СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинико-биохимической лабораторной диагностики и может быть использовано в каче-стве прогностического теста при эффективном лечении различных заболеваний.
Сущность способа определения холестерина заключается в том, что в пробирке берут 0,25 мл сыворотки крови, добавляют 1 мл рабочего стан-дарта -трикосан 0,125 мг/мл и 5мл хлороформ, взбалтывают в течение 5 минут, фильтруют и вы-паривают досуха. Затем в содержимое пробирке добавляют 0,5мл бидистиллированную воду и 0,5мл 4N раствора едкого натрия и гидролизируют в течение 15 минут. Гидролизат нейтрализуют 10% раствором соляной кислоты и дважды экс-трагируют хлороформом. Хлороформный экс-тракт промывают водой и сушат над сульфатом натрия. Затем экстракт фильтруют и после удаление растворителя, остаток растворяют в 0,3мл этилового спирта и хроматографируют.

Разработанный новый способ определения содержание холестерина в сыворотке крови относится к области клинико-биохимической лабораторной диагностики и может быть использован в качестве прогностического теста при эффективном лечение различных заболевании. Основным аналитическим методом при анализе биологического объекта здесь является газо-жидкостная хромато-графия, чувствительный детектор которой в состоянии определит незначительное количество холе-стерина в крови за короткое время.
Способ определения холестерина, в соответствие с настоящей изобретением, представляет собой новый, неописанный в литературах среди других известных аналогичных способов определения сывороточного холестерина относящийся к обычным серийным клиническим тестом.
До настоящего времени известны ряд способов определения содержания холестерина в сыворотке крови, которые имеют свои недостатки. Известно метод определение холестерина с применением газовой хроматографии [1] William J. Ferell "Critical Reviews in Clinical laboratory Science. Gas-Liquid Chromatography as a Method for Analysis of serum cholesterol, 1977, v.8, #3, p. 259-278., являющийся близким по процедуре к новым разработанным методом определения содержания холестерина в сыворотки крови. Данный способ определения заключается в том, что авторы определяли холестерин в виде метилового эфира, а также использовали силилпроизводных холестерина. При использование такого метода уходит много время, и он невыгоден в клинических диагностиках.
Известно также совсем другая методика определения содержания холестерина в сыворотке крови (Blomhoff J.P."Serum cholesterol determina-tion by gas-liquid chromatography" Clin. chem. Acta 1973; 43; 257), которая используется в медицинской практике в диагностических целях. Но при использования данного метода расходуется значительное количество реактив.
Другой способ, относившийся к данной области, находится ближе к заявленным изобретенным способом и в данное описание последний способ считается прототипом изобретения среди известных аналогов. Сущность прототипного способа определения содержания холестерина в крови заключается в том, что здесь для количественного определения холестерина стерины (холестерин) превращают в триметилсилиловые эфиры. Напри-мер, растворяют пробу непосредственно в смеси гексаметилдисилозан - триметилхлорсилан- пиридин (12:5:2) и вводят раствор в газовой хроматограф без нагревания [3] Kuksis A., Myher I. J., Marai L., Grher К., Chromat, 8 ci. 1975, v. 13, p. 423.
Недостатками данного способа это:
Во-первых, процесс превращения стеринов в триметилсилиловых эфир требует некоторое время, что влияет на длительность клинической лабораторной диагностики; Во-вторых, реактивы используемые в прототипом способе определения содержания холестерина в крови стоят дороже, чем реактивы используемые в заявляемой изобретения. В прототипе используется дорогостоящий реактив трихлорсилан, гексаметилдисилозан и пиридин, а в новом способе необходимо хлороформ и 4Н раствор едкого натрия.
Целью изобретения является нахождение метода, который по сравнению с другими существующими методами было бы более точным и информативным в определение холестерина, будучи в то же время не трудоемким и дешевым.
Предлагаемый новый способ определение общего холестерина в сыворотке крови является менее трудоемким и требует сравнительно малых средств. Его можно использовать и в анализе других биологических объектах при помощи газовой хроматографии.
Другой его превосходство в том, что здесь в качестве стандарта-метки подбирали такое вещество (трикосан), который не реагирует с другими компонентами смеси, также не очень сильно сорбируется и появляется на хроматограмме отдельно от других компонентов. Кроме того, это вещество отсутствует в исследуемой смеси.
Сущность изобретения заключается в экстракции холестерина и его связанных эфиров из 0,25 мл сыворотки крови содержащий 0,125 мг/мл рабочего стандарта трикосан, 5 мл хлороформом. Затем с последующим гидролизом 0,5 мл бидистиллированной водой и 0,5 мл 4N раствором едкого натрия в течение 15 мин до образования свободного холестерина.
Гидролизать нейтрализуют 10%-ным раствором соляной кислоты, и дважды экстрагируют хлороформом. Экстракт сушат и после удаления растворителя количество общего холестерина определяли газохроматографическим методом, для чего использовали газовый хроматограф «Хром-5» (Словакия) с пламенно-ионизационным детектором.
Этот метод проводят путем экстракции суммы эфиров и свободных холестеринов с последующим гидролизом этих компонентов до образования свободного холестерина.
Пример. В притертой пробирке берется 0,25мл сыворотка, и добавляют 1мл рабочего стандарта - трикосан 0,125мг/мл и 5мл хлороформ взбалтывают в течение 5 мин. Затем фильтруют и выпаривают растворителя досуха. Затем в содержимое колбочки добавляют 0,5мл бидисстилированую воду и 0,5мл 4N раствора едкого натрия и гидролизируют в течение 15 мин. После чего гидролизат нейтрализуют 10% раствором соляной кислоты и дважды экстрагируют хлороформом. Хлороформный экстракт промывают водой и сушат над сульфатом натрия. Затем экстракт фильтруют и после удаление растворителя остаток растворяют в 0,3мл этилового спирта и хроматографируют.
Предлагаемый метод определения холестерина сыворотке крови является точным и более эффективным по сравнению с существующими, за счет своей кратковременности и работы с очень незначительными количествами реактивов. Пре-имущество способа является доступность сырья: хлороформ, трикосан, соляной кислоты и едкого натра.
Условия хроматографирования. Колонку длиной 1,26м с внутренним диаметром 0,3см заполняли фазой: хроматон N-AW зернения 0,160 - 0,200 мм, содержащий 3% SE-30. Температура хроматографической колонки 185°С, испарителя - 290 С, детектора - 280°С, скорость газоносителя - 40 мл/мин, скорость движения ленты самописца - 0,3 см/мин, продолжительность анализа 150 мин. Для идентификации были приготовлении искусственные смеси из хроматографически чистых эталонов холестерина и внутреннего стандарта - трикосан. Все получение хроматограммы оцени-вали методом внутреннего стандарта [4] Вяхирев Д. А., Шушунова А.Ф. Руководство по газовой хроматографии. М., 1975 -с 226-228.
Относительного поправочного коэффициента вычислили по следующей формуле.

К- относительный поправочный коэффициент
Cj - концентрация холестерина
SCT - площадь пика стандарта
Сст - концентрация стандарта
Sj - площадь пика холестерина
Процент холестерина в сыворотке крови оценивали по следующей формуле:111111111111111:
М - масса стандарта
а - количество анализируемой пробы

1. William J. Ferrell "Critical Reviews in Clinical laboratory Science. Gas-liquid Chromatography as a Method for Analysis of serum cholesterol", 1977, v.8, #3, p. 259-278.
2. Blomhoff J.P. "Serum cholesterol determina-tion by gas-liquid chromatography", Clin.
chem. Acta 1973, 43, 257.
3.Kuksis A., Myher I.J., Marai L., Grher K. Cromat, 8 ci. 1975, v. 13, p. 423.