(-)-ЭНАНТИОМЕР ЦИС-4-АМИНО-1-(2-ГИДРОКСИМЕТИЛ-1,3-ОКСАТИОЛАН-5-ИЛ)-(1Н)-ПИРИМИДИН-2-ОНА ИЛИ ЕГО СОЛЬ, ИЛИ ЕГО СЛОЖНЫЙ ЭФИР, ИЛИ СОЛЬ СЛОЖНОГО ЭФИРА, СМЕСЬ (-)-ЭНАНТИОМЕРА И (+)-ЭНАНТИОМЕРА, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, АНТИВИРУСНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕ-НИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ВКЛЮЧАЯ ЧЕЛОВЕКА, СТРАДАЮЩИХ ОТ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ИЛИ ВОСПРИИМЧИВЫХ К НЕЙ

(-)-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-окса-тиолан-5-ил/-(IH)-пиримидин-2-он, фармацевтиче-ски приемлемые производные этого соединения, фармацевтические составы на их основе, способы их приготовления и применения как противовирусных препаратов описаны в этом изобретении.

Настоящее изобретение относится к нуклеозидным аналогам и их использованию в ме-дицине. Более конкретно, настоящее изобретение относится к нуклеозидным аналогам 1,3-оксатиолана, фармацевтическим составам на их основе и их использованию при лечении вирусных инфекций.
Соединение формулы (1)


также известно под маркой ВСН-189 или NGРВ-21 и было описано как соединение, обла-дающее противовирусной активностью, в частности, как средство против вируса иммуно-дефицита человека (ВИЧ) являющегося причиной СПИД (5 th Anti - Aids Conference, Montreal, Canada 5-9 June 1989: Adstracts T.C.O.1 and M.C.P. 63; European Patent Application Publication №0382562). Соединение формулы (1) это-рацемат двух энантиомеров формулы (1-1) и формулы (1-2):


и было описано и исследовано в форме рацемата. В настоящее время только соединение 3-азидо-3-дезокситимидин (AZT, зидовудин, BW 509) апробировано в качестве препарата для лечения заболеваний, спровоцированных ВИЧ. Однако, это соединение обладает зна-чительным побочным действием и поэтому либо не может быть использовано, или будучи однажды использованным, может привести к выводу из строя значительного числа боль-ных. В связи с этим существует постоянная потребность в создании соединений, которые были бы эффективны против ВИЧ и в то же время обладали бы значительно лучшим тера-певтическим индексом.
К нашему удивлению недавно мы обнаружили, что оба энантиомера соединения фор-мулы (1) обладают равным действием против ВИЧ но один из энантиомеров ((-)-энантиомер) обладают существенно более низкой цитотоксичностью, чем другой энантио-мер. Таким образом возникает первый аспект настоящего изобретения - обеспечивается (-) /или левовращающий/ энантиомер соединения формулы (1) и фармацевтически приемле-мые соединения на его основе.
Химическая формула (-) энантиомера представлена следующим образом: (-)-цис-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил-(IH)-пиримидин-2-он (здесь далее соедине-ние А). Он абсолютно стереохимичен с соединением формулы (1-1), формула которого (2R, цис)-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-(IH)-пиримидин-2-он.
Предпочтительно, когда обеспечивается создание преимущественно свободного от со-ответствующего (+)-энантиомера соединения А, т.е. когда это соединение А содержит не более 5 вес./вес.% (+)-энантиомера, а более предпочтителен вариант, когда количество (+) энантиомера не превышает примерно 2 вес./вес.%, и самый оптимальный вариант, когда он присутствует в количестве примерно менее 1%.
Под фармацевтически приемлемыми производными подразумевают любые фармацев-тически приемлемые соли, эфиры или соли таких эфиров соединения (А) или любого дру-гого соединения, которое при введении реципиенту способно выделить (прямо или опо-средованно) соединение (А) или противовирусный активный метаболит или остаток на основе этого соединения.
Специалисты в данной области понимают, что соединение (А) может быть модифици-ровано с целью создания фармацевтически приемлемых производных на его основе, за счет функциональных групп как пиримидинового основания, так и за счет оксиметильной группы оксатиоланового кольца. Модификации за счет всех этих функциональных групп включаются в рамки настоящего изобретения. Однако особый интерес представляют фар-мацевтически приемлемые производные, полученные путем модификации 2-оксиметильной группы оксатиоланового кольца.
Предпочтительные эфиры соединения (А) включают соединения, в которых атом водо-рода 2-оксиметильной группы ацильной функциональной группой R-C=O, в которой не-карбонильная группировка R эфира выбрана из группы: водород, линейный или разветв-ленный алкил/например, метил, этил, н-пропил, трет-бутил, н-бутил/, алкоксиал-кил/например, метоксиметил/, аралкил/например, бензил/, арилоксиалкил/например, фе-ноксиметил, /арил/ например, фенил, возможно замещенный галогеном, С1-4 алкилом, или С1-4 -алкоксилом/; сульфоновые эфиры/ например, алкил- или аралкилсульфонил, напри-мер, метансульфонил/; эфиры аминокислот/например, L-валил или L-изолейцил/, а также моноди или трифосфаты.
Что касается вышеописанных эфиров, то, если отсутствует другая спецификация, лю-бая представленная алкильная группировка преимущественно содержит 1-16 атомов угле-рода, в частности 1-4 атома углерода. Любая арильная группировка, представленная в та-ких эфирах, преимущественно включает фенильную группу.
В частности эфирами могут быть С1-16 алкиловые эфиры, незамещенный бензиловый эфир или бензиловый эфир, замещенный, по крайней мере, одним атомом галогена (бро-мом, хлором, фтором или иодом), С1-6 алкилом, С1-6 алкокси, нитро или трифторметильной группой.
Фармацевтически приемлемые соли соединения (А) включают те, которые получены из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. К подходящим кислотам относятся, например, хлористоводородная, бромистоводородная серная, азотная, перхлорная, фумаровая, малеиновая, фосфорная, гликолевая, молочная, салициловая, янтарная, пара-толуолсульфовинная, уксусная, лимонная, метансульфо-, му-равьиная, бензойная малоновая, нафталин-2-сульфо-, и бензолсульфо-кислоты. Другие кис-лоты, такие как, щавелевая, хотя сами по себе фармацевтически не приемлемы, могут быть использованы как посредники при получении соединений настоящего изобретения и их фармацевтически приемлемых кислых солей присоединения.
Соли, полученные из соответствующих оснований, включают щелочные металлы (например, натрий), щелочноземельные металлы (например, магний) аммоний и NR+4, ( где R-C1-4 алкил).
Следующие здесь далее ссылки на соединения, соответствующие данному изобрете-нию, включают и соединение (А) и его фармацевтически приемлемые производные.
Соединения данного изобретения либо сами по себе обладают противовирусной ак-тивностью, либо переходят в таковые и процессе метаболизма. В частности, эти соедине-ния эффективны при ингибировании репликации ретровирусов, включая ретровирусы человека, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), являющийся причиной СПИ-Да.
Таким образом здесь обеспечивается еще один аспект изобретения - соединения (А) или его фармацевтически приемлемое производное предлагается использовать в качестве ак-тивного терапевтического средства, в частности, в качестве противовирусного средств, например, при лечении ретровирусных инфекционных заболеваний.
Еще одним или альтернативным аспектом в данном изобретении является обеспечение способа лечения вирусных инфекционных заболеваний, в частности, заболеваний, причи-ной которых является ретровирус, такой как ВИЧ, как у животных, так и человека, спосо-ба, который включает введение эффективного количества соединения (А) или его фарма-цевтически приемлемого производного.
В данном изобретении также обеспечивается использование соединения (А) или его фармацевтически приемлемого производного для производства медикамента для лечения вирусного заболевания.
Соединения настоящего изобретения также полезны при лечении осложнений, вы-званных СПИД, таких СПИД-ассоциированный комплекс (ARC), прогрессирующая гене-рализованная лимфоденопатия (PGL) СПИД-ассоциированные осложнения нервной си-стемы /такие как тропический парапарез или слабоумие /деменция/, анти-ВИЧ серопози-тивные и ВИЧ-положительные осложнения, саркома Капоши, тромбоцитопеническая пур-пура и ассоциированные инфекционные заболевания, например, пневмоцистоз Pneumocystis carinii.
Соединения настоящего изобретения также полезны в предотвращении прогрессии клинических заболеваний индивидуумов, анти-ВИЧ-сероположительных или ВИЧ-антиген положительных, а также в профилактике последующей устойчивости к ВИЧ.
Соединение (А) или его фармацевтически приемлемые производные могут быть также использованы для предотвращения загрязнением вирусом физиологических жидкостей, таких кровь или семенная жидкость in vitro.
Cпециалистам, работающим в данной области понятно, что термин “лечить” здесь рас-пространяется и на профилактику, а также на лечение установившихся инфекционных за-болеваний или симптомов.
Кроме того понятно, что количество соединения (А) данного изобретения, которое необходимо для лечения может варьироваться не только в зависимости от соединения, вы-бранного для лечения, но также от способа его введения, природы заболевания, которое необходимо лечить, возраста и состояния больного, и может быть в конце концов предо-ставлено на усмотрение врача или ветеринара.
Однако, как правило, подходящая доза может находиться в интервале от примерно 0,1 до примерно 750 мг/кг массы тела в сушки, предпочтительно - в интервале от примерно 0,5 до 60 мг/кг/сутки, наиболее предпочтительно, от 1 до 20 мг/кг/сутки.
Необходимая доза может обычно вводиться за один раз или же быть может осуществ-лено дробное введение через соответствующие интервалы, например, необходимое коли-чество вводимого препарата может быть разбито на две, три, четыре или более суб-доз в сутки.
Соединение удобно вводить в единицах лекарственной формы, содержащей например, от 10 до 1500 мг, обычно от 20 то 1000 мг, и более удобно, когда содержится от 50 до 700 мг активного ингредиента на единицу лекарственной формы.
В идеальном варианте активный ингредиент следует вводить в таком количестве, что-бы пик концентраций активного ингредиента в плазме составлял примерно от 1 до 75  М, предпочтительно от примерно 2 до 50  М, а наиболее предпочтительна от примерно 3 до примерно 30  М. Такое состояние может быть достигнуто, например, при внутренних инъекциях 0,1-5% раствора активного ингредиента, возможно в физиологическом раство-ре, или при оральном приеме в виде шариков, содержащих примерно от 1 до примерно 100 мг активного ингредиента. Желательный уровень в крови может поддерживаться при не-прерывной инфузии, обеспечивающей примерно от 0,01 до примерно 5,0 мг/кг/час или при периодическом внутривенном вливании, содержащем примерно от 0,4 до примерно 5,0 мг/кг активного ингредиента.
Хотя можно вводить соединение данного изобретения и само по себе, однако предпо-чтительно, когда оно вводится в виде активного ингредиента фармацевтического препара-та.
Таким образом данное изобретение обеспечивает еще и фармацевтический препарат, содержащий соединение (А) или фармацевтически приемлемое производное данного со-единения вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и, воз-можно, другими терапевтическими/или профилактическими ингредиентами. Носитель(и) должен быть “приемлем” в смысле совместимости с другими ингредиентами состава пре-парата и не отравлять реципиента, который принимает этот препарат.
Фармацевтические составы (препараты) могут находится в лекарственных формах, подходящих для перорального, ректального, назального, локального (включая трансбук-кальный и подъязычный), влагалищного или парентерального (включая внутримышечный, подкожный и внутривенный) способов введения или в форме, подходящей для ингаляции или вдувания. Препараты могут, когда это бывает удобным, представлены в виде дискрет-ных единиц лекарственных форм и могут быть получены любым из методов, хорошо из-вестных специалистам в области фармации. Все вышеперечисленные методы включают стадию смешения активного соединения с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с теми и другими, если в этом возникает необходимость, введе-ние продукта в желаемый состав.
Фармацевтические составы (препараты) подходящие для перорального введения могут обычно выпускаться в виде капсул, крахмальных облаток или таблеток, каждая из которых содержит предварительно рассчитанное количество активного ингредиента; в виде порош-ков или гранул; в виде раствора, суспензии или эмульсии. Активный ингредиент может быть также выпущен в виде шариков, паст или лекарственной кашки. Таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать традиционные добавки, такие как связующие средства, лабриканты, дезинтеграторы или смачивающие средства. Таблетки могут иметь покрытие, наносимое хорошо известными специалистам методами. Жидкие пероральные препараты могут быть, например, в форме водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов, эликсиров, или могут выпускаться в виде сухого продукта, который может быть разбавлен водой или другим подходящим разбавителем перед употреблением. Такие жидкие препараты для перорального введения могут содержать традиционные до-бавки типа суспендирующих средств, эмульгаторов, на водных разбавителей (которые мо-гут включать съедобные масла) или консерванты.
Соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут также использоваться в форме для парэнтерального введения /инъекций, например, болезные инъекции или не-прерывные инфузии и могут быть выпущены в виде ампул, предварительно заполненных шприцев, небольших инфузионных объемов или во флаконах, содержащих многократные дозы с добавленными туда консервантами. Композиции могут быть в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных разбавителях, и могут содер-жать дополнительные компоненты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В альтернативном варианте препарат для инъекций или инфу-зий может быть выпущен в виде порошка, который получают в асептических условиях из стерильного твердого продукта или путем лиофилизации из раствора, этот порошок затем перед употреблением разбавляют подходящим разбавителем, например, стерильной, апи-рогенной водой.
Для локального нанесения на кожу соединения, соответствующие настоящему изобре-тению, могут быть приготовлены в виде мазей, кремов или лосьонов, или в виде транс-дермальной облатки (пластыря). Мази и кремы могут быть, например, созданы на водной или масляной основе с добавлением подходящих загустителей и/или желирующих средств. Лосьоны могут быть созданы на водной или масляной основе, и могут также содержать один или более эмульгирующих средств, суспендирующих средств, загустителей или кра-сящих добавок.
Составы, пригодные для локального введения в полость рта, включают лепешки, со-держащие активный ингредиент в ароматизированной основе, обычно это бывает сахароза и гумиарабик или трагакант; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной ос-нове, такой как желатин и глицерин или сахароза и гуммиарабик воду для полоскания рта, содержащую активный ингредиент в подходящем жидком носителе.
Фармацевтические препараты, пригодные для ректального введения, в которых носи-тель - твердое вещество, наиболее предпочтительно готовить в виде суппозиториев. Под-ходящими носителями будут масло какао и другие материалы, обычно используемые для этих целей специалистами, а суппозитории обычно можно формировать путем смешения активного соединения с размягченным или расплавленным носителем, после чего полу-ченную смесь охлаждают и формуют из нее суппозитории.
Препараты, подходящие для введения во влагалище могут быть приготовлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст пен или спреев, содержащих в дополнение к ак-тивному ингредиенту подходящие носители, которые хорошо известны специалистам.
Для введения внутриназально соединения настоящего изобретения могут выпускаться в форме спреев, диспергируемых порошков или в форме капель.
Капли могут быть приготовлены на водной или неводной основе, также содержащей один или более диспергирующих средств, солюбилизирующих средств или суспендирую-щих средств. Жидкие спреи обычно поставляют в баллончиках, находящихся под давлени-ем.
Для проведения ингаляций соединения, соответствующие настоящему изобретению, обычно доставляют из инсуфлятора /порошковдувателя/, аэрозольного ингалятора или упа-ковки, находящейся под давлением или любыми другими традиционными средствами до-ставки аэрозольных спреев. Упаковки, находящиеся пол давлением могут содержать под-ходящий распылитель, такой, как дихлордифторметан, диоксид углерода, трихлортри-фторметан, дихлортетрафторэтан и другие подходящие газы. В случае сжатого аэрозоля дозировка может осуществляться за счет клапана, подающего отмеренное количество.
В альтернативном варианте, для введения препарата путем ингаляции или инсуфля-ции, соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут быть предоставлены в виде сухих порошковых композиций, например, порошковой смеси соединения и подхо-дящего основания типа лактозы или крахмала. Порошковая композиция может быть вы-пущена, например, в виде капсул или патронов или, например, в виде желатиновых или блистерных упаковок из которых порошок может быть введен с помощью ингалятора или инсуфлятора.
В случае необходимости вышеописанные препараты адаптируют таким образом, чтобы обеспечить постепенное освобождение активного ингредиента и постоянную его доставку в организм.
Фармацевтические препараты, соответствующие данному изобретению, могут также содержать другие активные ингредиенты, такие как противомикробные средства или кон-серванты.
Соединения данного изобретения могут быть также использованы в сочетании с дру-гими лекарственными средствами, например, с другими противоинфекционными сред-ствами. В частности, соединения данного изобретения могут быть использованы вместе с известными противовирусными средствами.
Таким образом настоящее изобретение обеспечивает комбинацию содержащую соеди-нение (А) или физиологически приемлемое производное этого соединения, а также тера-певтически активное средство, в частности, противовирусное средство.
Комбинации, о которых шла речь выше, можно представить в форме фармацевтическо-го препарата для использования и такие фармацевтические препараты, содержащие комби-нацию, определенную выше, вместе с фармацевтически приемлемым носителем составля-ют еще один аспект настоящего изобретения.
Подходящие терапевтические средства для использования в таких комбинациях вклю-чают ациклические нуклеозиды, такие как ацикловир или ганцикловир, интерфероны, та-кие, как ,  или  - интерферон, ингибиторы почечной экскреции такие, как пробенецид, ингибиторы транспорта нуклеозидов такие, как дипиридамол, 2,3-дидеоксинуклеозиды, такие как АZТ, 2,3-дидеоксицитидин, 2,3-дидеоксиаденозин, 2,3-дидеоксинозин, 2,3-дидеокситимедин, 2,3-дидеокси-2,3-дидегидротимидин и 2,3-дидеокси-2,3-дидегидроцитидин, иммуномодуляторы такие как, интерлейкин-2(IL2) и колониестимули-рующий фактор гранулоцитного макрофага (КСФ МГ), эритропоэтин, амплиген, тимомо-дулин, тимопентин, фоскарнет, рибавирин и ингибиторы ВИЧ-связывания с СД-4 рецеп-торами, например, растворимыми, например, растворимыми СД-4, фрагментами СД-4, СД-4 гибридными молекулами (СД-4-антигенный маркор хелперных Т-лимфоцитов), ингиби-торы гликозилирования, такие как 2-деокси-D-глюкоза, кастаноспермен и 1-деоксиноджиримицин.
Индивидуальные компоненты таких комбинаций можно вводить либо последователь-но, либо одновременно, в раздельном или вместе в объединенном фармацевтическом пре-парате.
В тех случаях, когда соединение (А) или фармацевтически приемлемое производное этого соединения используется в комбинации со вторым терапевтическим средством, ак-тивным в отношении того же вируса, дозе каждого соединения может быть либо такой же как в тех случаях когда соединение используется одно.
Соединение (А) и его фармацевтически приемлемые соединения могут быть получены способами, известными специалистами в данной области, для получения соединений ана-логичной структуры, например, как описано в Европейской патентной заявке №038262.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что для некоторых методов, описанных здесь ниже, требуемая стереохимическая структура соединения (А) может быть получена либо, если в качестве исходного материала берется оптически исходный матери-ал или путем растворения рацемической смеси на любой подходящей стадии синтеза. В случае всех процессов оптически чистый требуемый продукт может быть получен путем растворения конечного продукта каждой реакции.
В одном из таких процессов (А) 1,3-оксатиолан формулы (VIII)



в которой аномерная группа L является замещаемой группой, подвергается взаимодей-ствию с соответствующим основанием. Подходящие группы L включают -OR где R - ал-кильная группа, например, С1-6-алкильная группа такая, как метильная группа или пред-ставляет ацильную группу, например, С1-6-ацильная группа, такая, как ацетил или галоген, например, иод, бром или хлор.
Соединение формулы VIII преимущественно взаимодействует с предшественником пиримидинового основания (предварительное силилированное основание таким силили-рующим средством, как гексаметилдисилазан) или цитозином в подходящем растворителе, таком как метиленхлорид, с использованием кислоты Льюиса, такой как тетрахлорид тита-на, олова IV, соединения, например SnCI4 или триметилсилилтрифлат.
1,3-оксатиолан формулы (VIII) может быть получен, например, при взаимодействии альдегида формулы (VII) с меркаптоацеталем формулы (VI) в подходящем органическом растворителе, таком как толуол в присутствии кислотного катализатора, например, кисло-ты Льюиса, такой как хлорид цинка. (HSCH2CH(OC2H5)2 формула (VI) и С6Н5СО2СН2СНО (VII).
Меркаптоацетали формулы (VI) могут быть получены способами которые, известны специалистам в данной области, например, G.Hesseul. Jorder, Chem. Ber 85, 924-932 (1952).
Альдегиды формулы (VII) могут быть получены согласно известным методам, напри-мер, E.G.Halloqyist u H.Hibbert, Can. J.Research, 8, 129-136 (1933). Преимущественно не-очищенный альдегид (VII) может быть очищен путем превращения в кристаллический би-сульфитный аддукт присоединения с последующим восстановлением этого аддукта в сво-бодный альдегид.
Во втором процессе (В) соединение (А) получают путем интерконверсии соединения формулы (XI).

в которой В- представляет основание, превращаемое в цитозин. Такая интерконверсия мо-жет осуществлена либо путем простой химической трансформации (например, конверсии урацила в цитозин), или путем ферментативного превращения с использованием деокси-рибозилтрансферазы. Такие способы и условия для интерконверсии основания хорошо из-вестны специалистам в области химии нуклеозидов.
В третьем процессе (С) соединение формулы (XI)

может быть превращено в соединение (А) путем конверсии аномерной NH2 группы в ци-тозиновое основание способами, хорошо известными специалистами в химии нуклеози-дов.
В большинстве реакций, описанных здесь выше, сообщалось в контексте нуклеозидно-го синтеза, например, в книге Аналоги нуклеозидов-Химия, Биология и Применение в медицине, R.T.Walker и др., eds, Plenum Press, New York (1979), стр.165-192; T.Ueda в рабо-те “Химия нуклеозидов и нуклеотидов”, т.1, L.B.Townsend ed., Plenum Press, New York (1988) стр. 165-192.
Следует понять, что вышеприведенные реакции для своего осуществления могут нуж-даться в использовании исходных материалов, имеющих защищенные функциональные группы, и вследствие этого может понадобиться либо на промежуточной, либо на конеч-ной стадии снятие защитной группы для получения необходимого соединения. Защита и снятие защиты функциональных групп может осуществляться с использованием традици-онных методов. Так, например, аминогрупы могут быть защищены группой, выбранной из следующей группы: аралкил /например, бензил/, а ацил, арил, (например, 2,4 динитрофе-нил) или силил; последующее удаление защитной группы осуществляется, если это необ-ходимо, путем гидролиза или гидрогенолиза в подходящих стандартных условиях. Гид-роксильная группа может быть защищена с использованием любых традиционных гидрок-силзащитных групп, например, описанных в книге “Защитные группы в органической химии”, (Ed. I.F.W.Mcomie Pienum Press, 1973) или “Защитные группы в органическом синтезе” Theodora W.Greene (John Wiley and Sons, 1981). К подходящим гидроксилзащит-ным группам относятся, например, алкил (например, метил, трет.бутил, или метоксиме-тил), аралкил (например, бензил, дифенилметил, или трифенилметил), гетероциклические группы, такие как тетрагидропиранил, ацил (например, ацетил, или бензоил) и силильные группы, такие как триалкилсилил, например трет-бутилдиметилсилил. Гидроксилзащища-ющие группы могут быть удалены традиционными способами. Так, например, алкил, си-лил, ацил и гетероциклические защитные группы можно удалить путем сольволиза, например, при гидролизе в присутствии кислоты или основания. Аралкильные защитные группы могут быть удалены, например, такие как трифенилметил, аналогично путем соль-волиза, например, путем гидролиза в кислой среде. Такие аралкильные групы, как бензил, можно отщепить, например, путем обработки BF3 /эфиратом и уксусным ангидридом с по-следующим удалением образующихся при этом ацетатных групп на соовтетствующей ста-дии синтеза. Силильные группы можно удалить, использовав для этих целей источник фторидинов, такой как тетра-н-бутиламмоний фторид.
В предыдущих процессах соединение (А), как правило, получают в виде смеси цис- и транс-изомеров, из которых цис-изомер представляет интерес.
Эти изомеры могут быть разделены физическими методами, например путем хромато-графирования на силикагеле, или путем фракционной кристаллизации, с использованием либо непосредственно самого соединения или подходящего производного этого соедине-ния, например, ацетатов (полученных, например, при взаимодействии с уксусным ангид-ридом), которые затем возвращают после разделения в исходный продукт (например, пу-тем деацетилирования в метанольном растворе аммиака).
Фармацевтически приемлемые соли настоящего изобретения могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патенте США, №4,383,114, раскрытие которого дается здесь как ссылка. Так, например, когда хотят получить кислую соль присоединения соединения (А), продукт из любого вышеприведенного способа может быть превращен в соль путем обработки полученного свободного основания подходящей кислотой с исполь-зованием традиционных методов. Фармацевтически приемлемые кислые соли присоеди-нения могут быть получены при взаимодействии свободного основания с соответствую-щей кислотой возможно в присутствии подходящего растворителя, такого как эфир (например, этилацетат) или спирта) например, этанола, метанола или изопропанола). Не-органические основные соли могут быть получены при взаимодействии исходного соеди-нения с подходящим основанием, таким как алкоксид, (например, метоксид натрия) воз-можно в присутствии растворителя, такого как спирт) например, метанол) фармацевтиче-ски приемлемые соли могут быть также получены из других солей, включая фармацевти-чески приемлемые соли, соединени (А) с использованием стандартных методов.
Соединение (А) может быть превращено в фармацевтически приемлемый фосфат или другую соль (эфир) при взаимодействии с фосфорилирующим соединением, таком как POCI3 или подходящим этерифицирующим агентом, таким как галоидангидрид или ан-гидрид. Эфир или соль соединения (А) могут быть превращены в исходное соединения (А) путем гидролиза.
Разделение конечного продукта или промежуточного продукта или исходного матери-ала может быть осуществлено известными способами, описанными, например, “Стереохи-мия соединений углерода”, Е, L.Eliel /Mcgraw Hill, 1962/ и “Таблицы растворителей S.H.Wilen.
Так, например, соединение (А) может быть получено методом хиральной ВЭЖХ с ис-пользованием подходящей стационарной фазы, например, ацетилированного -циклодекстрина или триацетата целлюлозы и подходящего растворителя, например, спир-та, такого как этанол, или водного раствора, например, триэтиламонийацетат. В альтерна-тивном варианте соединения могут быть разделены методом селективного энантио катабо-лизма, катализируемого ферментом, таким как цитидин-деаминаза, или путем селективной ферментативной деградации подходящего производного в присутствии 5-нуклеотидазы. При разделении с использованием ферментативных методов, можно использовать раствор фермента или, более удобно, иммобилизованный фермент. Иммобилизация ферментов мо-жет быть осуществлена способами, хорошо известными специалистам в данной области, например, путем адсорбции на смоле, такой как Eupergit C.
Далее приводится описание данного изобретения, иллюстрируемое следующими при-мерами, которые ни коим образом не ограничивают рамки данного изобретения.

Промежуточный продукт 1
5-метокси-1,3-оксатиолан-2-метанол-бензоат

Раствор хлорида цинка (1,6 г) в горячем метаноле (15 мл) добавили при перемешива-нии к перемешиваемому раствору меркаптоацетальдегида, диметилацеталя (34,2 г) и бен-зоилоксиацетальдегида (48,3 г) в толуоле (1300 мл), затем полученный раствор нагревали с обратным холодильником в токе азота в течение 50 минут. Охлажденную смесь сконцен-трировали, разбавили некоторым количеством толуола, затем отфильтровали через кизель-гур. Соединенные фильтраты и толуол промыли насыщенным раствором бикарбоната натрия дважды и рассолом, высушили (MgSO4) затем упарили до масла, которое пропусти-ли через хроматографическую колонку, заполненную диоксидом кремния (2 кг, Меrck 9385), проэлюировали хлороформом и получили озаглавленный продукт в виде масла (45,1 г), представляющего смесь аномеров (1:1); параметры ЯМР спектра (ДМСО-d6)  (3,1-3,3 (4Н), 3,42 (6Н), 4,4-4,6 (4Н),
5,41 (1Н), 5,46 (1Н), 5,54 (1Н), 5,63 (1Н),
7,46 (4Н), 7,58 (2Н), 8,07 (4Н);  макс
(СНВч 3) 1717 см-1

Промежуточный продукт 2
//-цис-1-/2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-/1Н/-примидин-2-4-дион

Смесь тщательно измельченного урацила (9,62 г), гексаметилсилазана (50 мл) и сульфа-та аммония (30 мг) нагрели с обратным холодильником в токе азота, нагревали до тех пор пока раствор не стал прозрачным. Этот раствор охладили и затем упарили до образования бесцветного масла, которое затем растворили в атмосфере азота в ацетонитриле (50 мл). Раствор добавили к перемешиваемому охлажденному льдом раствору 5-метокси-11,3-оксатиолан-2-метанола-бензоата /промежуточное соединение 1/ (19,43 г) в ацетонитриле (600 мл) и добавили триметилсилилтрифторметансульфонат (14,7 мл). Удалили ледяную баню и раствор нагревали в течение 45 минут в токе азота. После охлаждения и упарива-ния, остаток очистили методом колоночной хроматографии пропустив над 1 кг силикагеля Меrck 9385 / и, проэлюировав смесью хлорформ/ метанол = 9:1. Нужные фракции охладили и упарили, получив в результате сырой остаток. Этот остаток подвергли фракционной кристаллизации из минимального количества горячего метанола (1200 мл), в результате получили озаглавленное соединение (6,32 г) в виде белых кристаллов. Параметры ЯМР спектра: (ДМСО-D6/ 11,36 (1H, м);
7,50-8,00 (6H, м); 6,20 (1H, м); 5,46 (2H, м)
4,62 (2H, м), 3,48 (1H, м), 3,25 (1H, м).

Промежуточное соединение 3
//-цис-4-амино-1-/2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-1Н/-пиримидин-2-он
Метод (а)
Суспензию цитозина (20.75 г) и сульфата аммония несколько мл) а гексаметилдисила-зане (110 мл) перемешивали и нагревали с обратным холодильником в течение двух с по-ловиной часов в токе азота. Растворитель удалили упариванием, а твердый остаток раство-рили в сухом ацетонитриле (350 мл). Этот раствор перенесли, используя гибкую иглу, в перемешиваемый, охлажденный льдом раствор 5-метокси-1,3-оксатиолан-2-метанол бензо-ата (промежуточное соединение 1) (43,57 г) в ацетонитриле (650 мл) в токе азота. Добавили триметилсилилтрифторметансульфонат (33 мл), раствору позволили нагреться до комнат-ной температуры (1,5 часа), затем в течение ночи нагревали с обратным холодильником. Оставшуюся смесь сконцентрировали, разбавили насыщенным водным раствором бикар-боната натрия (500 мл), затем проэкстрагировали этилацетатом (3 х 500 мл). Объединенные экстракты промыли водой (2 х 250 мл) и рассолом (250 мл), высушили над (MgSO4), затем упарили до получения пены, которую пропустили через хроматографическую колонку, заполненную диоксидом кремния (600 грамм, Меrck 7734), проэлюировали смесью этила-цетата и метанола (в результате получили смесь аномеров) (1:1) 31,59 грамма. Смесь пере-кристаллизовали из воды (45 мл) и этанола (9,0 мл), в результате получили твердый оста-ток 10,23 грамма, который перекристаллизовали из этаноле (120 мл) и воды (30 мл), в ре-зультате получили озаглавленный продукт в виде твердого вещества белого цвета (9,26 г); макс (МЕОН) 229,4 мм (Е1% 1см 610); 272,4 мм (Е1%1см 293); параметры ЯМР спектра 1Н ЯМР (ДМСО d6 ) 
3,14 (1H); 3,50 (1H); 4,07 (2H); 5,52 (1H);
5,66 (1H); 6,28 (1H); 7,22 (2H); 7,56
(2H); 7,72 (2H); 8,10 (2H).

Метод (в)
Оксихлорид фосфора (7,0 мл) по каплям добавили к перемешиваемому, охлаждаемой льдом суспензии 1,2,4-триазола (11,65 г) в ацетонитриле (120 мл), затем, сохраняя темпера-туру внутри реакционного сосуда ниже 15С, по каплям добавили триэтиламин (22,7 мл). Через 10 минут медленно добавили раствор ()-цис-1-(2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2,4-диона (6,27 г) в ацетонитриле (330 мл). Затем перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение ночи. Затем смесь охладили на ледяной бане и медленно добавили триэтиламин (30 мл) вслед затем - воду (21 мл). Полученный раствор упарили и, остаток разделили между насыщенным раствором бикарбоната натрия (400 мл) и хлороформом (3 х 200 мл). Объединенные хлорформные экстракты сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая сырой остаток (9,7 г). Остаток рас-творяли в 1,4-диоксане (240 мл) и добавляли концентрированный раствор водного аммиака (0,880 г, 550 мл). Через 1,5 часа раствор упаривали, и остаток растворяли в метаноле. Эта процедура вызывала осаждение твердого осадка, который отфильтровывали. Маточный раствор пропускали через хроматографическую колонку, заполненную силикагелем (600 грамм, Марк 9385). Нужные фракции собирали и упаривали, получая указанное в заголов-ке соединение в виде твердого вещества желтовато-коричневого цвета (2,81 г), идентично-го соединению, полученному по методу (А).

Пример 1
()-(2R,S цис-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он
Суспензию (цис)-4-амино-1-(2-бензоилокси-метил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она (промежуточное соединение 3) (8,19 грамма) и Амберлитовой смолы IPA-400 (ОН) (8,24 г) в метаноле (250 мл) перемешивали и нагревали с обратным холо-дильником в течение 1 часа 15 минут. Твердые вещества отфильтровывали, затем промы-вали метанолом.
Объединенные фильтраты упаривали. Остаток растирали с этилацетатом /80 мл/. Полу-ченный белый остаток отфильтровывали, получая указанный в заголовке продукт (5,09 г), параметры ЯМР спектра 1Н ЯМР (ДМСО d6)  3,40 (1Н), 3,40 (1Н), 3,73 (2Н), 5,18 (1Н), 5,29 (1Н), 5,73 (1Н), 6,21 (1Н- , 7,19 (2Н), 7,81 (1Н).

Пример 2
Хиральное ВЭЖХ разделение энантиомеров ()-цис-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидн-2-она
(А) 25 мг рацемического продукта примера (1) подвергали препаративной ВЭЖХ в следующих условиях:
Колонка: Мерк H i на r триацетат целлюлозы, 250 х 10 мм, 10 м
Элюент: этанол
Скорость потока: 3 мл/мин
Детектор: УФ, 270 нм
Температура: комнатная.

Выпаривания соответсвующих собранных фракций, давало (-)-(2Р, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она (6,8 мг примерно 100%) []Д21 -137 (с.1.01 МеОН) и (+)(2S, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она 3,5 мг/примерно 90% []Д21 +127 (с.1.01 МеОН).

В) 26 мг рацемического продукта продукта примере 1 подвергали препаративной ВЭЖХ в следующих условиях:
Колонка: ASIEC циклобонд 1 ацетил, 250х4,6 мм;
Элюент: 0,2% ацетат триэтиламмония (получен добавлением ледяной уксусной кисло-ты к 0,2% раствору триэтиламина в воде до конечной величины рН 9,2);
Скорость потока: 2 мл/мин;
Детектор: УФ, 300 нм;
Температура: комнатная.
Выпаривание соответствующих фракций давало неочищенный (-)(2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он (25 мг) и неочищенный (+) (2S, цис)-4-амино-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он (17 мг). Эти фракции раздельно подвергали дальнейшей препаративной ВЭЖХ в следующих усло-виях:
Колонка: ASTEC циклобонд 1 ацетил, 250 х 4,6 мм
Элюент: 15 мМ ацетат аммония, рН 6,8;
Скорость потока: 0,5 мл/мин.
Детектор: УФ, 300 нм;
Температура: 500.
Упаривание соответствующих собранных фракций давало 5,0 мг /около 91%/ (-)(2R, цис)-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-(1Н)-пиримидин-2-она и 7,6 мг (около 96%) (+) (2S, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксати-олан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она.

Пример 3
(-)-(2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроконметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он
(i) (±)-(2R, S цис)-4-амино-1-(2-гидрокси-метил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидинок, первичный кислый фосфат, аммониевая соль
Холодную (0% перемешиваемую суспензию ()-(2R, S цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она (1,0 г) из примера 1 в сухом триметилфосфата (20 мл) обрабатывали оксихлоридом фосфора (2,44 мл) и, смесь переме-шивала при 0С в течение 35 минут, затем гасили в ледяной воде (60 г). Добавлением 1Н норм.водного раствора гидроксида натрия доводили рН холодной смеси до значения 2,5, затем смесь пропускали через колонку, заполненную активированным углем (10 г, DARCO), которую элюировали сначала водой, потом смесью водный раствор аммиака-этанол, фракции, содержащие сырой монофосфат, объединяли и концентрировали. Полу-ченный раствор пропускали через колонку, заполненную ДЕАЕ софадексом А-25 (НСО3-форма). Элюирование осуществляли в градиенте концентрации: вода (120 мл) до 0,1М рас-твора NH4HCO (240 мл) затем 0,2, 0,3 и 0,4М NH4HCO3 (120, 240 и 400 мл соответственно). Соответствующие фракции объединяли и концентрировали. Полученный раствор разбав-ляли водой (40 мл) и сушили лиофильной сушкой, в результате получали указанный в за-головке продукт в виде твердого вещества белого цвета. (1,37 г):  макс. (рН 6, буфер) 271 нм (Е1%1см = 190);
1Н ЯМР (Д20)  3,23 (1Н), 3,55 (1Н); 4,0-4,2 (2Н), 5,43 (1Н); 6,07 (1Н), 6,33 (1Н); 8,08 (1Н).

(ii) (-)-(2R, цис)-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-/1Н/-пиримидин-2-он и (+)-(2S, цис)-4-амино-1-/2-гидроксаметил-1,3-окса-тиолан-5-ил/-/1Н/-пиримидин-2-он

5-нуклеотидазу (из crotalusatrox venom EC 3,1,3,5) /60 мг с содержанием 17 единиц /мг/ добавляли к раствору аммониевой соли 6’-первичного кислого фосфата ()-(2R, S цис)-4-амино-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она, (1,35 г) в суфере (50 мл), полученном из глицина (526 мг) и хлорида магния (190 мг) и воды (100 мл), и смесь выдерживали при 37С в течение 2,5 часов. Затем добавляли еще 20 мг фермента и инку-бацию продолжали еще в течение 3,5 часов. Эту смесь пропускали через колонку, запол-ненную ДЕАТ Сафедексом А-25 (НСО3-форма). Элюирование проводили водой (160 мл), затем 0,1, 0.2, 0,3 и 0,4 M NH4HCO3 (по 200 мл каждого раствора). Соответствующие фрак-ции, содержащие первый элюируемый компонент объединяли и упаривали, остаток под-вергали хроматографированию на колонке, заполненной силикагелем (60 грамм Merck 7734), которую затем элюировали хлороформ-метанольными смесями. Упаривание соот-ветствующих фракций из смеси метанол-этилацетат давало: 0,30 г (+)-(цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она в виде твердого вещества бе-лого цвета: []Д21+137 (с.1,04 МеОН);
1Н ЯМР (ДМСО)  3,04 (1Н); 3,40 (1Н), 3,73 (2Н); 5,18 (1Н); 5,29 (1Н); 5,73 (1Н); 6,21 (1Н); 7,19 (2Н); 7,61 (1Н).
Соответствующие фракции, полученные на колонке из Сафедекса, содержащие второй алюируемый компонент, объединяла и упаривали. Остаток растворяли в воде (30 мл), об-рабатывали щелочной фосфатазой, выделенной из Escherichia coli (EC 3,1, 3,1) (1,5 мл с 416 ед./мл), затем инкубировали при 37С в течение часа. Растворитель удаляли упариванием, и остаток пропускали через хроматографическую колонку, заполненную диоксидом крем-ния 60 г, Мerck 7734), алюировали хлороформ-метанольными смесями. Упаривание соот-ветствующих фракций из смеси метанолэтилацетат давало (-)-(цис)-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он в виде твердого вещества бело-го цвета (0,32 г); []Д21-132 (1,08 МеОН); 1Н
ЯМР (ДМСО)  3,04 (1Н); 3,40 (1Н); 3,73 (2Н); 5,18 (1Н); 5,29 (1Н); 5,73 (1Н); 6,21 (1Н); 7,19 (2Н); 7,81 (1Н).

Пример 4
(-)-(2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он

(i) Три колбы по 50 мл с питательным бульоном (Cxoid td) иннокулировали каждую с помощью петли, заполненной бактериями Escherichia coli (ATCC 23 848), снятыми с чашек с питательным агаром. Колбы инкубировали в течение ночи при 37С при встряхивании о 250 оо/мин, а затем содержимое каждой колбы использовали для иннокуляции 41 CDD среды (глутаминовая кислота 3 г/л; MgSO4 0,2 г/л; К2SO4 2,5 г/л; NaCl 2,3 г/л; Na2HPO4 2H2O 1,1 г/л; NaH2HPO4, 2H2O 0,6 г/л; цитидин 1,2 г/л) в ферментаре объемом семь литров. Ферментации культур проводилась при встряхивании 750 об/мил, 37С с аэрацией 4 м/мин. После 24 часового выращивания клетки собирали путем центрифугирования /5000 г, 30 мин./ выход составил 72 грамма влажной массы. Клеточные гранулы повторно сус-пендировали в 300 мл 20мМ трис НСl буфера рН 7,5/ и разрушали ультразвуком (4 х 45 секунд). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (30.000 г, 30 мин.), а белок (про-теин) супернатанта осаждали добавлением сульфата аммония до 75% насыщения. Осадок собрали путем центрифугирования (30,000 г, 30 мин.) и гранулы ресуспендировали в 25 мл НЕРЕS буфере /100 мМ, рН 7,0), содержащем сульфат аммония (75% насыщение). Раствор фермента получили путем центрифугирования (12,000 об/мин, 30 минут). Слой суперна-тантный слили, а гранулы растворили в трис -НСl буфере (100 мМ, рН 7,0), доведя объем до первоначального.
(ii) Продукт примера 1 (115 мг) был растворен в воде (100 мл) и перемешан. К нему до-бавили раствор фермента (0,5 мл) и смесь выдерживали при постоянном рН за счет непре-рывного добавления НCl (25 мМ). Превращение контролировалось методом хиральной ВЭЖХ, которая показала, что происходило предпочтительное дезаминирование (+) энан-тиомер субстрата. Через 22 часа (+) энантиомер субстрата (RT 12,5 мин.) был полностью выделен, и рН раствора довели до 10,5, добавляя концентрированный раствор гидроксида натрия.
Раствор, полученный выше, проэлюировали через колонку, заполненную ОАЕ Сефа-дексом (А 25; Pharmacia; 30x1,6см), уравновешенную предварительно до рН 11. Колонку промыли водой (200 мл), и затем 0,1 М НCl. Были отобраны фракции по 40 мл и проанали-зированы методом ВЭЖХ с обратимой фазой. Фракции 5-13, содержащие непрореагиро-вавший (-)энантиомер субстрата объединили и довели их рН до 7,5 с добавлением НCl.
Фракция 47, содержащая дезаминированный продукт, была доведена до рН 7,5 добав-лением разбавленного NaOH. Анализ, проведенный методом хиральной ВЭЖХ, показал, что этот материал это- смесь, состоящая в основном из одного энантиомера /RT 10,2 мин/ и другого энантиомера /RT 8,5 мин/-побочный продукт.
(iii) Cтадия (ii) была повторена в более широком масштабе. Соединение примера 1 (363 мг) в 250 мл воды инкубировали с раствором фермента (0,5 мл), полученного в стадии (i). Через 18 и соответственно 48 часов добавили еще порции по 0,5 мл растворах фермента. Реакционную смесь перемешивали в течение 70 часов, затем оставили стоять еще на 64 часа. Анализ, проведенный методом хиральной ВЭЖХ, показал, что (+) энантиомер суб-страта полностью дезаминирован, и полученный раствор довели, добавляя NaOH, до рН 10,5.
Раствор, полученный выше, пропустили через ту же ОАЕ колонку и проэлюировали так же, как в стадии (i). Фракции 2-6, содержащие смесь остатков субстрата и дезаминиро-ванного продукта, были собраны. Фракции 7-13, содержащие остатки субстрата //-/энантиомер/ были собраны и рН было доведено до 7,5. Фракции 25-26, содержащие дез-аминированный продукт были собраны и нейтрализованы.
Фракции 2-6 были вновь пропущены через ту же ОАЕ колонку. Фракции 3-11 из этой второй колонки содержали непрореагировавший субстрат ((-)эанатиомер). Фракция 70 со-держала дезаминированный продукт.
(iv) Фракции растворенного субстрата из стадий (ii) и (iii) были объединены и их рН доведено до 7,5. Раствор проэлюирован через колонку ХАD-16/40х2,4 см), упакованную в воде. Колонка была промыта водой, и затем проэлюирована смесью ацетон: вода = 1:4 об/об. Фракции, содержащие (-) энантиомер ВСН 189, были собраны и после сушки вымо-раживанием (лиофильной) был получен порошок белого цвета (190 мг).
Методы ВЭЖХ, использованные выше, соответствуют следующим параметрам:
Аналитическая ВЭЖХ с обратимой фазой:
Колонка: капилярный патрон, Сферисорб ODS-2(5мM), 150х4 мм.
Элюент дигидрофосфат аммония (50 мМ) + 5% МеС.
Скорость потока: 1,5 мл/мин
Детектор: УФ, 270 нм
Времена удерживания: (ВСН-189)-5 мин, дезаминированный ВСН-189 8, 1мин.
2. Аналитическая хиральная ВЭЖХ
Колонка: Циклобонд 1 ацетил, 250х4,6 мм
Элюент: 0,2% раствор триэтиламмоний ацетата (рН 7,2)
Скорость потока 1,0 мл/мин
Детектор: УФ, 270 нм
Времена удерживания ВСН - 189 11,0 мин и 12,5 мин, дезаминированный ВСН-189 8,5 мин и 10,2 мин.
(Биопревращение отслеживалось путем наблюдения за снижением пика в момент 12,5 минут и накоплением продукта в момент 10,2.).

Пример 5
(-)-цис-4-амино-1-/2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он
Бактериальные петли В клеток Е. coli (АТСС 32848), снятые с хорошо проросших ча-шек с питательным агаром, были использованы для инокуляции двух колб Florence каждая из которых содержала 250 мл питательного бульона. Культуру инкубировали при 37С при встряхивании (250 об/мин, 5 см) в течение 18 часов. Затем содержимое этих колб было ис-пользовано для инокуляции 40 л СДД-среды с цитидином в 70-литровом ферментере.
Условия ферментации были следующие: аэрация 40 л/мин, скорость перемешивания 750 об/мин при температуре 37С. Три импеллера Rushton были вставлены в ферментер. Ферментационный процесс длился 18 часов, затем выращенный урожай собрали, исполь-зовав центрифугу Sharples для непрерывного центрифугирования. Клеточную пасту (вес Влажный 150 г) заморозили при -20С прежде чем провести разрушение клеток.
ССД среда
грамм/литр
L - глутаминовая
кислота 3
MgSO4 0,2
K2SO4 2,5
NaCl 2,3
NaH2BO4 0,6
Na2HPO4 1,1

Была приготовлена эта среда на дистиллированной воде. Простерилизована при 121С в течение 30 мин. Цитидин (1,2 г/л) был простерилизован и добавлен перед иннокуляцией.
Замороженная клеточная паста (150 грамм/была оттаяна и суспендирована в 750 мл 100 мМ НЕРЕS/N-[2-гидроксиэтил] пиперазин-N-2-этансульфокислота]/буфере /рН7,5), содер-жащем 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (натриевая соль и 1 мМ дитиотрейтола) разрущающий буферный раствор). Клетки были разрушены в результате пропускания сус-пензии через Manton - Baultn гомогенизатор под давлением 7500 фунт/дюйм2 (42.102кПа). Такая процедура была повторена трижды с охлаждением суспензии примерно до 5С после каждого прохождения через гомогенизатор. Гомогенизат остветили путем центрифугиро-вания (1400 г, 60 мин). Цитидин дезаминазную активность адсорбировали на Q-сефарозной колонке (490 мг объем слоя), уравновешенной 50 мМ Трис (гидроксиметил) метиламином (рН 7,5), содержащем 1 мМ хлорида натрия. Собранные активные фракции (210 мл) пропустили через фенил-Сефарозную -колонку (490 мл объема слоя) предвари-тельно уравновешенную буферным раствором, содержащим 3,2 М сульфата аммония. Свя-занный фермент проэлюировали раствором сульфата аммония в градиенте уменьшающих-ся концентраций. Фракции, содержащие цитидин дезаминазную активность были собраны (695 мл), частично очищенный фермент был затем осажден 80% сульфатом аммония. После центрифугирования (1400 г, 60 мин) гранулы ресуспендировали в 54 мл супернатантного слоя из выше приведенной стадии и хранили и при 4С.
6,2 мл этого раствора центрифугировали (1800 г, 90 мин. и гранулы растворили в 24 мл 0,5 М Калий фосфатном буфере (рН 7,5). В течение ночи систему подвергли деализу в 1М фосфатном буфере, рН 7,5. Удержанный объем был затем проэлюирован равным объемом дистиллированной воды (20 мл). К 35 мл этого раствора добавили 1 г сухих шариков EnpergitC, и смесь оставили стоять при комнатной температуре на 150-300 часов/время определялось остаточной цитидин дезаминазной активностью в растворе). Иммобилизо-ванный фермент промыли 100 мМ/НСL буфером /рН 7,0/, содержащим 1мМ ЭДТА/, 1 мМ ДТТ, 0,5 NaCl и 500 частей на миллион этилового эфира пара-оксибензойной кислоты /буфер для хранения/. Иммобилизованный фермент (2,7 г влажной массы) хранили в этом буфере при 4С до момента востребования для биотрансформации.
Продукт примера 1 (3 г) растворили в 1-литровой колбе, снабженной магнитной ме-шалкой, в 500 мл дистиллированной воды. Биопревращение осуществлялось при 32С в рН-стате. РН поддерживалось постоянным при 7,0 за счет добавления 1М уксусной кисло-ты. 1 г влажной массы иммобилизованного фермента промыли водой предварительно ди-стиллированной до начала реакции. За превращением следили, используя хиральную ВЭЖХ, которая показала, что предпочтительнее дезаминируется (+) энантиомер субстрата. К концу реакции (72 часов) шарики с ферментом отфильтровывали и фильтрат использо-вали для изоляции необходимого (-) энантиомера.
РН реакционной смеси довели до 10,5, используя для этих целей 1М сульфат аммония, и раствор нанесли на дюолит (Duolite A113) высокополимерную смолу в ОН цикле (50 мл, 0,4 объема слоя в час). Уридиновый аналог адсорбировали на полимере /смоле/, и (-) энан-тиомер пропустили через эту смолу. Весь (-) энантиомер, оставшийся на смоле (удалили промыванием 0,04% раствором аммиака (2 объема слоя), скорость потока 0,8 объемов слоя/час).
РН прошедших растворов и промывных вод (600 мл) довели до рН 7,0, добавляя кон-центрированную серную кислоту, и раствор пропустили через ХАД16 смолу (50 мл, ско-рость потока 1,4 объема слоя/час/. Колонку промыли дистиллированной водой (2,6 объема слоя, скорость потока 2 объема слоя в час), и (-) энантиомер проэлюировали смесью ацетон: вода, взятой в соотношении 1:3) скорость потока 1,5 объема слоя в час).
Масса, содержащая фракцию (-) энантиомера (4 объема слоя) была сконцентрирована на испарителе Buchi до небольшого объема, после этого была профильтрована через стек-лянный фильтр №3. Фильтрат высушили, использовав лиофильную сушку, в результате получили 1,4 г продукта, название которого дано в заголовке, идентичного продукту, по-лученному в примере 4.

Пример 6
Составы для таблеток
А.Следующий состав получен путем влажной грануляции ингредиентов с раствором провидона в воде, высушивания и проверки, вслед за которой идет добавление стеарата магния и прессование.

мг/таблетка
(а) Активный ингредиент 250
(b) Лактоза Б.Ф. 210
(с) Провидон Б.Ф. 15
(d) Натрия крахмальный
элмиколят 20
(е) Магния стеарат 5
500

В. Следующий состав получен непосредственным прессованием лактоза-непосредственный компонент прессования

мг/таблетка
Активный ингредиент 250
Лактоза 145
Авицел 100
Магния стеарат 5
500

С. (Состав с контролируемым выделением). Этот состав получен путем влажной гра-нуляции ингредиентов с раствором провидона в воде, сушкой и скринингом, за которым следует добавление стеарата магния и прессование.

мг/таблетка
(а) Активный ингредиент 500
(b) Оксипропилметилцеллю-лоза 112
(с) Лактоза Б.Ф. 53
(d) Провидон Б.Ю. 28
(е) Магния стеарат 7
700

Пример 7
Состав для капсул
Состав для капсул получен путем смешения ингредиентов и заполнения этой смесью капсулы, состоящей из двух частей. Капсула изготовлена из жесткого желатина.

мг/капсула
Активный ингредиент 125
Лактоза 72,5
Авицел 50
Магния стеарат 2,5
250

Пример 8
Состав для инъекций
Активный ингредиент 0,200 грамма, раствор гидроксида натрия, 0,1 М для доведения рН до примерно 11, стерильная вода до 10 мл.
Активный ингредиент суспендируют в некотором количестве воды, которая может быть подогрета, и рН доводят до примерно 11 раствором гидроксида натрия. Дозировку затем доводят до требуемого объема и фильтруют через стерильный градуированный мем-бранный фильтр в стерильную стеклянную ампулу объемом 10 мл и закупоривают сте-рильной пробкой и запечатывают сверху изолирующим слоем.

Пример 9

мг/суппозиторный
Активный ингредиент 250
Твердый жир Б.Ф. 1770
2020

Одну пятую часть твердого жира расплавляют в лотке, оборудованном паронагрева-тельной рубашкой при 45С максимум. Активный ингредиент просеивают через 200 мм сито и добавляют к расплавленной основе при перемешивании, используя для этого ме-шалку с высоким сдвигом. Перемешивание ведут до тех пор, пока не будет получена одно-родная суспензия. Выдерживая смесь при 45С к ней добавляют оставшийся твердый жир и перемешивают до тех пор, пока не уверятся в образовании гомогенной смеси. Суспензию целиком пропускают через 250 мм сито из нержавеющей стали и при непрерывном поме-шивании оставляют охлаждаться до 40. При температуре от 38 до 40С по 2,02 грамма сме-си помещают в подходящие 2 мл формочки из пластмассы. Суппозитории (свечи) оставля-ют охлаждаться до комнатной температуры.
Пример 10
Биологическая активность
Противовирусная активность
Противовирусная активность соединений примера 2 была исследована в отношеии трех штаммов ВИЧ-1 и одного штамма ВИЧ-2 в следующих линиях клеток.
J м клетки, полузрелые Т-клетки, полученные от больного с лимфобластозной лейке-мией, инфицировали ВИЧ-1 штамм GB-8.
С8166 клетки, человеческие Т-лимфобластовидные клетки, инфицировали ВИЧ-1 штаммом RF.
СЕМ клетки, человеческие Т-лимфобластоидные клетки, инфицированные Вич-1, штаммы RF и U455, или ВИЧ-2, штамм ROD. МТ-4 клетки, человеческие Т-клетки лейке-мической клеточной линии, инфицированные ВИЧ-1, штамм RF.
Противовирусная активность в С8166, JM, и СЕМ клетках определяли путем ингиби-рования образования синцитин /Tochikura и др., Вирусология, 164, 542-546), а в МТ-4 клет-ках путем ингибирования превращения формазана (Вава и др.; (1987). Biochem Biophys Res Comm., 142, 128-134; Mossman (1983) J.Immuh. Meth; 65, 55-57). Противовирусная актив-ность препаратов определялась путем анализа количества ВИЧ р 24 антигенов, синтезиру-емых в присутствии и в отсутствии энантиомеров. Результаты приведены в таблицах 1 и 2:


Таблица 1


Анализ
Формазан Противовирусная активность (1мг/мл)
Ингибирование образования цинтия
Клетки МТ-4 СЕМ СЕМ СЕМ JM С8166
Вирус HIV-1RF HIV-2ROD HIV-1RF HIV-1U455 HIV-1GB8 HIV-1RF
(ВИЧ-1) ВИЧ-1 ВИЧ-2 ВИЧ-1 ВИЧ-1 ВИЧ-1 ВИЧ-1
Диантио-мер 0,28 0,045 0,07 0,006 0,03 0,05
Энантио-мер 0,20 0,055 0,04 0,008 0,05 0,01

Таблица 2
Ингибирование синтеза ВИЧр24

Ингибирование ВИЧ р24 синтеза
(мг/мл))
Клетки С8166 JM MT-4
Вирус RF GB8 RF
Энантиомер 0,021 0,033 0,0008
Энантиомер 0,016 0,016 0,0004
В. Цитотоксичность
Цитотоксичность соединений примера 2, рацемата (ВСН-189; пример 1) и 50/50 смеси двух энантиомеров определяли на пяти СД4 клеточных линиях: Н 9, JM, CEM, C8166 иU937.
Соединения, предназначенные для тестирования, были сериально разбавлены от 100 г/мл до 0,3 г/мл) граничные концентрации/ в 96 лунках титрационных микропланшетов, 3,6х104 клеток было иннокулировано в каждую лунку планшетов, включая контрольные, свободные от лекарства. После инкубирования при 37С в течение 5 дней число жизнеспо-собных клеток было определено путем удаления клеточного образца суспензии клеток и подсчета trypan голубым связанных клеток в гомоцитометре. Результаты приведены в таб-лице 3.

Таблица 3
Цитотоксичность

50% цитотонсичность (мг/мл)
Соединение СЕМ клетки клетки клетки клетки клетки
(+)-диантиомер 1 1,5 2 4 35
(-)-энантимер >100 30 >100 >100 >100
BCH-189 3 3,5 8 15 90
1:1 Смесь 2,5 ND* ND ND ND

ND = не определено

Авторское свидетельство СССР № 1174433, кл. А 61 К 31/505, 1986.
Патент США № 4629729, кл. А 61 К 31/505, 1986.