СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИОГЛОБИНА

Изобретение относится к иммуноферментным способам определения миоглобина в пробе крови и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения мышечных клеток, например, при инфаркте миокарда. Цель изобретения - сокращение времени определения. Для этого в буферный раствор для разведения исследуемой пробы и меченых пероксидазой антител к миоглобину добавляют полиэтиленгликоль молекулярной массы 6000 Д в концентрации 3%, что позволяет сократить время инкубации исследуемой пробы крови с иммобилизованными на полистиро-ле антителами к миоглобину и образовавшегося комплекса миоглобин-антитело с мечеными пероксидазой антителами к миоглобину до 10 минут каждую. Кроме того, использование предлагаемого способа позволит повысить чувствительность определения

Изобретение относится к области иммунодиагностики, в частности, к иммунофермент-ным способам определения миоглобина в пробе крови, и может быть использовано в кар-диологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения мы-шечных клеток, например, при инфаркте миокарда.
Известен способ иммуноферментного определения миоглобина в сыворотке крови, описанный в статье M.Sarkaz and C.Mandаl, J. Jmmuol. Meth. 1985, v.83, p.55-60. Согласно известному способу фракцией JgM, выделенной из сыворотки крови кролика, иммунизи-рованного миоглобином, сенсибилизируют полиэфирную твердую фазу, отмывают водой, содержащей твин-20, затем к сенсибилизированной твердой фазе добавляют пробу плазмы крови, инкубируют и опять отмывают водой с твином-20. После этого к твердой фазе до-бавляют меченую пероксидазой антимиоглобиновую Jg-М-фракцию иммунной сыворотки кролика, повторно инкубируют, отмывают фосфатным буфером и добавляют субстратную смесь, содержащую перекись водорода и О-дианизидин, а по интенсивности окраски опре-деляют количество миоглобина в исследуемой пробе. Недостатком известного способа яв-ляется малый диапазон определения миоглобина (0,25-10 нг/мл).
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому резуль-тату можно считать способ иммуноферментного определения миоглобина в плазме крови, описанный в статье Г.А.Ермолина и др., Вопр.мед.хим., 1986, №1, с.с.130-134. Согласно прототипному способу антитела к миоглобину сенсибилизируют в лунках полистиролово-го плоскодонного планшета, инкубируют и промывают водой с твином-20, добавляют к сенсибилизированным антителам разбавленную в 40 раз фосфатным буфером с твином-20 сыворотку крови, инкубируют и повторно отмывают водой с твином-20, затем к образо-вавшемуся комплексу добавляют меченые пероксидазой антимиоглобиновые антитела, повторно инкубируют и снова отмывают водой с твином-20, после чего полученный ком-плекс подвергают взаимодействию с субстратной смесью, содержащей перекись водорода и О-фенилендиамина и помещают планшет в автоматический спектрофотометр, а по опти-ческой плотности определяют концентрацию миоглобина.
К недостаткам прототипного способа следует отнести значительную длительность про-ведения анализа, которая составляет около 1,5 часов. В то же время, при определении кон-центрации в плазме крови такого специфического мышечного белка, как миоглобин, для оценки степени повреждения сердечной мышцы экспрессность играет решающую роль, ибо от длительности анализа зависит эффективность и правильность последующего лече-ния такого заболевания, как инфаркт миокарда. Однако длительность анализа, обеспечива-емая прототипным способам, является недостаточной для экспресс-диагностики инфаркта-миокарда. Это можно объяснить значительным временем инкубации (40 минут) исследуе-мой пробы крови с иммобилизованными на полистироле антителами к миоглобину и по-вторной инкубацией (40 минут) образовавшегося комплекса миоглобин-антитело с мече-ными пероксидазой антителами к миоглобину.
Целью изобретения является сокращение времени определения за счет уменьшения длительности обеих инкубаций.
Поставленная цель достигается усовершенствованием способа иммуноферментного определения миоглобина, согласно которому антитела к миоглобину сенсибилизируют на твердой фазе и отмывают, добавляют к сенсибилизированным антителам исследуемую пробу разведенную в буферном растворе, инкубируют и повторно отмывают, затем к обра-зовавшемуся комплексу добавляют меченые пероксидазой антитела к миоглобину, разве-денные в буферном растворе, повторно инкубируют и снова отмывают, после чего полу-ченный комплекс подвергают взаимодействию с субстратной смесью и по оптической плотности раствора определяют количество миоглобина в исследуемой пробе.
Новые качества способу придает то, что в буферный раствор для разведения исследуе-мой пробы и меченых пероксидазой антител к миоглобину добавляют полиэтиленгликоль молекулярной массы 6000 в концентрации 3%, при этом каждую из указанных инкубаций этими буферными растворами ведут в течение 10 минут.
Существенность отличий предлагаемого способа можно обосновать следующим обра-зом. Известно использование полиэтиленгликоля для отделения связанного с антителами биологически активного вещества от свободного (Т.Чард, Радиоиммунологические мето-ды, М.”Мир”, 1981, с.с.110-119). Кроме того в статье Johnson A.M., J. Pharm. Blomed. Anal., 1987, v.5 №8, р.р.803-809 известно использование полиэтиленгликоля для осаждения ком-плекса антиген-антитело в нефелометрическом иммуноанализе. Однако, по сведениям ав-торов, полиэтиленгликоль для ускорения инкубации пробы с антителами и мечеными пе-роксидазой антителами в иммуноферментном анализе не использовался. Отсюда можно заключить, что отличительные признаки предлагаемого способа являются новыми, и по-скольку они приносят способу новое качество - сокращение времени определения - эти признаки можно считать существенными для достижения поставленной цели.
Сущность изобретения поясняется приведенными на чертеже калибровочными кривы-ми для определения миоглобина предлагаемым и прототипным способами.
Способ иммуноферментного определения миоглобина осуществляют следующим обра-зом, а для иллюстрации этого приводим один пример конкретного выполнения, поскольку, заявляемые параметры реализации способа являются однозначными.
Для анализа используют предварительно обработанный антителами к миоглобину и 1% лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при температуре - 15С. В лунки планшета вносят по 50 мкл растворов миоглобина-стандарта (от 1,25 до 160 нг/мл), приготовленного на 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 3% полиэтиленгликоля молекулярной массы 6000D. Одновременно в свободные лунки вносят анализируемую пробу сыворотки крови, разведенную в 10 раз 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2, содер-жащем 3% полиэтиленгликоля молекулярной массы 6000D. Растворы миоглобина-стандарта и пробы инкубируют в течение 10 минут при 37С. После отмывки водой лунки обрабатывают раствором казеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. После этого в каждую лунку добавляют по 50 мкл разведенные 1:500 меченые пе-роксидазой антитела к миоглобину человека в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2, содержа-щем 3% полиэтиленгликоля молекулярной массы 6000D, и инкубируют в течение 10 ми-нут при 37С. После отмывки водой лунки обрабатывают раствором казеина. Затем опре-деляют пероксидазную активность по общепринятой методике в присутствии хромогена 0-фенилендиамина при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строят калибровочную кривую и по ней рассчитывают концентрацию миоглобина в испы-туемой плазме крови. Ее значение составляет 56,82,7 нГ/мл.
Оптимальность применяемых в предлагаемом способе молекулярной массы и концен-трации полиэтиленгликоля, а также длительности инкубаций можно обосновать следую-щим образом.
Полиэтиленгликоль является продуктом полимеризации двухатомного спирта - эти-ленгликоля - и может быть расфракционирован по молекулярным массам. Полиэти-ленгликоль, как продажный препарат фирм Serva (ФРГ) и Sigma (США), имеет следу-ющие молекулярные массы: 600, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000 и более. Таким образом, молекулярные массы полиэтиленгликоля являются величинами дискретными, а вы-бранная нами молекулярная масса 6000 является однозначным параметром предлагаемого способа, чем иллюстрирует следующая таблица:


Таблица 1

молекулярная масса
полиэтиленгликоля, Д Оптическая плотность окрашенного раствора при 492 нм
для концентрации миоглобина 160 нГ/мл, отн.ед.
600 1,24
1000 1,31
2000 1,48
4000 1,50
6000 1,73
8000 1,48



Как видно из таблицы 1, при нахождении в буферных растворах полиэтиленгликоля молекулярной массы 6000 наблюдается максимальная оптическая плотность окрашенного раствора, что свидетельствует о более высокой чувствительности определения миоглобина в присутствии полиэтиленгликоля именно такой молекулярной массы. Для той же концен-трации миоглобина-стандарта (160 нГ/мл), в присутствии полиэтиленгликоля молекуляр-ной массы больше или меньше 6000, оптическая плотность окрашенного раствора меньше, чем при оптимальной молекулярной массе полиэтиленгликоля, что говорит о снижении чувствительности определения.
Выбор оптимальной концентрации полиэтиленгликоля с оптимальной молекулярной массой 6000, при которой наблюдается наибольшая чувствительность определения, иллю-стрирует следующая таблица:
Таблица 2

концентрация полиэтиленгли-коля в буферном растворе, % оптическая плотность окрашенного раствора при 492 нм
для концентрации миоглобина 160 нГ/мл, отн.ед.
1,0 1,97
1,5 2,03
2,0 2,04
2,5 2,25
3,0 2,73
3,5 2,74
4,0 2,75


Как видно из таблицы 2 при концентрациях полиэтиленгликоля в буферном растворе ниже 3% наблюдаются более низкие значения оптической плотности окрашенного раство-ра, что говорит о снижении чувствительности определения. При концентрациях полиэти-ленгликоля с молекулярной массой 6000 3% и выше значения оптической плотности окра-шенного раствора максимальны и практически не меняются. Поэтому оптимальной и од-нозначной концентрацией полиэтиленгликоля в буферном растворе является 3%, посколь-ку увеличение концентрации сверх этой величины нецелесообразно по экономическим соображениям.
Снижение времени определения миоглобина предлагаемый способ иллюстрирует сле-дующая таблица:
Таблица 3

Способ время определения миоглобина, мин оптическая плотность окрашен-ного раствора при 492 нм для концентрации миоглобина 160 нГ/мл, отн.ед.
Предлагаемый 80 0,72
60 1,09
40 2,17
30 2,23
20 2,44
10 2,18
Прототипный 80 0,66


Как видно из таблицы 3, при содержании в буферном растворе полиэтиленгликоля мо-лекулярной массы 6000 и концентрации 3% максимальная чувствительность определения наблюдается при времени определения 20 минут, которое складывается из двух равных времен инкубаций по 10 минут, о чем свидетельствует максимальная оптическая плотность 2,44. При увеличении времени определения сверх 20 минут наблюдается увеличение не-специфического связывания, как это видно по снижению оптической плотности, что явля-ется недопустимым. В то же время, уменьшение времени инкубации ниже 20 минут явля-ется, по-видимому, недостаточным для образования комплекса антиген-антитело, о чем говорит уменьшение оптической плотности окрашенного раствора. Таким образом, время инкубации иммобилизованных антител с пробой и комплекса антиген-антитело с мечены-ми антителами в буферных растворах с полиэтиленгликолем молекулярной массы 6000 и концентрации 3% является однозначным параметром способа и составляет каждая по 10 минут.
Использование предлагаемого способа позволит уменьшить время определения мио-глобина в 4 раза по сравнению с временем определения прототипным способом. Кроме того, дополнительным эффектом является повышение чувствительности определения, что видно из прилагаемых калибровочных кривых, представленных на чертеже, и из таблицы 3. Экономический эффект от использования предлагаемого способа затруднительно оце-нить в денежном выражении. Однако более выраженным является социальный эффект, заключающийся в быстрой диагностике инфаркта миокарда и измерений степени повре-ждения сердечной мышцы.

В статье M. Sarkar and C. Mandal, J. Jmmuol. Meth 1985, v. 83, p.55-60.
В статье Г.А. Ермолина и др., Вопр. мед. хим., 1986, №1, с.с. 130-134.