ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИОГЛОБИНА В КРОВИ

Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунодиагностике и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения мышечных клеток. Цель изобретения - повышение точности способа. Она осуществляется за счет одновременной обработки миоглобина - стандарта и пробы крови формальдегидом, последующей инкубации и диализа.
Точность предлагаемого способа превышает известный в 7 раз.

Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунодиагностике и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения мышечных клеток.
Целью изобретения является повышение точности способа.
Способ осуществляется следующим образом:
Очищенными антителами к миоглобину в концентрации 20 мг/мл при рН 9,6 в объеме 50 мкл обрабатывают полистироловый планшет для иммунологических реакций при 4°С в течение 18 часов. Одновременно обрабатывают миоглобин - стандарт и пробу крови фор-мальдегидом. Для этого к 300 мкл миоглобина-стандарта с концентрацией 1 мг/мл добав-ляют 30 мкл 3%-ного раствора формальдегида и смесь икубируют в течение 1 часа при 30°С. После этого смесь подвергают диализу против 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 в течение 40-60 мин. и при перемешивании и частой смене диализирующего раствора. Ана-логичным образом к 300 мкл предварительно разведенной в 10 раз плазмы крови добавля-ют 30 мкл 3%-ного раствора формальдегида и смесь инкубируют в течение 1 часа при 30°С. После этого смесь диализуют против фосфатного буфера рН 7,2. Приготовленный, таким образом, миоглобин-стандарт используют для построения калибровочной кривой, а пробу - для иммуноферментного определения уровня миоглобина.
Способ иллюстрируется примерами.
Пример 1
В лунки планшета, содержащие антитела к миоглобину, добавляют обработанный формальдегидом миоглобинсодержащий раствор плазмы крови пациента Г. в объеме 50 мкл на лунку и инкубируют в течение 40 минут при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают 350 мкл раствора казеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 в течение 3 минут. После этого в каждую лунку добавляют по 50 мкл разве-денных 1:500 меченных пероксидазой антител к миоглобину человека и инкубируют в те-чение 40 минут при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают раствором казеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 в течение 3 минут. Определя-ют пероксидазную активность по общепринятой методике в присутствии хромогена О-фенилендиамина. Время экспозиции составляет 20 минут, а после остановки ферментатив-ной реакции 50%-ной серной кислотой измеряют оптическую плотность при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов - стандартов строят калибровочную кривую и по ней рассчитывают концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови.
Пример 2
Анализ уровня миоглобина в цельной крови и пробе сыворотки крови пациента Г. проводят по примеру 1. По результатам анализа уровень миоглобина в цельной крови и пробе сыворотки крови составляет 37,9±0,9 нг/мл и 38,1±1,0 нг/мл.
Для доказательства оптимальности концентрации казеина в промывочном растворе (0,5 мг/мл) используют результаты измерений холостого опыта. Этот опыт представляет собой измерение оптической плотности окрашенного раствора в результате проведения иммуно-ферментного анализа в отсутствии миоглобина. Из таблицы 4 видно, что оптимальной и однозначной концентрацией казеина является 0,5 мг/мл, о чем свидетельствует наиболее низкая оптическая плотность раствора в холостом опыте.
Показано, что значения коэффициента вариации, характеризующего точность метода, рассчитанные для каждой определяемой концентрации миоглобина, для предлагаемого способа значительно меньше, чем для прототипного. Это указывает на более высокую точ-ность предлагаемого способа. Более наглядно это видно из соотношения значений этого коэффициента /CV прототипа/ CV предлагаемого/ для каждой определяемой концентра-ции. Это соотношение лежит в пределах от 2,55 до 13,31. Среднее значение этого соотно-шения составляет 7,65±4,09. Это говорит о том, что предлагаемым способом можно опре-делить уровень миоглобина с точностью более, чем в 7 раз превышающей точность прото-типного способа.
Оптимальность заявляемых параметров способа - концентрации формальдегида 3 мг/мл времени обработки формальдегида 1 час, температуры обработки 30°С иллюстрируют сле-дующие таблицы:

Таблица 1

Концентрация формальдегида
в растворе, мг/мл Оптическая плотность раствора при 492 нм
для концентрации миоглобина 80 нг/мл,
отн.ед.

0 0,68
1 0,97
3 1,16
7 0,84
10 0,86
15 0,78

Таблица 2

Время обработки формальдегида,
час Оптическая плотность раствора при 492 нм
концентрации миоглобина 80 нг/мл,
относ.ед.

0 0,82
0,5 1,07
1 1,18
2 1,09
3 1,02
4 0,97
5 0,89


Таблица 3

Температура обработки формальдегида,
°С Оптическая плотность раствора при 492 нм
для концентрации миоглобина 80 нг/мл,
отн. ед.

2 1,53
12 1,51
20 1,54
30 1,85
37 1,60
53 1,38


Таблица 4

Концентрация казеина в промывочном
растворе, мг/мл Оптическая плотность раствора
в холостом опыте при 492 нм
отн. ед.

0,1 0,45
0,3 0,31
0,5 0,20
0,7 0,19
0,9 0,19

Ермолина Н.А. и др. Вопр.мед.хим. 1986, №1, с.130-134.