein, M., и Zanger, R., Trends in Biotechnology 4: 179 - 185 (1986). В данных областях ферменты используют потому, что они эффективно работают в качестве катализаторов многих типов реакций при умерен-ных температурах, при субстратной специфичности и стереоселективности. Тем не менее имеются проблемы, связанные с использованием растворимых ферментных катализаторов, которые ограничивают их применение в промышленных и лабораторных химических про-цессах (Akiyama и др. CHEMТЕСН 627 - 634 (1988)).
Ферменты являются дорогими и относительно нестабильными по сравнению с большин-ством промышленных и лабораторных катализаторов, даже когда их используют в водной среде, в которой ферменты обычно работают. В обычной практике многие из наиболее эко-номически важных химических реакций несовместимы с водной средой, в которой, напри-мер, субстраты и продукты часто нерастворимы или нестабильны и в которой может оказы-вать существенное влияние гидролиз. Кроме того, выделение растворимого ферментного ка-тализатора из продукта и непрореагировавшего субстрата в сырье часто требует применения сложной и дорогой технологии сепарации. Наконец, ферменты трудно сохранять таким обра-зом, чтобы поддерживать их активность и функциональную целостность в течение коммерче-ски разумных периодов времени (от месяцев до нескольких лет) без того, чтобы прибегать к их замораживанию (от 4 до -80С и до температур жидкого азота), или трудно поддерживать в водных растворителях подходящей ионной силы, рН и т.д.
Методы ферментной иммобилизации во многих случаях обходят эти проблемы. Иммоби-лизация может улучшить стабильность ферментных катализаторов и защитить их функцио-нальную целостность в грубой среде растворителя и высоких температурах, характерных для промышленных и лабораторных химических процессов (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149 - 153 (1985)).
Процессы непрерывного потока могут осуществляться с иммобилизованными фермент-ными частицами в колонах, например, где растворимое сырье проходит через эти частицы и постепенно превращается в продукт. В настоящем описании, выражение “ферментная иммо-билизация” относится к переведению ферментного катализатора в нерастворимое состояние посредством его присоединения к, или инкапсуляцией, или агрегацией в макроскопические (10-1 мм) частицы.
В литературе имеется несколько полезных обзоров методов ферментной иммобилизации (Maugh, T.H. Science 223: 474 - 476 (1984), Tramper J., Trends in Biotechnology, 3: 45 - 50 (1985)). Maugh описывает пять основных подходов к иммобилизации ферментов. Они включают ад-сорбцию на твердых подложках (таких, как ионообменные смолы), ковалентное присоедине-ние к подложкам (таким, как инообменные смолы, пористые керамические или стеклянные шарики), захватывание в полимерные гели, инкапсулирование и осаждение растворимых белков посредством их структурирования с бифункциональными реагентами беспорядочным и неопределенным образом. Заявка ЕР-А-367302 (Соэджима и др.) описывает водораствори-мую структурированную протеазу 1 Ахромобактера для ее использования в процессе полу-синтезирования человеческого инсулина. ЕР-А-341503 (Висури) описывает водонераствори-мую гликозоизомеразу, которая образована кристаллическим ферментом, превращенным в твердую форму посредством его сшивания с диальдегидом (глютаральдегидом) в присутствии аминосодержащего соединения. Кроме того, можно иммобилизовать целые клетки (обычно неживые и сделанные проницаемыми), которые проявляют желательную ферментную актив-ность на высоком уровне (например, упомянутая на 1 стр. статья Нагасавы и Ямалы в “Тен-денциях в биотехнологии” 7: 153 - 158 (1989).
Каждая из этих процедур иммобилизации имеет свои преимущества и ограничения, и ни одну из них нельзя считать оптимальной или доминирующей. В большинстве из них фер-ментный катализатор в конечном счете представляет собой только небольшую фракцию (часть) от общего объема материала, присутствующего в химическом реакторе. Следователь-но, основная масса иммобилизованной среды выполнена из инертного, но зачастую дорого-стоящего материала-носителя. Во всех из них иммобилизирующее взаимодействие молекул ферментного катализатора друг с другом и/или с материаломносителем имеет тенденцию к неупорядоченности и неопределенности. В результате, хотя эти взаимодействия и придают некоторое увеличение стабильности молекулам ферментного катализатора, их относительная неспецифичность и нерегулярность делают эту стабилизацию неоптимальной и неравномер-ной. В большинстве случаев доступ к активному сайту ферментного катализатора остается неясным. Кроме того, вышеописанные иммобилизационные методы не могут решить про-блем, связанных с хранением и охлаждением. Также, как правило, эти методы не могут иметь дело с обычно иммобилизуемыми (традиционными) ферментами, например при замене одно-го растворителя на другой выбранный растворитель, без риска повредить структурную и функциональную целостность фермента. На практике, за исключением присоединенной к ним связующей группы для связывания их с материалом-носителем традиционно иммобили-зируемые ферменты имеют тесное сходство с растворимыми ферментами и разделяют вместе с ними чувствительность к денатурации и утрату функциональных свойств в грубой окружа-ющей среде. В общем, методы иммобилизации ведут к снижению наблюдаемых скоростей катализируемых ферментами реакций по сравнению с таковыми, полученными в растворе. Это главным образом является следствием пределов внутренней диффузии субстрата и внеш-ней (то есть направленной наружу) диффузии продукта внутри иммобилизованных фермент-ных частиц (Qniocho, F.A. и Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)). Необходимое присутствие инертного носителя в частицах с иммобилизованным ферментом увеличивает средний свободный путь между растворителем извне частицы с иммобилизованным фермен-том и активным сайтом ферментного катализатора, и этим усугубляет диффузионные про-блемы. Когда имеют дело с иммобилизованными клетками, то диффузионные проблемы осо-бенно ужесточаются, даже если клеточные стенки и мембраны сделаны проницаемыми для субстрата и продукта каким-либо образом. Далее, следует также учитывать множество по-бочных ферментных активностей, метоболиты и токсины, содержащиеся в клетках, а также стабильность клеток в грубых растворителях или высоких температурах рабочей среды. Со-вершенствование технологии иммобилизации, которое бы избегало недостатков используе-мых в настоящее время способов, требуется для использования ферментов в качестве про-мышленных катализаторов, особенно при производстве в большом масштабе (Daniels M.J., “Methods in Enzymology”, 136: 371 - 379 (1987).
Изобретение касается иммобилизации фермента путем образования кристалла фермента, в общем случае посредством структурирования кристаллов многофункциональным (бифунк-циональным) сшивающим агентом, а именно сшитых кристаллов иммобилизованного фер-мента, которые далее сокращенно называются СLEC или CLIEC, устройства, содержащего такой кристалл и используемого, например, в качестве биосенсора, а также способа получе-ния желаемого продукта (здесь - конкретно аспартама), с использованием сшитого белкового кристалла по изобретению.
По изобретению небольшие, размером 10-1 мм, кристаллы белка выращивают из водных растворов, или водных растворов, содержащих органические растворители, в которых фер-ментный катализатор является структурно и функционально стабильным. В предпочтитель-ном выполнении кристаллы затем структурируют посредством бифункционального реагента, такого как глютаральдегид. Это структурирование приводит к стабилизации контактов в кристаллической решетке между отдельными молекулами ферментного катализатора, состав-ляющими этот кристалл. В результате этой дополнительной стабилизации, структированные кристаллы иммобилизованного фермента могут работать при повышенной температуре, крайних рН и в грубой водной, органической и почти безводной средах, включая их смеси. Иными словами, CLEC по настоящему изобретению может функционировать в средах, несовместимых с функциональной целостностью соответствующих некристаллизованных, неструктурированных, нативных ферментов или иммобилизованных, традиционными мето-дами ферментных катализаторов.
Кроме того, CLEC могут быть подвергнуты лиофилизации с получением лиофилизован-ных CLEC, которые могут храниться в этом лоифилизированном виде при непониженных (комнатных) температурах в течение длительных периодов времени и которые могут быть легко восстановлены в водных, органических или смешанных водно-органических раствори-телях по выбору, без образования аморфных суспензий и с минимальным риском денатура-ции.
Изобретение относится также к их использованию в лабораторном и широкомасштабном промышленном производстве желаемых веществ, таких как хиральные органические молеку-лы, пептиды, углеводы, жиры или другие химические вещества. В настоящее время эти веще-ства обычно получают традиционными химическими методами, которые могут требовать грубых условий (например, водных, органических или почти безводных растворителей, сме-шанных водно-органических растворителей или повышенных температур), которые несовме-стимы с функциональной целостностью некристаллизованных, неструктурированных, на-тивных ферментных катализаторов. В предлагаемую CLEC-технологию также могут быть введены другие макромолекулы с каталитической активностью. Эти молекулы могут вклю-чать каталитические антитела (Lerner, R.A., Benkovic, S.J., и Schultz, P.G. Science 252: 659-667 (1991) и каталитические полинуклеотиды (Сech, T.R., Call 65: 667 - 669 (1991). Celander D.W. и Cech, T.R., Science, 251: 401 - 407 (1991)).
Изобретение также относится к способу изготовления выбранного продукта посредством реакции, катализованной CLEC по настоящему изобретению.
В практическом примере выполнения способа по настоящему изобретению фермент тер-молизин, -цинк-металлопротеазу-, использовали для синтезирования хирального предше-ственника дипептидильного искусственного подсластителя - аспартама. Фермент термолизин кристаллизовали из исходного водного раствора, состоящего из 45% диметилсульфоксида и 55% 1,4 М ацетата кальция, 0,05М накодилата натрия с рН 6,5. Полученные кристаллы струк-турировали глютральдегидом с образованием CLEC термолизина. CLEC термолизина затем переносили из водного кристаллизационного раствора, в котором они изготавливались, в раствор этилацетата, содержащий субстраты, -N-/бензилоксикарбонил/-L-аспартовую кислоту Z-(L-Asp) и L-фенилаланин метиловый эфир (L-Phe)-OMe. CLEC термолизина затем исполь-зовали для катализирования реакции конденсации двух субстратов для синтезирования N-/бензилоксикарбонил/-L-аспартил-L-фенилаланин метилового эфира Z-(L-Asp)-(L-Phe)-OMe, который является дипептидильным предшественником искусственного подсластителя - ас-партама. С использованием одной из многих известных технологий (см. например, Lindeberg, G.J. Chem. Ed. 64: 1062 - 1064 (1987)). L-аспартовая кислота в синтезированном дипептидиль-ном предшественнике может быть лишена защиты путем удаления бензилоксикарбонильной (Z) группы для получения аспартама (L-Asp)-(L-Phe)-OMe.
Во втором примере практического выполнения настоящего изобретения фермент термо-лизин использовали для получения CLEC термолизина. Активность и стабильность CLEC термолизина сравнивали с этими характеристиками растворимого термолизина при опти-мальных условиях, а также при условиях экстремальных рН и температуры, с последующей инкубацией в присутствии органических растворителей и последующей инкубацией в при-сутствии экзогенной протеазы.
Фермент термолизин кристаллизовали из раствора 1,2 М ацетата кальция и 30% диметил-сульфоксида, с рН 8.0. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом при кон-центрации 12,5% с образованием CLEC термолизина. CLEC термолизина затем лиофилизи-ровали стандартной процедурой (Cooper, T.G., The Tools of Biochemistry. стр. 379 - 380 (изд. Джон Уилей и Сыновья, Нью-Йорк, 1977) с образованием лиофилизированного фермента CLEC термолизина. Этот лиофилизированный CLEC трансформировали непосредственно с различных водных, органических и смешанных водно-органических растворителях по выбо-ру, без промежуточной процедуры замены растворителя, без образования аморфных суспен-зий, и с минимальным риском денатурации. Эти растворители включают ацетонитрил, диок-сан, ацетон и тетрагидрофуран, но не отключая и другие. После инкубирования активность исследовали спектрофометрически посредством расщепления дипептидного субстрата FAGIA (фурилакрилоил-глицил-L-лейцин-амид).
В третьем примере практического выполнения изобретения фермент эластазу (из свиной поджелудочной железы) кристаллизовали из водного раствора 5,5 мг/мл белка в 0,1 М натрий ацетата с рН 5,0 при комнатной температуре (Сойер Л. и др. Ж.Мол. Биол. 118: 137 - 208). По-лученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 5% для образова-ния CLEC эластазы. CLEC эластазы лиофилизировали, как описано в примере 2.
В четвертом примере практического выполнения настоящего изобретения, как раскрыто здесь, фермент эстеразу (свиная печень) кристаллизовали из водного раствора 15 мг/мл белка в 0,25 М ацетата кальция с рН 5,6 при комнатной температуре. Полученные кристаллы струк-турировали глютаральдегидом с концентрацией 12,5% доя образования CLEC эстеразы. CLEC эстеразу лиофилизировали, как описано в примере 2.
В пятом примере раскрытого здесь практического выполнения настоящего изобретения фермент липазу (Geotrichum candidum) кристаллизовали из водного раствора 20 мг/мл белка в 50 мМ Трис с рН 7 при комнатной температуре. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 12,5% с образованием CLEC липазы. CLEC липазы лио-филизировали как описано в примере 2.
В шестом примере практического выполнения настоящего изобретения фермент лизоцим (белок куриного яйца) кристаллизовали из водного раствора 40 мг/мл белка в 40 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 5% натрия хлорида с рН 7,4 при комнатной температуре (Blake, C.C.F. и др., Nature 196: 1173 (1962)). Полученные кристаллы структурировали глюта-ральдегидом с концентрацией 20% для образования CLEC лозицима. CLEC лозицима лиофи-лизировали, как описано в примере 2.
В седьмом примере практического выполнения настоящего изобретения фермент аспара-гиназу (Escherichia coli) кристаллизовали из водного раствора 25 мг/мл белка в 50 мМ натрия ацетата и 33% этанола с рН 5,0 при 4С. Эта кристаллизация является модификацией проце-дуры, описанной Грабнером и др. в патенте США № 3664926 (1972). Как раскрыто здесь, по-лученные кристаллы структурировали глютаральдегидом концентрации 7,5% с получением CLEC аспарагиназы. CLEC аспарагиназы лиофилизировали, как описано в примере 2.
Другие ферменты, которые могут иммобилизироваться подобным образом и использо-ваться в качестве катализаторов и соответствующей реакции, включают люциферазу и уреазу. Другие ферменты, такие как перечисленные в таблицах 1-5, также могут быть кристаллизова-ны и структурированы с использованием настоящего способа, с получением желательных CLEC, которые могут быть, в свою очередь, использованы для катализа реакции, которая приводит к получению требуемого продукта или для катализа реакции, являющейся проме-жуточной стадией (то есть одной реакцией в ряде секций) в производстве выбранного про-дукта. Признано, что хотя структурирование способствует стабилизированию большинства кристаллов, оно не во всех случаях является необходимым или желательным. Некоторые кри-сталлические ферменты сохраняют свою функциональную и структурную целостность в гру-бых условиях окружающей среды даже при отсутствии структурирования. Хотя в предпочти-тельном выполнении кристалл является структурированным, структурирование не всегда необходимо для получения ферментного кристалла, используемого по настоящему способу.
CLEC-ферменты имеют несколько ключевых характеристик, которые сообщают им суще-ственные преимущества над традиционными методами иммобилизации ферментов, исполь-зуемыми в настоящее время. CLEC не нуждаются в отдельной инертной подложке. Отсут-ствие инертной подложки улучшит диффузию субстрата и продукта внутри CLEC и обеспе-чит внутри кристалла концентрацию фермента, близкую к теоретическому пределу загрузки для молекул такого размера. Высокие концентрации фермента могу т привести к значитель-ной рабочей экономии благодаря повышенной эффективной активности данного объема ка-тализатора, снижению времени контакта субстрата с ферментом и общему уменьшению раз-мера завода и капиталовложений (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371 - 379 (1987)). Равномерное распределение по объему кристалла и повышенная стабильность составляющего его фермента в CLEC создают новые возможности применения ферментных катализаторов в сложных условиях, таких как повышенная температура, а водные, органические и почти без-водные растворители, а также их смеси. Кроме того, ограниченный доступ растворителя и постоянное белковое окружение в кристаллической решетке должно привести к улучшенно-му удержанию металлических ионов и ко-факторов CLEC по сравнению с традиционными системами иммобилизованных ферментов.
Фиг.1 графически представляет результаты оценки ферментной активности растворимого термолизина и CLEC термолизина.
Фиг.2 графически представляет результаты сравнения зависимостей рН CLEC термоли-зина и растворимого термолизина.
Фиг.3 графически представляет измерения активности растворимого и кристаллического термолизина после инкубирования при 65С.
Фиг.4 графически представляет результаты оценки сопротивления растворимого и CLEC термолизина внешней протеолитической деградации.
Фиг.5 графически представляет результаты оценки ферментной активности для раство-римой эластазы и соответствующей CLEC-эластазы.
Фиг.6 графически представляет сопротивление растворимой эластазы и соответствующей CLEC - эластазы внешней (экзогенной) протеолитической деградации.
Фиг.7 графически представляет результаты оценки ферментной активности для раство-римой эстеразы и соответствующей CLEC-эстеразы.
Фиг.8 графически представляет сопротивляемость растворимой эстеразы и соответству-ющей CLEC-эстеразы экзогенной протеолитической деградации.
Фиг.9 графически представляет результаты оценки ферментной активности для раство-римой липазы и соответствующей CLEC-липазы.
Фиг.10 графически представляет результаты оценки ферментной активности растворимо-го лизоцима и соответствующего CLEC-лизоцима.
Фиг.11 графически представляет результаты оценки ферментной активности раствори-мой аспарагиназы и соответствующей CLEC-аспарагиназы.
Очень полезной была бы простая, общая процедура, обеспечивающая стабильность и функционирование конкретного фермента или их набора при условиях, представляющих ин-терес для химика, занимающегося синтезом, и которые чересчур грубы для использования с ферментами по известным до сих пор методам. Структурированные кристаллы иммобилизо-ванных ферментов (упоминаемые как CLEC или CLIEC), как описано здесь, могут использо-ваться для этой цели. Стабилизация кристаллической решетки и составляющих ее фермент-ных катализаторов в кристалле путем структурирующей реакции позволяет использовать CLEC в таких средах, как водные, органические или почти безводные растворители, смеси этих растворителей, крайних значениях рН и повышенных температурах, которые несовме-стимы с функционированием ферментов, полученных традиционными методами. Кроме того, стабилизирование кристаллической решетки в CLEC позволяет осуществлять лиофилизацию CLEC стандартными методами. Лиофилизированные CLEC могут храниться в течение ком-мерчески привлекательных периодов времени (от месяцев до лет) в отсутствие охлаждения, и способствуют быстрому и простому использованию CLEC в процессах лабораторного и про-мышленного масштаба посредством простого добавления желаемых растворителей, без необ-ходимости промежуточных процедур замены растворителей. CLEC также обладают высокой резинстентностью к их перевариванию экзогенными протеазами. Способ по настоящему изобретению облегчает применение универсальных ферментных катализаторов в основных промышленных химических процессах, а также в лабораторном синтезе новых соединений для исследований.
Хотя структурирование повышает стабильность кристаллического фермента, оно не явля-ется необходимым или желательным во всех случаях. Некоторые кристаллические ферменты сохраняют свою функциональную и структурную целостность в тяжелых условиях даже при отсутствии структурирования. Предпочтительное выполнение настоящего изобретения предусматривает структурирование кристаллического фермента и подробно описано в сле-дующих разделах. Однако следует понимать, что кристаллические ферменты, не структури-рованные в последующем, также могут использовать в некоторых выполнениях настоящего изобретения.
Регулярные взаимодействия между составляющими ферментными молекулами в кристал-лической решетке CLEC приводят к хорошо определенным порам ограниченного размера, ведущим к ферментным молекулам внутри тела CLEC. В результате субстраты большего раз-мера, чем размер пор, не смогут проникнуть в тело CLEC частицы.
Как следствие ограниченного размера пор, многие ферментативные реакции, представ-ляющие коммерческий и научный интерес, включающие субстраты больше размера пор CLEC, будут находиться вне объема настоящего изобретения. Они могут включать большин-ство реакций с использованием крупных полимеров, таких как белки, полинуклеотиды, по-лисахариды и другие органические полимеры, а также другие органические полимеры, у ко-торых количество полимерных субъединиц будет таким, что полимер станет больше размера пор CLEC. В таких примерах, однако, катализ все-таки будет иметь место на поверхности CLEC.
Настоящим изобретением является способ иммобилизации выбранного белка, в частности фермента, путем кристаллизации и структурирования этого белка, приводящим к производ-ству структурированного кристалла иммобилизованного фермента (CLEC), который может использоваться для катализного производства желаемого продукта, такого как пептид, угле-вод, липид или хиральная органическая молекула. Настоящее изобретение далее касается та-ких CLEC, а также способа изготовления выбранного продукта посредством CLEC - катали-зированной реакции или CLEC - катализированной стадии в серии реакций. В одном из вы-полнений настоящего изобретения дипептидильный предшественник аспартама был получен в реакции конденсации, катализированной посредством структурированного иммобилизиро-ванного термолизина, полученного по настоящему способу. В другом выполнении изобрете-ния индикаторный субстрат, FAGLA, расщепили с получением колориметрического продук-та, присутствие которого указывает на ферментативную активность у CLEC - термолизина. FAGLA - гидролиз использовали в качестве модельной реакции для установления устойчиво-сти CLEC - термолизина в некоторых средах, которые обычно несовместимы с активностью этого фермента.
В других выполнениях настоящего изобретения ферменты эластаза, эстераза, липаза, ас-парагиназа и лизоцим использовали для расщепления различных указанных веществ, таких как р-нитрофенил ацетат (эстеразой и липазой), сукцинил-(ала)-3-р-нитроанилид (эластазой), 4-метилумбелли-ферил N-ацетил-хитриозида (лизоцимом) и NADH (аспарагиназой).
Используя способ по настоящему изобретению, средний специалист в данной области может приспособить протокол способа для изготовления желаемого продукта с помощью ре-акции, катализируемой иммобилизированным ферментом. Интересующий фермент, будучи кристаллизован из подходящего раствора, может быть структурирован глютаральдегидом или другим пригодным бифункциональным реагентом в кристаллизационном растворе для полу-чения CLEC этого фермента. В последующем CLEC фермента может быть лиофилизирован, как описано в примере 2.
Использование CLEC предлагает несколько преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время методами ферментативного катализа. Например, структурированная кри-сталлическая матрица CLEC обеспечивает ему свою собственную опору. Чтобы связать фер-ментный катализатор, дорогие носители - шарики, стекла, гели и пленки, - как в известных методах иммобилизации, теперь не нужны. В результате концентрация фермента в CLEC близка к теоретическому пределу загрузки, который может быть достигнут для молекул дан-ного размера, значительно превышающих плотности, доступные даже в концентрированных растворах. Весь CLEC состоит из активного фермента (а не нейтрального носителя), и таким образом, связанное с ухудшением диффузии снижение скорости ферментативной реакции, обычно наблюдаемое с ферментами, иммобилизированными традиционными методами по сравнению с ферментами в растворе, будет сведено до минимума, поскольку средний размер свободного пути для субстрата и продукта между активным ферментом и свободным раство-рителем будет в значительной степени сокращен для CLEC (по сравнению с ферментом, им-мобилизованными традиционными методами на частицах носителях). Эти высокие плотно-сти белка будут особенно полезны в биодатчиках, при аналитических и других применениях, требующих больших количеств белка в малом объеме. В промышленных процессах превосхо-дящая производительность и компактность CLEC приводит к значительным производствен-ным экономиям посредством повышения эффективной активности данного объема катализа-тора, позволяя при этом уменьшить размер завода, а также капиталовложения (Daniels, M.J. Methods in Enzymol. 136:371-379 (1987). CLEC - ферменты являются относительно монодис-персными, микроскопического размера и с формой, отражающей естественные характеристи-ки роста кристалла отдельного ферментного катализатора. Замена имеющейся среды иммоби-лизированного на носителе фермента на CLEC - ферменты не вызовет затруднений, посколь-ку обе системы сравнимы по размеру и форме, и обе могут быть аналогичным образом вос-становлены из сырья путем любого количества простых методов, включая основные приме-няемые экономичные процедуры, такие как фильтрование, центрифугирование, декантация растворителя и др.
Кроме того, использование лиофилизированных CLEC - ферментов позволяют простое обращение и хранение этих материалов перед их использованием (сухое хранение при ком-натной температуре без охлаждения в течение продолжительных периодов времени). Лиофи-лизированные CLEC - ферменты также обеспечивают простое составление рецептур путем непосредственного добавления растворителей и субстратов, представляющих интерес, без длительных процедур замены растворителей или образования аморфных суспензий. Лиофи-лизированная форма CLEC расширяет область общего применения ферментов в качестве ка-тализаторов до более широкого спектра ферментов и условий их функционирования.
Вторым преимуществом CLEC является то, что структурирование кристаллизированного фермента стабилизирует и укрепляет кристаллическую решетку и составляющие ферменты молекулы, как механически, так и химически. В результате, CLEC может быть единственным средством достижения значительных концентраций активного ферментного катализатора в тяжелых условиях водных, органических, почти безводных растворителей или в смесях вод-но-органических растворителей. Использование ферментов в качестве катализаторов в реак-циях органического синтеза было затруднительно вследствие их тенденции к денатурации в присутствии неводных растворителей, и особенно, в смесях водных и неводных растворите-лей (Klidanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141-144 (1989)). У CLEC - ферментов ограничение конформационной мобильности, приводящей к стабильности, обеспечивается посредством межмолекурлярных контактов и поперечных связей между составляющих фер-ментных молекул, создавая ферментную кристаллическую решетку, а не вследствие почти полного отсутствия воды в среде. В результате промежуточные концентрации воды могут переноситься (выдерживаться) ферментами, составленными в виде CLEC, что ранее было не-возможно (см.табл.12). В коммерческих применениях водно-органические смеси растворите-лей позволяют манипулировать образованием продукта посредством использования преиму-ществ относительной растворимости продуктов и субстратов. Даже в водных средах фер-ментные катализаторы, иммобилизированные или растворимые, подвергаются в химическом реакторе механическим усилиям, которые могут приводить к денатурации и сокращению их полупериода разложения. Химические поперечные связи внутри CLEC - ферментов обеспе-чивают необходимую механическую прочность (Quiocho b Richards, Proc. Natl. Acad. Sci (США) 52: 833-839 (1964)), что приводит к повышению срока работы в реакторе ферментного катализатора.
Третье преимущество CLEC происходит из его кристаллической природы, и состоит в том, что CLEC может достичь однородности по всему объему структурированного кристалла. Описанные здесь кристаллические ферменты выращивают и структурируют в водной среде, и поэтому расположение (порядок) молекул внутри кристаллической решетки остается пра-вильным и равномерным. Эта равномерность поддерживается межмолекулярными контакта-ми и химическими поперечными связями между молекулами фермента, составляющими кри-сталлическую решетку, даже когда осуществляют перенос в другую водную, органическую или почти безводную среду, или смешанные водные/органические растворители. Во всех этих растворителях молекулы фермента поддерживают равномерную дистанцию друг от дру-га, образуя хорошо определенные стабильные поры в кристаллах CLEC, которые облегчают доступ субстрата к ферментному катализатору, а также удаление продукта. Постоянство фер-ментативной активности является крайне важным (критическим) условием для промышлен-ных, медицинских и аналитических применений, когда первостепенное значение имеют вос-производимость и постоянство результата.
Четвертым преимуществом использования CLEC является то, что кристаллический фер-мент проявляет повышенный срок работы и хранения. Решеточные взаимодействия даже в отсутствие поперечных связей, как известно, стабилизируют белки отчасти благодаря огра-ничению конформационных степеней свободы, необходимых для денатурации белка. В CLEC - ферментах взаимодействия в решетке, будучи фиксированными химическими попе-речными связями, особенно важны для предотвращения ненатурации, особенно в смесях вод-ных и безводных растворителей (Klidanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences 14: 141-144 (1989)). Ферменты, находившиеся в кристаллическом состоянии месяцы и годы, обычно со-храняют высокий процент их каталитической активности. Структурированные кристаллы иммобилизированного фермента, сохраняемые в безводных растворителях, будут еще больше защищены от микробиального загрязнения и повреждения, что является серьезной проблемой при хранении больших количеств белка в водной среде, богатой питательными веществами. В случае лиофилизированного CLEC - фермента он хранится в отсутствии растворителя. Это, а также стабилизация, достигнутая структурированием, позволяет осуществлять хранение без охлаждения в течение длительных периодов времени.
Пятым преимуществом использования CLEC является то, что он проявляет повышенную температурную стабильность вследствие поперечных связей, стабилизирующих кристалличе-скую решетку. Проведение реакций при более высоких температурах, чем используемые при традиционных методах, повысит скорости химических реакций, представляющих интерес, как термодинамически, так и ввиду повышения скорости диффузии вещества в и из кристал-лической решетки CLEC. В сочетании эти эффекты представляют значительное улучшение эффективности реакции, потому что они могут увеличить до максимума производительность данного количества ферментного катализатора, который как правило является наиболее доро-гостоящим компонентом реакционного процесса (Daniels, M.J. Methods in Enzymol. 136% 371-379 (1987)). Температурная стабильность CLEC - ферментов значительна вследствие того, что большинство ферментных систем требует мягких условий реакции. CLEC - ферменты будут также стабилизированы против денатурации при временном повышении температуры при хранении.
Последним преимуществом использования CLEC является то, что в нижележащей кри-сталлической решетке между отдельными ферментными молекулами образованы поры пра-вильного размера и формы. Это ограничение доступа растворителя существенно повышает характеристики удерживаемости CLEC - ферментами ионов металла и ко-фактора по сравне-нию с традиционными иммобилизированными ферментами и ферментами в растворе. Это свойство CLEC позволит использовать более выгодные экономически процессы непрерывно-го потока (см., например, Oyama и др. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)) в ситуациях, когда ферменты иначе были бы инактивированы посредством утечки иона металла или ко-фактора. Например, в осуществляемом с помощью термолизина синтезе дипептидильного предшественника аспартама - Z - L - Asp - L - Phe - OМe известно, что традиционно иммоби-лизированный фермент теряет каталитическую активность в процессах постоянного потока, проходящих в колоннах, отчасти вследствие утечки ионов кальция, необходимых для актив-ности фермента термолизина. На практике, утечка ионов кальция приводит к тому, что при-ходится использовать менее эффективные периодические процессы (Наканиши и др., Биотех-нология, 3: 459-464 (1985)). Утечка происходит, когда комплексы ионов кальция образованы субстратом Z - L - Asp, в конкуренции с природными сайтами связывания кальция на поверх-ности фермента, приводящей к потере каталитической активности. Высокая плотность фер-мента в кристаллах CLEC и соответственно ограниченное пространство, доступное для рас-творителя в промежуточных пустотах кристаллов, мешает образованию конкурирующих L - Asp - Ca++ комплексов, ответственных за утечку ионов металла.
CLEC - кристаллизация фермента
Кристалл иммобилизованного фермента (CLEC) приготавливают следующим образом. Кристаллы фермента выращивают путем контролируемого осаждения белка из водного рас-твора, или из водного раствора, содержащего органические растворители. Условия подлежа-щие контролю, включают, например, скорость выпаривания растворителя, присутствие соот-ветствующих растворенных веществ и буферов, в также рН и температуру. Подробный обзор различных факторов, затрагивающих кристаллизацию белков, был опубликован МакФерсо-ном в Methods Enzymol. 114: 112 (1985). Кроме того, и МакФерсон, и Гиллиланд (см. J. Cristal Growth 90: 51-59 (1988)) составили обширные списки всех белков и нуклеиновых кислот, о которых сообщалось как о кристаллизуемых, а также условия, ведущие к их кристаллизации. Коллекция кристаллов и рецептов кристаллизации, а также хранилище данных о раствори-мых белках и нуклеиновых кристаллических структурах содержится в Белковом Банке Дан-ных (Protein Data Bank, см. Bernstein и др., J.Mol. Biol. 112: 535-542 (1977) в Брукхэвенской национальной лаборатории. Эти ссылки могут быть использованы для установления условий, необходимых для кристаллизации данного белка или ранее кристаллизованного фермента, в качестве предпосылки для образования соответствующего CLEC, и могут дать указания по составлению кристаллизационной стратегии для белков, которые ранее не кристаллизова-лись. Альтернативно, во многих случаях, продуманная стратегия поиска путем проб и оши-бок (см., например, Картер и Картер, J. Biol.Chem. 254: 12219-12223 (1979)) может дать подхо-дящие условия кристаллизации большинства белков, включая, но не только, белки, обсуж-давшиеся выше, при том условии, что для них может быть достигнута приемлемая степень чистоты. Требуемая степень чистоты может значительно различаться у разных белков. В слу-чае лизоцима, например, фермент кристаллизовали непосредственно из его неочищенного источника - белка куриного яйца (Гиллиланд, J. Cristal Growth 90: 51-59 (1988).
Для использования в качестве CLEC в способе по настоящему изобретению не требуются крупные отдельные кристаллы, которые необходимы для дифракции рентгеновских лучей, а фактически могут быть нежелательны вследствие диффузионных проблем, связанных с раз-мером кристалла. Мелкокристаллические материалы (с кристаллами порядка 10-1 мм размера в поперечном сечении) пригодны для CLEC и часто наблюдались, хотя о них редко сообщалось в литературе по рентгеновской кристаллографии. Микрокристаллы очень полезны в способе по настоящему изобретению для сведения к минимуму проблем, связанных с диффузией (см., например, Quiocho F.A. и Richards F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967).
В общем кристаллы получают путем соединения белка, подлежащего кристаллизации, с соответствующим водным растворителем или водным растворителем, содержащим осадители (приципитирующие агенты), такие как соли или органические вещества. Растворитель со-единяют с белком при температуре, которую определяют экспериментально, чтобы она под-ходила для вызывания кристаллизации и была приемлемой для поддержания стабильности и активности белка. Растворитель по желанию может включать дополнительные растворенные вещества, такие как двухвалентные катионы, ко-факторы и хаотропы, а также виды буферов для контролирования уровня рН. Необходимость дополнительно (совместно) растворенных веществ и их концентрации определяют экспериментально для того, чтобы облегчить кри-сталлизацию. В процессе промышленного масштаба контролируемое осаждение (преципита-ция), ведущее к кристаллизации, лучше всего проводить путем простого соединения белка, осадителя, растворенных веществ и, возможно, буферов в периодическом процессе. Также могут быть приспособлены альтернативные лабораторные методы кристаллизации, такие как диализ или паровая диффузия. МакФерсон (Methods Enzymol. 114: 112 (1985) и Гиллиланд (J. Cristal Growth. 90: 51-59 (1988)) включают в свои обзоры в литературе по кристаллизации по-дробные списки пригодных параметров. В некоторых случаях несовместимость между сши-вающим реагентом и средой для кристаллизации может потребовать перенос кристаллов в более подходящую систему растворителя.
Многие из белков, для которых ранее уже были описаны условия кристаллизации, обла-дают значительным потенциалом в качестве практических ферментных катализаторов в про-мышленных и лабораторных химических процессах, и непосредственно относятся к веще-ствам типа CLEC в объеме настоящего изобретения. Табл.1 представляет образцы ферментов, которые уже кристаллизовали ранее. Следует заметить, что условия, сообщаемые в большин-стве из этих ссылок, были оптимизированы для выращивания крупных кристаллов дифрак-ционного качества, часто с большим трудом. В некоторых случаях для изготовления меньших кристаллов для получения CLEC необходима некоторая подгонка параметров.
Получение CLEC - реакция структурирования.
Если кристаллы выращивали в подходящей среде, то они могут быть структурированы. Структурирование приводит к стабилизации кристаллической решетки посредством введе-ния в нее ковалентных связей между составляющими кристалл молекулами фермента. Это позволяет осуществлять перенос фермента в другую реакционную среду, которая иначе была не несовместимой с существованием кристаллической решетки, или даже с существованием интактного нативного белка. Структурирование может быть достигнуто с помощью большого разнообразия бифункциональных реагентов, хотя на практике был выбран недорогой реагент - глютаральдегид.
(С целью ознакомления со списком представителей доступных структурирующих реаген-тов, см., например, каталог 1990 г. компании Pierce Chemical.).
Структурирование с помощью глютаральдегида образует сильные ковалентные связи, в первую очередь, между лизиновыми аминокислотными остатками и между молекулами фер-мента в кристаллической решетке, составляющей кристалл. Структурные взаимодействия предотвращают обратный выход в раствор составляющих кристалл молекул фермента, эффек-тивно иммобилизуя (или делая нерастворимыми) молекулы фермента в микрокристалличе-ских частицах (в идеале размером 10-1). Эти макроскопические, иммобилизованные, нерас-творимые кристаллы могут затем легко отделяться от сырья и непрореагировавшего субстрата посредством простых приемов, таких как фильтрование, декантация и др. Эти кристаллы также могут использоваться в колоннах, заполняемых CLEC в непрерывных поточных про-цессах, в которых они демонстрируют улучшенные свойства удерживать металлические ионы и ко-факторы.
CLEC - ферменты получают с целью их использования в качестве ферментных катализа-торов в известных и новых средах. Повышенная стабильность CLEC-ферментов, происходя-щая от реакции структурирования, позволяет переносить CLEC в растворитель (например, водный, органический или почти безводный, или в их смесь), который иначе был бы несов-местимым с этим ферментом, и проводить химические процессы в реакторе при высоких температурах и экстремальном рН. Макроскопические частицы CLEC - катализаторы позво-ляют легко с ними обращаться, восстанавливать их из сырья простыми методами, такими как фильтрование, центрифугирование или декантация растворителя. Кроме того, они могут ис-пользоваться для заполнения колонн непрерывных химических процессов.
Получение CLEC - лиофилизация
Суспензию одного объема структурированных кристаллов термолизина в десяти объемах деминерализованной воды при рН 7,0 лиофилизировали до утра с использованием лиофили-затора ВирТис (VirTir) Модель # 24. Лиофилизированные кристаллы хранили при комнатной температуре или при 4С перед их реконституцией (восстановлением содержания жидкости), которую осуществляли посредством добавления десяти объемов выбранного растворителя непосредственно на кристаллы, взятые после хранения. Регидратированные кристаллы вос-станавливали в 10 мМ кальциево-ацетатном буфере с рН 7,0 для экспериментов по FAGLA - расщеплению. Восстановленные лиофилизированные кристаллы обычно хранили при ком-натной температуре. Напротив, растворимый фермент требует хранения при -70С для под-держания его специфичной активности в течение периода, превышающего неделю. Этот по-рядок (протокол) использовали для всех ферментов, описанных в нижеприводимых приме-рах, включенных в описание.
Синтез предшественника аспартама с помощью CLEC - термолизина
Способ по настоящему изобретению, согласно которому получают структурированные кристаллические ферменты, описывается далее на примерах производства структурирован-ных кристаллов иммобилизованного термолизина для использования в процессе получения дипептидильного предшественника аспартама в среде этил-ацетата, который является почти безводным растворителем. Термолизин - белок, который был кристаллизован ранее, и струк-тура которого была разрешена при 1,6Е разрешении (см. Холмс и Мэтьюз J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)), является одним из примеров фермента, который может использоваться в ка-честве CLEC по настоящему способу. Термолизин используется в производстве искусствен-ного подсластителя аспартама (Исова и др., патент США №4436925 (1984); Линдеберг, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985); Ояма и др. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987). В настоящее время большая часть аспартама, очевид-но, производится традиционного подхода химического синтеза, хотя использование иммоби-лизованного известными методами термолизина в почти безводной среде дело обнадежива-ющие результаты. (Ояма и др., J. Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Усовершенствование ферментативного подхода к производ-ству аспартама, которое возможно посредством использования настоящего способа, позволит ему конкурировать с используемым в настоящее время способом, как в отношении удобства, так и стоимости (Ояма и др. Methods in Enzymol 136: 503-516 (1987)).
Оценка CLEC-термолизина
Вышеописанные процедуры использовали для получения CLEC-термолизина, которые оценивали в отношении их рН-зависимости и стабильности, стабильности при повышенных температурах, резистентности к экзогенному протеолизу и стабильности в присутствии орга-нического растворителя. CLEC-термолизина сравнивали с растворимым термолизином, как подробно описано в примере 2 и на фиг. 1-4. Результаты оценки показали следующее.
1. Что касается рН-зависимости и стабильности, обе формы продемонстрировали макси-мальную активность при рН 7 и продемонстрировали аналогичную активность в кислом диа-пазоне. В щелочном диапазоне CLEC сохраняет свою максимальную активность до рН 10; растворимый термолизин обладает 75%-ной активностью при рН 8,5, только 25%-ной актив-ностью при рН 9, и неактивен совершенно - при рН 9,5.
2. Дополнительная стабилизация, достигнутая у CLEC-фермента, приводит к фермента-тивной активности при более высоких температурах, чем это возможно с растворимым тер-молизином. Повышенная стабильность CLEC-термолизина при более низких температурах позволяет упростить его хранение по сравнению с хранением растворимого фермента. Тем-пературная стабильность и резистентность к автолизу были также продемонстрированы для CLEC-термолизина, кристаллы которого сохраняли максимальную активность через пять по-сле их инкубирования при 65С. Напротив, растворимый термолизин утратил 50% своей ак-тивности через 2 часа инкубирования и продемонстрировал незначительную активность через 24 часа инкубирования при 65С.
3. Ферментативная активность CLEC термолизина осталась без изменений после четы-рехдневного инкубирования в присутствии мощной стрептококковой протеазы - Проназы. Напротив, растворимый термолизин быстро деградировал и утратил всю свою активность через 90 минут такой инкубации.
4. CLEC-термолизин и растворимый термолизин продемонстрировали заметно различ-ную стабильность в присутствии органических растворителей, как показано в табл.12. CLEC термолизина сохранили более чем 95% своей максимальной активности после инкубирования со всеми органическими растворителями, с которыми проводилась оценка.
Эти характеристики CLEC термолизина и других ферментов делают их особенно полез-ными, поскольку их легче хранить, они более стабильны и труднее теряют активность или деградируют, чем соответствующие растворимые ферменты.
Оценка CLEC-эластазы
Также получали CLEC-эластазу, которую оценивали в отношении ее активности и рези-стентности к экзогенному протеолизу. CLEC-ферменты эластазы сравнивали с растворимой эластазой, как описано подробно в пример 3 и на фиг. 5 и 6. Результаты оценки продемон-стрировали следующее.
1. CLEC-эластаза сохраняет приблизительно 50% активности по сравнению с раствори-мым ферментом.
2. Растворимая эластаза быстро разрушалась протеазой. Активность растворимой эласта-зы была снижена до 50% исходной активности после 10 минут инкубирования в присутствии протеазы. Через час инкубирования растворимый фермент утратил более 90% своей первона-чальной активности. Напротив, ферментативная активность эластазных структурированных кристаллов осталась незатронутой инкубированием с протеазой.
Оценка CLEC-эстеразы
Также получали CLEC-эластазу, которую оценивали в отношении ее активности и рези-стентности к экзогенному протеолизу. CLEC-эстеразу сравнивали с растворимой эстеразой, как детально описано в примере 4 и табл. 7 и 8. Результаты оценки продемонстрировали сле-дующее.
1. CLEC-эстераза сохраняет примерно 50% активности по сравнению с растворимым ферментом.
2. Растворимая эстераза была высокочувствительной к протеолитической деградации. Активность растворимой эстеразы снизилась до 50% исходной активности через десять минут инкубирования в присутствии протеазы. После часа инкубирования растворимого фермента он утратил более 90% исходной активности. Напротив, ферментативная активность CLEC-эстеразы не пострадала от инкубирования в присутствии протеазы.
Оценка CLEC-липазы
Также получали CLEC-липазу, которую оценивали в отношении ее активности, CLEC-липазу сравнивали с растворимой липазой, как детально описано в примере 5 и на фиг. 9. Результаты этой оценки продемонстрировали, что CLEC-липаза сохраняет прибилизительно 90% активности по сравнению с растворимой липазой.
Оценка CLEC-лизоцима
Также получали CLEC-лизоцим, который оценивали в отношении его активности и рези-стентности к экзогенному протеолизу. CLEC-лизоцим сравнивали с растворимым лизоци-мом, как детально описано в примере 6 и на фиг. 10. Результаты этой оценки продемонстри-ровали, что CLEC-лизоцим сохраняет приблизительно 50% активности по сравнению с рас-творимым ферментом.
Оценка CLEC-аспарагиназы
Также получали CLEC-аспарагиназу, которую оценивали в отношении ее активности. CLEC-аспарагиназу сравнивали с растворимой аспарагиназой, как детально описано в при-мере 7 и на фиг. 11. Результаты оценки продемонстрировали следующее: CLEC-аспарагиназа сохраняла приблизительно 77% активности по сравнению с растворимым ферментом.
Общая применимость CLEC-ферментов
Как раскрыто в настоящем описании, CLEC-ферменты представляют собой новую техно-логию с широким применением во многих областях, включая, но не только, синтезы про-мышленного масштаба, лабораторные методики, биодатчики и медицинские применения. В табл. 2-5 ниже приведены примеры различных систем, использующих при их осуществлении традиционные методы иммобилизации ферментов. Специалист в данной области сможет приспособить эти и подобные им системы к CLEC-технологии, раскрытой в настоящей заяв-ке. Для иллюстрации этого ниже обсуждаются конкретные примеры более подробно для каж-дой из этих категорий применения.
Табл. 2 ниже приводит список примеров, использующих ферменты, иммобилизованные традиционными методами, в промышленных процессах, которые (примеры) могут быть легко адаптированы к раскрытой здесь CLEC-технологии.
Производство акриламида с использованием CLEC-технологии.
Ниже приводится описание использования изобретения: а именно приспосабливание производства акриламида из иммобилизованных клеток, которые перепроизводят фермент нитрил-гидразу (Haгасава Т. и Ямада X. Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)), к CLEC-технологии, описанной выше.
Производство акриламида в промышленном масштабе, этого важного в химии вещества, описано Ямадой и его сотрудниками (Нагасава Т. и Ямада Х. Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)). Тысячи тонн акриламида в год производятся в химических реакторах, загружен-ных иммобилизованными клетками, выбранными в качестве перепроизводителей фермента нитрилгидратазы. Нитрилгидратаза, как сообщалось ранее, очищалась и кристаллизовалась из двух источников. - Brevibakterium R 312 (Нагасава и др. Biochem. Biophis. Res. Commun. 139: 1305-1312 (1986) и P. Chlororaphis B23 (Нагасава и др., Eur. J. Biochem. 162: 691-698 (1987)). Как здесь раскрыто, эти кристаллические ферменты, каждый могут быть иммобилизированы посредством их структурирования глютаральдегидом или другим подходящим сшивающим реагентом для получения CLEC-фермента. CLEC нитрилгидратазы могут быть затем исполь-зованы в традиционном реакторе вместо иммобилизованных клеток, используемых в настоя-щее время. Приспособление этого процесса к CLEC-технологии ведет к немедленным пре-имуществам. Эти преимущества включают уменьшение размера завода и повышенный выход вследствие увеличения активности на единицу объема вследствие более высокой концентра-ции фермента в CLEC-ферментах и улучшенной диффузии субстрата и продукта, снижение нежелательного загрязнения микроорганизмами и побочными реакциями вследствие более высокой чистоты CLEC-фермента, а также благодаря более низкой чувствительности к мик-робиальному загрязнению из-за отсутствия клеток. Кроме того, имеются и другие преимуще-ства, присуще только технологии CLEC. Эти преимущества включают более высокую рабо-чую температуру для повышения скорости реакции; способность работы в водных, органиче-ских и почти безводных растворителях, позволяющих оптимизировать реакцию получения акриламида; а также продление срока хранения им работы вследствие более высокой химиче-ской стабильности и механической прочности CLEC, что особенно заметно в нетрадицион-ных растворителях.
Применение CLEC-технологии в медицине для экстракорпорального лечения
Соответственно выбранный CLEC-фермент или набор CLEC-ферментов также могут ис-пользоваться для медицинского применения. Такой фермент или набор ферментов могут ис-пользоваться, например, для удаления компонента жидкости, такой как кровь, обычно путем изменения компонента и, таким образом, превращая его в вещество, не оказывающее вредно-го воздействия на пациента, которое может выводиться из организма нормальными процес-сами (например, посредством детоксикации, или разложения в печени, почечной экскреци-ей). В таком применении соответствующим образом выбранный CLEC-фермент или их набор приводится в контакт с тканевой жидкостью, содержащей компонент, подлежащий измене-нию, или содержащей реагент (продукт или субстрат) реакции, в которой участвует такой компонент, на который (компонент или реагент) действует данный фермент. В результате, фермент способен воздействовать на компонент, подлежащий изменению, или реагировать с другим веществом, которое является продуктом реакции, в которой участвует компонент, подлежащий изменению. Активность фермента приводит либо к непосредственному измене-нию компонента, подлежащего удалению, либо к изменению продукта реакции, в которой такой компонент участвует, делая таким образом невозможным продолжение этой реакции. Это может быть осуществлено посредством использования экстракорпорально (то есть “вне тела”) устройства, которое включает соответствующим образом выбранный CLEC-фермент или их набор и удерживающее средство из некоего материала, такого как пористый материал, на котором удерживается CLEC, или трубка, в которой может находиться CLEC, позволяю-щее (средство) осуществить контакт между самим компонентом или веществом в жидкости, являющимся продуктом реакции, в которой данный компонент, подлежащий изменению, принимает участие.
Это также может быть достигнуто посредством введения соответствующего CLEC в при-годную полость тела, такую как брюшина или лимфатический узел, где CLEC мог бы иметь доступ к жидкостям организма. Такое введение может быть выполнено хирургическим путем, либо посредством инъекции суспензии CLEC. Введение CLEC непосредственно в кровь бы-ло бы неподходящим, учитывая высокий риск эмболии (закупорки сосудов).
Использование соответствующих CLEC в этой области могло бы послужить альтерна-тивной генетическим методам, применяемым в терапии заменой фермента для исправления врожденного дефекта, такого как, например, фенилкетонурия.
Табл. 3 иллюстрирует некоторые из медицинских применений, в которых может быть ис-пользован CLEC. Для большинства их этих случаев экстра-корпоральное лечение находится еще в стадии исследований, но преимущества, предлагаемые CLEC, могли бы предложить новые методы лечения в тех областях, в которых ранее не было альтернативного лечения.
Конкретным примером применения настоящего способа является система гепаринлиазы для удаления гепарина из крови (Берштейн и др., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987), обсуждаемая ниже.
Все экстракорпоральные устройства, через которые перекачивается кровь, такие как устройство для почечного диализа, фильтры артериовенозной крови непрерывного действия или экстракорпоральные мембранные оксигенаторы, требуют введения гепарина пациенту для предотвращения свертывания крови. Однако гепаринизация пациента к геморрагическим осложнениям и остается угрозной для здоровья человека. Эти проблемы возрастают по мере увеличения времени перекачивания крови, например в случае мембранного оксигенатора, и могут привести к серьезной потере крови. После экстракорпоральной терапии гепарин может быть удален из крови с помощью гепариназного устройства (т.е. содержащего гепариназу) на выходе этого экстракорпорального устройства, которое устраняет весь гепарин из крови, воз-вращаемой пациенту, и избегает таким образом имеющиеся в настоящее время проблемы, свя-занные с гепаринизацией.
Опубликованные исследования (Лангер и др., Science 217: 261-263 (1982); Бернштейн и др., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987); подробно излагают проблемы, возникающие при использовании в экстракорпоральных устройствах ферментов, иммобилизованных тра-диционными методами. Главная проблема состоит в том, что традиционная иммобилизация приводит к плохому удержанию ферментативной активности на единицу объема, что требует больших объемов иммобилизованного фермента для осуществления необходимой гепарини-зации. Этот слишком велик, чтобы иметь практическое значение для лечения человека. Напротив, высокая удерживаемость активности на единицу объема у CLEC - фермента благо-даря отсутствию инертных подложек позволяет обойти эту проблему и предлагает практиче-ское решение проблемы удаления гепарина у человека. Повышенная стабильность CLEC по-низит скорость вымывания (диссассоциации) фермента из структурированного кристалла. Это превосходит менее стабильные ферменты, иммобилизированные традиционными мето-дами, также вследствие того, что иммунные реакции, происходящие из-за утечки фермента, будут меньше (ослаблены). Температурная стабильность CLEC - фермента предотвращает де-натурацию фермента при временном повышении температуры во время хранения; представ-ляется возможным хранить CLEC при комнатной температуре с сохранением высокой актив-ности фермента. Кроме того, CLEC будет дешевле и удобнее использовать, чем аналогичные ферменты, иммобилизованные традиционными методами вследствие их более длительного периода работы и хранения.
Дополнительные применения CLEC - технологии: биодатчики
CLEC или набор CLEC-ферментов могут использоваться в качестве компонента сенсора (датчика), называемого здесь “биодатчиком”, который может использоваться для обнаружения и/или количественного анализа интересующего вещества (аналита) в жидкости, такой как тканевая жидкость (например, кровь, моча), промышленная и лабораторная среда для химиче-ской реакции, органические среды, вода, культуральная среда и напитки. В некоторых случа-ях интересующей текучей средой может быть газ, как, например, в анализаторе для обнару-жения алкоголя в выдыхаемом воздухе. (Барзана, Клибанов и Карелл, NASA Tech. Brief 13:104 (1989)). В этом применении соответствующим образом выбранный CLEC или их набор приводят в контакт с текучей средой (т.е. с жидкостью или газом), подлежащей иссле-дованию в качестве аналита. Интересующий аналит может быть измерен непосредственно (например, уровень содержания глюкозы в крови) или непрямым образом (например, посред-ством обнаружения или количественного определения вещества, являющегося реактантом (продуктом или субстратом) в реакции, в которой участвует интересующий аналит. В любом из них CLEC способен оказывать свое действие на аналит или вещество, являющееся реак-тантом в реакции, в которой также участвует аналит. Активность фермента приводит к обна-ружимым изменениям (например, изменению рН, производству света, тепла, изменению электрического потенциала), которое обнаруживается или количественно измеряется соответ-ствующими средствами детекции (например, электродами рН-метра, световыми или тепло-выми датчиками, средствами для измерения изменений электричества) (Яната и др., Anal. Chem. 63:33P-44P (1990)). Могут использоваться любые средства, которые могут обнаружи-вать изменения, происходящие в процессе ферментного катализа. Биодатчики по настоящему изобретению включают CLEC или их набор и средства для удерживания CLEC, которые поз-воляют осуществлять контакт между CLEC и интересующим аналитом или веществом в теку-чей среде, которое является реактантом в реакции, в которой участвует интересующий ана-лит. Табл. 4 иллюстрирует некоторые из применений биодатчиков, в которых могут исполь-зоваться CLEC - ферменты.
В настоящее время в некоторых применениях используются иммобилизованных фермен-ты, но при этом возникают проблемы, связанные с низкой стабильностью, низкой плотно-стью фермента, коротким периодом его жизни и отсутствием воспроизводимости результа-тов. Эти примеры могут быть легко адаптированы к раскрытой здесь CLEC - технологии.
В способе по настоящему изобретению, используемом для проведения анализа образцов в биодатчике, особенно желательно получить обнаружимый сигнал максимально возможной силы от наименьшего возможного количества субстрата и катализатора. В этом отношении раскрытая здесь CLEC - технология является особенно притягательной, поскольку она позво-ляет достичь наивысшей возможной концентрации ферментного катализатора в данном объ-еме.
Часто предпринимаются значительные усилия для того, чтобы совместить интересующую конечную ферментативную реакцию, осуществляемую непосредственно или через подходя-щие промежуточные соединения, с производством света ферментами типа люциферазы (Кур-киярви и др., Methods in Enzymol. 137:171-181 (1988)). Это делается, чтобы использовать чув-ствительность и эффективность оборудования, обнаруживающего фотоны, что при соответ-ствующих условиях позволяет обнаруживать фемто-молярные концентрации продуктов фер-ментативной реакции. Следуя этому принципу, ранее были созданы биосенсорные системы с использованием ферментов, иммобилизованных традиционными методами для обнаружения различных субстратов, представляющих медицинский и др. интерес. Реакции, производящие свет, могут быть совмещены с реакциями в экспериментах по обнаружению таких субстратов, как D-глюкоза, L-лактат, L-глютамат и этанол, среди прочих, при крайне низких концентра-циях субстрата.
Что касается вышеупомянутого применения, фермент люциферазу из Vibrio harvevii уже кристаллизовали, как сообщалось Свансоном и др., J. Biol. Chem. 260:1287 - 1289 (1985). Кри-сталлы этой люциферазы могут быть структурированы глютаральдегидом или другим при-годным реагентом с образованием CLEC - люциферазы. Для аналитического и биосенсорно-го применений CLEC - люцифераза предлагает много преимуществ по сравнению с фермен-тами, иммобилизованными традиционными методами. У CLEC весь объем будет состоять из излучающего свет фермента люциферазы. У иммобилизованного традиционным методом фермента, однако, 95% общего объема занято “инертным” носителем, который действует ско-рее как поглотитель света, излучаемого ферментом. Кроме того, повышенная стабильность CLEC - фермента облегчит его хранение при комнатной температуре, и также сделает воз-можными новые сенсорные применения в жестких условиях и при повышенных температу-рах.
Дополнительные применения CLEC - технологии - лабораторные реакции
CLEC - ферменты могут использоваться в качестве лабораторных реагентов в маленьких колонках или в периодических процессах, которые могут использоваться для проведения ла-бораторных реакций. Некоторые из широких категорий реакций показаны в табл.5.
Шнейдер и др. Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 (N 1): 64-68 (1984) иллюстрирует как можно использовать ферменты в процессах органического синтеза. Эстеразу печени свиньи приме-няли в процессе трансформирования мезо-эфира в хиральный мезо-эфир в водном фосфатном буфере.
Преимущество использования в лаборатории реакций, катализируемых посредством CLEC, является тройным. Во-первых, CLEC сохраняет высокую активность в жестких усло-виях (например, в водных, органических, почти безводных растворителях и их смесях, и при высоких температурах), типичных для лабораторных опытов по химическому синтезу. Во-вторых, CLEC проявляет высокую стабильность при работе и хранении, что подходит для периодически прерывающихся лабораторных опытов. В-третьих, высокая активность CLEC на единицу объема позволит сократить время реакции и уменьшить необходимые объемы фермента (на единицу активности). Таким образом, преимущества, которыми обладают CLEC-ферменты по сравнению со свободными или иммобилизованными ферментами, дают химикам-органикам альтернативу, представляющую собой высоко избирательный, искус-ственный инструмент.
Во всех вышеописанных примерах, но не только, способ по настоящему изобретению может быть приспособлен специалистом в данной области для преобразования способа, ис-пользующего катализатор в виде иммобилизованного традиционным методом фермента, для использования CLEC соответствующего фермента. CLEC - ферменты не только могут заме-нить ферменты, иммобилизованные традиционными методами, но также могут использовать-ся в преобразованиях, вызываемых клетками. Далее настоящее изобретение будет проиллю-стрировано следующими примерами, которые никоим образом не предназначены для ограни-чения объема изобретения.
Пример 1. Кристаллизация и структурирование термолизина для синтеза предшественни-ка аспартама. -Z-Asp-Phe-OMe Кристаллизация. 250 мг термолизина от Bacillus thermoproteolyticus, закупленного у компании Берингер-Мангейм ГмбХ, растворили в 4 мл 45%-ного диметил-сульфоксида (ДМСО) и 55%-ного 1,40 М ацетата кальция, 0,50 М какоди-лата натрия для рН 6,5. Эти исходные условия аналогичны описанным Мэттьюзом и др. для производства крупных кристаллов термолизина (дифракционного качества), см., например, Холм и Мэттьюз. J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982). Раствор белка затем концентрировали до 1 мл в микро-концентраторе “Центрикон”-10. Хороший выход микрокристаллов был получен способом мгновенной кристаллизации, теперь раскрытом в этом описании, по которому 1 мл воды, или 1,40 М ацетата кальция, 0,50 М какодилата натрия с рН 6,5, быстро вводили в тот или иной ДМСО-термолизиновый раствор, описанный выше. Этим способом получают мно-жество гексагональных микрокристаллов примерно одинаковых размеров (длиной примерно 10-1 мм).
Структурирование микрокристаллов термолизина.
Процедуры, использованные в этом конкретном примере выполнения способа по изобре-тению, являются приспособлением протокола, описанного Наканиши и др., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985), согласно которому термозилин сначала адсорбировали на гранулированный носитель, составленный из ионообменной смолы Амберлит XAD-7, а затем иммобилизирова-ли посредством его структурирования глютаральдегидом (Квичо и Ричардс, - Proc . Natl. Acad. Sci (США) 52: 833 - 839 (1964). В этом примере микрокристаллы полученного термоли-зина центрифугировали и пеллетировали (осаждали), а надосадочную жидкость выбрасывали. Затем к микрокристаллам добавляли 5 мл 17,5%-ного технического глютаральдегида в 2,5% ДМСО, 0,05 М ацетата кальция и 0,025 М какодилата натрия с рН 6,5. Смесь инкубировали при легком перемешивании в течение 4 ч при 37°С. Реакцию структурирования прекращали повторной промывкой кристаллов 10 мл для аликвотами воды для удаления раствора глюта-ральдегида. Промытые структурированные кристаллы термолизина и составляют тот CLEC - термолизин, который использовали ниже в качестве катализатора.
Синтез Z - Asp - Phe - OМe в водном растворе.
5 мл суспензии CLEC - термолизина добавляют в периодический раствор с постоянным перемешиванием, инкубируемый при 37°С. После центрифугирования и декантации надоса-дочной жидкости к CLEC добавляли водную реакционную среду. Этот раствор приготавли-вали путем смешивания 80 мг Z - (L - Asp) и 80 мг (L - Phe) - OМe - HCI в 1 мл воды, с добав-лением уксусной кислоты для получения рН 7,0. Образцы анализировали посредством HPLC. Ниже таблицы 6 показывает высоту результатов по HPLC - исследованию субстрата Z - (L - Asp), нормализованных к 1 при времени t = 0. Поскольку Z - (L - Asp) ограничивает скорость этой реакции, то измерение уменьшения количества этого вещества эквивалентно измерению появления продукта - Z - (L - Asp) - (L - Phe) - OМe (Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985). Кроме нормализованной высоты результатов HPLC по субстрату Z - (L - Asp) табл.6 включает также оценку степени завершенности реакции. Ясно, что реакция выходит на уро-вень прибилизительно 20% завершенности в течение первых 30 с и затем стабилизируется на этом уровне. Эти результаты также согласуются с наблюдениями Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985), полученными с использованием термолизина, иммобилизо-ванного традиционным методом в водной реакционной среде, аналогичной вышеуказанной, и могут быть объяснены плохой растворимостью продукта, -Z- (L-Asp) - (L - Phe) - OМe, в воде.
Синтез Z - Asp - Phe - OMe в почти безводном растворе.
5 мл суспензии CLEC - термолизина добавляют в реактор периодического действия с по-стоянным перемешиванием, который инкубируют при 37С. После центрифугирования и декантации надосадочной жидкости к CLEC добавляли почти безводную органическую реак-ционную среду. Этот раствор приготавливали путем смешивания 80 мг Z - (L - Asp) и 240 мг (L - Phe) - ОМе в 1 мл 99% этил-ацетата с 1% воды. Образцы анализировали посредством HPLC. Табл. 7 ниже представляет нормализованные по высоте результаты по содержанию Z - (L - Asp) в зависимости от длительности реакции, которые нормализованы к 1 при времени t = 0. Поскольку Z - (L - Asp) ограничивает скорость этой реакции, измерение уменьшения это-го вещества эквивалентно измерению возникновения продукта Z - (L - Asp) - (L - Phe) - ОМе (Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Табл. 7 включает нормализованное остаю-щееся количество ограничивающего Z - (L - Asp) субстрата и оценку степени завершенности реакции. В данном случае реакция прошла до 70%-ной завершенности в течение первых 30 секунд и стабилизировалась на этом уровне. Эти результаты также согласуются с наблюдени-ями Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985), полученными с использованием термо-лизина, иммобилизованного традиционным методом, в почти безводной реакционной смеси, и могут быть объяснены с ингибированием фермента получаемым продуктом.
Пример.2. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация термолизина и оценка ха-рактеристик полученного продукта.
Кристаллизация термолизина
Термолизин (компании Диава Казеи К.К., Япония) растворяют в 10 мМ ацетата кальция (Сигма), с рН 10,0, до концентрации 10% (вес/об.) рН раствора поддерживают на уровне 10,0 посредством его титрования 2 М раствором NaOH. После полной солюбилизации (растворе-ния) раствор белка титруют до рН 2 М раствором HCI. Добавляют сухой ацетат кальция до 1,2 М. Затем добавляют до 30% диметил сульфоксид (Сигма). Белок концентрируют до 100 мг/мл посредством ультрафильтрации в приборе Амикон (мембрана 10,000 MWCO). Концентриро-ванный фермент затем делили на аликвоты и хранили при -70°С. Термолизин кристаллизуют путем добавления 9 объемов деминерализованной воды к 1 мл концентрированного (100 мг/мл) белкового раствора. Раствор кратковременно встряхивают и оставляют до утра при комнатной температуре. Кристаллы промывают 10 объемами 10 мМ ацетата кальция с рН 7,0 и выделяют посредством центрифугирования малой скорости (10 мин, при 1500 • G, центри-фуга Бекман GPR).
Быстрое добавление воды к концентрированному (100 мг/мл) раствору термолизина вы-зывает образование кристаллов, которые становятся видимыми при небольшом увеличении в течение 10 минут. Размер кристаллов воспроизводимым образом зависит от конечной кон-центрации белка. Три объема воды на один объем концентрата термолизина (100 мг/мл) дают 0,5 миллиметровые по длине гексогональные палочки-кристаллы качества для рентгеногра-фии, которые соответствуют кристаллам, описанным ранее Колманом с сотр. (Колман, Янсо-ниус и Мэттьюз, J. Mol. Biol. 70: 701-724 (1972), что подтверждено нами с помощью дифрак-ционного анализа. Добавление десяти объемов воды к одному объему белкового концентрата уменьшает длину получаемых кристаллов до 0,05 мм. Эти микрокристаллы являются предпо-чтительными в применениях CLEC, поскольку у них уменьшаются диффузионные проблемы, связанные с размерами кристаллов (см. Квиочо и Ричардс, Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967). В одной конкретной партии белка размер кристаллов выдерживается постоянным. (В этом исследовании использовали кристаллы размером 0,05-0,10 мм длины для того, чтобы облег-чить точное отмеривание пипеткой суспензий кристаллов). Денситометрическое сканирова-ние SDC - PAGE показало шестикратную очистку фермента при кристаллизации, что суще-ственно повышает специфичную активность CLEC. Кристаллизация привела к 20%-ному снижению общей активности CLEC - белка по сравнению с растворимым термолизином, ко-гда его исследовали посредством спектрофотометрического расщепления дипептидного суб-страта фурил-акрилоил-глицил-L-лейцинамид (FAGLA), как описано ниже.
Cтруктурирование кристаллов термолизина.
Кристаллы термолизина структурировали в течение 3 часов при комнатной температуре в растворе 12,5%-ного глютаральдегида (Сигма), 5% ДМСО и 50 мМ Трис с рН 6,5. Структури-рованные кристаллы промывали трижды деминерализованной водой и выделяли центрифу-гированием малой скорости, как описано в отношении кристаллизации термолизина. Хими-ческое структурирование кристаллов фермента стабилизирует кристаллическую решетку и составляющие ее молекулы фермента в кристалле достаточным образом для того, чтобы поз-волить практическое использование CLEC в средах, которые иначе несовместимы с функци-онированием фермента. При спектрофотометрическом исследовании посредством монито-ринга расщепления дипептидного субстрата FAGLA, описанного ниже, не было обнаружено заметного различия в ферментативной активности между структурированными и неструкту-рированными кристаллами. Кроме того, структурирование стабилизирует CLEC до такой степени, что они могут быть лиофилизированы, с сохранением полной ферментной активно-сти при их восстановлении в водных, органических и смешанных водно-органических рас-творителях, как показано в табл.1 и табл.8. Хотя кристаллизация приводила к 30%-ному сни-жению специфичной активности у CLEC - фермента по сравнению с растворимым термоли-зином, структурирование и лиофилизация CLEC в дальнейшем не уменьшали его специфич-ную активность.
Ферментативная активность растворимого и CLEC-термолизина
Каталитическую активность растворимого и CLEC-термолизина оценивали (Федер и Шук, Biochemistry 9:2784-2791 (1970) посредством гидролиза блокированного дипептидного субстрата фурилакрилоил-глицил-L-лейцин-амида (FAGLA) (Швейцерхолл). Расщепление амидных связей измеряли спектрофотометрически посредством уменьшения поглощения при длине волны 345 нм. Исходная концентрация фермента составила 10-7 М согласно определе-нию содержания белка по Брэдфорду и денситометрическому сканированию (Фармация LKB UltroScan XL) окрашенных Кумасси гелей SDS-PAGE. CLEC-фермент был определен как восстановленные лиофилизированные структурированные кристаллы термолизина. Раство-римый фермент был определен как термолизин, концентрированный до 100 мг/мл. Фермент добавляли к 5 мл реакционного объема, содержащего субстрат. В указанные моменты брали аликвоты реакционной смеси и измеряли из поглощение при 345 нм. CLEC - термолизин от-деляли от реакционной смеси путем кратковременного центрифугирования (Бекман, микро-центрифуга серии Е) перед считыванием поглощения. Поглощение использовали в уравне-нии скорости псевдо-первого порядка и рассчитывали путем деления этого подогнанного значения на концентрацию фермента (Программа “Мультифит 2.0 Подгонка Кривой” для компьютера Эппл Макинтош, Day Computing P.O. Box 327, Милтон, Кембридж, СВ4 6WI, Великобритания (1990).
рН-зависимоть и стабильность
Оптимальный уровень рН и стабильность растворимого фермента сравнивали с этими характеристиками CLEC - термолизина посредством расщепления дипептидного субстрата FAGLA. Результаты показаны на фиг. 2 и табл. 9. Как растворимый, так и кристаллический фермент продемонстрировал максимальную активность при рН 7,0 CLEC и растворимый термолизин также продемонстрировали сходную активность в кислом диапазоне, и колоко-лообразный рН-профиль, полученный у растворимого фермента, хорошо согласовался с опубликованными данными (Федер и Шук, Biochemistry 9:2784-2791 (1970). Однако в щелоч-ном диапазоне кристаллический фермент сохраняет максимальную активность до рН 10,0 тогда как растворимый фермент имеет 75%-ную активность при рН 8,5, и только 25%-ную активность при рН 9. При рН 9,5 растворимый фермент совершенно неактивен.
Стабильность при повышенных температурах
При осуществлении определенных химических процессов при более высоких температу-рах могут быть достигнуты более высокие скорости реакции и более короткое время диффу-зии для субстратов и продуктов, которые обычно ограничиваются температурной стабильно-стью субстратов и продуктов. Однако при ферментном катализе на температуру проводимого процесса накладывает на практике ограничение, связанное с утратой фермента его активно-сти. Дополнительная стабилизация, достигаемая у CLEC, позволяет им проявлять фермента-тивную активность при значительно более высоких температурах, чем это возможно для рас-творимых ферментов.
Повышенная стабильность при более низких температурах упрощает обычное долговре-менное хранение CLEC - катализаторов. Например, растворы растворимого термолизина, концентрированные до более чем 50 мг/мл, необходимо хранить при 80°С, чтобы сохранить максимальную ферментативную активность. При комнатной температуре активность обычно утрачивается в течение дня. Напротив, регидратированный CLEC - термолизин может хра-ниться обычным образом при комнатной температуре в течение месяцев без заметной потери активности. Представляется, что невосстановленный лиофилизированный CLEC - термоли-зин может сохранять жизнеспособность в течение неограниченных периодов времени.
Температурная стабильность и резистентность к автолизу были продемонстрированы у CLEC - термолизина после инкубирования его при 65°С в течение пяти последовательных дней (см. фиг.3 и табл. 10). CLEC - термолизин сохраняет максимальную активность после пятидневного инкубирования при повышенной температуре. Напротив, растворимый термо-лизин теряет 50% своей исходной активности после всего лишь двух часов инкубирования и демонстрирует незначительную активность после 24-часового инкубирования при 65°С.
Активность растворимого и CLEC - термолизина измеряли после его инкубирования при 65°С. Растворимый термолизин инкубировали в 10 мМ ацетате кальция, 50 мМ Трис с рН 7,0 в водяной бане 65°С. Реакционный объем составлял 500 л. Конечная концентрация белка составляла 10 мг/мл. Аликвоты брали через 0, 1, 2, 4, 6, 10 и 18 часов. Образцы исследовали SDS-PAGE или расщеплением FAGLA при комнатной температуре, как описано выше. Для CLEC - термолизина 250 л суспензии кристаллов в 10 мМ ацетата кальция и 50 мМ Трис также инкубировали в 65С водяной бане. Активность исследовали через 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 и 120 часов посредством FAGLA - расщепления.
Резистентность к экзогенному протеолизу
Также проводили оценку резистентности CLEC - термолизина к действию экзогенной протеазы. SDS-PAGE анализ (электрофорез на полиакриламидом геле с додецил-сульфатом натрия) предполагает, что коммерческие ферменты могут содержать значительный процент загрязняющих веществ, некоторые из которых могут обладать протеолитической активностью против основных видов растворимых ферментов. Имея упаковку молекул фермента в кри-сталлическую решетку, можно предположить, что внутренние молекулы фермента у CLEC будут защищены от протеолиза. Чтобы проверять эту возможность, CLEC - термолизин и препарат растворимого фермента инкубировали в присутствии стрептококковой протеазы, -Проназы, -неспецифичной протеазы, способной переваривать большинство белков до сво-бодных аминокислот (Каталог 1990, Calbiochem; La Jolla, Канада).
Растворимый и CLEC - термолизин инкубировали в 50 мМ Трис с рН 7,5 при 40С в при-сутствии Проназы (Калбиохем). Соотношение Проназы и термолизина составляло 1:40. Для ингибирования автолиза термолизина и предотвращения протеолитического разрушения проназы термолизином к реакционной среде растворимого фермента добавляли ЭДТК до ее конечной концентрации 100 мМ (ЭДТК ингибирует активность термолизина, но не проназы). В указанное время из реакционной смеси брали аликвоты и исследовали спектрофометриче-ски активность фермента путем расщепления дипептидного субстрата FAGLA. Чтобы устра-нить ингибирование термолизина присутствием ЭДТК, спектрофометрическое исследование активности растворимого фермента осуществляли в 0,5 М кальциево-ацетатном буфере с рН 7,0 и концентрацию фермента повышали вдвое. Структурированный кристаллический фер-мент исследовали, как было описано выше.
Как можно видеть на фиг. 4 и табл. 11, растворимый термолизин быстро разрушался и те-рял всю свою активность через 90 минут инкубирования. Напротив, активность CLEC - тер-молизина осталась той же после четырехдневного инкубирования в присутствии протеазы. Эта почти неуязвимость к протеолизу представляет особый интерес в диагностических при-менениях биосенсорного типа, когда может потребоваться работа подходящего CLEC в при-сутствии неизвестного коктейля встречающихся в природе протеолитических ферментов.
Стабильность в присутствии органического растворителя
Для того, чтобы ферменты приобрели идеальную приемлемость в качестве жизнеспособ-ных промышленных катализаторов, они должны быть способны функционировать без избы-точного воздействия на фактическую окружающую среду производственных процессов. В частности, эта среда должна включать использование водных, полярных и неполярных орга-нических растворителей, а также смесей. В коммерческих применениях водно-органические смеси растворителей позволяют управлять образованием продукта путем использования от-носительной растворимости продуктов и субстратов.
Растворимый термолизин и термолизиновые CLEC проявляют существенно отличающу-юся стабильность в присутствии органических растворителей (табл.12). Концентрации рас-творимого фермента, которые могли инкубироваться в органическом растворителе, были ограничены до максимум 10 мг/мл. Концентрации выше этого значения приводили к немед-ленному осаждению (преципитации) термолизина при добавлении органического раствори-теля. Напротив, концентрации CLEC - термолизина были ограничены только объемом, зани-маемым кристаллами. Растворимый термолизин сохраняет свою наибольшую активность (75%) после инкубирования в ацетоне и наименьшую (36%) - в тетрагидрофуране. Через 1 час инкубирования в присутствии ацетонитрила или диоксана растворимый фермент утрачивает приблизительно 50% своей исходной активности. CLEC - термолизин сохраняет более 95% своей максимальной активности после инкубирования со всеми испытанными органически-ми растворителями.
Стабильность в органических растворителях
CLEC - термолизина или препараты растворимого термолизина инкубировали в 50% (об/об) растворах указанных органических растворителей. 100л суспензии CLEC - термоли-зина (10 г/мл) в 10 мМ Трис рН 7 помещали в стеклянный сосуд емкостью около 2 мл (1/2 dram). Затем к белковому раствору добавляли 100 мл органического растворителя и кратко-временно встряхивали. CLEC и растворимый фермент инкубировали в присутствии органи-ческого растворителя в течение одного часа при 40С. После инкубирования активность фер-мента исследовали посредством расщепления дипептидного субстрата FAGLA, как уже опи-сано.
Предположительно, низкое содержание воды мешает развертыванию белковой молекулы на промежуточных этапах пути к ее денатурации. У CLEC, это ограничение конформацион-ной мобильности обеспечивается межмолекулярными связями и контактами составляющих фермент молекул, создающих кристаллическую решетку, скорее, чем почти полным отсут-ствием воды в среде. В результате, промежуточные концентрации водно-органического рас-творителя легко переносятся ферментами в виде CLEC, что ранее у ферментов не наблюда-лось (см. табл. 12). Это открытие открывает целые новые области химии синтеза для их раз-работки с использованием ферментного катализа.
Даже в почти безводных органических растворителях, однако, обычное использование ферментов было затруднено вследствие их тенденции образовывать неопределенные суспен-зии с проблемами образования комков и других явлений агрегации. Это свойство делает та-кие препараты в сущности непривлекательными для широкомасштабных промышленных процессов. Например, CLEC и составляющие ферменты в кристаллической решетке сохраня-ют монодисперсию во всех этих растворителях.
Сравнение с другими методами иммобилизации
В литературе было опубликовано несколько полезных обзоров на тему методов иммоби-лизации (Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984); Tramper, J. Trends in Biotechnology 3:45-50 (1985)). В этих источниках фермент всегда представляет собой небольшую часть от общего объема иммобилизованных частиц, основную массу которых составляет инертный материал носителя. Носитель увеличивает средний свободный путь между внешней средой раствори-теля вокруг частиц иммобилизованного фермента и активными сайтами этого фермента, усу-губляя диффузионные проблемы (Квиочо и Ричардс, Biochemistry 5: 4062-4076 (1967).
У CLEC структурированная матрица кристалла обеспечивает себе свою собственную опору, устраняя необходимость в носителе. В результате, концентрация фермента в CLEC близка к теоретическому пределу загрузку, который может быть достигнут для молекул дан-ного размера, значительно превышая плотности, достижимые даже в концентрированных растворах. Весь CLEC состоит из активного фермента и таким образом уменьшается до ми-нимума, связанное с проблемами диффузии снижение скорости ферментативной реакции, которое обычно наблюдают с ферментами, иммобилизованными традиционными методами по сравнению с ферментами в растворе (см. фиг. 1), поскольку средний свободный путь для субстрата и продукта между активным ферментом и свободным растворителем будет значи-тельно укорочен у CLEC (по сравнению с частицами носителя с традиционно иммобилизо-ванным ферментом). Важно, что составляющий CLEC фермент является, в сущности, моно-дисперсным, и может быть выделен простыми приемами с CLEC-частицами, такими как фильтрование, центрифугирование или декантация растворителя.
Пример 3. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация эластазы, и оценка харак-теристик получаемого продукта.
Кристаллизация эластазы
Лиофилизированную эластазу из поджелудочной железы свиньи растворяли в 0,1 М аце-тата натрия с рН 5,0 до концентрации 5 мг/мл (вес/об) при комнатной температуре. Палочко-образные кристаллы эластазы становились видимыми в течение одной минуты полного рас-творения белка. Кристаллизационный раствор переносили в холодильник с 4С и отставляли до утра для завершения кристаллизации. Кристаллы выделяли центрифугированием, как уже было описано.
Структурирование кристаллов эластазы
200 л объема кристаллов эластазы добавляли к 1,3 мл раствора 5,77% глютаральдегида и 1,5 М ацетата натрия с рН 5,0. Кристаллы структурировали в течение одного часа при мягком перемешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы промывали тремя объемами по 15 мл 0,2 М Трис с рН 8,0. CLEC-эластазу лиофилизировали, как описано в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-эластазы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-эластазы исследовали спектрофото-метрически посредством измерения гидролиза субстрата-сукцинил-(Ala)3 р-нитроанилида (Bachem) (Бит и др., Biochem. Med. 11:350-357 (1974) (см. табл. 13, фиг. 5). Расщепление ис-следовали на повышении поглощения при 410 нм. Исходная концентрация субстрата состав-ляла 2·10-4. Концентрация фермента была 2,8·10-7 М. CLEC или растворимый фермент до-бавляли к 5 мл реакционному объему, содержащему субстрат в 0,2 Трис с рН 8,0. Как описано выше, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси перед измерением поглощения.
Резистентность к экзогенному протеолизу
Также проводили оценку резистентности CLEC-эластазы к действию протеазы и при условиях, идентичных тем, которые использовали для термолизина (см. пример 2). Актив-ность растворимого и CLEC-фермента после их инкубирования с протеазой оценивали по-средством гидролиза нитроанилидного субстрата, как описано выше (табл. 14 и фиг. 6).
Пример 4. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация эстеразы, и оценка харак-теристик полученного продукта
Кристаллизация эстеразы
Как раскрыто в настоящем описании, 30 мг/мл суспензии сульфата аммония эстеразы из печени свиньи (Fluka) растворили в 0,25 М ацетата кальция с рН 5,6 при комнатной темпера-туре. Кристаллы эстеразы становились видимыми через несколько минут после добавления раствора ацетата кальция. Кристаллизационный раствор оставляли стоять при комнатной температуре и кристаллизацию завершали на следующее утро. Кристаллы выделяли посред-ством центрифугирования, как описано выше, в примере 2.
Структурирование кристаллов эстеразы
Как раскрыто здесь, 300 л кристаллов эстеразы добавляли к 5 мл раствора из 12,5% глю-таральдегида и 0,5 М ацетата натрия с рН 5,5. Кристаллы структурировали в течение одного часа при легком помешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы трижды промывали 15 мл 0,5 М ацетата кальция с рН 6,3. CLEC-эстеразу лиофилизировали, как описано выше, в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-эстеразы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-эстеразы оценивали спектрофотомет-рически посредством мониторинга гидролиза субстрата, - р-нитрофенилацетата (Fluka) (табл. 15 и фиг. 7). Расщепление изучали по усилению поглощения при 400 нм. Исходная концен-трация субстрата составляла 0,001%. Концентрация фермента была 1·10-8 М. CLEC или рас-творимый фермент добавляли к 5 мл реакционной среды, содержащей субстрат в 0,25 ацетата кальция с рН 6,3. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугирования перед измерением поглощения.
Резистентность к экзогенному протеолизу
Оценку резистентности CLEC-эстеразы к действию протеазы осуществляли при услови-ях, идентичных описанным для термолизина в примере 2. Активность растворимого и CLEC-фермента после их инкубирования с протеазой оценивали с помощью гидролиза субстрата, - р-нитрофенилацетата, как описано выше (см. табл. 16 и фиг. 8).
Пример 5. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация и оценка характеристик полученного продукта
Кристаллизация липазы
Как здесь раскрыто, фермент липазу (Geotrichum candidum) кристаллизовали паровой диффузией из водного раствора 20 мг/мл белка в 50 мМ Трис с рН 7, содержащего 8% сульфа-та аммония. Кристаллы в виде двойных пирамид становились видимыми через 20-30 дней инкубирования при комнатной температуре. Кристаллы выделяли посредством центрифуги-рования, как описано выше в примере 2.
Структурирование кристаллов липазы
Как здесь раскрыто, кристаллы липазы добавляли к раствору 12,5% глютаральдегида и 50 мМ Трис рН 5,6. Кристаллы структурировали в течение одного часа. После структурирования кристаллы промывали трижды 15 мл объемами 50 мМ Трис с рН 7,0. CLEC-липазы лиофили-зировали, как описано выше в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-липазы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-липазы исследовали спектрофометри-чески путем мониторинга гидролиза субстрата, - р-нитрофенилацетата (табл. 17 и фиг. 9). Расщепление изучали по увеличению поглощения при 400 нм. Исходная концентрация суб-страта составляла 0,005%. Концентрация фермента была 1,5·10-8 М. CLEC или растворимый фермент добавляли в 5 мл объем реакционной среды, содержащей субстрат в 0,2 М Трис с рН 7,0 при комнатной температуре. Как описано выше в примере 2. CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугирования перед измерением поглощения.
Пример 6. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация лизоцима, и оценка харак-теристик полученного продукта
Кристаллизация лизоцима
Следуя методу Блейка с сотр., Nature, 196: 1173 (1962), 200 мг лиофилизированного лизо-цима из белка куриного яйца (Берингер, Мангейм) растворяли в 2,5 мл 0,04 М натриево-ацетатном буфере с рН 4,7 при комнатной температуре. После растворения белка к раствору лизоцима по каплям при помешивании добавляли 2,5 мл 10%-ного хлорида натрия. Кристал-лизационный раствор оставляли стоять до утра при комнатной температуре и кристаллиза-цию завершали через 48 часов. Кристаллы выделяли посредством центрифугирования, как описано выше в примере 2.
Структурирование кристаллов лизоцима
Как описано здесь, 500 л объем кристаллов лизоцима добавляли к 10 мл 24%-ного глю-таральдегида и 50 мМ трис с рН 5,6 содержащим 20% хлорида натрия. Кристаллы структури-ровали в течение 20 минут при легком перемешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы промывали трижды 50 мл объемами 20 М ацетата кальция и 50 мМ хлорида калия с рН 5,3. CLEC-лизоцим лиофилизировали, как описано выше в примере 2.
Ферментативная активность растворимого и CLEC-лизоцима
Каталитическую активность растворимого и CLEC-лизоцима исследовали посредством измерения скорости гидролиза субстрата - 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-хитриозида (Fluka) Янг и Хамагучи, J. Biochem., 8:1003-1014 (1980) (табл. 18 и фиг. 10). Освобождение 4-метилумбеллиферона устанавливали флуорометрически (Perkin Elmer, модель LS-50). Исход-ная концентрация субстрата составляла 1,42·10-3. Концентрация фермента была 3·10-7. CLEC или растворимый фермент добавляли к 2 мл реакционной среды, содержащей субстрат в 20 мМ ацетата кальция и 50 мМ хлорида калия с рН 5,3 при 42С. Количество 4-метилумбеллиферона определяли флуорометрически, путем измерения флуоресценции при 450 нм с возбуждением при 360 нм. Ширина щели как для возбуждения, так и эмиссии была 10 мм. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посред-ством центрифугирования перед измерением флуоресценции.
Пример 7. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация аспарагиназы, и оценка характеристик полученного продукта
Кристаллизация аспарагиназы
В качестве модификации процедуры, описанной Грабнером с сотр., см. патент США №3664926 (1972), 25 мг лиофилизированной аспарагиназы (Worthington) растворяли в 500 мл 50 мМ натриево-фосфатного буфера с рН 7,2. Раствор охлаждали до 4С и рН доводили до 5,0 с помощью 1 М уксусной кислоты. Затем к раствору аспарагиназы по каплям добавляли хо-лодный (-20С) этанол до конечной концентрации 33%. Раствор инкубировали при 4С. Кри-сталлизацию завершали через 48 ч. Кристаллы выделяли посредством центрифугирования, как описано выше.
Структурирование кристаллов аспарагиназы
Как раскрыто здесь, кристаллы аспарагиназы структурировали в растворе из 7,5% глюта-ральдегида в 50 мМ натриево-фосфатного буфера с рН 5,6. После структурирования кристал-лы промывали пять раз 15 мл объемами 50 мМ Трис с рН 7,0. CLEC аспарагиназу лиофилизи-ровали, как описано выше в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-аспарагиназы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-аспарагиназы исследовали спектрофо-тометрически посредством измерения эфолюции иона аммония в сопряженной ферментатив-ной реакции, описываемой ниже (все реагенты были закуплены у фирмы Берингер Майгейм) (табл. 19 и фиг. 11).
L-аспарагин аспаргиназа аспарат+
-кетоглютарат глютамат-дегидрогеназа глютамовая кислота+NAD+
Окисление NADH измеряли по уменьшению поглощения при 340 нм Исходная концен-трация NADH составляла 1,4 мг/мл. Концентрация аспарагина была 10-3 М. Концентрация альфа-кетоглютарата была 10-4 М. Концентрация глютамат-дегидрогеназы составляла 10-7. Концентрация аспарагиназы была 2,3·10-8 М. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугировани перед измерением поглоще-ния.
Данное изобретение выделено из заявки США Сер. №07/562280, поданной 3 августа 1990 г.6 с названием “Структурированные кристаллы в качестве нового вида ферментной иммоби-лизации”.
Ферменты используются в качестве промышленных катализаторов для широкомасштаб-ного и лабораторного производства чистых и специальных коммерческих химикатов (Jones J.B., Tetrahedron, 42: 3351-3403 (C986), для производства пищевых веществ (Zaks и др., Trends in Biotechnology, 6: 272 - 275 (1988), а также в качестве средств для синтеза органических со-единений (Wong, C.-H. Science 244: 1145 - 1152 (1969), Chemtrasts-Org. Chem. Res. 23: 114 - 120 (1990); Klidanov A.M., Acc. Chem. Res. 23: 114 - 120 (1990)).
Ферментативное производство может существенно уменьшить загрязнение окружающей среды снятием бремени широкомасштабного производства неиспользуемых иным образом промежуточных химикалиев, таких как нитрил-гидратаза в производстве акриламида (Nagacawa, T., и Yamada, H., Trends in Biotechology 7 : 153 - 158 (1989).
Ферменты используют также в качестве биодатчиков для обнаружения различных ве-ществ, представляющих клинический, промышленный и проч. интерес (Hall, E., “Biosensors”, Open University Press, 1990). В области медицины ферменты могут использоваться для экстра-корпоральной терапии, такой как гемодиализ и гемофильтрация, при которых ферменты се-лективно удаляют из крови выделяемые и токсические вещества (Klein, M., и Zanger, R., Trends in Biotechnology 4: 179 - 185 (1986). В данных областях ферменты используют потому, что они эффективно работают в качестве катализаторов многих типов реакций при умерен-ных температурах, при субстратной специфичности и стереоселективности. Тем не менее имеются проблемы, связанные с использованием растворимых ферментных катализаторов, которые ограничивают их применение в промышленных и лабораторных химических про-цессах (Akiyama и др. CHEMТЕСН 627 - 634 (1988)).
Ферменты являются дорогими и относительно нестабильными по сравнению с большин-ством промышленных и лабораторных катализаторов, даже когда их используют в водной среде, в которой ферменты обычно работают. В обычной практике многие из наиболее эко-номически важных химических реакций несовместимы с водной средой, в которой, напри-мер, субстраты и продукты часто нерастворимы или нестабильны и в которой может оказы-вать существенное влияние гидролиз. Кроме того, выделение растворимого ферментного ка-тализатора из продукта и непрореагировавшего субстрата в сырье часто требует применения сложной и дорогой технологии сепарации. Наконец, ферменты трудно сохранять таким обра-зом, чтобы поддерживать их активность и функциональную целостность в течение коммерче-ски разумных периодов времени (от месяцев до нескольких лет) без того, чтобы прибегать к их замораживанию (от 4 до -80С и до температур жидкого азота), или трудно поддерживать в водных растворителях подходящей ионной силы, рН и т.д.
Методы ферментной иммобилизации во многих случаях обходят эти проблемы. Иммоби-лизация может улучшить стабильность ферментных катализаторов и защитить их функцио-нальную целостность в грубой среде растворителя и высоких температурах, характерных для промышленных и лабораторных химических процессов (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149 - 153 (1985)).
Процессы непрерывного потока могут осуществляться с иммобилизованными фермент-ными частицами в колонах, например, где растворимое сырье проходит через эти частицы и постепенно превращается в продукт. В настоящем описании, выражение “ферментная иммо-билизация” относится к переведению ферментного катализатора в нерастворимое состояние посредством его присоединения к, или инкапсуляцией, или агрегацией в макроскопические (10-1 мм) частицы.
В литературе имеется несколько полезных обзоров методов ферментной иммобилизации (Maugh, T.H. Science 223: 474 - 476 (1984), Tramper J., Trends in Biotechnology, 3: 45 - 50 (1985)). Maugh описывает пять основных подходов к иммобилизации ферментов. Они включают ад-сорбцию на твердых подложках (таких, как ионообменные смолы), ковалентное присоедине-ние к подложкам (таким, как инообменные смолы, пористые керамические или стеклянные шарики), захватывание в полимерные гели, инкапсулирование и осаждение растворимых белков посредством их структурирования с бифункциональными реагентами беспорядочным и неопределенным образом. Заявка ЕР-А-367302 (Соэджима и др.) описывает водораствори-мую структурированную протеазу 1 Ахромобактера для ее использования в процессе полу-синтезирования человеческого инсулина. ЕР-А-341503 (Висури) описывает водонераствори-мую гликозоизомеразу, которая образована кристаллическим ферментом, превращенным в твердую форму посредством его сшивания с диальдегидом (глютаральдегидом) в присутствии аминосодержащего соединения. Кроме того, можно иммобилизовать целые клетки (обычно неживые и сделанные проницаемыми), которые проявляют желательную ферментную актив-ность на высоком уровне (например, упомянутая на 1 стр. статья Нагасавы и Ямалы в “Тен-денциях в биотехнологии” 7: 153 - 158 (1989).
Каждая из этих процедур иммобилизации имеет свои преимущества и ограничения, и ни одну из них нельзя считать оптимальной или доминирующей. В большинстве из них фер-ментный катализатор в конечном счете представляет собой только небольшую фракцию (часть) от общего объема материала, присутствующего в химическом реакторе. Следователь-но, основная масса иммобилизованной среды выполнена из инертного, но зачастую дорого-стоящего материала-носителя. Во всех из них иммобилизирующее взаимодействие молекул ферментного катализатора друг с другом и/или с материаломносителем имеет тенденцию к неупорядоченности и неопределенности. В результате, хотя эти взаимодействия и придают некоторое увеличение стабильности молекулам ферментного катализатора, их относительная неспецифичность и нерегулярность делают эту стабилизацию неоптимальной и неравномер-ной. В большинстве случаев доступ к активному сайту ферментного катализатора остается неясным. Кроме того, вышеописанные иммобилизационные методы не могут решить про-блем, связанных с хранением и охлаждением. Также, как правило, эти методы не могут иметь дело с обычно иммобилизуемыми (традиционными) ферментами, например при замене одно-го растворителя на другой выбранный растворитель, без риска повредить структурную и функциональную целостность фермента. На практике, за исключением присоединенной к ним связующей группы для связывания их с материалом-носителем традиционно иммобили-зируемые ферменты имеют тесное сходство с растворимыми ферментами и разделяют вместе с ними чувствительность к денатурации и утрату функциональных свойств в грубой окружа-ющей среде. В общем, методы иммобилизации ведут к снижению наблюдаемых скоростей катализируемых ферментами реакций по сравнению с таковыми, полученными в растворе. Это главным образом является следствием пределов внутренней диффузии субстрата и внеш-ней (то есть направленной наружу) диффузии продукта внутри иммобилизованных фермент-ных частиц (Qniocho, F.A. и Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)). Необходимое присутствие инертного носителя в частицах с иммобилизованным ферментом увеличивает средний свободный путь между растворителем извне частицы с иммобилизованным фермен-том и активным сайтом ферментного катализатора, и этим усугубляет диффузионные про-блемы. Когда имеют дело с иммобилизованными клетками, то диффузионные проблемы осо-бенно ужесточаются, даже если клеточные стенки и мембраны сделаны проницаемыми для субстрата и продукта каким-либо образом. Далее, следует также учитывать множество по-бочных ферментных активностей, метоболиты и токсины, содержащиеся в клетках, а также стабильность клеток в грубых растворителях или высоких температурах рабочей среды. Со-вершенствование технологии иммобилизации, которое бы избегало недостатков используе-мых в настоящее время способов, требуется для использования ферментов в качестве про-мышленных катализаторов, особенно при производстве в большом масштабе (Daniels M.J., “Methods in Enzymology”, 136: 371 - 379 (1987).
Изобретение касается иммобилизации фермента путем образования кристалла фермента, в общем случае посредством структурирования кристаллов многофункциональным (бифунк-циональным) сшивающим агентом, а именно сшитых кристаллов иммобилизованного фер-мента, которые далее сокращенно называются СLEC или CLIEC, устройства, содержащего такой кристалл и используемого, например, в качестве биосенсора, а также способа получе-ния желаемого продукта (здесь - конкретно аспартама), с использованием сшитого белкового кристалла по изобретению.
По изобретению небольшие, размером 10-1 мм, кристаллы белка выращивают из водных растворов, или водных растворов, содержащих органические растворители, в которых фер-ментный катализатор является структурно и функционально стабильным. В предпочтитель-ном выполнении кристаллы затем структурируют посредством бифункционального реагента, такого как глютаральдегид. Это структурирование приводит к стабилизации контактов в кристаллической решетке между отдельными молекулами ферментного катализатора, состав-ляющими этот кристалл. В результате этой дополнительной стабилизации, структированные кристаллы иммобилизованного фермента могут работать при повышенной температуре, крайних рН и в грубой водной, органической и почти безводной средах, включая их смеси. Иными словами, CLEC по настоящему изобретению может функционировать в средах, несовместимых с функциональной целостностью соответствующих некристаллизованных, неструктурированных, нативных ферментов или иммобилизованных, традиционными мето-дами ферментных катализаторов.
Кроме того, CLEC могут быть подвергнуты лиофилизации с получением лиофилизован-ных CLEC, которые могут храниться в этом лоифилизированном виде при непониженных (комнатных) температурах в течение длительных периодов времени и которые могут быть легко восстановлены в водных, органических или смешанных водно-органических раствори-телях по выбору, без образования аморфных суспензий и с минимальным риском денатура-ции.
Изобретение относится также к их использованию в лабораторном и широкомасштабном промышленном производстве желаемых веществ, таких как хиральные органические молеку-лы, пептиды, углеводы, жиры или другие химические вещества. В настоящее время эти веще-ства обычно получают традиционными химическими методами, которые могут требовать грубых условий (например, водных, органических или почти безводных растворителей, сме-шанных водно-органических растворителей или повышенных температур), которые несовме-стимы с функциональной целостностью некристаллизованных, неструктурированных, на-тивных ферментных катализаторов. В предлагаемую CLEC-технологию также могут быть введены другие макромолекулы с каталитической активностью. Эти молекулы могут вклю-чать каталитические антитела (Lerner, R.A., Benkovic, S.J., и Schultz, P.G. Science 252: 659-667 (1991) и каталитические полинуклеотиды (Сech, T.R., Call 65: 667 - 669 (1991). Celander D.W. и Cech, T.R., Science, 251: 401 - 407 (1991)).
Изобретение также относится к способу изготовления выбранного продукта посредством реакции, катализованной CLEC по настоящему изобретению.
В практическом примере выполнения способа по настоящему изобретению фермент тер-молизин, -цинк-металлопротеазу-, использовали для синтезирования хирального предше-ственника дипептидильного искусственного подсластителя - аспартама. Фермент термолизин кристаллизовали из исходного водного раствора, состоящего из 45% диметилсульфоксида и 55% 1,4 М ацетата кальция, 0,05М накодилата натрия с рН 6,5. Полученные кристаллы струк-турировали глютральдегидом с образованием CLEC термолизина. CLEC термолизина затем переносили из водного кристаллизационного раствора, в котором они изготавливались, в раствор этилацетата, содержащий субстраты, -N-/бензилоксикарбонил/-L-аспартовую кислоту Z-(L-Asp) и L-фенилаланин метиловый эфир (L-Phe)-OMe. CLEC термолизина затем исполь-зовали для катализирования реакции конденсации двух субстратов для синтезирования N-/бензилоксикарбонил/-L-аспартил-L-фенилаланин метилового эфира Z-(L-Asp)-(L-Phe)-OMe, который является дипептидильным предшественником искусственного подсластителя - ас-партама. С использованием одной из многих известных технологий (см. например, Lindeberg, G.J. Chem. Ed. 64: 1062 - 1064 (1987)). L-аспартовая кислота в синтезированном дипептидиль-ном предшественнике может быть лишена защиты путем удаления бензилоксикарбонильной (Z) группы для получения аспартама (L-Asp)-(L-Phe)-OMe.
Во втором примере практического выполнения настоящего изобретения фермент термо-лизин использовали для получения CLEC термолизина. Активность и стабильность CLEC термолизина сравнивали с этими характеристиками растворимого термолизина при опти-мальных условиях, а также при условиях экстремальных рН и температуры, с последующей инкубацией в присутствии органических растворителей и последующей инкубацией в при-сутствии экзогенной протеазы.
Фермент термолизин кристаллизовали из раствора 1,2 М ацетата кальция и 30% диметил-сульфоксида, с рН 8.0. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом при кон-центрации 12,5% с образованием CLEC термолизина. CLEC термолизина затем лиофилизи-ровали стандартной процедурой (Cooper, T.G., The Tools of Biochemistry. стр. 379 - 380 (изд. Джон Уилей и Сыновья, Нью-Йорк, 1977) с образованием лиофилизированного фермента CLEC термолизина. Этот лиофилизированный CLEC трансформировали непосредственно с различных водных, органических и смешанных водно-органических растворителях по выбо-ру, без промежуточной процедуры замены растворителя, без образования аморфных суспен-зий, и с минимальным риском денатурации. Эти растворители включают ацетонитрил, диок-сан, ацетон и тетрагидрофуран, но не отключая и другие. После инкубирования активность исследовали спектрофометрически посредством расщепления дипептидного субстрата FAGIA (фурилакрилоил-глицил-L-лейцин-амид).
В третьем примере практического выполнения изобретения фермент эластазу (из свиной поджелудочной железы) кристаллизовали из водного раствора 5,5 мг/мл белка в 0,1 М натрий ацетата с рН 5,0 при комнатной температуре (Сойер Л. и др. Ж.Мол. Биол. 118: 137 - 208). По-лученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 5% для образова-ния CLEC эластазы. CLEC эластазы лиофилизировали, как описано в примере 2.
В четвертом примере практического выполнения настоящего изобретения, как раскрыто здесь, фермент эстеразу (свиная печень) кристаллизовали из водного раствора 15 мг/мл белка в 0,25 М ацетата кальция с рН 5,6 при комнатной температуре. Полученные кристаллы струк-турировали глютаральдегидом с концентрацией 12,5% доя образования CLEC эстеразы. CLEC эстеразу лиофилизировали, как описано в примере 2.
В пятом примере раскрытого здесь практического выполнения настоящего изобретения фермент липазу (Geotrichum candidum) кристаллизовали из водного раствора 20 мг/мл белка в 50 мМ Трис с рН 7 при комнатной температуре. Полученные кристаллы структурировали глютаральдегидом с концентрацией 12,5% с образованием CLEC липазы. CLEC липазы лио-филизировали как описано в примере 2.
В шестом примере практического выполнения настоящего изобретения фермент лизоцим (белок куриного яйца) кристаллизовали из водного раствора 40 мг/мл белка в 40 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 5% натрия хлорида с рН 7,4 при комнатной температуре (Blake, C.C.F. и др., Nature 196: 1173 (1962)). Полученные кристаллы структурировали глюта-ральдегидом с концентрацией 20% для образования CLEC лозицима. CLEC лозицима лиофи-лизировали, как описано в примере 2.
В седьмом примере практического выполнения настоящего изобретения фермент аспара-гиназу (Escherichia coli) кристаллизовали из водного раствора 25 мг/мл белка в 50 мМ натрия ацетата и 33% этанола с рН 5,0 при 4С. Эта кристаллизация является модификацией проце-дуры, описанной Грабнером и др. в патенте США № 3664926 (1972). Как раскрыто здесь, по-лученные кристаллы структурировали глютаральдегидом концентрации 7,5% с получением CLEC аспарагиназы. CLEC аспарагиназы лиофилизировали, как описано в примере 2.
Другие ферменты, которые могут иммобилизироваться подобным образом и использо-ваться в качестве катализаторов и соответствующей реакции, включают люциферазу и уреазу. Другие ферменты, такие как перечисленные в таблицах 1-5, также могут быть кристаллизова-ны и структурированы с использованием настоящего способа, с получением желательных CLEC, которые могут быть, в свою очередь, использованы для катализа реакции, которая приводит к получению требуемого продукта или для катализа реакции, являющейся проме-жуточной стадией (то есть одной реакцией в ряде секций) в производстве выбранного про-дукта. Признано, что хотя структурирование способствует стабилизированию большинства кристаллов, оно не во всех случаях является необходимым или желательным. Некоторые кри-сталлические ферменты сохраняют свою функциональную и структурную целостность в гру-бых условиях окружающей среды даже при отсутствии структурирования. Хотя в предпочти-тельном выполнении кристалл является структурированным, структурирование не всегда необходимо для получения ферментного кристалла, используемого по настоящему способу.
CLEC-ферменты имеют несколько ключевых характеристик, которые сообщают им суще-ственные преимущества над традиционными методами иммобилизации ферментов, исполь-зуемыми в настоящее время. CLEC не нуждаются в отдельной инертной подложке. Отсут-ствие инертной подложки улучшит диффузию субстрата и продукта внутри CLEC и обеспе-чит внутри кристалла концентрацию фермента, близкую к теоретическому пределу загрузки для молекул такого размера. Высокие концентрации фермента могу т привести к значитель-ной рабочей экономии благодаря повышенной эффективной активности данного объема ка-тализатора, снижению времени контакта субстрата с ферментом и общему уменьшению раз-мера завода и капиталовложений (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371 - 379 (1987)). Равномерное распределение по объему кристалла и повышенная стабильность составляющего его фермента в CLEC создают новые возможности применения ферментных катализаторов в сложных условиях, таких как повышенная температура, а водные, органические и почти без-водные растворители, а также их смеси. Кроме того, ограниченный доступ растворителя и постоянное белковое окружение в кристаллической решетке должно привести к улучшенно-му удержанию металлических ионов и ко-факторов CLEC по сравнению с традиционными системами иммобилизованных ферментов.
Фиг.1 графически представляет результаты оценки ферментной активности растворимого термолизина и CLEC термолизина.
Фиг.2 графически представляет результаты сравнения зависимостей рН CLEC термоли-зина и растворимого термолизина.
Фиг.3 графически представляет измерения активности растворимого и кристаллического термолизина после инкубирования при 65С.
Фиг.4 графически представляет результаты оценки сопротивления растворимого и CLEC термолизина внешней протеолитической деградации.
Фиг.5 графически представляет результаты оценки ферментной активности для раство-римой эластазы и соответствующей CLEC-эластазы.
Фиг.6 графически представляет сопротивление растворимой эластазы и соответствующей CLEC - эластазы внешней (экзогенной) протеолитической деградации.
Фиг.7 графически представляет результаты оценки ферментной активности для раство-римой эстеразы и соответствующей CLEC-эстеразы.
Фиг.8 графически представляет сопротивляемость растворимой эстеразы и соответству-ющей CLEC-эстеразы экзогенной протеолитической деградации.
Фиг.9 графически представляет результаты оценки ферментной активности для раство-римой липазы и соответствующей CLEC-липазы.
Фиг.10 графически представляет результаты оценки ферментной активности растворимо-го лизоцима и соответствующего CLEC-лизоцима.
Фиг.11 графически представляет результаты оценки ферментной активности раствори-мой аспарагиназы и соответствующей CLEC-аспарагиназы.
Очень полезной была бы простая, общая процедура, обеспечивающая стабильность и функционирование конкретного фермента или их набора при условиях, представляющих ин-терес для химика, занимающегося синтезом, и которые чересчур грубы для использования с ферментами по известным до сих пор методам. Структурированные кристаллы иммобилизо-ванных ферментов (упоминаемые как CLEC или CLIEC), как описано здесь, могут использо-ваться для этой цели. Стабилизация кристаллической решетки и составляющих ее фермент-ных катализаторов в кристалле путем структурирующей реакции позволяет использовать CLEC в таких средах, как водные, органические или почти безводные растворители, смеси этих растворителей, крайних значениях рН и повышенных температурах, которые несовме-стимы с функционированием ферментов, полученных традиционными методами. Кроме того, стабилизирование кристаллической решетки в CLEC позволяет осуществлять лиофилизацию CLEC стандартными методами. Лиофилизированные CLEC могут храниться в течение ком-мерчески привлекательных периодов времени (от месяцев до лет) в отсутствие охлаждения, и способствуют быстрому и простому использованию CLEC в процессах лабораторного и про-мышленного масштаба посредством простого добавления желаемых растворителей, без необ-ходимости промежуточных процедур замены растворителей. CLEC также обладают высокой резинстентностью к их перевариванию экзогенными протеазами. Способ по настоящему изобретению облегчает применение универсальных ферментных катализаторов в основных промышленных химических процессах, а также в лабораторном синтезе новых соединений для исследований.
Хотя структурирование повышает стабильность кристаллического фермента, оно не явля-ется необходимым или желательным во всех случаях. Некоторые кристаллические ферменты сохраняют свою функциональную и структурную целостность в тяжелых условиях даже при отсутствии структурирования. Предпочтительное выполнение настоящего изобретения предусматривает структурирование кристаллического фермента и подробно описано в сле-дующих разделах. Однако следует понимать, что кристаллические ферменты, не структури-рованные в последующем, также могут использовать в некоторых выполнениях настоящего изобретения.
Регулярные взаимодействия между составляющими ферментными молекулами в кристал-лической решетке CLEC приводят к хорошо определенным порам ограниченного размера, ведущим к ферментным молекулам внутри тела CLEC. В результате субстраты большего раз-мера, чем размер пор, не смогут проникнуть в тело CLEC частицы.
Как следствие ограниченного размера пор, многие ферментативные реакции, представ-ляющие коммерческий и научный интерес, включающие субстраты больше размера пор CLEC, будут находиться вне объема настоящего изобретения. Они могут включать большин-ство реакций с использованием крупных полимеров, таких как белки, полинуклеотиды, по-лисахариды и другие органические полимеры, а также другие органические полимеры, у ко-торых количество полимерных субъединиц будет таким, что полимер станет больше размера пор CLEC. В таких примерах, однако, катализ все-таки будет иметь место на поверхности CLEC.
Настоящим изобретением является способ иммобилизации выбранного белка, в частности фермента, путем кристаллизации и структурирования этого белка, приводящим к производ-ству структурированного кристалла иммобилизованного фермента (CLEC), который может использоваться для катализного производства желаемого продукта, такого как пептид, угле-вод, липид или хиральная органическая молекула. Настоящее изобретение далее касается та-ких CLEC, а также способа изготовления выбранного продукта посредством CLEC - катали-зированной реакции или CLEC - катализированной стадии в серии реакций. В одном из вы-полнений настоящего изобретения дипептидильный предшественник аспартама был получен в реакции конденсации, катализированной посредством структурированного иммобилизиро-ванного термолизина, полученного по настоящему способу. В другом выполнении изобрете-ния индикаторный субстрат, FAGLA, расщепили с получением колориметрического продук-та, присутствие которого указывает на ферментативную активность у CLEC - термолизина. FAGLA - гидролиз использовали в качестве модельной реакции для установления устойчиво-сти CLEC - термолизина в некоторых средах, которые обычно несовместимы с активностью этого фермента.
В других выполнениях настоящего изобретения ферменты эластаза, эстераза, липаза, ас-парагиназа и лизоцим использовали для расщепления различных указанных веществ, таких как р-нитрофенил ацетат (эстеразой и липазой), сукцинил-(ала)-3-р-нитроанилид (эластазой), 4-метилумбелли-ферил N-ацетил-хитриозида (лизоцимом) и NADH (аспарагиназой).
Используя способ по настоящему изобретению, средний специалист в данной области может приспособить протокол способа для изготовления желаемого продукта с помощью ре-акции, катализируемой иммобилизированным ферментом. Интересующий фермент, будучи кристаллизован из подходящего раствора, может быть структурирован глютаральдегидом или другим пригодным бифункциональным реагентом в кристаллизационном растворе для полу-чения CLEC этого фермента. В последующем CLEC фермента может быть лиофилизирован, как описано в примере 2.
Использование CLEC предлагает несколько преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время методами ферментативного катализа. Например, структурированная кри-сталлическая матрица CLEC обеспечивает ему свою собственную опору. Чтобы связать фер-ментный катализатор, дорогие носители - шарики, стекла, гели и пленки, - как в известных методах иммобилизации, теперь не нужны. В результате концентрация фермента в CLEC близка к теоретическому пределу загрузки, который может быть достигнут для молекул дан-ного размера, значительно превышающих плотности, доступные даже в концентрированных растворах. Весь CLEC состоит из активного фермента (а не нейтрального носителя), и таким образом, связанное с ухудшением диффузии снижение скорости ферментативной реакции, обычно наблюдаемое с ферментами, иммобилизированными традиционными методами по сравнению с ферментами в растворе, будет сведено до минимума, поскольку средний размер свободного пути для субстрата и продукта между активным ферментом и свободным раство-рителем будет в значительной степени сокращен для CLEC (по сравнению с ферментом, им-мобилизованными традиционными методами на частицах носителях). Эти высокие плотно-сти белка будут особенно полезны в биодатчиках, при аналитических и других применениях, требующих больших количеств белка в малом объеме. В промышленных процессах превосхо-дящая производительность и компактность CLEC приводит к значительным производствен-ным экономиям посредством повышения эффективной активности данного объема катализа-тора, позволяя при этом уменьшить размер завода, а также капиталовложения (Daniels, M.J. Methods in Enzymol. 136:371-379 (1987). CLEC - ферменты являются относительно монодис-персными, микроскопического размера и с формой, отражающей естественные характеристи-ки роста кристалла отдельного ферментного катализатора. Замена имеющейся среды иммоби-лизированного на носителе фермента на CLEC - ферменты не вызовет затруднений, посколь-ку обе системы сравнимы по размеру и форме, и обе могут быть аналогичным образом вос-становлены из сырья путем любого количества простых методов, включая основные приме-няемые экономичные процедуры, такие как фильтрование, центрифугирование, декантация растворителя и др.
Кроме того, использование лиофилизированных CLEC - ферментов позволяют простое обращение и хранение этих материалов перед их использованием (сухое хранение при ком-натной температуре без охлаждения в течение продолжительных периодов времени). Лиофи-лизированные CLEC - ферменты также обеспечивают простое составление рецептур путем непосредственного добавления растворителей и субстратов, представляющих интерес, без длительных процедур замены растворителей или образования аморфных суспензий. Лиофи-лизированная форма CLEC расширяет область общего применения ферментов в качестве ка-тализаторов до более широкого спектра ферментов и условий их функционирования.
Вторым преимуществом CLEC является то, что структурирование кристаллизированного фермента стабилизирует и укрепляет кристаллическую решетку и составляющие ферменты молекулы, как механически, так и химически. В результате, CLEC может быть единственным средством достижения значительных концентраций активного ферментного катализатора в тяжелых условиях водных, органических, почти безводных растворителей или в смесях вод-но-органических растворителей. Использование ферментов в качестве катализаторов в реак-циях органического синтеза было затруднительно вследствие их тенденции к денатурации в присутствии неводных растворителей, и особенно, в смесях водных и неводных растворите-лей (Klidanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141-144 (1989)). У CLEC - ферментов ограничение конформационной мобильности, приводящей к стабильности, обеспечивается посредством межмолекурлярных контактов и поперечных связей между составляющих фер-ментных молекул, создавая ферментную кристаллическую решетку, а не вследствие почти полного отсутствия воды в среде. В результате промежуточные концентрации воды могут переноситься (выдерживаться) ферментами, составленными в виде CLEC, что ранее было не-возможно (см.табл.12). В коммерческих применениях водно-органические смеси растворите-лей позволяют манипулировать образованием продукта посредством использования преиму-ществ относительной растворимости продуктов и субстратов. Даже в водных средах фер-ментные катализаторы, иммобилизированные или растворимые, подвергаются в химическом реакторе механическим усилиям, которые могут приводить к денатурации и сокращению их полупериода разложения. Химические поперечные связи внутри CLEC - ферментов обеспе-чивают необходимую механическую прочность (Quiocho b Richards, Proc. Natl. Acad. Sci (США) 52: 833-839 (1964)), что приводит к повышению срока работы в реакторе ферментного катализатора.
Третье преимущество CLEC происходит из его кристаллической природы, и состоит в том, что CLEC может достичь однородности по всему объему структурированного кристалла. Описанные здесь кристаллические ферменты выращивают и структурируют в водной среде, и поэтому расположение (порядок) молекул внутри кристаллической решетки остается пра-вильным и равномерным. Эта равномерность поддерживается межмолекулярными контакта-ми и химическими поперечными связями между молекулами фермента, составляющими кри-сталлическую решетку, даже когда осуществляют перенос в другую водную, органическую или почти безводную среду, или смешанные водные/органические растворители. Во всех этих растворителях молекулы фермента поддерживают равномерную дистанцию друг от дру-га, образуя хорошо определенные стабильные поры в кристаллах CLEC, которые облегчают доступ субстрата к ферментному катализатору, а также удаление продукта. Постоянство фер-ментативной активности является крайне важным (критическим) условием для промышлен-ных, медицинских и аналитических применений, когда первостепенное значение имеют вос-производимость и постоянство результата.
Четвертым преимуществом использования CLEC является то, что кристаллический фер-мент проявляет повышенный срок работы и хранения. Решеточные взаимодействия даже в отсутствие поперечных связей, как известно, стабилизируют белки отчасти благодаря огра-ничению конформационных степеней свободы, необходимых для денатурации белка. В CLEC - ферментах взаимодействия в решетке, будучи фиксированными химическими попе-речными связями, особенно важны для предотвращения ненатурации, особенно в смесях вод-ных и безводных растворителей (Klidanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences 14: 141-144 (1989)). Ферменты, находившиеся в кристаллическом состоянии месяцы и годы, обычно со-храняют высокий процент их каталитической активности. Структурированные кристаллы иммобилизированного фермента, сохраняемые в безводных растворителях, будут еще больше защищены от микробиального загрязнения и повреждения, что является серьезной проблемой при хранении больших количеств белка в водной среде, богатой питательными веществами. В случае лиофилизированного CLEC - фермента он хранится в отсутствии растворителя. Это, а также стабилизация, достигнутая структурированием, позволяет осуществлять хранение без охлаждения в течение длительных периодов времени.
Пятым преимуществом использования CLEC является то, что он проявляет повышенную температурную стабильность вследствие поперечных связей, стабилизирующих кристалличе-скую решетку. Проведение реакций при более высоких температурах, чем используемые при традиционных методах, повысит скорости химических реакций, представляющих интерес, как термодинамически, так и ввиду повышения скорости диффузии вещества в и из кристал-лической решетки CLEC. В сочетании эти эффекты представляют значительное улучшение эффективности реакции, потому что они могут увеличить до максимума производительность данного количества ферментного катализатора, который как правило является наиболее доро-гостоящим компонентом реакционного процесса (Daniels, M.J. Methods in Enzymol. 136% 371-379 (1987)). Температурная стабильность CLEC - ферментов значительна вследствие того, что большинство ферментных систем требует мягких условий реакции. CLEC - ферменты будут также стабилизированы против денатурации при временном повышении температуры при хранении.
Последним преимуществом использования CLEC является то, что в нижележащей кри-сталлической решетке между отдельными ферментными молекулами образованы поры пра-вильного размера и формы. Это ограничение доступа растворителя существенно повышает характеристики удерживаемости CLEC - ферментами ионов металла и ко-фактора по сравне-нию с традиционными иммобилизированными ферментами и ферментами в растворе. Это свойство CLEC позволит использовать более выгодные экономически процессы непрерывно-го потока (см., например, Oyama и др. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)) в ситуациях, когда ферменты иначе были бы инактивированы посредством утечки иона металла или ко-фактора. Например, в осуществляемом с помощью термолизина синтезе дипептидильного предшественника аспартама - Z - L - Asp - L - Phe - OМe известно, что традиционно иммоби-лизированный фермент теряет каталитическую активность в процессах постоянного потока, проходящих в колоннах, отчасти вследствие утечки ионов кальция, необходимых для актив-ности фермента термолизина. На практике, утечка ионов кальция приводит к тому, что при-ходится использовать менее эффективные периодические процессы (Наканиши и др., Биотех-нология, 3: 459-464 (1985)). Утечка происходит, когда комплексы ионов кальция образованы субстратом Z - L - Asp, в конкуренции с природными сайтами связывания кальция на поверх-ности фермента, приводящей к потере каталитической активности. Высокая плотность фер-мента в кристаллах CLEC и соответственно ограниченное пространство, доступное для рас-творителя в промежуточных пустотах кристаллов, мешает образованию конкурирующих L - Asp - Ca++ комплексов, ответственных за утечку ионов металла.
CLEC - кристаллизация фермента
Кристалл иммобилизованного фермента (CLEC) приготавливают следующим образом. Кристаллы фермента выращивают путем контролируемого осаждения белка из водного рас-твора, или из водного раствора, содержащего органические растворители. Условия подлежа-щие контролю, включают, например, скорость выпаривания растворителя, присутствие соот-ветствующих растворенных веществ и буферов, в также рН и температуру. Подробный обзор различных факторов, затрагивающих кристаллизацию белков, был опубликован МакФерсо-ном в Methods Enzymol. 114: 112 (1985). Кроме того, и МакФерсон, и Гиллиланд (см. J. Cristal Growth 90: 51-59 (1988)) составили обширные списки всех белков и нуклеиновых кислот, о которых сообщалось как о кристаллизуемых, а также условия, ведущие к их кристаллизации. Коллекция кристаллов и рецептов кристаллизации, а также хранилище данных о раствори-мых белках и нуклеиновых кристаллических структурах содержится в Белковом Банке Дан-ных (Protein Data Bank, см. Bernstein и др., J.Mol. Biol. 112: 535-542 (1977) в Брукхэвенской национальной лаборатории. Эти ссылки могут быть использованы для установления условий, необходимых для кристаллизации данного белка или ранее кристаллизованного фермента, в качестве предпосылки для образования соответствующего CLEC, и могут дать указания по составлению кристаллизационной стратегии для белков, которые ранее не кристаллизова-лись. Альтернативно, во многих случаях, продуманная стратегия поиска путем проб и оши-бок (см., например, Картер и Картер, J. Biol.Chem. 254: 12219-12223 (1979)) может дать подхо-дящие условия кристаллизации большинства белков, включая, но не только, белки, обсуж-давшиеся выше, при том условии, что для них может быть достигнута приемлемая степень чистоты. Требуемая степень чистоты может значительно различаться у разных белков. В слу-чае лизоцима, например, фермент кристаллизовали непосредственно из его неочищенного источника - белка куриного яйца (Гиллиланд, J. Cristal Growth 90: 51-59 (1988).
Для использования в качестве CLEC в способе по настоящему изобретению не требуются крупные отдельные кристаллы, которые необходимы для дифракции рентгеновских лучей, а фактически могут быть нежелательны вследствие диффузионных проблем, связанных с раз-мером кристалла. Мелкокристаллические материалы (с кристаллами порядка 10-1 мм размера в поперечном сечении) пригодны для CLEC и часто наблюдались, хотя о них редко сообщалось в литературе по рентгеновской кристаллографии. Микрокристаллы очень полезны в способе по настоящему изобретению для сведения к минимуму проблем, связанных с диффузией (см., например, Quiocho F.A. и Richards F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967).
В общем кристаллы получают путем соединения белка, подлежащего кристаллизации, с соответствующим водным растворителем или водным растворителем, содержащим осадители (приципитирующие агенты), такие как соли или органические вещества. Растворитель со-единяют с белком при температуре, которую определяют экспериментально, чтобы она под-ходила для вызывания кристаллизации и была приемлемой для поддержания стабильности и активности белка. Растворитель по желанию может включать дополнительные растворенные вещества, такие как двухвалентные катионы, ко-факторы и хаотропы, а также виды буферов для контролирования уровня рН. Необходимость дополнительно (совместно) растворенных веществ и их концентрации определяют экспериментально для того, чтобы облегчить кри-сталлизацию. В процессе промышленного масштаба контролируемое осаждение (преципита-ция), ведущее к кристаллизации, лучше всего проводить путем простого соединения белка, осадителя, растворенных веществ и, возможно, буферов в периодическом процессе. Также могут быть приспособлены альтернативные лабораторные методы кристаллизации, такие как диализ или паровая диффузия. МакФерсон (Methods Enzymol. 114: 112 (1985) и Гиллиланд (J. Cristal Growth. 90: 51-59 (1988)) включают в свои обзоры в литературе по кристаллизации по-дробные списки пригодных параметров. В некоторых случаях несовместимость между сши-вающим реагентом и средой для кристаллизации может потребовать перенос кристаллов в более подходящую систему растворителя.
Многие из белков, для которых ранее уже были описаны условия кристаллизации, обла-дают значительным потенциалом в качестве практических ферментных катализаторов в про-мышленных и лабораторных химических процессах, и непосредственно относятся к веще-ствам типа CLEC в объеме настоящего изобретения. Табл.1 представляет образцы ферментов, которые уже кристаллизовали ранее. Следует заметить, что условия, сообщаемые в большин-стве из этих ссылок, были оптимизированы для выращивания крупных кристаллов дифрак-ционного качества, часто с большим трудом. В некоторых случаях для изготовления меньших кристаллов для получения CLEC необходима некоторая подгонка параметров.
Получение CLEC - реакция структурирования.
Если кристаллы выращивали в подходящей среде, то они могут быть структурированы. Структурирование приводит к стабилизации кристаллической решетки посредством введе-ния в нее ковалентных связей между составляющими кристалл молекулами фермента. Это позволяет осуществлять перенос фермента в другую реакционную среду, которая иначе была не несовместимой с существованием кристаллической решетки, или даже с существованием интактного нативного белка. Структурирование может быть достигнуто с помощью большого разнообразия бифункциональных реагентов, хотя на практике был выбран недорогой реагент - глютаральдегид.
(С целью ознакомления со списком представителей доступных структурирующих реаген-тов, см., например, каталог 1990 г. компании Pierce Chemical.).
Структурирование с помощью глютаральдегида образует сильные ковалентные связи, в первую очередь, между лизиновыми аминокислотными остатками и между молекулами фер-мента в кристаллической решетке, составляющей кристалл. Структурные взаимодействия предотвращают обратный выход в раствор составляющих кристалл молекул фермента, эффек-тивно иммобилизуя (или делая нерастворимыми) молекулы фермента в микрокристалличе-ских частицах (в идеале размером 10-1). Эти макроскопические, иммобилизованные, нерас-творимые кристаллы могут затем легко отделяться от сырья и непрореагировавшего субстрата посредством простых приемов, таких как фильтрование, декантация и др. Эти кристаллы также могут использоваться в колоннах, заполняемых CLEC в непрерывных поточных про-цессах, в которых они демонстрируют улучшенные свойства удерживать металлические ионы и ко-факторы.
CLEC - ферменты получают с целью их использования в качестве ферментных катализа-торов в известных и новых средах. Повышенная стабильность CLEC-ферментов, происходя-щая от реакции структурирования, позволяет переносить CLEC в растворитель (например, водный, органический или почти безводный, или в их смесь), который иначе был бы несов-местимым с этим ферментом, и проводить химические процессы в реакторе при высоких температурах и экстремальном рН. Макроскопические частицы CLEC - катализаторы позво-ляют легко с ними обращаться, восстанавливать их из сырья простыми методами, такими как фильтрование, центрифугирование или декантация растворителя. Кроме того, они могут ис-пользоваться для заполнения колонн непрерывных химических процессов.
Получение CLEC - лиофилизация
Суспензию одного объема структурированных кристаллов термолизина в десяти объемах деминерализованной воды при рН 7,0 лиофилизировали до утра с использованием лиофили-затора ВирТис (VirTir) Модель # 24. Лиофилизированные кристаллы хранили при комнатной температуре или при 4С перед их реконституцией (восстановлением содержания жидкости), которую осуществляли посредством добавления десяти объемов выбранного растворителя непосредственно на кристаллы, взятые после хранения. Регидратированные кристаллы вос-станавливали в 10 мМ кальциево-ацетатном буфере с рН 7,0 для экспериментов по FAGLA - расщеплению. Восстановленные лиофилизированные кристаллы обычно хранили при ком-натной температуре. Напротив, растворимый фермент требует хранения при -70С для под-держания его специфичной активности в течение периода, превышающего неделю. Этот по-рядок (протокол) использовали для всех ферментов, описанных в нижеприводимых приме-рах, включенных в описание.
Синтез предшественника аспартама с помощью CLEC - термолизина
Способ по настоящему изобретению, согласно которому получают структурированные кристаллические ферменты, описывается далее на примерах производства структурирован-ных кристаллов иммобилизованного термолизина для использования в процессе получения дипептидильного предшественника аспартама в среде этил-ацетата, который является почти безводным растворителем. Термолизин - белок, который был кристаллизован ранее, и струк-тура которого была разрешена при 1,6Е разрешении (см. Холмс и Мэтьюз J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)), является одним из примеров фермента, который может использоваться в ка-честве CLEC по настоящему способу. Термолизин используется в производстве искусствен-ного подсластителя аспартама (Исова и др., патент США №4436925 (1984); Линдеберг, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985); Ояма и др. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987). В настоящее время большая часть аспартама, очевид-но, производится традиционного подхода химического синтеза, хотя использование иммоби-лизованного известными методами термолизина в почти безводной среде дело обнадежива-ющие результаты. (Ояма и др., J. Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Усовершенствование ферментативного подхода к производ-ству аспартама, которое возможно посредством использования настоящего способа, позволит ему конкурировать с используемым в настоящее время способом, как в отношении удобства, так и стоимости (Ояма и др. Methods in Enzymol 136: 503-516 (1987)).
Оценка CLEC-термолизина
Вышеописанные процедуры использовали для получения CLEC-термолизина, которые оценивали в отношении их рН-зависимости и стабильности, стабильности при повышенных температурах, резистентности к экзогенному протеолизу и стабильности в присутствии орга-нического растворителя. CLEC-термолизина сравнивали с растворимым термолизином, как подробно описано в примере 2 и на фиг. 1-4. Результаты оценки показали следующее.
1. Что касается рН-зависимости и стабильности, обе формы продемонстрировали макси-мальную активность при рН 7 и продемонстрировали аналогичную активность в кислом диа-пазоне. В щелочном диапазоне CLEC сохраняет свою максимальную активность до рН 10; растворимый термолизин обладает 75%-ной активностью при рН 8,5, только 25%-ной актив-ностью при рН 9, и неактивен совершенно - при рН 9,5.
2. Дополнительная стабилизация, достигнутая у CLEC-фермента, приводит к фермента-тивной активности при более высоких температурах, чем это возможно с растворимым тер-молизином. Повышенная стабильность CLEC-термолизина при более низких температурах позволяет упростить его хранение по сравнению с хранением растворимого фермента. Тем-пературная стабильность и резистентность к автолизу были также продемонстрированы для CLEC-термолизина, кристаллы которого сохраняли максимальную активность через пять по-сле их инкубирования при 65С. Напротив, растворимый термолизин утратил 50% своей ак-тивности через 2 часа инкубирования и продемонстрировал незначительную активность через 24 часа инкубирования при 65С.
3. Ферментативная активность CLEC термолизина осталась без изменений после четы-рехдневного инкубирования в присутствии мощной стрептококковой протеазы - Проназы. Напротив, растворимый термолизин быстро деградировал и утратил всю свою активность через 90 минут такой инкубации.
4. CLEC-термолизин и растворимый термолизин продемонстрировали заметно различ-ную стабильность в присутствии органических растворителей, как показано в табл.12. CLEC термолизина сохранили более чем 95% своей максимальной активности после инкубирования со всеми органическими растворителями, с которыми проводилась оценка.
Эти характеристики CLEC термолизина и других ферментов делают их особенно полез-ными, поскольку их легче хранить, они более стабильны и труднее теряют активность или деградируют, чем соответствующие растворимые ферменты.
Оценка CLEC-эластазы
Также получали CLEC-эластазу, которую оценивали в отношении ее активности и рези-стентности к экзогенному протеолизу. CLEC-ферменты эластазы сравнивали с растворимой эластазой, как описано подробно в пример 3 и на фиг. 5 и 6. Результаты оценки продемон-стрировали следующее.
1. CLEC-эластаза сохраняет приблизительно 50% активности по сравнению с раствори-мым ферментом.
2. Растворимая эластаза быстро разрушалась протеазой. Активность растворимой эласта-зы была снижена до 50% исходной активности после 10 минут инкубирования в присутствии протеазы. Через час инкубирования растворимый фермент утратил более 90% своей первона-чальной активности. Напротив, ферментативная активность эластазных структурированных кристаллов осталась незатронутой инкубированием с протеазой.
Оценка CLEC-эстеразы
Также получали CLEC-эластазу, которую оценивали в отношении ее активности и рези-стентности к экзогенному протеолизу. CLEC-эстеразу сравнивали с растворимой эстеразой, как детально описано в примере 4 и табл. 7 и 8. Результаты оценки продемонстрировали сле-дующее.
1. CLEC-эстераза сохраняет примерно 50% активности по сравнению с растворимым ферментом.
2. Растворимая эстераза была высокочувствительной к протеолитической деградации. Активность растворимой эстеразы снизилась до 50% исходной активности через десять минут инкубирования в присутствии протеазы. После часа инкубирования растворимого фермента он утратил более 90% исходной активности. Напротив, ферментативная активность CLEC-эстеразы не пострадала от инкубирования в присутствии протеазы.
Оценка CLEC-липазы
Также получали CLEC-липазу, которую оценивали в отношении ее активности, CLEC-липазу сравнивали с растворимой липазой, как детально описано в примере 5 и на фиг. 9. Результаты этой оценки продемонстрировали, что CLEC-липаза сохраняет прибилизительно 90% активности по сравнению с растворимой липазой.
Оценка CLEC-лизоцима
Также получали CLEC-лизоцим, который оценивали в отношении его активности и рези-стентности к экзогенному протеолизу. CLEC-лизоцим сравнивали с растворимым лизоци-мом, как детально описано в примере 6 и на фиг. 10. Результаты этой оценки продемонстри-ровали, что CLEC-лизоцим сохраняет приблизительно 50% активности по сравнению с рас-творимым ферментом.
Оценка CLEC-аспарагиназы
Также получали CLEC-аспарагиназу, которую оценивали в отношении ее активности. CLEC-аспарагиназу сравнивали с растворимой аспарагиназой, как детально описано в при-мере 7 и на фиг. 11. Результаты оценки продемонстрировали следующее: CLEC-аспарагиназа сохраняла приблизительно 77% активности по сравнению с растворимым ферментом.
Общая применимость CLEC-ферментов
Как раскрыто в настоящем описании, CLEC-ферменты представляют собой новую техно-логию с широким применением во многих областях, включая, но не только, синтезы про-мышленного масштаба, лабораторные методики, биодатчики и медицинские применения. В табл. 2-5 ниже приведены примеры различных систем, использующих при их осуществлении традиционные методы иммобилизации ферментов. Специалист в данной области сможет приспособить эти и подобные им системы к CLEC-технологии, раскрытой в настоящей заяв-ке. Для иллюстрации этого ниже обсуждаются конкретные примеры более подробно для каж-дой из этих категорий применения.
Табл. 2 ниже приводит список примеров, использующих ферменты, иммобилизованные традиционными методами, в промышленных процессах, которые (примеры) могут быть легко адаптированы к раскрытой здесь CLEC-технологии.
Производство акриламида с использованием CLEC-технологии.
Ниже приводится описание использования изобретения: а именно приспосабливание производства акриламида из иммобилизованных клеток, которые перепроизводят фермент нитрил-гидразу (Haгасава Т. и Ямада X. Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)), к CLEC-технологии, описанной выше.
Производство акриламида в промышленном масштабе, этого важного в химии вещества, описано Ямадой и его сотрудниками (Нагасава Т. и Ямада Х. Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)). Тысячи тонн акриламида в год производятся в химических реакторах, загружен-ных иммобилизованными клетками, выбранными в качестве перепроизводителей фермента нитрилгидратазы. Нитрилгидратаза, как сообщалось ранее, очищалась и кристаллизовалась из двух источников. - Brevibakterium R 312 (Нагасава и др. Biochem. Biophis. Res. Commun. 139: 1305-1312 (1986) и P. Chlororaphis B23 (Нагасава и др., Eur. J. Biochem. 162: 691-698 (1987)). Как здесь раскрыто, эти кристаллические ферменты, каждый могут быть иммобилизированы посредством их структурирования глютаральдегидом или другим подходящим сшивающим реагентом для получения CLEC-фермента. CLEC нитрилгидратазы могут быть затем исполь-зованы в традиционном реакторе вместо иммобилизованных клеток, используемых в настоя-щее время. Приспособление этого процесса к CLEC-технологии ведет к немедленным пре-имуществам. Эти преимущества включают уменьшение размера завода и повышенный выход вследствие увеличения активности на единицу объема вследствие более высокой концентра-ции фермента в CLEC-ферментах и улучшенной диффузии субстрата и продукта, снижение нежелательного загрязнения микроорганизмами и побочными реакциями вследствие более высокой чистоты CLEC-фермента, а также благодаря более низкой чувствительности к мик-робиальному загрязнению из-за отсутствия клеток. Кроме того, имеются и другие преимуще-ства, присуще только технологии CLEC. Эти преимущества включают более высокую рабо-чую температуру для повышения скорости реакции; способность работы в водных, органиче-ских и почти безводных растворителях, позволяющих оптимизировать реакцию получения акриламида; а также продление срока хранения им работы вследствие более высокой химиче-ской стабильности и механической прочности CLEC, что особенно заметно в нетрадицион-ных растворителях.
Применение CLEC-технологии в медицине для экстракорпорального лечения
Соответственно выбранный CLEC-фермент или набор CLEC-ферментов также могут ис-пользоваться для медицинского применения. Такой фермент или набор ферментов могут ис-пользоваться, например, для удаления компонента жидкости, такой как кровь, обычно путем изменения компонента и, таким образом, превращая его в вещество, не оказывающее вредно-го воздействия на пациента, которое может выводиться из организма нормальными процес-сами (например, посредством детоксикации, или разложения в печени, почечной экскреци-ей). В таком применении соответствующим образом выбранный CLEC-фермент или их набор приводится в контакт с тканевой жидкостью, содержащей компонент, подлежащий измене-нию, или содержащей реагент (продукт или субстрат) реакции, в которой участвует такой компонент, на который (компонент или реагент) действует данный фермент. В результате, фермент способен воздействовать на компонент, подлежащий изменению, или реагировать с другим веществом, которое является продуктом реакции, в которой участвует компонент, подлежащий изменению. Активность фермента приводит либо к непосредственному измене-нию компонента, подлежащего удалению, либо к изменению продукта реакции, в которой такой компонент участвует, делая таким образом невозможным продолжение этой реакции. Это может быть осуществлено посредством использования экстракорпорально (то есть “вне тела”) устройства, которое включает соответствующим образом выбранный CLEC-фермент или их набор и удерживающее средство из некоего материала, такого как пористый материал, на котором удерживается CLEC, или трубка, в которой может находиться CLEC, позволяю-щее (средство) осуществить контакт между самим компонентом или веществом в жидкости, являющимся продуктом реакции, в которой данный компонент, подлежащий изменению, принимает участие.
Это также может быть достигнуто посредством введения соответствующего CLEC в при-годную полость тела, такую как брюшина или лимфатический узел, где CLEC мог бы иметь доступ к жидкостям организма. Такое введение может быть выполнено хирургическим путем, либо посредством инъекции суспензии CLEC. Введение CLEC непосредственно в кровь бы-ло бы неподходящим, учитывая высокий риск эмболии (закупорки сосудов).
Использование соответствующих CLEC в этой области могло бы послужить альтерна-тивной генетическим методам, применяемым в терапии заменой фермента для исправления врожденного дефекта, такого как, например, фенилкетонурия.
Табл. 3 иллюстрирует некоторые из медицинских применений, в которых может быть ис-пользован CLEC. Для большинства их этих случаев экстра-корпоральное лечение находится еще в стадии исследований, но преимущества, предлагаемые CLEC, могли бы предложить новые методы лечения в тех областях, в которых ранее не было альтернативного лечения.
Конкретным примером применения настоящего способа является система гепаринлиазы для удаления гепарина из крови (Берштейн и др., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987), обсуждаемая ниже.
Все экстракорпоральные устройства, через которые перекачивается кровь, такие как устройство для почечного диализа, фильтры артериовенозной крови непрерывного действия или экстракорпоральные мембранные оксигенаторы, требуют введения гепарина пациенту для предотвращения свертывания крови. Однако гепаринизация пациента к геморрагическим осложнениям и остается угрозной для здоровья человека. Эти проблемы возрастают по мере увеличения времени перекачивания крови, например в случае мембранного оксигенатора, и могут привести к серьезной потере крови. После экстракорпоральной терапии гепарин может быть удален из крови с помощью гепариназного устройства (т.е. содержащего гепариназу) на выходе этого экстракорпорального устройства, которое устраняет весь гепарин из крови, воз-вращаемой пациенту, и избегает таким образом имеющиеся в настоящее время проблемы, свя-занные с гепаринизацией.
Опубликованные исследования (Лангер и др., Science 217: 261-263 (1982); Бернштейн и др., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987); подробно излагают проблемы, возникающие при использовании в экстракорпоральных устройствах ферментов, иммобилизованных тра-диционными методами. Главная проблема состоит в том, что традиционная иммобилизация приводит к плохому удержанию ферментативной активности на единицу объема, что требует больших объемов иммобилизованного фермента для осуществления необходимой гепарини-зации. Этот слишком велик, чтобы иметь практическое значение для лечения человека. Напротив, высокая удерживаемость активности на единицу объема у CLEC - фермента благо-даря отсутствию инертных подложек позволяет обойти эту проблему и предлагает практиче-ское решение проблемы удаления гепарина у человека. Повышенная стабильность CLEC по-низит скорость вымывания (диссассоциации) фермента из структурированного кристалла. Это превосходит менее стабильные ферменты, иммобилизированные традиционными мето-дами, также вследствие того, что иммунные реакции, происходящие из-за утечки фермента, будут меньше (ослаблены). Температурная стабильность CLEC - фермента предотвращает де-натурацию фермента при временном повышении температуры во время хранения; представ-ляется возможным хранить CLEC при комнатной температуре с сохранением высокой актив-ности фермента. Кроме того, CLEC будет дешевле и удобнее использовать, чем аналогичные ферменты, иммобилизованные традиционными методами вследствие их более длительного периода работы и хранения.
Дополнительные применения CLEC - технологии: биодатчики
CLEC или набор CLEC-ферментов могут использоваться в качестве компонента сенсора (датчика), называемого здесь “биодатчиком”, который может использоваться для обнаружения и/или количественного анализа интересующего вещества (аналита) в жидкости, такой как тканевая жидкость (например, кровь, моча), промышленная и лабораторная среда для химиче-ской реакции, органические среды, вода, культуральная среда и напитки. В некоторых случа-ях интересующей текучей средой может быть газ, как, например, в анализаторе для обнару-жения алкоголя в выдыхаемом воздухе. (Барзана, Клибанов и Карелл, NASA Tech. Brief 13:104 (1989)). В этом применении соответствующим образом выбранный CLEC или их набор приводят в контакт с текучей средой (т.е. с жидкостью или газом), подлежащей иссле-дованию в качестве аналита. Интересующий аналит может быть измерен непосредственно (например, уровень содержания глюкозы в крови) или непрямым образом (например, посред-ством обнаружения или количественного определения вещества, являющегося реактантом (продуктом или субстратом) в реакции, в которой участвует интересующий аналит. В любом из них CLEC способен оказывать свое действие на аналит или вещество, являющееся реак-тантом в реакции, в которой также участвует аналит. Активность фермента приводит к обна-ружимым изменениям (например, изменению рН, производству света, тепла, изменению электрического потенциала), которое обнаруживается или количественно измеряется соответ-ствующими средствами детекции (например, электродами рН-метра, световыми или тепло-выми датчиками, средствами для измерения изменений электричества) (Яната и др., Anal. Chem. 63:33P-44P (1990)). Могут использоваться любые средства, которые могут обнаружи-вать изменения, происходящие в процессе ферментного катализа. Биодатчики по настоящему изобретению включают CLEC или их набор и средства для удерживания CLEC, которые поз-воляют осуществлять контакт между CLEC и интересующим аналитом или веществом в теку-чей среде, которое является реактантом в реакции, в которой участвует интересующий ана-лит. Табл. 4 иллюстрирует некоторые из применений биодатчиков, в которых могут исполь-зоваться CLEC - ферменты.
В настоящее время в некоторых применениях используются иммобилизованных фермен-ты, но при этом возникают проблемы, связанные с низкой стабильностью, низкой плотно-стью фермента, коротким периодом его жизни и отсутствием воспроизводимости результа-тов. Эти примеры могут быть легко адаптированы к раскрытой здесь CLEC - технологии.
В способе по настоящему изобретению, используемом для проведения анализа образцов в биодатчике, особенно желательно получить обнаружимый сигнал максимально возможной силы от наименьшего возможного количества субстрата и катализатора. В этом отношении раскрытая здесь CLEC - технология является особенно притягательной, поскольку она позво-ляет достичь наивысшей возможной концентрации ферментного катализатора в данном объ-еме.
Часто предпринимаются значительные усилия для того, чтобы совместить интересующую конечную ферментативную реакцию, осуществляемую непосредственно или через подходя-щие промежуточные соединения, с производством света ферментами типа люциферазы (Кур-киярви и др., Methods in Enzymol. 137:171-181 (1988)). Это делается, чтобы использовать чув-ствительность и эффективность оборудования, обнаруживающего фотоны, что при соответ-ствующих условиях позволяет обнаруживать фемто-молярные концентрации продуктов фер-ментативной реакции. Следуя этому принципу, ранее были созданы биосенсорные системы с использованием ферментов, иммобилизованных традиционными методами для обнаружения различных субстратов, представляющих медицинский и др. интерес. Реакции, производящие свет, могут быть совмещены с реакциями в экспериментах по обнаружению таких субстратов, как D-глюкоза, L-лактат, L-глютамат и этанол, среди прочих, при крайне низких концентра-циях субстрата.
Что касается вышеупомянутого применения, фермент люциферазу из Vibrio harvevii уже кристаллизовали, как сообщалось Свансоном и др., J. Biol. Chem. 260:1287 - 1289 (1985). Кри-сталлы этой люциферазы могут быть структурированы глютаральдегидом или другим при-годным реагентом с образованием CLEC - люциферазы. Для аналитического и биосенсорно-го применений CLEC - люцифераза предлагает много преимуществ по сравнению с фермен-тами, иммобилизованными традиционными методами. У CLEC весь объем будет состоять из излучающего свет фермента люциферазы. У иммобилизованного традиционным методом фермента, однако, 95% общего объема занято “инертным” носителем, который действует ско-рее как поглотитель света, излучаемого ферментом. Кроме того, повышенная стабильность CLEC - фермента облегчит его хранение при комнатной температуре, и также сделает воз-можными новые сенсорные применения в жестких условиях и при повышенных температу-рах.
Дополнительные применения CLEC - технологии - лабораторные реакции
CLEC - ферменты могут использоваться в качестве лабораторных реагентов в маленьких колонках или в периодических процессах, которые могут использоваться для проведения ла-бораторных реакций. Некоторые из широких категорий реакций показаны в табл.5.
Шнейдер и др. Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 (N 1): 64-68 (1984) иллюстрирует как можно использовать ферменты в процессах органического синтеза. Эстеразу печени свиньи приме-няли в процессе трансформирования мезо-эфира в хиральный мезо-эфир в водном фосфатном буфере.
Преимущество использования в лаборатории реакций, катализируемых посредством CLEC, является тройным. Во-первых, CLEC сохраняет высокую активность в жестких усло-виях (например, в водных, органических, почти безводных растворителях и их смесях, и при высоких температурах), типичных для лабораторных опытов по химическому синтезу. Во-вторых, CLEC проявляет высокую стабильность при работе и хранении, что подходит для периодически прерывающихся лабораторных опытов. В-третьих, высокая активность CLEC на единицу объема позволит сократить время реакции и уменьшить необходимые объемы фермента (на единицу активности). Таким образом, преимущества, которыми обладают CLEC-ферменты по сравнению со свободными или иммобилизованными ферментами, дают химикам-органикам альтернативу, представляющую собой высоко избирательный, искус-ственный инструмент.
Во всех вышеописанных примерах, но не только, способ по настоящему изобретению может быть приспособлен специалистом в данной области для преобразования способа, ис-пользующего катализатор в виде иммобилизованного традиционным методом фермента, для использования CLEC соответствующего фермента. CLEC - ферменты не только могут заме-нить ферменты, иммобилизованные традиционными методами, но также могут использовать-ся в преобразованиях, вызываемых клетками. Далее настоящее изобретение будет проиллю-стрировано следующими примерами, которые никоим образом не предназначены для ограни-чения объема изобретения.
Пример 1. Кристаллизация и структурирование термолизина для синтеза предшественни-ка аспартама. -Z-Asp-Phe-OMe Кристаллизация. 250 мг термолизина от Bacillus thermoproteolyticus, закупленного у компании Берингер-Мангейм ГмбХ, растворили в 4 мл 45%-ного диметил-сульфоксида (ДМСО) и 55%-ного 1,40 М ацетата кальция, 0,50 М какоди-лата натрия для рН 6,5. Эти исходные условия аналогичны описанным Мэттьюзом и др. для производства крупных кристаллов термолизина (дифракционного качества), см., например, Холм и Мэттьюз. J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982). Раствор белка затем концентрировали до 1 мл в микро-концентраторе “Центрикон”-10. Хороший выход микрокристаллов был получен способом мгновенной кристаллизации, теперь раскрытом в этом описании, по которому 1 мл воды, или 1,40 М ацетата кальция, 0,50 М какодилата натрия с рН 6,5, быстро вводили в тот или иной ДМСО-термолизиновый раствор, описанный выше. Этим способом получают мно-жество гексагональных микрокристаллов примерно одинаковых размеров (длиной примерно 10-1 мм).
Структурирование микрокристаллов термолизина.
Процедуры, использованные в этом конкретном примере выполнения способа по изобре-тению, являются приспособлением протокола, описанного Наканиши и др., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985), согласно которому термозилин сначала адсорбировали на гранулированный носитель, составленный из ионообменной смолы Амберлит XAD-7, а затем иммобилизирова-ли посредством его структурирования глютаральдегидом (Квичо и Ричардс, - Proc . Natl. Acad. Sci (США) 52: 833 - 839 (1964). В этом примере микрокристаллы полученного термоли-зина центрифугировали и пеллетировали (осаждали), а надосадочную жидкость выбрасывали. Затем к микрокристаллам добавляли 5 мл 17,5%-ного технического глютаральдегида в 2,5% ДМСО, 0,05 М ацетата кальция и 0,025 М какодилата натрия с рН 6,5. Смесь инкубировали при легком перемешивании в течение 4 ч при 37°С. Реакцию структурирования прекращали повторной промывкой кристаллов 10 мл для аликвотами воды для удаления раствора глюта-ральдегида. Промытые структурированные кристаллы термолизина и составляют тот CLEC - термолизин, который использовали ниже в качестве катализатора.
Синтез Z - Asp - Phe - OМe в водном растворе.
5 мл суспензии CLEC - термолизина добавляют в периодический раствор с постоянным перемешиванием, инкубируемый при 37°С. После центрифугирования и декантации надоса-дочной жидкости к CLEC добавляли водную реакционную среду. Этот раствор приготавли-вали путем смешивания 80 мг Z - (L - Asp) и 80 мг (L - Phe) - OМe - HCI в 1 мл воды, с добав-лением уксусной кислоты для получения рН 7,0. Образцы анализировали посредством HPLC. Ниже таблицы 6 показывает высоту результатов по HPLC - исследованию субстрата Z - (L - Asp), нормализованных к 1 при времени t = 0. Поскольку Z - (L - Asp) ограничивает скорость этой реакции, то измерение уменьшения количества этого вещества эквивалентно измерению появления продукта - Z - (L - Asp) - (L - Phe) - OМe (Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985). Кроме нормализованной высоты результатов HPLC по субстрату Z - (L - Asp) табл.6 включает также оценку степени завершенности реакции. Ясно, что реакция выходит на уро-вень прибилизительно 20% завершенности в течение первых 30 с и затем стабилизируется на этом уровне. Эти результаты также согласуются с наблюдениями Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985), полученными с использованием термолизина, иммобилизо-ванного традиционным методом в водной реакционной среде, аналогичной вышеуказанной, и могут быть объяснены плохой растворимостью продукта, -Z- (L-Asp) - (L - Phe) - OМe, в воде.
Синтез Z - Asp - Phe - OMe в почти безводном растворе.
5 мл суспензии CLEC - термолизина добавляют в реактор периодического действия с по-стоянным перемешиванием, который инкубируют при 37С. После центрифугирования и декантации надосадочной жидкости к CLEC добавляли почти безводную органическую реак-ционную среду. Этот раствор приготавливали путем смешивания 80 мг Z - (L - Asp) и 240 мг (L - Phe) - ОМе в 1 мл 99% этил-ацетата с 1% воды. Образцы анализировали посредством HPLC. Табл. 7 ниже представляет нормализованные по высоте результаты по содержанию Z - (L - Asp) в зависимости от длительности реакции, которые нормализованы к 1 при времени t = 0. Поскольку Z - (L - Asp) ограничивает скорость этой реакции, измерение уменьшения это-го вещества эквивалентно измерению возникновения продукта Z - (L - Asp) - (L - Phe) - ОМе (Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Табл. 7 включает нормализованное остаю-щееся количество ограничивающего Z - (L - Asp) субстрата и оценку степени завершенности реакции. В данном случае реакция прошла до 70%-ной завершенности в течение первых 30 секунд и стабилизировалась на этом уровне. Эти результаты также согласуются с наблюдени-ями Наканиши и др., Biotechnology 3: 459-464 (1985), полученными с использованием термо-лизина, иммобилизованного традиционным методом, в почти безводной реакционной смеси, и могут быть объяснены с ингибированием фермента получаемым продуктом.
Пример.2. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация термолизина и оценка ха-рактеристик полученного продукта.
Кристаллизация термолизина
Термолизин (компании Диава Казеи К.К., Япония) растворяют в 10 мМ ацетата кальция (Сигма), с рН 10,0, до концентрации 10% (вес/об.) рН раствора поддерживают на уровне 10,0 посредством его титрования 2 М раствором NaOH. После полной солюбилизации (растворе-ния) раствор белка титруют до рН 2 М раствором HCI. Добавляют сухой ацетат кальция до 1,2 М. Затем добавляют до 30% диметил сульфоксид (Сигма). Белок концентрируют до 100 мг/мл посредством ультрафильтрации в приборе Амикон (мембрана 10,000 MWCO). Концентриро-ванный фермент затем делили на аликвоты и хранили при -70°С. Термолизин кристаллизуют путем добавления 9 объемов деминерализованной воды к 1 мл концентрированного (100 мг/мл) белкового раствора. Раствор кратковременно встряхивают и оставляют до утра при комнатной температуре. Кристаллы промывают 10 объемами 10 мМ ацетата кальция с рН 7,0 и выделяют посредством центрифугирования малой скорости (10 мин, при 1500 • G, центри-фуга Бекман GPR).
Быстрое добавление воды к концентрированному (100 мг/мл) раствору термолизина вы-зывает образование кристаллов, которые становятся видимыми при небольшом увеличении в течение 10 минут. Размер кристаллов воспроизводимым образом зависит от конечной кон-центрации белка. Три объема воды на один объем концентрата термолизина (100 мг/мл) дают 0,5 миллиметровые по длине гексогональные палочки-кристаллы качества для рентгеногра-фии, которые соответствуют кристаллам, описанным ранее Колманом с сотр. (Колман, Янсо-ниус и Мэттьюз, J. Mol. Biol. 70: 701-724 (1972), что подтверждено нами с помощью дифрак-ционного анализа. Добавление десяти объемов воды к одному объему белкового концентрата уменьшает длину получаемых кристаллов до 0,05 мм. Эти микрокристаллы являются предпо-чтительными в применениях CLEC, поскольку у них уменьшаются диффузионные проблемы, связанные с размерами кристаллов (см. Квиочо и Ричардс, Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967). В одной конкретной партии белка размер кристаллов выдерживается постоянным. (В этом исследовании использовали кристаллы размером 0,05-0,10 мм длины для того, чтобы облег-чить точное отмеривание пипеткой суспензий кристаллов). Денситометрическое сканирова-ние SDC - PAGE показало шестикратную очистку фермента при кристаллизации, что суще-ственно повышает специфичную активность CLEC. Кристаллизация привела к 20%-ному снижению общей активности CLEC - белка по сравнению с растворимым термолизином, ко-гда его исследовали посредством спектрофотометрического расщепления дипептидного суб-страта фурил-акрилоил-глицил-L-лейцинамид (FAGLA), как описано ниже.
Cтруктурирование кристаллов термолизина.
Кристаллы термолизина структурировали в течение 3 часов при комнатной температуре в растворе 12,5%-ного глютаральдегида (Сигма), 5% ДМСО и 50 мМ Трис с рН 6,5. Структури-рованные кристаллы промывали трижды деминерализованной водой и выделяли центрифу-гированием малой скорости, как описано в отношении кристаллизации термолизина. Хими-ческое структурирование кристаллов фермента стабилизирует кристаллическую решетку и составляющие ее молекулы фермента в кристалле достаточным образом для того, чтобы поз-волить практическое использование CLEC в средах, которые иначе несовместимы с функци-онированием фермента. При спектрофотометрическом исследовании посредством монито-ринга расщепления дипептидного субстрата FAGLA, описанного ниже, не было обнаружено заметного различия в ферментативной активности между структурированными и неструкту-рированными кристаллами. Кроме того, структурирование стабилизирует CLEC до такой степени, что они могут быть лиофилизированы, с сохранением полной ферментной активно-сти при их восстановлении в водных, органических и смешанных водно-органических рас-творителях, как показано в табл.1 и табл.8. Хотя кристаллизация приводила к 30%-ному сни-жению специфичной активности у CLEC - фермента по сравнению с растворимым термоли-зином, структурирование и лиофилизация CLEC в дальнейшем не уменьшали его специфич-ную активность.
Ферментативная активность растворимого и CLEC-термолизина
Каталитическую активность растворимого и CLEC-термолизина оценивали (Федер и Шук, Biochemistry 9:2784-2791 (1970) посредством гидролиза блокированного дипептидного субстрата фурилакрилоил-глицил-L-лейцин-амида (FAGLA) (Швейцерхолл). Расщепление амидных связей измеряли спектрофотометрически посредством уменьшения поглощения при длине волны 345 нм. Исходная концентрация фермента составила 10-7 М согласно определе-нию содержания белка по Брэдфорду и денситометрическому сканированию (Фармация LKB UltroScan XL) окрашенных Кумасси гелей SDS-PAGE. CLEC-фермент был определен как восстановленные лиофилизированные структурированные кристаллы термолизина. Раство-римый фермент был определен как термолизин, концентрированный до 100 мг/мл. Фермент добавляли к 5 мл реакционного объема, содержащего субстрат. В указанные моменты брали аликвоты реакционной смеси и измеряли из поглощение при 345 нм. CLEC - термолизин от-деляли от реакционной смеси путем кратковременного центрифугирования (Бекман, микро-центрифуга серии Е) перед считыванием поглощения. Поглощение использовали в уравне-нии скорости псевдо-первого порядка и рассчитывали путем деления этого подогнанного значения на концентрацию фермента (Программа “Мультифит 2.0 Подгонка Кривой” для компьютера Эппл Макинтош, Day Computing P.O. Box 327, Милтон, Кембридж, СВ4 6WI, Великобритания (1990).
рН-зависимоть и стабильность
Оптимальный уровень рН и стабильность растворимого фермента сравнивали с этими характеристиками CLEC - термолизина посредством расщепления дипептидного субстрата FAGLA. Результаты показаны на фиг. 2 и табл. 9. Как растворимый, так и кристаллический фермент продемонстрировал максимальную активность при рН 7,0 CLEC и растворимый термолизин также продемонстрировали сходную активность в кислом диапазоне, и колоко-лообразный рН-профиль, полученный у растворимого фермента, хорошо согласовался с опубликованными данными (Федер и Шук, Biochemistry 9:2784-2791 (1970). Однако в щелоч-ном диапазоне кристаллический фермент сохраняет максимальную активность до рН 10,0 тогда как растворимый фермент имеет 75%-ную активность при рН 8,5, и только 25%-ную активность при рН 9. При рН 9,5 растворимый фермент совершенно неактивен.
Стабильность при повышенных температурах
При осуществлении определенных химических процессов при более высоких температу-рах могут быть достигнуты более высокие скорости реакции и более короткое время диффу-зии для субстратов и продуктов, которые обычно ограничиваются температурной стабильно-стью субстратов и продуктов. Однако при ферментном катализе на температуру проводимого процесса накладывает на практике ограничение, связанное с утратой фермента его активно-сти. Дополнительная стабилизация, достигаемая у CLEC, позволяет им проявлять фермента-тивную активность при значительно более высоких температурах, чем это возможно для рас-творимых ферментов.
Повышенная стабильность при более низких температурах упрощает обычное долговре-менное хранение CLEC - катализаторов. Например, растворы растворимого термолизина, концентрированные до более чем 50 мг/мл, необходимо хранить при 80°С, чтобы сохранить максимальную ферментативную активность. При комнатной температуре активность обычно утрачивается в течение дня. Напротив, регидратированный CLEC - термолизин может хра-ниться обычным образом при комнатной температуре в течение месяцев без заметной потери активности. Представляется, что невосстановленный лиофилизированный CLEC - термоли-зин может сохранять жизнеспособность в течение неограниченных периодов времени.
Температурная стабильность и резистентность к автолизу были продемонстрированы у CLEC - термолизина после инкубирования его при 65°С в течение пяти последовательных дней (см. фиг.3 и табл. 10). CLEC - термолизин сохраняет максимальную активность после пятидневного инкубирования при повышенной температуре. Напротив, растворимый термо-лизин теряет 50% своей исходной активности после всего лишь двух часов инкубирования и демонстрирует незначительную активность после 24-часового инкубирования при 65°С.
Активность растворимого и CLEC - термолизина измеряли после его инкубирования при 65°С. Растворимый термолизин инкубировали в 10 мМ ацетате кальция, 50 мМ Трис с рН 7,0 в водяной бане 65°С. Реакционный объем составлял 500 л. Конечная концентрация белка составляла 10 мг/мл. Аликвоты брали через 0, 1, 2, 4, 6, 10 и 18 часов. Образцы исследовали SDS-PAGE или расщеплением FAGLA при комнатной температуре, как описано выше. Для CLEC - термолизина 250 л суспензии кристаллов в 10 мМ ацетата кальция и 50 мМ Трис также инкубировали в 65С водяной бане. Активность исследовали через 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 и 120 часов посредством FAGLA - расщепления.
Резистентность к экзогенному протеолизу
Также проводили оценку резистентности CLEC - термолизина к действию экзогенной протеазы. SDS-PAGE анализ (электрофорез на полиакриламидом геле с додецил-сульфатом натрия) предполагает, что коммерческие ферменты могут содержать значительный процент загрязняющих веществ, некоторые из которых могут обладать протеолитической активностью против основных видов растворимых ферментов. Имея упаковку молекул фермента в кри-сталлическую решетку, можно предположить, что внутренние молекулы фермента у CLEC будут защищены от протеолиза. Чтобы проверять эту возможность, CLEC - термолизин и препарат растворимого фермента инкубировали в присутствии стрептококковой протеазы, -Проназы, -неспецифичной протеазы, способной переваривать большинство белков до сво-бодных аминокислот (Каталог 1990, Calbiochem; La Jolla, Канада).
Растворимый и CLEC - термолизин инкубировали в 50 мМ Трис с рН 7,5 при 40С в при-сутствии Проназы (Калбиохем). Соотношение Проназы и термолизина составляло 1:40. Для ингибирования автолиза термолизина и предотвращения протеолитического разрушения проназы термолизином к реакционной среде растворимого фермента добавляли ЭДТК до ее конечной концентрации 100 мМ (ЭДТК ингибирует активность термолизина, но не проназы). В указанное время из реакционной смеси брали аликвоты и исследовали спектрофометриче-ски активность фермента путем расщепления дипептидного субстрата FAGLA. Чтобы устра-нить ингибирование термолизина присутствием ЭДТК, спектрофометрическое исследование активности растворимого фермента осуществляли в 0,5 М кальциево-ацетатном буфере с рН 7,0 и концентрацию фермента повышали вдвое. Структурированный кристаллический фер-мент исследовали, как было описано выше.
Как можно видеть на фиг. 4 и табл. 11, растворимый термолизин быстро разрушался и те-рял всю свою активность через 90 минут инкубирования. Напротив, активность CLEC - тер-молизина осталась той же после четырехдневного инкубирования в присутствии протеазы. Эта почти неуязвимость к протеолизу представляет особый интерес в диагностических при-менениях биосенсорного типа, когда может потребоваться работа подходящего CLEC в при-сутствии неизвестного коктейля встречающихся в природе протеолитических ферментов.
Стабильность в присутствии органического растворителя
Для того, чтобы ферменты приобрели идеальную приемлемость в качестве жизнеспособ-ных промышленных катализаторов, они должны быть способны функционировать без избы-точного воздействия на фактическую окружающую среду производственных процессов. В частности, эта среда должна включать использование водных, полярных и неполярных орга-нических растворителей, а также смесей. В коммерческих применениях водно-органические смеси растворителей позволяют управлять образованием продукта путем использования от-носительной растворимости продуктов и субстратов.
Растворимый термолизин и термолизиновые CLEC проявляют существенно отличающу-юся стабильность в присутствии органических растворителей (табл.12). Концентрации рас-творимого фермента, которые могли инкубироваться в органическом растворителе, были ограничены до максимум 10 мг/мл. Концентрации выше этого значения приводили к немед-ленному осаждению (преципитации) термолизина при добавлении органического раствори-теля. Напротив, концентрации CLEC - термолизина были ограничены только объемом, зани-маемым кристаллами. Растворимый термолизин сохраняет свою наибольшую активность (75%) после инкубирования в ацетоне и наименьшую (36%) - в тетрагидрофуране. Через 1 час инкубирования в присутствии ацетонитрила или диоксана растворимый фермент утрачивает приблизительно 50% своей исходной активности. CLEC - термолизин сохраняет более 95% своей максимальной активности после инкубирования со всеми испытанными органически-ми растворителями.
Стабильность в органических растворителях
CLEC - термолизина или препараты растворимого термолизина инкубировали в 50% (об/об) растворах указанных органических растворителей. 100л суспензии CLEC - термоли-зина (10 г/мл) в 10 мМ Трис рН 7 помещали в стеклянный сосуд емкостью около 2 мл (1/2 dram). Затем к белковому раствору добавляли 100 мл органического растворителя и кратко-временно встряхивали. CLEC и растворимый фермент инкубировали в присутствии органи-ческого растворителя в течение одного часа при 40С. После инкубирования активность фер-мента исследовали посредством расщепления дипептидного субстрата FAGLA, как уже опи-сано.
Предположительно, низкое содержание воды мешает развертыванию белковой молекулы на промежуточных этапах пути к ее денатурации. У CLEC, это ограничение конформацион-ной мобильности обеспечивается межмолекулярными связями и контактами составляющих фермент молекул, создающих кристаллическую решетку, скорее, чем почти полным отсут-ствием воды в среде. В результате, промежуточные концентрации водно-органического рас-творителя легко переносятся ферментами в виде CLEC, что ранее у ферментов не наблюда-лось (см. табл. 12). Это открытие открывает целые новые области химии синтеза для их раз-работки с использованием ферментного катализа.
Даже в почти безводных органических растворителях, однако, обычное использование ферментов было затруднено вследствие их тенденции образовывать неопределенные суспен-зии с проблемами образования комков и других явлений агрегации. Это свойство делает та-кие препараты в сущности непривлекательными для широкомасштабных промышленных процессов. Например, CLEC и составляющие ферменты в кристаллической решетке сохраня-ют монодисперсию во всех этих растворителях.
Сравнение с другими методами иммобилизации
В литературе было опубликовано несколько полезных обзоров на тему методов иммоби-лизации (Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984); Tramper, J. Trends in Biotechnology 3:45-50 (1985)). В этих источниках фермент всегда представляет собой небольшую часть от общего объема иммобилизованных частиц, основную массу которых составляет инертный материал носителя. Носитель увеличивает средний свободный путь между внешней средой раствори-теля вокруг частиц иммобилизованного фермента и активными сайтами этого фермента, усу-губляя диффузионные проблемы (Квиочо и Ричардс, Biochemistry 5: 4062-4076 (1967).
У CLEC структурированная матрица кристалла обеспечивает себе свою собственную опору, устраняя необходимость в носителе. В результате, концентрация фермента в CLEC близка к теоретическому пределу загрузку, который может быть достигнут для молекул дан-ного размера, значительно превышая плотности, достижимые даже в концентрированных растворах. Весь CLEC состоит из активного фермента и таким образом уменьшается до ми-нимума, связанное с проблемами диффузии снижение скорости ферментативной реакции, которое обычно наблюдают с ферментами, иммобилизованными традиционными методами по сравнению с ферментами в растворе (см. фиг. 1), поскольку средний свободный путь для субстрата и продукта между активным ферментом и свободным растворителем будет значи-тельно укорочен у CLEC (по сравнению с частицами носителя с традиционно иммобилизо-ванным ферментом). Важно, что составляющий CLEC фермент является, в сущности, моно-дисперсным, и может быть выделен простыми приемами с CLEC-частицами, такими как фильтрование, центрифугирование или декантация растворителя.
Пример 3. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация эластазы, и оценка харак-теристик получаемого продукта.
Кристаллизация эластазы
Лиофилизированную эластазу из поджелудочной железы свиньи растворяли в 0,1 М аце-тата натрия с рН 5,0 до концентрации 5 мг/мл (вес/об) при комнатной температуре. Палочко-образные кристаллы эластазы становились видимыми в течение одной минуты полного рас-творения белка. Кристаллизационный раствор переносили в холодильник с 4С и отставляли до утра для завершения кристаллизации. Кристаллы выделяли центрифугированием, как уже было описано.
Структурирование кристаллов эластазы
200 л объема кристаллов эластазы добавляли к 1,3 мл раствора 5,77% глютаральдегида и 1,5 М ацетата натрия с рН 5,0. Кристаллы структурировали в течение одного часа при мягком перемешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы промывали тремя объемами по 15 мл 0,2 М Трис с рН 8,0. CLEC-эластазу лиофилизировали, как описано в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-эластазы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-эластазы исследовали спектрофото-метрически посредством измерения гидролиза субстрата-сукцинил-(Ala)3 р-нитроанилида (Bachem) (Бит и др., Biochem. Med. 11:350-357 (1974) (см. табл. 13, фиг. 5). Расщепление ис-следовали на повышении поглощения при 410 нм. Исходная концентрация субстрата состав-ляла 2·10-4. Концентрация фермента была 2,8·10-7 М. CLEC или растворимый фермент до-бавляли к 5 мл реакционному объему, содержащему субстрат в 0,2 Трис с рН 8,0. Как описано выше, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси перед измерением поглощения.
Резистентность к экзогенному протеолизу
Также проводили оценку резистентности CLEC-эластазы к действию протеазы и при условиях, идентичных тем, которые использовали для термолизина (см. пример 2). Актив-ность растворимого и CLEC-фермента после их инкубирования с протеазой оценивали по-средством гидролиза нитроанилидного субстрата, как описано выше (табл. 14 и фиг. 6).
Пример 4. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация эстеразы, и оценка харак-теристик полученного продукта
Кристаллизация эстеразы
Как раскрыто в настоящем описании, 30 мг/мл суспензии сульфата аммония эстеразы из печени свиньи (Fluka) растворили в 0,25 М ацетата кальция с рН 5,6 при комнатной темпера-туре. Кристаллы эстеразы становились видимыми через несколько минут после добавления раствора ацетата кальция. Кристаллизационный раствор оставляли стоять при комнатной температуре и кристаллизацию завершали на следующее утро. Кристаллы выделяли посред-ством центрифугирования, как описано выше, в примере 2.
Структурирование кристаллов эстеразы
Как раскрыто здесь, 300 л кристаллов эстеразы добавляли к 5 мл раствора из 12,5% глю-таральдегида и 0,5 М ацетата натрия с рН 5,5. Кристаллы структурировали в течение одного часа при легком помешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы трижды промывали 15 мл 0,5 М ацетата кальция с рН 6,3. CLEC-эстеразу лиофилизировали, как описано выше, в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-эстеразы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-эстеразы оценивали спектрофотомет-рически посредством мониторинга гидролиза субстрата, - р-нитрофенилацетата (Fluka) (табл. 15 и фиг. 7). Расщепление изучали по усилению поглощения при 400 нм. Исходная концен-трация субстрата составляла 0,001%. Концентрация фермента была 1·10-8 М. CLEC или рас-творимый фермент добавляли к 5 мл реакционной среды, содержащей субстрат в 0,25 ацетата кальция с рН 6,3. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугирования перед измерением поглощения.
Резистентность к экзогенному протеолизу
Оценку резистентности CLEC-эстеразы к действию протеазы осуществляли при услови-ях, идентичных описанным для термолизина в примере 2. Активность растворимого и CLEC-фермента после их инкубирования с протеазой оценивали с помощью гидролиза субстрата, - р-нитрофенилацетата, как описано выше (см. табл. 16 и фиг. 8).
Пример 5. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация и оценка характеристик полученного продукта
Кристаллизация липазы
Как здесь раскрыто, фермент липазу (Geotrichum candidum) кристаллизовали паровой диффузией из водного раствора 20 мг/мл белка в 50 мМ Трис с рН 7, содержащего 8% сульфа-та аммония. Кристаллы в виде двойных пирамид становились видимыми через 20-30 дней инкубирования при комнатной температуре. Кристаллы выделяли посредством центрифуги-рования, как описано выше в примере 2.
Структурирование кристаллов липазы
Как здесь раскрыто, кристаллы липазы добавляли к раствору 12,5% глютаральдегида и 50 мМ Трис рН 5,6. Кристаллы структурировали в течение одного часа. После структурирования кристаллы промывали трижды 15 мл объемами 50 мМ Трис с рН 7,0. CLEC-липазы лиофили-зировали, как описано выше в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-липазы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-липазы исследовали спектрофометри-чески путем мониторинга гидролиза субстрата, - р-нитрофенилацетата (табл. 17 и фиг. 9). Расщепление изучали по увеличению поглощения при 400 нм. Исходная концентрация суб-страта составляла 0,005%. Концентрация фермента была 1,5·10-8 М. CLEC или растворимый фермент добавляли в 5 мл объем реакционной среды, содержащей субстрат в 0,2 М Трис с рН 7,0 при комнатной температуре. Как описано выше в примере 2. CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугирования перед измерением поглощения.
Пример 6. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация лизоцима, и оценка харак-теристик полученного продукта
Кристаллизация лизоцима
Следуя методу Блейка с сотр., Nature, 196: 1173 (1962), 200 мг лиофилизированного лизо-цима из белка куриного яйца (Берингер, Мангейм) растворяли в 2,5 мл 0,04 М натриево-ацетатном буфере с рН 4,7 при комнатной температуре. После растворения белка к раствору лизоцима по каплям при помешивании добавляли 2,5 мл 10%-ного хлорида натрия. Кристал-лизационный раствор оставляли стоять до утра при комнатной температуре и кристаллиза-цию завершали через 48 часов. Кристаллы выделяли посредством центрифугирования, как описано выше в примере 2.
Структурирование кристаллов лизоцима
Как описано здесь, 500 л объем кристаллов лизоцима добавляли к 10 мл 24%-ного глю-таральдегида и 50 мМ трис с рН 5,6 содержащим 20% хлорида натрия. Кристаллы структури-ровали в течение 20 минут при легком перемешивании (перемешивающая чашка). После структурирования кристаллы промывали трижды 50 мл объемами 20 М ацетата кальция и 50 мМ хлорида калия с рН 5,3. CLEC-лизоцим лиофилизировали, как описано выше в примере 2.
Ферментативная активность растворимого и CLEC-лизоцима
Каталитическую активность растворимого и CLEC-лизоцима исследовали посредством измерения скорости гидролиза субстрата - 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-хитриозида (Fluka) Янг и Хамагучи, J. Biochem., 8:1003-1014 (1980) (табл. 18 и фиг. 10). Освобождение 4-метилумбеллиферона устанавливали флуорометрически (Perkin Elmer, модель LS-50). Исход-ная концентрация субстрата составляла 1,42·10-3. Концентрация фермента была 3·10-7. CLEC или растворимый фермент добавляли к 2 мл реакционной среды, содержащей субстрат в 20 мМ ацетата кальция и 50 мМ хлорида калия с рН 5,3 при 42С. Количество 4-метилумбеллиферона определяли флуорометрически, путем измерения флуоресценции при 450 нм с возбуждением при 360 нм. Ширина щели как для возбуждения, так и эмиссии была 10 мм. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посред-ством центрифугирования перед измерением флуоресценции.
Пример 7. Кристаллизация, структурирование и лиофилизация аспарагиназы, и оценка характеристик полученного продукта
Кристаллизация аспарагиназы
В качестве модификации процедуры, описанной Грабнером с сотр., см. патент США №3664926 (1972), 25 мг лиофилизированной аспарагиназы (Worthington) растворяли в 500 мл 50 мМ натриево-фосфатного буфера с рН 7,2. Раствор охлаждали до 4С и рН доводили до 5,0 с помощью 1 М уксусной кислоты. Затем к раствору аспарагиназы по каплям добавляли хо-лодный (-20С) этанол до конечной концентрации 33%. Раствор инкубировали при 4С. Кри-сталлизацию завершали через 48 ч. Кристаллы выделяли посредством центрифугирования, как описано выше.
Структурирование кристаллов аспарагиназы
Как раскрыто здесь, кристаллы аспарагиназы структурировали в растворе из 7,5% глюта-ральдегида в 50 мМ натриево-фосфатного буфера с рН 5,6. После структурирования кристал-лы промывали пять раз 15 мл объемами 50 мМ Трис с рН 7,0. CLEC аспарагиназу лиофилизи-ровали, как описано выше в примере 2.
Ферментативная активность растворимой и CLEC-аспарагиназы
Каталитическую активность растворимой и CLEC-аспарагиназы исследовали спектрофо-тометрически посредством измерения эфолюции иона аммония в сопряженной ферментатив-ной реакции, описываемой ниже (все реагенты были закуплены у фирмы Берингер Майгейм) (табл. 19 и фиг. 11).
L-аспарагин аспаргиназа аспарат+
-кетоглютарат глютамат-дегидрогеназа глютамовая кислота+NAD+
Окисление NADH измеряли по уменьшению поглощения при 340 нм Исходная концен-трация NADH составляла 1,4 мг/мл. Концентрация аспарагина была 10-3 М. Концентрация альфа-кетоглютарата была 10-4 М. Концентрация глютамат-дегидрогеназы составляла 10-7. Концентрация аспарагиназы была 2,3·10-8 М. Как описано выше в примере 2, CLEC-фермент удаляли из реакционной смеси посредством центрифугировани перед измерением поглоще-ния.
(56) Документы, цитированные в отчёте
ЕР 0341503 А, 15.11.89. US 5010006 А, 16.10.90. Biotechnology, 1985, N 3, c.459-464.