СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ПОЛИПЕПТИДА В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМАХ.

Использование: биотехнология, в частности генная инженерия при получении гетерологич-ного полипептида в эукариотических микроорганизмах. Сущность изобретения: способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей промотор BAR1 Saccharomyces cerevisiae или промотор алкогольдегидрогеназы IS cerevisiae часть по-следовательности гена BAR1, кодирующей сигнальный пептид, и иесто отщепления сиг-нального пептида КЕХ2 от гетерологичного полипептида, которое представляет собой Arg-Arg или Lys-Lys, а также структурный ген. Затем проводят трансформацию полученной ДНК штаммов - реципиентов, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта. В качестве штаммов – реципиентов целесообразно использовать штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae или Schizosauharomyces pombe или Aspergillus или Neurospora. 8 з. п. ф-лы, 21 ил., 5 табл.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению рекомби-нантных ДНК, содержащих транслируемую часть сигнального пептида гена Saccharomyces cerevisiae BAR1 и один структурный ген, являющийся чужеродным для клетки, трансформи-рованной указанной ДНК. Трансформация организмов хозяев такими конструкциями ДНК приводит в результате к экспрессии первичного продукта трансляции, включающего струк-турный белок, кодируемый чужеродным геном, слитым с сигнальным пептидом BAR1. В результате данный белок секретируется из клетки хозяина и может выделяться в питательную среду или в периплазменное пространство.
В качестве хозяев для получения гетерологичных полипептидов были использованы различные прокариотические и эукариотические микрооганизмы. Особый интерес вызывало использование различных видов эукариотических гибковых организмов, включая Saccharo-myces cerevisiae Schizosauharomyces pombe или Aspergillus и Neurospora. В частности, была ро-делана большая работа по культивированию дрожжей S. сerevisiae. Дрожжевые клетки при трансформации их соответствующих конструкций ДНК, например, плазмидой, экспрессиро-вали полипептид, закодированный в гетерологичном гене, содержащемся в данной плазмиде.
Однако данная технология ограничена тем, что белковые продукты не выделяются из клеток-хозяев в среду и в связи с этим необходимо разрушение клеток и очистка белка от раз-личных загрязняющих клеточных компонентов без его денатурации или инактивации.
Таким образом, желательно создать трансформированные клетки, секретирующие гете-рологичный продукт, что позволит, упростит очистку данного продукта.
Кроме того, желательно, чтобы некоторые белки прошли путь секреции клетки-хозяина для образования, например, бисульфидной связи.
Известно, что S. сerevisiae секретирует некоторые из своих белков в питательную среду, хотя сведения о данном процессе очень ограничены по сравнению с тем, что известно о сек-реции белков из бактерий и клеток млекопитающих. Как известно, большинство секретируе-мых дрожжевых белков представляют собой ферменты, которые остаются в периплазменном пространстве, хотя такие ферменты, как инвертаза и кислотная фосфатаза, могут входит в стенку клетки. Белки, которые, как известно, выделяются S. сerevisiae в питательную среду, включают спаривающие феромоны (альфа-фактор и а-фактор), уничтожающий токсин и бе-лок, который отвечает за активность Барьер.
Клетки S. сerevisiae α-спаривающего типа продуцируют альфа-фактор, в то время как а-клетки продуцируют два полипептида альфа-фактор и Баррьер, все секретируемые в пита-тельную среду; ген альфа-фактора был клонирован, секвенирован и проанализирован (Kurjan and Herskowitz, Cell, 30, 933 – 943, 1982). Сигнальный пептид (короткая пептидная последова-тельность, обеспечивающая секрецию связанного с ней белка), главная последовательность, (включающая полипептид-предшественник, который отщепляется при созревании альфа-фактора) и нетранслируемые нуклеотидные последовательности (включающие области сти-мулятора и регулятора) гена альфа-фактора могут использоваться для секреции чужеродных белков в дрожжах (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81, 4642 – 4646, 1984). Экспрессия гена альфа-фактора регулируется продуктом гена МАТα1 и переработка предшественника альфа-фактора в созревший белок требует осуществления двух этапов под контролем генов STE13 и KEX2.
В противоположность альфа-фактору Баррьер гликозируется его способностью связы-вать конканавалин А. Баррьер продуцируется а-клеткамии экспрессируется под контролем гена МАТα 2. За исключением отщепления сигнального никаких обработок предшественни-ка Баррьер ранее не осуществлялось и гены STE13 и KEX2 не рассматривались как гены, участвовавшие в выражении Барьер.
Учитывая указанные выше различия между контролем экспрессии и преобразования аль фа - фактора и Баррьер, можно определить, какой из этих дрожжевых генов подходит лучше для направления секреции специфического инородного белка. Ввиду того, что эти два белка проходят через различные пути секреции, желательно использовать свойства системы секре-ции Баррьер.
Известен способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроор-ганизмах, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содер-жащий промотор, последовательность, кодирующую сигнальный пептид и структурный ген, трансформацию полученной рекомбинантной ДНК штаммов-реципиетов (ЕПО, N 0121884, кл. C 12 N 15/00, 1983).
Объектом предлагаемого изобретения является способ получения гетерологичных по-липептидов путем экcпрессии чужеродных генов в микробном хозяине.
Изобретение касается способов использования конструкций ДНК, содержащих по меньшей мере кодирующую последовательность сигнального пептида гена ВАR1 Saccharo-myces cerevisiae, по меньшей мере один структурный ген, являющийся чужеродным геном для штамма-реципиента, и стимулятор, который контролирует экспрессию в штамме слитого белка, включающего сигнальный пептид ВАR1 и чужеродный белок.
Изобретение поясняется чертежами, на которых:
фиг. 1 - 3 -нуоклеотидная последовательность гена ВАR1 и выведенная аминокислотная последовательность первичного трансляционного продукта, где связывающая точка МАТα2 подчеркнута, предполагаемая точка расщепления сигнального пептида показана стрелкой, а точки возможного гликозилирования отмечены звездочкой;
фиг. 4 - физическая карта плазмиды рZV9;
фиг. 5 - конструирование плазмиды р254;
фиг. 6 - конструирование плазмид рZV30, рZV31, рZV32, рZV33;
фиг. 7 и 8 - конструирование плазмиды рZV50;
фиг. 9 - конструирование плазмиды m115;
фиг. 10 - конструирование плазмиды рZV49;
фиг. 11 - конструирование плазмиды рZV134, включающей стимулятор ТРI1;
фиг. 12 -субклонирование части гена МFα1;
фиг. 13 - конструирование плазмиды рZV75;
фиг. 14 - конструирование плазмид, включающих стимулятор ТРI1 и слияние ВАR1-МFα1;
фиг. 15 -конструирование плазмиды рSW22;
фиг. 16 - конструирование плазмид, включающих слияние ВАR1-МFα1;
фиг. 17 - конструирование плазмиды рZV100;
фиг. 18 - конструирование плазмиды рZV102;
фиг. 19 - конструирование плазмиды рSW96;
фиг. 20 - конструирование плазмиды рSW97;
фиг. 21 - конструирование плазмид рSW98 и рSW99; ∆ указывает мутацию у кодона 25.
Под термином "конструкция ДНК" имеется в виду молекула ДНК, включающая плаз-миду, которая была модифицирована при частии человека таким образом, чтобы нуклеотид-ная последовательность данной молекулы не совпадала с последовательностью, которая со-здана естественным путем. Понятие "конструкция ДНК" охватывает также клоны молекул ДНК, модифицированные таким образом. Термины "вектор экспрессии" и "плазмида экс-прессии" определены как конструкция ДНК, которая включает точку инициирования тран-скрипции, и по меньшей
мере один структурный ген, кодирующий желаемый белок, который экспрессируется в орга-низме хозяина. Вектор экспрессии обычно включает также соответствующие области, такие как стимулятор и концевую часть, которые направляют экспрессию желаемого белка в орга-низме хозяина, а также источник репликации. Векторы экспрессии обычно включают селек-тивный маркер, например, геноустойчивости к антибиотикам или маркер зависимости от питательного вещества.
Понятие "конструкция ДНК" включает также части вектора экспрессии, входящего в хромосому хозяина.
Термин "плазмида" имеет его общепринятое значение, т. е. конструкция ДНК с авто-номной репликацией, обычно с замкнутой петлей.
Термин "сигнальный пептид" относится к той части первичного продукта трансляции, которая определяет секрецию полипептида из клетки. Сигнальный пептид обычно отщепля-ется от остальной части полипептида сигнальной пептидазой. Сигнальный пептид характе-ризуется наличием гидрофобных аминокислот, находящихся у концевой аминогруппы пер-вичного продукта трансляции и обычно состоит из 17 - 25 аминокислот. Точки расщепления сигнальной пептидазой были охарактеризованы von Неinуе (Еuг.J.Вijchem., 133, 17, 1983). Под термином
"сигнальный пептид" могут также иметься в виду функциональные части сигнального пеп-тида естественного происхождения.
Предлагаемое изобретение предусматривает способ получения гетерологичных поли-пептидов с помощью трансформированных клеток, обеспечивающих секреций гетерологич-ных белков через клеточную стенку. Эти клетки содержат конструкцию ДНК с чужеродным геном, связанным с дрожжевым ВАR1 геном или его частью, кодирующей по меньшей мере сигнальный пептид ВАR1.
Гетерологичные белки выделяются в периплазменное пространство или в питательную среду. Дрожжевой ген ВАR-1 кодирует гликозилированный белок, который секретируется клетками а типа S. сerevisiae и обладает активностью Баррьер. Секретированный белок Баррь-ер позволяет созревшим клеткам а-типа преодолевать задерживающее действие С1, вызван-ное альфа-фактором. При этом предлагается, что Баррьер может представлять cобой протеазу (Маппеу, J. Васteriol, 155, 291 - 301, 1983). Транскрипция гена ВАR1 стимулируется альфа-фактором. Баррьер или аналогичная активность не обнаруживается в α.- или а/α-клетках и ген ВАR1 не транскрибируется в этих типах клеток.
На фиг. 1 - 3 показана нуклеотидная последовательность размером 2750 пар оснований гена ВАR1 вместе с выведенной аминокислотной последовательностью первичного продукта трансляции. АТG точка-инициации трансляции гена ВАR1 находится в положении 681 фрагмента, составляющего примерно 2,75 kb, показано на фиг. 1, который субклонирован от фрагмента, полученного из библиотеки дрожжевых геномов (Nasmyth and Tatchell, Сеll, 19, 753 - 764, 1980). Открытая рамка считывания начинается с кодона АТG в +1 и простирается до 1761 bр в 3' -направлении. Последовательность первых 24 аминокислот первичного про-дукта трансляции ВАR1 аналогична известным последовательностям сигнальных пептидов дрожжей и млекопитающих. Так, аланин в положении 24 может быть использован как точка расщепления, как дрожжевой инвертазой, так и кислотной фосфатазой. Расщепление может происходить также после 23 аминокислоты. В первичном продукте трансляции имеется не менее девяти возможных, связанных с аспарагином точек гликозилирования, хотя степень гликозилирования созревшего выделенного Баррьер пока еще неизвестна. Области стимуля-тора и регулятора гена ВАR1 располагаются в пределах зоны примерно 680 bp на 5’ -стороне колена инициации трансляции. Полная функция стимулятора и реакция на стимулирование альфа-фактора были локализованы у ближайшего АТG, примерно 680 bр нетранслируемой области 5’.
Конструкция ДНК предлагаемого изобретения содержит точку расщепления в месте со-единения Баррьер и частей чужеродного белка. Такой предпочтительной точкой является точка расщепления КЕХ2, последовательность аминокислот, которая распознается и расщеп-ляется продуктом гена КЕХ2 S. сегеvisiaе (Julius еt аl., Сеll, 37, 1075-1080, 1984). Точка КЕХ2 характеризуется парой основных аминокислот, таких как лизин и аргинин. Желательно, что-бы последовательность точки КЕХ2 представляла собой Lуs-Агg или Агg-Агg. Первичный продукт трансляции ВАR1 содержит две такие пары, локализованные в структурной области: Агg-Агg в положениях 177-178 и Lуs-Lуs в положениях 404 - 405.
Как отмечалось выше, ген КЕХ2 не участвует в обработке исходного белка Баррьер и это говорит о том, что возможные точки обработки блокируются белковой конформацией или гликозилированием. Кроме того, это говорит также о том, что Баррьер обычно при его обработке может проходить путь, отличный от того, который используется такими КЕХ2-обработанными белками, как альфа- фактор.
Однако авторы изобретения обнаружили, что при вьючении точки КЕХ2-обработки в белок слияния, cодержащий часть первичного продукта трансляции гена ВАR1 с сигналь-ным пептидом и желаемый белок, белок слияния расщепляется в этой точке, что приводит в результате к секреции желаемого белка.
Кроме того, было установлено, что снизив эффективность отщепления сигнальной пеп-тидазой части Баррьер в белке, включающем точку расщепления КЕХ2, из клетки выделяют-ся повышенные количества желаемого белка. Точка расщепления КЕХ2 может находиться в последовательности ВАR1 желаемого гена, или же она может быть включена с помощью сайт-специфического мутагенеза, т.д.
Согласно изобретению часть гена ВАR1, включающая кодон инициации АТG и коди-рующую последовательность сигнального пептида, может быть присоединена к желаемому чужеродному гену и трансформирована в эукариотическую клетку хозяина. Образуемый в результате ген слияния будет включать точку обработки, предпочтительно точку расщепле-ния КЕХ2, расположенную в месте соединения последовательностей гена ВАR1 и чужерод-ных последовательностей. Такая конструкция может включать также области регулятора и промотора от 5'-неко-дирующей зоны гена ВАR1 или же может включать области регулятора и/или промотора от других генов.
Кроме стимулятора от гена ВАR1 могут использоваться другие промоторы от генов ал-когольдегидрогеназы I или II S. сегеvisiaе и генов гликолитической обработки S. cегеvisiaе, таких как промотор ТРII и соответствующих
генов других видов, включая дрожжи Schizosaccharomyces роmbe (Russell and Hall, J. Biol. Сhem., 258, 143 - 149, 1983 аnd Russell, Nature, 301, 167 - 169, 1983).
Ген алкогольдегидрогеназы I S. сегеvisiaе был описан в работе Ammrer (Metod in Еnzy-mology, 101, 192 - 201, 1983).
Ген алкогольдегидрогеназы II был описан в работе Рассела (Russell et al., J. Вiol. Сhem., 258, 2674 - 2682, 1983).
Гликолитические гены S. сегеvisiaе были описаны в ряде работ (Kawasaki, Рh. D.Thesis, University of Waschington, 1979; Hitzeman еt аl., J. Вiol. Сhem., 225, 12073 - 12080, 1980; Каwаsаki аnd Fraenkel, Biochem. Вiophys. Res. Соmm., 108, 1107 - 1112, 1982 and Аlber и Ka-wasaki, J. Моl. Аррl. Genet., 1, 419 - 434, 1982).
Предпочтительно изобретение предусматривает преобразование сигнального пептида, кодируемого последовательностью гена ВАR1, которое снижает эффективность отщепления сигнальной пептидазой части Баррьер в белке слияния, включающем точку расщепления КЕХ2. Это может осуществляться путем сайт-специфического мутагенеза точек возможного расщепления, предпочтительно точек у места соединения аминокислоты 23 - 24 (последова-тельности белка Баррьер) или места соединения аминокислоты 24 - 25.
Отвечающее данному изобретению конструирование ДНК включает общепринятые приемы. Структурный ген ВАR1 или его часть, а также структурный ген, который экспрес-сируется, находится под контролем единственного промотора.
Способы лигирования фрагментов ДНК описаны достаточно широко и специалисты в данной области в состоянии их практически осуществить. Кодируемая ДНК последователь-ность белка, который экспрессируется, может быть по сути последовательностью любого белка, в частности, последовательностью белков коммерческого значения, таких как интер-фероны, инсулин, проинсулин, α-1-антитрипсин, факторы роста, активатор тканевого плаз-миногена.
После получения конструкции ДНК, включающей ген ВАR1 или его часть и структур-ный ген, который экспрессируется, их трансформируют в штаммы хозяина. Способы транс-формации прокариотов и эукариотов (включая клетки млекопитающих) уже известны из ли-тературы.
Штамм хозяина (реципиента) представляет собой предпочтительно штамм дрожжей Sac-charomyces сегеvisiaе, однако могут использоваться и другие грибки, включая дрожжи Schiz-osaccharomyces pombe и нитевидные грибки Aspergillus nidulans и Neurospora spp.
Приведенные ниже примеры даются как иллюстрация. Во всех случаях, за исключением тех, которые указаны особо, используются стандартные методы молекулярной биологии. Ре-стрикционные эндонуклеазы были получены из научно-исследовательских лабораторий Веthesda, New England BioLabs и Воеhringer-Маппheim Вiochemicals и использованы в соот-ветствии с указанием изготовителя, обычно с добавлением панкреатической рибонуклеазы (10 мкг/мл) в продукты переваривания.
Т4 ДНК-лигаза была получена из научно-исследовательских лабораторий " Веthesda, Res. Laborat” или “Воеhringer-Маппheim” и была использована в соответствии с указаниями.
Штаммы хозяина М13 и рUС и векторы были получены из научно-исследовательских лабораторий "Веthesda".
Клонирование М13 осуществлялось, как описано в работе "Меssing" (Меthods in Enzy-mology, 101, 20 - 77, 1983).
ДНК полимераза I (фрагмент Кленова) использовалась, как описано в работе Маniatis et аl., "Моlecular Cloning: А Labогаtогу Маnual, Соld Spring Наrbог Laboratory", 1982. Культуры Е. соli были трансформированы методом Воlivаг et аl., Gene, 2, 95-113 1977.
Культуры S. сегеvisiaе были трансформированы способом Веggs, Nature, 275, 104 - 108, 1978, модифицированным МacKay Меthods in Епzimology, 101, 325, 1983.
S. роmbe был трансформирован, как описано Russell (Nature, 301, 167 -169, 1983).
Альфа- фактор спаривающего феромона получен методом Duntze et al., Еur. j. Вiochem ., 35, 357-365, 1973, модифицированным Маnney еt al., j. Сеll Вiol., 96, 1592 - 1600, 1983 или был приобретен у фирмы "Sigma Сhemical Со".
Олигонуклеотиды были синтезированы в устройстве для синтеза ДНК (Аррllied Вio-sistems Моdel 38OА) и очищены путем электрофореза на полиакриламидном геле или с ис-пользованием денатурирующего геля.
Методы анализа.
Анализ на активность Баррьер. Анализ на определение продуцирования Баррьер транс-формированными дрожжевыми клетками связан со способностью Баррьер изменять на об-ратное ингибирование роста чувстви-тельных клеток, подвергнутых воздействию альфа- фактора. Испытуемый штамм был таким штаммом, который проявлял чрезмерную чувстви-тельность к альфа- фактору, такой как штамм RС629 МАТа bаг1, поскольку он не продуциру-ет активность Баррьер. Культуру приготавливали с использованием такого штамма в мягком верхнем
слое агара в чашке с агаровой средой. В верхний слой агара вводили альфа- фактор в количе-стве (0,05 - 0,1 ед, как определено Маnnеу, ibid), достаточном для ингибирования роста кле-ток. Трансформанты, отбираемые на продуцирование Баррьер, наносились отдельными точ-ками на культуру. Секреция Баррьер трансформированными клетками не ингибировала рост клеток альфа- фактором непосредственно вокруг нанесенной точки. Выделенные клетки наблюдались в виде бахромы роста, окаймляющей обычно гладкий край колонии трансфор-мированных
клеток. Наличие этой бахромы указывает на то, что плазмида в трансформированном штамме обеспечивает экспрессию и секрецию Баррьер.
Анализ на IRI и IRC.
Анализ на IRI и IRC осуществляли с использованием набора инструментов, полученно-го от фирмы "Nоvо Industry (Ваgsvaerd, Denmark). Вместе с данным набором поставлялись анти-свиной инсулин морских свинок и антитела античеловеческого С-пептида морских свинок.
Анализ на IRI.
Образец в количестве 50 мкл в МаFАМ (0,04 мол, буферный раствор фосфата рН 7,4, содержащий альбумин бычьей сыворотки).
Антитело в количестве 50 мкл (разбавленный раствор 1:30) 16 - 24 ч при 4°С.
50 мкл 125 I-инсулина (разбавление 1:100) 2 ч при 4°С.
50 мкл 1%-нoго Staphilococcus аureu в NaFАМ 45 мин при 0°С.
Двукратная промывка 1 %-ным ВSА/TNEN*
*ТNEN - 20 мMол Триc, рН 8,0; 100мМол. NaCl, 1 мМол этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% NР-40.
Центрифугирование и приготовление гранул для отсчета.
Различные этапы могут успешно осуществляться в микротитровальных чашках до тех пор, пока гранулы не переносятся в сцинтилляционные склянки.
Анализ на IRC.
Образец в количество 50 мкл в NаFАМ.
50 мкл антитела (разбавленный раствор 1:50) 16 - 24 ч при 4°С.
50 мкл125 I-С пептида (разбавленный раствор 1:30) 2 - 4 ч при 4°С.
50 мкл 1% S. aureus в NaFАМ 45 мин при 0°С.
Двукратная промывка 1% ВSА/ТNEN.
* ТNEN - см. выше.
Центрифугирование и приготовление гранул для отсчета.
Анализ на активность альфа-фактора.
Анализ, используемый для обнаружения экспортируемого трансформированным дрож-жевыми клетками альфа-фактора, основан на использовании способности альфа-фактора ин-гибировать рост чувствительных клеток.
Испытуемый штамм [такой как штамм S. сегеvisiaе RС629 (МАТа bаг1)] содержит мутацию в гене ВАR1, которая предотвращает продуцирование белка Баррьер и придает клеткам сверх-чувствительность к альфа-фактору. Культивирование испытуемого штамма осуществляется в верхнем слое мягкого агара на чашке со стандартной селективной, синтетической дрожжевой средой (например, средой с недостатком лейцина). Трансформанты, отбираемые на экспорти-рование альфа-фактора, наносились в виде точек на культуру и термостатировались при 30°С. Секреция альфа-фактора данными трансформантами вызывает ингибирование роста клеток в культуре непосредственно вокруг колонии. Ореол ингибирования роста культуры испытуемых клеток указывает на то, что данная колония выделяет активный альфа-фактор. Сопоставление размера ореола позволяет определить относительные количества альфа-фактора, выделяемого каждым трансформантом.
Пример 1. Экспрессия проинсулина в S. сегеvisiaе с использованием гена ВАR1.
Рекомбинатная плазмидная совокупность, включающая весь дрожжевой геном, была по-строена Nasmyth и Таtchell, Сеll 19, 753-764, 1980) с использованием челночного вектора YЕр13 (Вгоасh еt аl., Genе, 8, 121-133, 179). Дрожжевые ДНК-фрагменты, полученные в ре-зультате частичной обработки Sau ЗА рестриктазой, были вставлены в YEр13, гидролизован-ную Ваm НI. Данная плазмидная совокупность была использована для трансформации штам-ма S. cегеvisiaе ХР635-10С МАТа leu2-3 leu2-112 bar1-1 ga112; АТСС # 20679) и трансформан-ты были
отобраны на лейциновую прототрофность и на концентрацию альфа-фактора, т.е. подавление клеток а bаг1. Полученные в результате колонии затем отбирались по способности выделять белок Баррьер, при этом были обнаружены две колонии, которые несут ген, обеспечивающий независимость от лейцина, так и способность выделять белок Баррьер. Эти колонии несут плазмиды, обозначенные как рВАR2 и рВАRЗ.
Плазмидная ДНК, выделенная из этих двух трансформантов, использовалась для транс-формации штамма Е.соli R-RI (АТСС # 31343). Трансформанты были отобраны на стойкость к ампициллину. Плазмиды рВАR-2 и РВАR-3 были очищены из трансформантов Е.соli и были охарактеризованы путем обработки рестрикционной эндонуклеазой и путем электрофореза на агарозных или акриламидных гелях. Плазмида рВАR2, как установлено, включает вставку примерно 9,2 kb. Культура Е.соli RR1, трансформированная плазмидой рВАR2, была сдана на хранение в коллекцию АТСС, где находится под номером 39410.
Субклонирование показало, что плазмидная вставка рВАRЗ содержит часть вставки рВАR2, но ориентирована в данном векторе в противоположном направлении. Дальнейшее субклонирование и отбор на секрецию Баррьер позволили выявить функциональную генную последовательность ВАR1 до области примерно 2,75 kb. Этот фрагмент включает кодирую-щую последовательность, не транслируемые, но транскрибируемые последовательности, промотор, регуляторные области, концевой терминатор транскрипции и боковые хромосом-ные последовательности.
Плазмида рВАR2 обрабатывалась рестрикционными эндуклеазами Нind III и Хho I и фрагмент примерно 3 kb очищался путем электрофореза на агарозном геле. Этот фрагмент был вставлен в плазмиду рUС13, которая была гидролизована Hind III и Sal 1. Полученная рекомбинантная плазмида, обозначенная как рZV (фиг. 3) могла использоваться для транс-формации Е.соli, но в ней отсутствовал необходимый источник репликации и селективный маркерный ген для дрожжевого вектора. Данная плазмида рZV9 в штамме Е.соli RRI была сдана на хранение в коллекцию АТСС, где хранится под номером 53283.
Из гена ВАR1, служащего для направления секреции проинсулина, использовались фрагменты, включающие регуляторную область 5' и часть кодирующей последовательности. Слияние ВАR1 фрагментов и гена проинсулина осуществлялось в соответствующей рамке считывания в точке ВАR1 последовательности, в которой полученный полипептид слияния может быть расщеплен, в условиях in vivo. Некоторые точки гена являются точками возмож-ного расщепления; Агg-Агg в положении 177 - 178 была выбрана как испытательная точка слияния с проинсулином. Согласно этому регуляторные 5' последовательности и кодирую-щей последовательности ВАR1 размером примерно 800 bp были очищены от плазмиды рZV9, как Hind III-Sal I фрагмент размером 1,9 kb.
Фиг. 5 иллюстрирует способ субклонирования с ДНК человеческого препоинсулина с ДНК человеческого препроинсулина (клон ргеВСА), р27, получается путем С-гидролиза плазмиды рВRЗ27, обработанной Рst I и вставки С-разрезанной ДНК, полученной путем об-ратной транскрипции общей ДНК из поджелудочной железы человека. Плазмида рВR327 была описана в работе "Sobeгоn еt аl.Gеnе", 9, 287 - 305, 1980 и последовательность человече-ского препроинсулина - в работе "Веll еt аl.", Naturе, 232, 525 527, 1979. Полная транслиро-ванная последовательность была выделена на Nсо I -Нga I фрагменте. Выступающие концы были дополнены ДНК- полимеразой I (фрагмент Кленова) и одновременно были присоеди-нены синтезированные связывающие звенья Есо R1 (GGААТТСС), связывающие звенья Хbа I (CТСТАGАG). Данный фрагмент был субклонирован в рUС13 (Vieiга аnd Мessing, Gene, 19, 259 268, 1982; аnd Messing, Меthods in Еnzimology 101, 20 -77, 1983), который был обработан Есо RI и Хbа I. Поскольку ввод связывающего звена Есо RI в 5' концевом положении восста-навливает точку Nco I (ССАТGG) в кодоне инициирования, то плазмиды отбирались на наличие точек Есо RI, Nco I и Хbа I, граничащих с вставкой 340 bр. Плазмида, обладающая такими свойствами, носит название р47, как показано -на фиг. 4. Фрагмент проинсулина (ВСА) с затупленной 5' концевой частью образован в ходе синтеза предшественника (описан-ного в работе Lawn еt аl., Nuc. Асids Res., 9, 6103 6114, 1981) плазмиды р47. Последующая обработка Xbа I приводит к образовано фрагмента 270 bр, который вставлен в рUС12 (Vieiга аnd Меssing, ibid аnd1 Меssing, ibid). Данный вектор получен путем гидролиза Hind III, затуп-ления концов ДНК полимеразой I (фрагмент Кленова), а также путем обработки Xbа I и геле-вой очистки. Полученный в результате векторный фрагмент, включающий затупленный ко-нец и клейкий конец Xbа I, был лигирован с описанным выше фрагментом ВСА. Поскольку созревший ВСА начинается с фенилаланина (кодон III), то лигирование затупленного конца данных двух фрагментов восстанавливает Нind III сайт в месте соединения. Плазмиды снача-ла отбирались на выделение сайта Hind III, затем путем секвенирования зоны соединения с использованием М13 в качестве секвенирующего праймера. Плазмида р254 имела коррект-ную последовательность.
Как показано на фиг. 6, плазмиду р254 обрабатывали с помощью Нind III и Есо RI, а фрагмент проинсулина, составляющий примерно 270 bр, подвергали гелевой очистке. Концы данного фрагмента затуплялись с использованием ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова) и деоксинуклеотидтрифосфатов.
Последовательности связывающего звена Sal I (GGТGGАGG) обрабатывались Т4 поли-нуклеотидкиназой и γ-32 Р-АТР и лигировались с затупленнным у конца фрагментом гена проинсулина. После обработки Sal I и Ваm НI осуществлялся электрофорез на 1,5 %-ном ага-розном геле, в результате чего получался фрагмент проинсулина с когезивными концами Sal I и Ваm НI.
Фрагмент проинсулина и фрагмент ВАR1 размером 1,9 kb лигировали с рUС13, кото-рый обрабатывался с Нind III и Ваm I. Эта конструкция использовалась для трансформации Еcoli К12 (JМ83).
Трансформированные клетки отбирались на стойкость к ампициллину и продуцирова-нию белых колоний. Дополнительный отбор путем обработки с помощью рестрикционных эндонуклеаз с использованием Hind III, Ваm НI и Sal I обнаружил плазмиду (рZV27), содер-жащую фрагмент Нind III - Ваm НI нужного размера и единственную точку Sal I.
Для того, чтобы пришить первую аминокислоту проинсуллина к потенциальной точке обработки генного продукта ВАR1 Агg-Агg, осуществлялось удаление материала, располо-женного в зоне слияния ВАR1-проинсулина, при этом использовали синтетический олиго-нуклеотид для направленного ввода мутации.
Как показано на фиг. 6 плазмиду рZV27 обрабатывали с помощью Нind III и Ваm НI и фрагмент слияния БАR1-проинсулин подвергали головой очистке. Этот фрагмент затем был вставлен в репликационную форму вектора фага М13mр11 (Messing, Меthods iп Еnzуmology, 101, 20 77, 1983), который обрабатывался Нind III и Ваm НI.
Данная рекомбинантная ДНК использовалась для трансфекции Е.соli К12 (JМ103) (Меssing, ibid). Были выбраны белые пятна и рестрикционные формы рекомбинантного фага отбирались на основании правильных рестрикционных структур путем двукратной обработ-ки ферментов с использование Нind III + Sal и Sal I + Ваm НI. Конструкция, показывающая желаемую структуру, представляет собой mр11-ZV29. Олигонуклеотидный праймер (после-довательность: 3' GGАТСТТСТАААСАСТТG 5') метился с использованием у-32Р-АТР и Т4- полинуклеотидкиназы. 7,5 пмоль праймера киназы смешивали с 80 мг секвенированного праймера М13 (Веthеsda Research Laboratories, Inс.). Эта смесь аннелировалась с 2 мкг одно-ниточной mр11-ZV29 и вторая нить строилась с использованием Т4 ДНК лигазы и ДНК по-лимеразы 1 (фрагмент Кленова), как описано для направленного олигонуклеотидом мутаге-неза (двухпраймерного метода) Zoller еt аl (Маnual fоr Аdvаnсеd Тесhniques in Моleculаг Clon-ing Соurse, Соld Spring Нагbог Lаbогаtогу, 1983).
ДНК, полученная таким образом, использовалась для трансфекции Есоli К12 (JM103) и отбирались колонии, используемые в качестве пробы содержащего киназу олигомера (Zollег еt аl., ibid). Идентифицированные таким образом колонии использовались для приготовления ДНК репликационной формы фага (RF) (Меssing, ibid).
Обработка с помощью рестрикционного фермента (RF) ДНК обнаруживала два клона, имеющих подходящую рестрикционную структуру Хbа I (фрагменты 7,5 kb), 0,81 kb и 0,65 kb), отсутствие сайта рестрикции Sal I (который присутствует в зоне делении слияния ВАR1-проинсулин).
RF ДНК от этих двух клонов обрабатывались Нind III и Ваm НI и фрагмент слияния 1,9 kb от каждого был подвергнут головой очистке. Эти фрагменты пришивались к векторам рUС13 и YEр13 (Вгоасh еt аl., Gеnе,8, 121 - 133, 1979), которые были обработаны с Нind III и Ваm НI. Гибридные плазмиды рUС/ВАR1-проинсулин для секвенирования трансформирова-лись в Е.соli К12 (JM83). Обе эти плазмиды были обозначены рZVЗ1 и рZVЗЗ. Рекомбинанты YEр13 используют для трансформации Е.соli RRI (Nasmyth аmd Reed, Ргос. Nat. Асаd. Sсi., USА, 77, 2119 - 2123, 1980). Две из этих плазмид были обозначены, как рZV30 и рZVЗ1 (фиг. 4).
Секвенирование рZVЗ2 и рZVЗЗ осуществлялось способом Махаm и Gilbert (Меthids in Еbsimologyу, 65, 57, 1980). Последовательность слияния ВАR1-проинсулина начиналась от сайта Вg1 II, расположенного примерно у 190 bp, и продолжалась до 5' конца места соедине-ния; и начиналась от сайта Sau 961, расположенного примерно у 140 bp и продолжалась до 3' конца места соединения (в проинсулиновом гене). Данные этих экспериментов подтвердили, что получена желаемая конструкция путем слияния между ВАR1 и проинсулиновыми генами.
Штамм S.сегеvisiае ХР635-10С трансформировался плазмидами рZVЗО и рZVЗ1. Один литр культуры выращивался в стандартной дрожжевой синтетической среде, в которой от-сутствовал лейцин. По прошествии 34 ч в 10-мл аликвоту каждой культуры вводили альфа-фактор. Спустя дополнительных 11 ч культуры собирали путем центрифугирования. Клеточ-ные гранулы и насадочная жидкость (после центрифугирования) подвергались анализу на присутствие инсулина или аналогичного инсулину материала. Результаты двух таких анали-зов надосадочной
жидкости культуры, трансформированной плазмидой рZVЗ1, показали наличие 3 пмоль IRI на мл питательной среды разведения и 5,8 пмоль IRС на мл питательной среды разведения. IRI содержал инсулин, проинсулин или продукты их разложения. IRС был свободен от С-пептида и содержал проинсулин или продукты его разложения.
Пример 2. Экспрессия проинсулина в S.сегеvisiае с использованием промотора алко-гольдегидрогеназы I, гена ВАR1 и терминатора триозофосфатизомеразы.
Промотор алкогольдегидрогеназы I S. сегеvisiае (далее будет называться промотор АDHI; известен также как промотор АDС1) анализировался на возможность использования для экспрессии чужеродных полипептидов в сочетании с последоватeльностями ВАR1. При этом была построена плазмида, включающая эти последовательности. Плазмида рZV50 (фиг. 8) включает промотор S.сtrtvisiае АDН1, описанное выше слияние ВАR1 - проинсулин и об-ласть терминатора гена S.сегеvisiае триозофосфатизомеразы (ТРI1) (Аlbег аnd Каwаsаki, J. Моlес. Аррl. Gепеt., 1, 419 -434, 1982). Она была построена следующим образом. Как показано на фиг. 7, плазмида pАH5 (Аmmегег, ibid) обрабатывалась с помощью Hind III и Ваm НI и фрагмент промотора АDНI 1,5 kb подвергался гелевой очистке. Этот фрагмент вместе с по-лилинкерным фрагментом Hind III - Есо RI от рUС13 вставлялся в плазмиду рВК-327, обра-ботанную Есо RI, Ваm НI с использованием лигазы ДНК Т4. Полученная плазмида, обозна-ченная как рАМ5, гидроли- зовалась с Sрh I и Хbа 1, и фрагмент промотора АDНI примерно 0,5 kb очищался на 2 %-ном агарозном геле. Плазмида рZV9 обрабатывалась с Хbа I и фраг-мент ВАR1 примерно 2 kb, содержащий всю кодирующую область ВАR1., подвергался ана-логичной гeлeвой очистке.
Эти два фрагмента, АDНI промотор и последовательность ВАR1 сшивались с YЕр13, обработанной Хbа I, Sрh I, в результате чего получалась плазмида рZV24. Обработка рZV24 с Sрh I и Вq1 II с последующей головой очисткой приводила к образованию слияния промото-ра ADНI-ВАR1 примерно 800 bр, которое содержало кодон начала транcляции АТG, но в котором отсутствовали кодоны для Агg-Агg сайт возможного процессинга. Плазмида рZVЗЗ, содержащая слияние ВАR1-проинсулин, обрабатывалась Вq1 II и Хbа I, и фрагмент слияния (примерно 500 bp), который включал кодоны для Агg-Агg, подвергался очистке.
Как показано на фиг. 9, терминатор ТРI1 был получен из плазмиды рFGI (А1bег аnd Каwasaki, ibid). Плазмиду рFG1 обрабатывали Есо RI, концы линеаризованной плазмиды за-туплялись с использованием ДНК полимеразы 1 (фрагмента Кленова) и вводились последо-вательности линкера Ваv НI (СGGАТССА). Данный фрагмент обрабаты- вался Ваm НI, и снова сшивался с образованием плазмиды р136. Терминатор ТРI1 700 bp очищался от р136 как фрагмент Хbа I-Ваm НI. Данный фрагмент вставлялся в YPр13, гидролизованную с Хbа I и Ваm НI, который затем обрабатывался Нind III, края затуплялись с использованием ДНК полимеразы I (фрагмента Кленова), и снова сшивались, образуя плазмиду р270. Терминатор ТРI1 очищался от р270 как фрагмент Хbа I-Ваm Н1 и вставлялся в рUС13, обработанную Хbа I, Ваm НI, в результате чего получалась плазмида m115.
Как показано на фиг. 8, терминатор ТРI1 удалялся из плазмиды m115 путем обработки с Хbм I и Sst I с последующей гелевой очисткой. Три фрагмента - фрагмент слияния ADHI-ВАR 1, фрагмент слияния ВАR1-проин- сулин и концевая части ТРI1 – вставлялись в плаз-миду рUС18 (Nогrаndег еt аl., Genе 26: 101 106, 1983), которая была обработана Sрh I и Sst 5811. Данная ДНК была использована для трансформации Е. соli К12 (JМ83). Отбор на устой-чивость к ампициллину и отбор на продуцирование белых колоний обнаружили плазмиду рZV45, содержащую желаемые вставки. Плазмида рZV45 далее гидролизовалась Sрh I и Ваm НI, и последовательность АDHI-ВАR1-проинсулин-терминатор ТРI подвергалась гелевой очистке. Этот фрагмент вставлялся в YЕр13, которая обрабатывалась Sрh I и Ваm НI, в ре-зультате чего получался вектор экспрессии S.сегеvisiae1ае pZV50.
Штамм S.сегеvisiае ХР635-10С трансформировался плазмидой рZV50 и культивировал-ся, а затем анализировался, как описано в примере 1. В среде разведения не было обнаружено никакого материала IRI и было обнаружено менее чем 0,5 пмоль IRC на мл. Клетки, экстра-гированные 0,1%, Monidet Р-40, показали присутствие IRC материала с концентрацией 1 пмоль на мл клеточного экстракта.
Пример 3. Экспрессия проинсулина в Schizosaccharjmyces роmbе и использованием гена ВАR1 и промотора алкогольдепадрогеназы S.роmbе.
На данном примере демонстрируется использование фрагментов гена ВАR1 для направления секреции чужеродных полипептидов, экспрессированных в трансформирован-ном хозяине Schizosaccharjmyces роmbе. При этом была построена плазмида, которая сочетает промотор (АDН) алкогольдегидрогеназы S. роmbе с геном слияния ВАR1 -проинсулин.
Промотор АDН S.роmbе был получен из библиотеки фрагментов ДНК, образованных от штамма S.роmbе 972h- (АТСС 24843), которые были клонированы в YЕр13, как описано в работе Russel аnd Hall (J. Вiоl. Сhem., 258, 143-149, 1983). Данная промоторная последова-тельность была выделена из библиотеки как фрагмент SрhI -Есо RI 0,7 5 kb. Этот фрагмент и фрагмент многозвенного линкера Есо RI-Hind III плазмиды рUС12 были вшиты в YЕр13, которая обрабатывалась Shр I и Hind III. Полученная плазмида известна как рЕVР-11.
Как показано на фиг. 10, иллюстрирующей построение вектора экспрессии S.роmbe, промотор АDН очищали от рЕVР-11 как фрагмент Sрh I-Хbа I. Плазмида рZVЗЗ выварива-лась с Хbа I и Вg1 II, и фрагмент ВАR1 примерно 340 bp, который включал инициирующий кодой АТG, подвергался очистке, рZVЗЗ обрабатывался с Вgl II и Sst I, и последовательность слияния ВАR1-проинсулин подвергалась очистке. Эти три фрагмента комбинировались с рUС18, гидролизованной Sрh I, Sst I, в результате чего получалась плазмида рZV46. По-скольку рUC18 неэффективна для трансформации S.роmbе, то данная плазмида подвергалась двум обработкам ферментами. Фрагмент слияния АDН промотор-ВАR1 очищался от Hind 111-Вg1 II-фрагмента и последовательность слияния ВАR1-проинсулин очищалась от Вgl II-Хbа I фрагмента. Эти фрагменты вставлялись в YЕр13, обработанную Hind III, Хbа I, в ре-зультате чего получался вектор экспрессии рZV49 в S. роmbе.
Один литр культуры трансформированного штамма S. роmbе 118-4h- (АТСС #20680) выращивали в течение 36 ч при 30°С в стандартной синтетической дрожжевой среде (-leu D), содержащей 200 мг/л аспаргиновой кислоты и по 100 мг/л гистидина, аденина и урацила. Культуры собирали путем центрифугирования и надосадочную жидкость анализировали на IRI и IRC. Две пробы трансформированных рет49 клеток содержали 1,6 пмоль/мл материала IRI и 0,5 пмоль/мл IRС-активного материала соответственно. Контрольная проба от культу-ры, трансформированной YЕр13, не показала наличия IRС-активного материала.
Пример 4. Выделение альфа-фактора с использованием сигнального пептида ВАR1.
Сигнальный пептид ВАR1 подвергался анализу на определение способности выделять альфа-фактор из дрожжевого трансформанта. При этом было построено несколько плазмид, содержащих фрагменты ДНК, кодирующие белки слияния с различной длиной белка ВАR1, и 1 или 4 копии созревшего альфа- фактора. Эти плазмиды трансформировались в штамм а/α-диплоидного хозяина, а трансформанты анализировались на продуцирование альфа- фактора по наличию ореола.
Плазмиды рSW94, рSW95, рSW96 и рSW97 включают промотор триозофосфатизомера-зы (ТРI1) S.сегеvisiaе, фрагмент 355 bр или 767 bр гена ВАR1 (содержащего 114 или 251 ко-донов 5' конца кодирующей последовательности БАR11 соответственно) и либо одну, либо четыре копии кодирующей последовательности альфа-фактора (МFα1). Эти конструкции приводятся в табл. 1.
Плазмида рМ220 (известная также как рМ210) использовалась как источник фрагмента стимулятора ТРI1. Е.соli RRI, трансформированная плазмидой рМ220, была депонирована в коллекции АТСС, где находится под номером 39853. Плазмида рМ220 обрабатывалась Есо R1, и фрагмент 0,9 kb, включающий промотор ТРI1, был выделен путем электрофореза на агарозном геле, и края его были затуплены ДНК полимеразой I (фрагментом Кленова). Со-держащие киназу линкеры Хbа I встраивались в данный фрагмент, который затем обрабаты-вался с Вgl II и Хbа I. Этот фрагмент модифицированного промотора ТРI1 затем встраивался в векторный фрагмент 3,4 kb ВgI II-Хbа I плазмиды рDR1107, в результате чего получалась рZV118. Плазмида рDR1107 была построена путем субклонирования фрагмента промотора ТРI1 900 bр. Вgl II-Есо R1 плазмиды рМ220 в рIС7 (Магsh, Егflе аnd Wykes, Gеnе, 32, 481 - 485, 1984), в результате чего образуется плазмида рDR1101. Плазмида рDR1101 была обрабо-тана Нind III и Sрh I для выделения фрагмента промотора ТРI1 700 bр. Плазмида pDR1100, включающая фрагмент терминато- ра размером 800 bр Хbа I-Ваm НI, плазмиды рМ220, суб-клонированный в рUС18, гидролизовалась Hind III и Sрh I. Частичный фрагмент промотора ТРI1 700 bр встраивался в линеаризованную рDR1100, и в результате получалась рDR1107. Затем сайт Есо RI на 3' конце промотора ТPI1 в плазмиде рZV118 застраивают. Данную плаз-миду обрабатывают Нind III и Есо RI, и фрагмент 0,9 kb выделяют и сшивают с синтетиче-ским линкером, полученным путем слияния олигонуклеотидов ZС708 (5’ ААТТGCТСGАGТ 3' и ZС709 (3' СGАGСТСАGАТС 5'). Ввод этого линкера убирает сайт Есо RI на 3' концевой части фрагмента промотора ТРI1 и вводит сайты ХhoI и Хbа I. Затем данный фрагмент при-соединяется к рUС13, а Hind III-Хbа I фрагмент вырезается. Образованная плазмида обозна-чается как рZV134 (фиг. 11).
Клонирование гена альфа-фактора (МF α1) дрожжевого спаривающего феромона было описано Кurjan и Негskowitz (ibid). Этот ген был выделен в данной лаборатории из дрожже-вой геномной библиотеки частичной обработкой фрагментов Sau 3А, клонированных в точку Ваm НI вектора YЕр13 (Nasmyth and Таtchell, Сеll, 19, 753 - 764, 1980). Из этой библиотеки была выделена плазмида, которая экспрессировала альфа-фактор в диплоидном штамме гомо-зиготных дрожжей с мутацией matα-34 (Маnnеу еt аl., J. Сеll. Вiol., 96, 1592, 1983). Клон, со-держащий вставку, охватываемую геном МFα1, был охарактеризован Кurjan и Негskowitz. Данную плазмиду, известную как рZA2, обрабатывали Есо RI, и фрагмент 1,7 kb, содержа-щий МFα1, был выделен и встроен в Есо RI сайт плазмиды рUС13. Полученная плазмида, обозначенная как р192, расщеплялась Есо RI, и образующийся фрагмент МFα1 1,7 kb выделен и обработан Мbо II. Фрагмент Мbо II-Есо RI размером 550 bр был выделен и сшит с содер-жащими киназу линкерами Sаl I. Этот сшитый фрагмент был обработан Sаl I. Полученный фрагмент Sаl I размером 0,3 kb встроен в сайт Sаl I плазмиды рUС4 (Vieга апd Меssing, Genе, 19, 259-268, 1982) и в результате получалась плазмида, обозначенная как р489 (фиг. 12).
Затем было построено слияние гена,включающее части ВАR1 (114 кодонов) и кодиру-ющей последовательности МFα1. Плазмида рSV24 (пример 2) обрабатывалась с Sрh I и Вg1 II, был выделен фрагмент промотор ADHI-ВАR 1 размером 0,8 kb. Плазмида р489 расщепля-лась Ваm НI и выделялся фрагмент МFα1 размером 0,3 kb. Эти два фрагмента сшиты Sрh I-Ваm НI, фрагментом YЕр13. Полученная плазмида обозначена как рZV69 (фиг. 14).
Затем был построен второй ген слияния, кодирующий 251 аминокислоту Баррьер, свя-занный с частью предшественника альфа-фактора. Плазмида рZV16, включающая фрагмент Хbа I-Sаl I с ВАR1 размером 767 bp плазмиды рZV9 (пример 1) .сшитый с вырезом Хbа I-Sаl I, фрагментом рUС13 линеаризовалась с Sаl I. Этот фрагмент размером 4,0 kb соединялся с Sаl I фрагментом р489 размером 0,3 kb, кодирующим четыре копии альфа- фактора. Плазми-да, включающая слияние ВАR1-МFα1 в правильной ориентации, обозначена как рZV71. Слияние ВАR1-МFα1 от рZ71 затем было соединено с промотором АDНI. Плазмиду рZV71 обрабатывали Хbа I и Рst I и выделяли фрагмент размером 1,07 kb. Промотор АDНI был вы-делен на фрагменте Sрh I-Хbа I размером 0,42 kb из рZV24. Эти два фрагмента были соеди-нены с фрагментом Sрh I-Рst I рUС18. Полученная в результате плазмида рZV73 обрабатыва-лась Sрh I и Ваm HI и фрагмент 1,5 kb, включающий данную единицу экспрессии, был выде-лен и лигирован с фрагментом Sрh I-Ваm НI, плазмиды YEр13, образуя рZV75 (фиг. 13).
Для облегчения фрагменты слияния ВАR1-МFα1 из рZV69 и рZV75 были субклониро-ваны с промотором ТРI1 в рUС18 (фиг. 11). Плазмида рZV69 обрабатывалась Есо R1 и Ваm НI и был выделен фрагмент размером 0,55 kb, содержащий данное слияние. Фрагмент промо-тора 0,9 kb ТРI1 был выделен из рZV118 путем обработки Нind III и Есо R1. Сшитый из трех частей фрагмент был получен с использованием ВАR1-МFα1 фрагмента размером 0,55 kb, ТРI1 фрагмента размером 0,9 kb и рUС19, обработанной Hind III и Ваm НI. Полученная в результате плазмида была обозначена как рSW59. Плазмида рZV75 обрабатывалась Есо RI и Ваm НI, в результате чего выделялся фрагмент слияния ВАR1-МFα1 размером 954 bр. Этот фрагмент ВАR1-МFα1 был лигирован с фрагментом промотора ТРI1 Нind III+Есо RI разме-ром 0,9 kb с образованием лигированного фрагмента, состоящего из трех частей, и рUС18 обрабатывалась Нind III и Ваm НI , образуя плазмиду рSW60.
При построении плазмид экспрессии источником 5' 116 bр кодирующей последователь-ности ВАR1 являлась рSW11, которая была построена следующим образом (фиг. 15). Коди-рующая область ВАR1 в рSW22 происходит от рZV9. Плазмида рZV9 (пример 1) обрабаты-валась Sаl I и Ваm НI, в результате чего был выделен ВАR1 фрагмент размером 1,3 kb. Этот фрагмент лигировали Sаl и Ваm Нi рUС13, в результате чего образовалась плазмида, обозна-ченная как рZV17. Плазмида рZV17 обрабатывалась Есо RI, в результате чего удалялась не-большая 3' часть в кодирующей последовательности ВАR1 размером 0,5 kb. Векторный ВАR1 фрагмент снова сшивался, образуя плазмиду, обозначенную как рJН66. Плазмида рJН66 линеаризовалась Есо RI и затуплялась фрагментом Кленова. Затем вводили содержа-щие киназу линкеры Ваm НI (5’ ССGGАТССGG3') и избыточные линкеры удалялись путем обработки Ваm НI. Полученная плазмида, рSW8, обрабатывалась Sаl I и Ваm НI, и в резуль-тате был выделен
фрагмент размером 824 bp, кодирующий аминокислоты 252 - 525 ВАR. Данный фрагмент ВАR1 сшивался с фрагментом, кодирующим С-концевую часть вещества Р (Мurno аnd1 Реl-ham, ЕМВО J., 3, 3087 3093, 1984). Плазмида рРМ2, содержащая синтетическую олигонуклео-тидную последовательность, кодирующую димерную форму вещества Р в М13mр8, была по-лучена от Мurnо и Реlham.
Плазмида рРМ2 была обработана Ваm НI и Sаl I и сшивалась с фрагментом ВАR1 раз-мером 824 bр. Полученная в результате плазмида рSW14 обрабатывалась Sаl I и Sma I, в ре-зультате чего выделялся фрагмент ВАR1 - вещество Р размером 871 bр. Плазмида рZV16 (фиг. 10) обрабатывалась Хbа I и Sаl I и в результате выделялась 5' кодирующая последова-тельность фрагмента ВАR1 размером 767 bр. Этот фрагмент был сшит вместе с фрагментом ВАR1 – вещество Р размером 871 bр плазмиды рUС18, обработанной Хbа I и Smа I, образуя лигированный фрагмент из трех частей. Полученная плазмида была обозначена как рSW15. Плазмида рSW15 обрабатывалась Хbа I и Smа I, в результате чего выделялся фрагмент ВАR 1 -вещество Р размером 1,64 kb. Был получен промотор АDHI рRL029, включающий фраг-мент Sрh I, Есо RI размером 0,54 kb, содержащий промотор АDНI и 5' кодирующую зону ВАR1 рZV24 размером 116 bр в рUС18. Плазмида рRL029 обрабатывалась Sрh I и Хbа I, в результате чего был выделен фрагмент промотора 0,42 kb АDНI. Терминатор ТРI1 (Аlbег аnd Каwаsаki, J. Моl. Аррl. Gеn., 1, 419 - 434, 1982) выделялся как фрагмент Хbа I – Есо RI разме-ром 0,7 kb из рUС18. Данный линеаризованный фрагмент, содержащий терминатор ТРI1 и Хbа I-Sрh I рUС18 и фрагмент Кленова, сшивался с фрагментом промотора АDНI размером 0,42 kb и с фрагментом ВАR1-вещество Р размером 1,64 kb рекомбинантного фрагмента, со-стоящего из трех частей, образуя плазмиду РSW22.
Затем была построена плазмида pSW94 (фиг. 16). Фрагмент размером 2,3 kb, содержа-щий слияние ВАR 1 -вещество Р и терминатор ТРI1, был выделен из плазмиды рSW22 как фрагмент Хbа I-Sst I.
Нind III-Хbа I фрагмент промотора ТРI1, выделенный из рZV134, соединялся с фраг-ментом ВАR 1 -вещество Р – концевая часть ТРI1 путем сшивки трех частей рUС18, Hind III-Sst I фрагментом рUC18. Полученная плазмида рSW81 разщеплялась Hind III и Есо RI и в результате выделялся фрагмент размером 1,02 kb, содержащий промотор ТРI1 и 5' фрагмент ВАR1 размером 116 bр. Плазмида рSW59 обрабатывалась Есо R1 и Ваm НI, в результате чего выделялся фрагмент слияния ВАR1-МFα1 размером 0,55 kb. Данный фрагмент затем сшивал-ся тремя
фрагментами: ТРI1 промотор ВАR1 из рSW81 и YEр13, которую предварительно обработали Нind III и Ваm НI, образуя в результате плазмиду рSW94.
Конструкция плазмиды рSW95 иллюстрируется на фиг. 16. Плазмида рSW60 обрабаты-валась Есо RI и Ваm НI, в результате чего выделен фрагмент слияния ВАR1-МFα1 размером 954 kb. Плазмида рSW81 обрабатывалась Нind III и Есо RI, и в результате выделялся фраг-мент промотора ТРI1-ВАR размером 1,02 kb, который соединялся с фрагментом ВАR1-МFα1 в результате сшивки трех частей с фрагментом Hind III-Ваm НI плазмиды YEр13. Получен-ная плазмида была названа рSW95.
Конструкция фрагментов слияния стимулятор ТРI1- ВАR1-МFα1, содержащая лишь од-ну копию альфа-фактора, была образована от слияний ВАR1-МFα1 (кодирующих четыре ко-пии альфа- фактора), которые содержали промотор ТРI1 и препоследовательность МFα1 (фиг. 17 19). Плазмида рZV16 обрабатывалась Есо RI и Sаl I. Выделенный фрагмент ВАR1 разме-ром 651 bр встраивался вместе с содержащим киназу специфическим адаптером Нind III-Есо RI ВАR1 (получен путем слияния олигонуклеотида ZС566: 5'АGGТТТААСАААСGАТGGСАСТGGТСАСТТАG3' и олигонуклеотида ZС567:
5’ААТТСТААGТGАССАGТGССАТСGТТТGТТАА3') с Нind III-Sаl I фрагментом рUС13. По-лученная плазмида рZV96 обрабатывалась Нind III и Sаl I, в результате чего выделялся фраг-мент ВАR1 размером 684 bр. Плазмида рМ220 содержала промотор ТРI1 слитый с препосле-довательностью МFα1. Плазмида рМ220 обрабатывались Вgl II и Нind III, в результате чего получали фрагмент промотора ТРI1 - препро МFα1 размером 1,2 kb.3' часть зоны кодирую-щей
ВАR1 получалась в результате обработки Sаl I и Ваm НI плазмиды рZV9, в результате чего был выделен фрагмент ВАR1 размером 1,3 kb. Нind III-Sаl I ВАR1 фрагмент размером 684 bр промотор ТРI1 [Вgl II-Нind III] - препро МFα1 размером 1,2 kb и фрагмент Sаl I-Ваm НI- ВАRI (1,3 kb) встраивались в YEр13 на линеаризованной Ваm НI путем лигирования четы-рех частей. Данная конструкция с желаемой ориентацией промотора и слиянием МG α 1-ВАR1 была обозначена как рZV100 (фиг. 17).
Для облегчения обработки усеченный фрагмент слияния препропоследовательность МFα1-BAR1 от плазмиды рZV100 субклонировался в рUС13 как фрагмент Рst I-Ваm НI (1,6 kb). Полученная плазмида рZV101 обрабатывалась Рst I и Есо RI, в результате чего был вы-делен фрагмент препро МFα1-BAR1 размером 270 kb. Плазмиду рZV69 обрабатывали Есо RI и Ваm НI, в результате чего был выделен фрагмент слияния ВАR1- МFα1 (кодирующий че-тыре копии альфа-фактора) (0,55 kb). Этот фрагмент и фрагмент препро МFα1-BAR1 (270 kb) лигировался с Рst I - Ваm НI фрагментом рUС13. Образующаяся плазмида была обозначена как рZV102 (фиг. 18).
Затем было построено звено экспрессии, включающее промотор ТРI1, часть ВАR 1 и единственную копию кодирующей последовательности альфа-фактора (фиг. 16). Плазмида рZV102 была обработана Рst I и Ваm НI, в результате чего был получен фрагмент препро МFα1-BAR1 (0,82 kb). Нind III-Рst I фрагмент (1,0 kb), включающий промотор ТРI1 и усечен-ную препропоследовательность МFα1 от рМ220, был соединен вместе с фрагментом препро МF α1-BAR1 (0,82 kb), выделенным из рZV102 путем лигирования с YEp13, обработанной Нind III и Ваm НI. Образованная плазмида была обозначена как рZV105. Плазмиду рZV105 гидролизовали Hind III с выделением фрагмента промотор ТРI1-препро МFα1 (1,2 kb). Плаз-мида рZV102 обрабатывалась Нind III, в результате чего выделялся векторный фрагмент, со-держащий концевую копию альфа- фактора. Этот фрагмент вектор - МFα1 (2,8 kb) был сшит с фрагментом промотор ТРI1-препро МFα1 (1,2 kb). Данная плазмида с правильной ориентаци-ей и единственной копией кодирующей последовательности МFα1 была обозначена как рSW61. Плазмида рSW61 линеаризировалась путем частичного гидролиза Hind III. Плазмида рZV102 была обработана Hind III, в результате чего был выделен фрагмент BAR1 -МFα1 (0,3 kb). Этот фрагмент был встроен в рSW61. Данная плазмида с указанной вставкой в Нind III (284 bp) в правильной ориентации в 3' к начальному кодону МF α 1 была обозначена как рSW70. Плазмида рSW70 обрабатывалась Есо RI и Ваm НI, и в результате был выделен фраг-мент ВАR1- МFα1 размером 361 bр. Плазмида рSW81 (фиг.16) обрабатывалась Нind III и Есо RI, и в результате был выделен фрагмент промотор ТРI1-BAR1 размером 1,02 kb. Этот фраг-мент был слит с фрагментом ВАR1-МFα1 путем лигирования трех частей с YЕр13, обрабо-танной Нind III и Ваm НI. Полученная плазмида рSW96 содержит промотор ТРI1 и 5' коди-рующую последовательность ВАR1 (356 bр), слитой с одной копией кодирующей последова-тельности альфа- фактора.
Вторая конструкция ВАR1- МFα1, содержащая фрагмент ВАR1 (767 bр), слитый с одной копией кодирующей последовательности МFα1, была получена с использованием рZV75 в качестве источника фрагмента ВАR1 (фиг. 20). Плазмида рZV75 обрабатывалась с Есо RI -и Ваm НI, в результате чего был выделен фрагмент ВАR1- МFα1 (размером 954 bр). Плазмида рZV101, содержащая препропоследовательность МFα1, слитую с ВАR1, oбрабатывалась Рst I и Есо RI, в результате чего был выделен фрагмент препро МFα1-ВАRI (0,27 kb). Этот фраг-мент был соединен с фрагментом ВАR- МFα1 (954 bp), в результате лигирования в виде сшивки, состоящей из трех частей с рUС13, обработанной с Рst I и Ваm НI. Полученная плаз-мида рZVУ104 была обработана Нind III, в результате чего был выделен фрагмент ВАR1- МFα1 (0,70 kb). Этот фрагмент был встроен в рSW61, которая была линеаризована в резуль-тате обработки Нind III. Данная плазмида со вставкой в Нind III в правильной ориентации (264 bр) к 3'- начальному кодону МFα1 была обозначена как рSW74. Плазмида рSW74 была обработана Есо RI и Ваm НI, в результате чего был получен фрагмент ВАR1- МFα1 (738 bр). Плазмида рSW81 была обработана Нind III и Есо R1 и в результате был выделен фрагмент промотор ТРI1-ВАR1 размером 1,02 kb. Этот фрагмент был лигирован с фрагментом ВАR1- МFα1 (738 bр) в результате сшивки трех частей с фрагментом Hind III - Ваm YЕр13. Полу-ченная плазмида рSW97 включает промотор ТРI1 и 5' конец ВАR1 (767 bр), слитый с един-ственной копией кодирующей последовательности альфа- фактора.
Диплоидный штамм а/α S.сегеvisiае ХР733 (МАТа leu2-3 leu2-112 barl-1 gа12/Маtαleu2-3 leu2-112 bаг1-1 gа12) был трансформирован плазмидами рSW73, рSW94 и рSW95. Плазмида р5*/73 включает промотор ТРI1, сигнальный пептид и препропоследовательность МFα и ко-дирующую зону четырех копий альфа- фактора в YЕр13. Данные трансформанты наносились как пятна на культуру клеток S.сегеvisiае RС629 в мягком поверхностном агаровом слое на чашке с селективной средой и инкубировались в течение ночи при 30°С. Сопоставление раз-меров ореолов с использованием рSW73 и контрольной пробы показывает, что рSW94 выде-ляет не менее примерно 15%, количества альфа-фактора кодируемого рSW73.
Конструкции, содержащие ВАR1, слитый с одной копией кодирующей последователь-ности МFα1, анализировали на выделение альфа-фактора таким же образом. Плазмида рSW67, включающая промотор ТРI1, сигнальный пептид МFα1, препро и кодирующую зону одной копии альфа- фактора в YEp13, использовалась как контрольная для плазмид рSW96 и рSW97. Сопоставление размеров ореола показывает, что рSW96 направляет секрецию при-мерно до 30 - 40% количества альфа- фактора рSW67, и рSW97 направляет секрецию пример-но до 10 - 15% количества альфа- фактора рSW67.
Пример 5. Мутация точки расщепления сигнального пептида ВАR1.
Как описывалось выше, установлено, что изменение точки расщепления сигнального пептида предшественника Баррьер может упростить процесс и выделение содержащих Баррь-ер белков слияния по пути КЕХ2.
Возможные точки расщепления находятся между аминокислотами 23 и 24 и между ами-нокислотами 24 и 25. Так, последовательность ДНК, кодирующая первичный продукт транс-ляции ВАR1, мутировали в положении 25, кодирующем пролиновый остаток. Плазмиды рSW98 и рSW99 представляют собой основанные на YЕр13 плазмиды, включающие промо-тор S. сегеvisiае, фрагменты гена ВАR1 (355 bр или 767 bр), включающие точку расщепление точку расщепления сигныьного пептида, и одну копию кодирующей последовательности альфа- фактора.
Мутация последовательности, кодирующей сигнальный пептид была осуществлена стандартными способами мутагенеза в условиях in vitro (Zollег еt аl., Маnual fог Аdvаnсеd Тесhniques in Моlecular Сloning Соuгsе. Соld Sргing Нагbог lаbогаtогу, 1983) с использованием модели фага М13 и синтетического мутагенного олигонуклеотида (последовательность 5'АТТАСТGСТССТАСАААСGАТ3'). Модель фага рSW/54 была построена путем сшивки Sрh I-Есо RI фрагмента плазмиды рSW22 (0,54 kb) с М13mр19, обработанном Sрh I-Есо RI. После мутагенеза, в условиях in vitго, потенциально содержащие мутации фаги отбирались путем гибридизации фага с 32 Р-меченым олигонуклеотидом, содержащим мутацию, и выстраива-лись в последовательность, которая подтверждала наличие мутации. Репликативная форма одного из фатов mZС634-7, содержащая мутацию, была обработана Sрh I и Есо RI и был вы-делен фрагмент (0,54 kb), который был лигирован с Sрh + Есо RI фрагментом. Образованная плазмида, рSW66 (фиг. 21) была обработана Нind III и Хbа I, в результате чего удалялся про-мотор АDНI, и фрагмент, включающий последовательности данного вектора и ВАR1, был сшит с Нind III-Хbа I фрагментом промотора ТРI1 (0,9 kb) плазмиды рZV134. Эта плазмида с промотором ТРI1 и 5'-концом фрагмента ВАR1 (119 bр), включающая мутацию в точке от-щепления сигнального пептида, была обозначена как рSW82.
Как показано на фиг. 21, плазмида рSW82 обрабатывалась Нind III и Есо RI и с Вgl II и Есо RI, и были выделены фрагменты размером 1,02 kb. Фрагмент Нind III-Есо RI плазмиды рSW82 был лигирован с фрагментом Есо RI-Ваm НI плазмиды рSW74 с Нind III-Ваm НI фрагментом YЕр13, образуя рSW99. Фрагмент Вgl II-Есо RI плазмиды рSW82 был лигирован с фрагментом Есо III-Ваm НI (0,30 kb) плазмиды рSW70 и YEp13, обработанной Ваm НI, об-разуя рSW98. Плазмида рSW98 включает промотор ТРI1, 5'-конец последовательности ВАR1, содержащий мутацию (355 bр) и единственную копию кодирующей последовательности аль-фа- фактора. Плазмида рSW99 включает идентичное звено экспрессии, за исключением того, что имеет последовательность ВАR1, содержащую мутацию, размером 767 bр.
Анализ путем измерения ореола показал, что мутация точки расщепления усиливает выделение альфа- фактора при использовании плазмид, кодирующих одну копию альфа- фак-тора. Трансформанты, содержащие рSW98, выводят примерно на 50%, больше альфа- факто-ра, чем трансформанты, содержащие рSW96 (контроль естественного типа).
Пример. Экспрессия рJH39 в дрожжах.
А. Конструирование плазмиды рJНЗ9.
Последовательности ДНК, кодирующие ВАR1, использовали для секреции активатора плазминогена ткани (tРА). Кодирующую ВАR1 последовательность (от -17 до 342), показан-ную на фиг.1 настоящей заявки, лигировали последовательностью ДНК, кодирующей зрелую форму tРА, как описано ниже.
КДНК, кодирующую активатор плазминогена ткани (tРА), получали из плазмиды рDR1296, депонированной в качестве трансформанта Е.соli в коллекции Аmeriсаn Туре Сulturе Соllесtiоn (Rokville, МD) под номером 53347. Плазмида рDR1296 включает промотор ТРI1, tРА кДНК и векторные последовательности рUС19. Терминатор ТРI1 получали в каче-стве фрагмента Хbа I-Ваm НI (0,8 kb) и субклонировали в рDR1296, расщепленную Хbа I-Ваm НI, с образованием конструкции плазмиды рJНЗЗ. Плазмиду рJНЗЗ расщепляли Sрh I и Вgl II с выделением фрагмента (5,1 kb), содержащего вектор. Плазмиду рZV24 (пример 2 за-явки) расщепляли Sрh I и Вgl 11 с выделением фрагмента (0,76 kb), включающего промотор АDН1 и кодированную ВАR1 (от -17 bр до 342 bр), показанную на фиг. 1 - 3. Фрагмент Sрh I-Вgl II рZV24 и фрагмент (5,1 kb) рJНЗЗ лигировали. Полученную плазмиду обозначили рJНЗ5.
Единицу экспрессии, присутствующую в плазмиде рJH35, субклонировали в дрожже-вой челночный вектор YЕр13. Плазмиду YEр13 расщепляла Ваm НI и Sрh I с выделением фрагмента, содержащего вектор. Плазмиду рJНЗ5 расщепляли Sрh I и Ваm НI с выделением единицы экспрессии (3,1 kb). Sрh I-Ваm НI фрагменты YЕр13 и Sрh I-Ваm, рJНЗ5 лигирова-ли. Полученную плазмиду обозначили рJНЗ9.
Плазмидой рJНЗ9 трансформировали штамм Sассhагоmусеs сегеvisiае Е8-11С (МАТαleu2-3, 112 рер4-3) по методу, описанному по существу автором Hinnen еt аl (Ргос. Nаtl. Асаd. Sсi., USА, 57, 1929 1933, 1978). Трансформанты отбирали в зависимости от их способ-ности расти в синтетической полной среде, не содержащей аминокислоту лейцин.
Трансформаторы подвергали фибринолитическому анализу на определение их способ-ности tРА. Было найдено, что трансформанты секретировали 22 мкг/л (фибринолитическая активность).
Пример VII.
Пример 1. Трансформация клеток хозяина и экспрессия аналога инсулина М1-3,
Векторы экспрессии рSW167 и рSW200, включающие единицы экспрессии в векторе YЕр13, и векторы экспрессии рSW210, рSW219 и рZV187, включающие единицы экспрессии в векторе рSW197, трансформированы стандартными способами в приемлемые дрожжевые хозяева. Штаммы-хозяева S. сегеvisiае содержали мутации, которые дополняют селектируе-мые маркерные гены, присутствующие в плазмидах.
Плазмиду рSW167, включающую кодирующую последовательность для первых 526 аминокислот кодирующего участка ВАR1, слитую с кодирующей последовательностью МI-3 в YEр13, и плазмиду рSW200, включающую кодирующие последовательности для сигнально-го пептида ВАR1 и третий участок ВАR1, слитый с кодирующей последовательностью МI-3 в YЕр13, трансформировали в штамм S. сегеvisiae (МАТа leu2-3 10112-112 uraЗ рер4::URАЗ bаг1 ga12). Трансформанты отбирали в соответствии с их способностью расти в синтетиче-ской среде выращивания, не включающей лейцина.
Трансформаторы выращивали в течение ночи при 30°С в 5 мл -LeuD (Wickerham, L.J., Васt., 52, 293 - 301, 1946; содержащие Difсо Yeast Nitrogen Ваsе в качестве источника азота). Трансформанты разбавляли в соотношении 1:100 в 20 или 50 мл -LeuD) и выращивали при 30°С в течение 24 или 48 ч. Клетки гранулировали и промывали до замораживания при -70°С. Истощенную среду дважды центрифугировали и декантировали ее от клеточного материала перед замораживанием при -70"С. Содержание МI-3, определенное с помощью радиоиммуно-анализа (RIА, см. пример 11), показало, что трансформанты рSW167 продуцировали 38 пи-ког/мл иммунореактивного материала М1-3, в то время как трансформанты рSW200 продуци-ровали 113 мкг/мл иммунореактивного материала МI-3 в течение 54 ч.
Плазмиду рSW210, включающую последовательность, кодирующую первые 526 амино-кислот ВАR1, слитую с кодирующей последовательностью МI-3 в рSW197, и плазмиду рSW219, включающую кодирующие последовательности сигнального пептида ВАR1 и тре-тий участок ВАR1, cлитью с кодирующей последовательностью МI-3 в рSW197, трансформи-ровали в штаммы S. сегеvisiае GА18-1С (Маtа leu2-3 leu2-112 uга ЗΔtрil::LЕU2 [сiг°]) и ZМ114 (МАTа leu2-3, 112, uгаЗ-52 аdе2-101 рер4::ТРI промотор-САТΔtрil::URА3 vpt3 suс2-Δ[сiг°]). Трансформанты отбирали в соответствии с их способностью расти в присутствии глюкозы.
Экспрессию и секрецию МI-3 из штамма GА18-1С, трансформированного плазмидами рSW210 и рSW219, осуществляли путем выращивания трансформантов в течение ночи при 30°С в 5 мл МЕD 1 (2°/о "Васtо" Уеаsг Ехtгасt, 0,5%, сульфата аммония, 6%, глюкозы). Трансформанты разбавляли в соотношении 1:100 в 20 или 50 мл МЕD 1 и выращивали при 30°С в течение 24 или 48 ч. Клетки гранулировали, промывали и затем замораживали при -70°С. Истощенную среду дважды центрифугировали и декантировали ее от клеточного мате-риала, а потом замораживали ее при - 70°С. Содержание МI-3, определенное радиоиммуно-анализом (RIА), показывает, что трансформанты рSW210 продуцировали 0,3 «кг/мл иммуно-реактивного материала МI-3, что и трансформанты рSW219 продуцировали 0,15 мкг/мл им-мунореактивного материала МI-3 в течение 24 ч.
Степень экспрессии и секреции МI-3 из трансформантов рSW219 штамма ZM114 также измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (НPLC). Трансформан-ты выращивали в течение ночи при 30°С в 5 мл пополненном YEPD (YEPD + 40 мг/л Аdе + 80 мг/L Leu + 10 мM СаСl2, доведенном до 6% глюкозы). Культуру, выращенную в течение ночи, разбавляли в соотношении 1:100 в 50 мл пополненного YЕРD и выращивали при 30"С. По два образца объемом 4 мл брали в час 30, 48 и 75 соответственно. Центрифугировали об-разцы и отделяли поверхностные слои. Аликвоты 5 мл поверхностных слоев смешивали с 0,5 мл ферментативного бульона (552 г 96%, Еt0Н + 349 г Н20 + 5 мл конц, Н2S04) и смеси дают охладиться при комнатной температуре в течение 30 мин. Смеси затем фильтровали через Асгоdiscs (Gеlmаn Sciences, Аnn Агbог, Мich.) размером 2 мкм и их замораживали при -20°С. Содержание МI-3, определенное высокоэффективной жидкостной хроматографии, показыва-ло, что трансформанты рSW219 продуцируют 14 мкг/мл МI-3 в течение 75 ч.
Плазмиду рZV187, содержащую сайт расщепления тромбина между третьим участком ВАR1 и кодирующей МI-3 последовательностью, трансформировали в штаммы S.сегеvisiае GА18-1С и ZМ114. Отбирали трансформанты в соответствии с их способностью расти в при-сутствии глюкозы. Трансформанты выращивали в течение ночи в 5 мл YЕР + 6°/о глюкозы (1°/о Васto Yеаst Ехtгасt, 2% Васtо Yеаst Рерtоnе, причем добавляли 6% декстрозы после об-работки в автоклаве). Культуры, выращенные в течение ночи, разбавляли в соотношении 1:100 в 10 мл YЕР + 6%, глюкозы и их выращивали при 30°С. Образцы брали через 26 и 48 ч. Образцы центрифугировали для того, чтобы гранулировать клетки, и поверхностные слои декантировали и замораживали при -70°С. Содержание МI-3 определяли радиоиммуноанали-зом. Было установлено, что трансформанты GА18-1С продуцировали 0,9 нг/мл иммунореак-тивного материала МI-3 в течение 48 часов, а трансформанты ZМ114 продуцировали 0,52 нг/мл иммунореактивного материала МI-3 в течение 48 ч.
Пример VIII. Трансформация клеток-хозяина и экспрессия урокиназы.
Плазмиду рSW163, включающую промотор ТРI1, сигнальную последовательность РНО5, uРА кДНК, третий участок ВАR1 и терминатор ТРI1 в дрожжевом векторе YЕр13, трансформировали в дрожжевые штаммы ZY100 МАТа, аdе2-101 leu2-3, 112 uгаЗ-52 suс2Δ9gа12 рер4:САТ) и ZY200 (МАТа аdе2-101 leu2-3,112 uгаЗ-52 suс2-Δ9 gа12 рер4:САТ vрt3). Трансформанты отбирали в соответствии с их способностью расти в синтетической среде выращивания, не содержащей лейцина.
Экспрессию и секрецию свиной урокиназы из трансформаторов рSW163 осуществляли выращиванием трансформантов в течение ночи при 30°С в 5 мл –Leu6%D + 0,1 М сукцината при рН 5,5 (причем –Leu содержала 6% глюкозы и 0,1 М сукцината, рН доводили до 5,5 до-бавлением NаОН перед осуществлением обработки в автоклаве). Культуры, выращенные в течение ночи, разбавляли в соотношении 1:1000 в 5 мл -Leu6%D + 0,1 М сукцината при рН 5,5 и выращивали в течение 37 ч при 30"С. Клетки гранулировали и поверхностный слой де-кантировали и отделяли. Активность UРА измеряли фибринолитическим анализом. При ис-пользовании этого способа обнаруживали, что содержание uРА составляет 7,2 мкг/л в кле-точном экстракте, а 38 мкг/л в поверхностном слое трансформаторов рSW163 ZY200.
Пример IX. Экспрессия и секреция РDGF ВВ при использовании сигнала секреции ВАR1.
А. Клонирование последовательной РDGF. Конструирование последовательности, ко-дирующей В-цепь РDGF, описано авторами Мyrrау еt аl (патент США NN 4,766,073 и 4,769,328). В патенте США N 4,766,073 вектор экспрессии рВ12 включает последователь-ность ДНК, кодирующую В-цепь РDGF человека, которая оперативно связана с промотором ТРI1 S. сtгеvisiае, с препро-последовательностью МFα1 и с терминатором ТРI1. В патенте США N 4,766,073 также описано, что вектор рSВ1 включает единицу экспрессии, содержа-щую промотор ТРI1, препро-последовательность МFα1, последовательность, кодирующую v-sis, и терминатор ТРI1.
Последовательность МFα1/v-sis замещали МFα1 1 /В-цепью последовательности в векто-ре рSВ1. Единицу экспрессии РSВ1 вставляли в модифицированную плазмиду рВR322, не содержащую сайт Есо RI. Полученный вектор, обозначенный как рКР 10, обрабатывали с Есо RI и Хbа I для того, чтобы удалить фрагмент МFα1/v-sis. Фрагмент МFα1 /В-цепь из рВ12 за-тем вставляли в единицу экспрессии рКР10 с тем, чтобы сконструировать рКР26.
Последовательность альфа- фактора с оптимизированными кодонами вставляли затем в единицу экспрессии. Фрагмент Есо RI-Хbа 1, включающий последовательность препро аль-фа- фактора и последовательность инсулина, клонировали в рUС118, обработанную Есо RI и Хbа 1 (Viеiга аnd Меssing, Меthods in Еnsimology, 153, 3 -11, 1987), получали однонитевую ДНК. Эту ДНК затем подвергали мутагенезу в соответствии с двухпраймерным методом (Zoller аnd Smith, DNА, 3, 479 488, 1984), применяя олигонуклеотид 20862 с мутацией (5' СGА АТС ТТТ ТGА GCT САG ААА САС СЗ'). В результате мутагенеза образовывался Sst I-сайт в конечном В' положении лидера альфа- фактора. Отбирали плазмиду, измененную пра-вильным образом, и обозначали ее как рКР23. Расщепляли главную (лидерную) последова-тельность из рКР23 путем обработки Есо RI и Sst I и лидерный фрагмент субклонировали в рIС19Н, расщепленную Есо RI и Sас I (Магsh еt аl., Gеnе, 32, 481-486, 1984). Полученную плазмиду обозначали как рКР24. Плазмиду рКР26 расщепляли ЕсоRI и Sst I для того, чтобы удалить последовательность альфа- фактора. Последовательность альфа- фактора с оптимизи-рованными кодонами затем удаляли из рКР24 в качестве фрагмента Есо RI-Sst I и присоеди-няли ее к линеаризованной рКР26. Полученный вектор обозначали как рКР28.
Сайт Sst I, вставленный в лидер альфа- фактора с тем, чтобы облегчить конструирова-ние вектора, затем удаляли, в результате чего восстанавливали кодирующую последователь-ность дикого типа. Плазмиду рКР28 обрабатывали Есо RI и Хbо I и извлекали последова-тельность слияния В-цепи альфа-фактора. Этот фрагмент клонировали в плазмиду рUС118 и выделяли однонитевую ДНК. ДНК подвергали мутагенезу двухпраймерным методом, при-меняя олигонуклеотид с мутацией ZС1019 (5' АСС САА GGА ТСТ СТТ GТC САА АGА ААС АСС ТТС ТТС
3'). Плазмиду, содержащую нужную мутацию, обозначали как рКРЗ2.
Полную единицу экспрессии затем реконструировали, Плазмиду рКРЗ2 обрабатывали Есо RI и Хbа I и извлекали фрагмент В-цепи альфа- фактора. Этот фрагмент вставляли в плазмиду рКР10, расщепленную Есо RI и Хbа I, для того, чтобы сконструировать плазмиду рКРЗ4. Плазмиду рКРЗ4 обрабатывали Сlа I и Ваm НI и выделяли единицу экспрессии. Этот фрагмент вставляли в плазмиду рМРОТ2, отработанную Сlа I и Ваm НI, с тем, чтобы скон-струировать плазмиду рКРЗб (дрожжевая плазмида на основе 2 мкм, содержащая источники репликации дрожжей и бактерий, ген устойчивости к ампициллину и селектируемый маркер РОТ1, сдана на хранение в коллекцию АТСС, где хранится под номером 67788).
Последовательность А-цепи РDGF с оптимизированными кодонами из плазмиды рА7 (Мurraу еt аl., патент США N 4,766,073) объединяли с лидерной последовательностью альфа- фактора с оптимизированными кодoнами в течение разных стадий конструирования, анало-гичных стадиям, описанных выше для В-цепи. Последовательность А-цепи из рА7 выделяли как Sst I-Хbа I фрагмент и вставляли ее в плазмиду рК28, для того, чтобы сконструировать плазмиду рК27. Плазмиду рКР27 обрабатывали Есо RI и Хbа I и фрагмент А-цепи альфа- фактора клонировали в плазмиду рUС118.
Затем осуществляли мутагенез, применяя олигонуклеотид ZС1018 (5' ТТС GАТ АGА ТСТ СТТ GТС САА АGА ААС АСС ТТС ТТС 3') в соответствии с вышеизложенным с тем, чтобы удалить сайт Sst I и восстановить альфа- факторную последовательность дикого типа. Исправленную плазмиду обозначали как рКРЗ1.
Затем конструировали вектор оптимизированными кодонами. Плазмиду рКРЗ1 обраба-тывали Есо RI и Хbа I и фрагмент А - цепи альфа- фактора присоединяли к плазмиде рКРЮ, расщепленной с Есо RI и Хbа I. Полученный вектор, обозначенный как рКЗЗ, содержал еди-ницу экспрессии. Плазмиду рКРЗЗ обрабатывали Сla I и Ваm НI и выделяли фрагмент еди-ницы экспрессии. Этот фрагмент вставляли в рМРОТ2, расщепленную Сlа I и Ваm НI, для того, чтобы сконструировать вектор экспрессии рКРЗ5.
Кодирующую последовательность В-цепи РDGF получали из плазмиды рКР51. Плаз-миду рКРЗ2 трансформировали в штамм Е. соli МV1193. Получали однонитевую ДНК. ДНК подвергали мутагенезу, применяя олигонуклеотид с мутацией ZС1078 (табл. 3). Мутагенез ДНК с ZС1078 приводили к вставке сайта рестрикции Ваm НI в 5'конце кодирующей после-довательности В-цепи РDGF. Положительные клоны обнаруживали путем гибридизации фатов, рестрикционного анализа и дидезоксисеквенирования. Положительный клон обозна-чали как рКР47.
Сигнальную последовательность МFα1, присутствующую в плазмиде рКР47, замещали синтетической сигнальной последовательностью. Плазмиду рКР47 обрабатывали Есо RI и Ваm НI для того, чтобы выделить фрагмент, включающий последовательность В-цепи чело-века и последовательности вектора рUС118. Конструировали олигонуклеотиды ZС1157, ZС1158, ZС1076 и ZС1077 (табл. 1) таким образом, чтобы они кодировали при отжиге Есо RI-Ваm НI-адаптер, кодирующий синтетическую сигнальную последовательность. Олиго-нуклеотиды ZС1158 и ZС1076 обрабатывали киназой. Отжигали олигонуклеотиды ZС1158 и ZС1157, а ZС1076 и ZС1077 отжигали в отдельных реакциях. Фрагмент Есо RI-Ваm НI из рКР47 присоединяли к ZС1158/ZС1157 и ZС1076/ZС1077 в результате лигирования трех ча-стей. Полученная плазмида, обозначенная как рКР49, включала синтетическую сигнальную последовательности В-цепи РDGF и последовательности вектора рUС118.
Единицу экспрессии, включающую промотор ТРI1, синтетическую сигнальную после-довательность, последовательность В-цепи РDGF и терминатор ТРI1, конструировали из плазмиды рКР49 с последующим субклонированием в дрожжевой вектор экспрессии. Плаз-миду рКРЗ4 обрабатывали Сlа I и Ваm НI, в результате чего выделяли фрагмент 2,3 kb, вклю-чающий промотор ТрI1, сигнальную последовательность МFα1, последовательность В-цепи РDGF и единицу экспрессии терминатора ТРI1. Плазмиду pUC 12 обрабатывали Нind III и Есо RI. Олигонуклеотиды ZС1016 и ZС1017 (табл. 2) подвергли обработке киназой и отжигу, в результате чего образуется полилинкерадаптер, включающий сайты рестрикции Сlа I, Нind III, Хbо I, Асс I, Хbа I и Ваm НI. Линейный вектор лигировали с адаптером ZС1016/ZС1017, подвергнутыми обработке киназой и отжигу. В результате этого теряли сайты Нind III и Есо RI плазмиды рUС12. Полученный вектор рUС12 обрабатывали путем гидролиза Асс I и Ваm НI. Фрагмент единицы экспрессии (2,3 kb) присоединяли к линеаризованной рUС12. Полу-ченную плазмиду обозначали как рКРЗ8. Плазмиду обрабатывали Есо RI и Хba I для того, чтобы выделить фрагмент, включающий промотор ТРI1, терминатор ТРI1 и последователь-ности вектора рUС12 (4,3 kb). Плазмиду рКР49 обрабатывыи Есо RI и Хbа I для того, чтобы выделить фрагмент 0,8 kb, включающий синтетическую сигнальную последовательность и последовательность В-цепи РDGF. Присоединяли фрагмент 0,8 1kb к фрагменту 4,3 kb из рКРЗ7. Полученную плазмиду обозначали как рКР51.
В. Конструирование вектора экспрессии.
Последовательность В-цепи РDGF затем присоединяли к сигналу секреции, включаю-щему лидерную последовательность и последовательность, кодирующую третий участок гена ВАRI S.сегеvisiае. Сигнал секреции ВАRI присоединяли к кодирующей В-цепь последова-тельности, в результате чего конструировали векторы экспрессии рSW304 и рZY76.
Сначала конструировали плазмиду рSW255, включающую промотор ТРI1 и сигнал сек-реции ВАR1. Последовательность ВАR1, кодирующую третий участок и присутствующую в плазмиде рSW195, сливали с синтетическим адаптером, кодирующим аминокислоты 81 - 85 альфа- фактора, сайт расщепления Lys-Агg, 5' Есо R1, адгезивный конец 3' Вgl II и первую аминокислоту В-цепи РDGF. Олигонуклеотиды ZC1135 и ZC1136 (таблица 1) подвергали обработке киназой и отжигу, как описано автором Маniatis еt аl (ibid). Плазмиду рSW195 об-рабатывали Нind III и Есо R1, в результате чего выделяли фрагмент 1, 4 kb, включающий промотор ТРI1 и кодирующие последовательности ВАR1. Фрагмент 1,4 kb присоединяли к ZC1135/ZC1136-адаптером и рIС19Е, которая была обработана Нind III и Вg1 II, в результате слияния трех частей.
Полученную плазмиду обозначали как рSW255.
Последовательность В-цепи РDGF, присутствующую рКР51, присоединяли к промото-ру ТРI1, сигнальной последовательности ВАR1, третьему участку ВАR и ZС1135/ZС1136-адаптеру (кодирующему сайт расщепления Lys-Агg) для того, чтобы сконструировать плаз-миду рSW262. Плазмиду рКР51 обрабатывали Ваm НI, в результате чего выделялся фрагмент 1,09 kb, включающий кодирующую В-цепь РDGF последовательность и терминатор ТРI1. Плазмиду рSW255 вываривали Sрh I и Веl II для того, чтобы выделить фрагмент 0,75 kb, включающий частичный промотор ТРI1, сигнальную последовательность ВАR1 и ZС1135/ZС1136- адаптер. Два фрагмента присоединяли путем лигирования трех частей с рUС18, которую гидролизовали Sрh I и Ваm НI. Обнаружили плазмиду, включающую со-ставные фрагменты в правильной ориентации. Плазмиду обозначили как рSW262.
Дрожжевой вектор экспрессии рSW304, включающий промотор ТРI1, сигнальную по-следовательность ВАRI, третий участок ВАR1, В-цепь РDGF и терминатор ТРI1 в векторе рМОТ2, конструировали. Плазмиду рКРЗб обрабатывали Сlа I и Sрh I для того, чтобы выде-лить 5' участок промотора ТРI1 (0,76 kb). Плазмиду рКРЗб также обработали Сlа I и Вgl II для того, чтобы выделить фрагмент 11kb, содержащий вектор. Этот фрагмент включал последо-вательность В-цепи РDGF, терминатор ТРI1 и последовательности вектора рМРОТ2. Плаз-миду рSW262 вываривали Sрh I и Вgl II для того, чтобы выделить частичный промотор ТРI1 (0,75 kb), сигнальную последовательность ВАR1, третий участок ВАR1 и ZС1135/ZС1136. Три фрагмента- соединяли в результате сшивки трех частей и полученную плазмиду обозна-чили как рSW304.
Вектор экспрессии рZY76 конструировали путем встраивания единицы экспрессии В-цепи в вектор рRPOТ. Вектор рRРОТ получен из рСРОТ (АТСС 39685). Сначала замещали фрагмент SphI-Ваm НI плазмиды рСРОТ (750 bр) фрагментом Sрh I-Ваm НI плазмиды рВR322 (186 bр). Полученную плазмиду, рDРОТ, обрабатывали Sрh I и Ваm НI, в результате чего выделяли фрагмент 10,8 kb. Олигонуклеотиды ZC1551 и ZC1552 подвергали обработке киназой и отжигу для образования адаптера, имеющего адгезивный конец Dfm НI и адгезив-ный конец Sрh I, расположенные сбоку сайтов рестрикции Smа I, Sst I и Хhо I. Фрагмент 10,8 kb рDРОТ рециркулирован путем сшивки с ZC1551/ZC1552-адаптером. Полученную плазмиду обозначают как рRРОТ.
Терминатор ТРI1 субклонировали следующим образом.
Плазмиду рSW195 обрабатывали Вgl II и Sma I для того, чтобы выделить фрагмент 2,38 kb, включающий промотор ТРI1, концевую аминогруппу ВАR1 и третий участок ВАR1, по-следовательность, кодирующую МI-3, и терминатор ТРI1. Фрагмент 2,38 kb сшивали с плаз-мидой рRРОТ, которую обрабатывали Smа I и Вgl II. Полученную плазмиду, обозначенную как рSW313, обработали Хbа I и Sрh I для того, чтобы выделить фрагмент терминатор ТРI1 0,76 kb. Фрагмент 0,76 kb присоединяли к плазмиде рUС18, обработанной Sрh I и Хba I. По-лученную плазмиду обозначают как рZY75.
Затем конструировали плазмиду рZY76. Плазмиду рSW195 обрабатывали Вgl II и Есо RI для того, чтобы выделить фрагмент 1,4 kb, включающий промотор ТРI1 и концевую ами-ногруппу ВАR1 и третий участок ВАR1. Плазмиду рSW262 обработали Есо RI и Хbа I для того, чтобы выделить фрагмент 0,35 kb, включающий ZС1135/ZС1136-адаптер и последова-тельность, кодирующую В-цепи РDGF. Плазмиду pZY75 обработали Хbа I и Sрh I для того, чтобы выделить фрагмент 0,75 kg, включающий терминатор ТрI1. Три фрагмента присоеди-няли к рRРОТ, гидроли- зованной с Ваm НI и Sрh I, в результате сшивки четырех частей. По-лученную плазмиду, включающую промотор ТРI1, концевую аминогруппу ВАR1 и третий участок ВАR1, кодирующую РDGF последовательность, терминатор ТРI1 и последователь-ности вектора рRРОТ, обозначали как pZY76.
С. Экспрессия гомодимера ВВ.
Экспрессию РDGF ВВ в дрожжевых штаммах, трансформированных плазмидами рSW304 и pZY76, сравнивают с экспрессией РDGF из контрольных плазмид рВ170m (Мurrау еt аl., USSN 896, 485) и рКР57 (включающая единицу экспрессии рКРЗ4 в рRРОТ). Плазмиды рSW304, рZY76, рВ170m и рКР57 трансформировали в дрожжевые штаммы Е18#9 (МАТа leu2-3,112 his4-580 рер4-3 Δtpil::LEU2/МАТα leu2-3,112 рер4-3 Δtpil::LEU2) ХВ13-5В (МАТ а leu2-3,112 uга 3 bагl gа112 Δ tpil::URA3 [сiг°]) и ZМ114 (МАТа аdе2-101 leu2-3,112 uгаЗ-52 Δ tpil::URA3 vрt3 suс2- Δ 9 ga12 рер4::ТРI промотор-САТ [сiг°]) согласно описанию автора Веggs (Natuге 275: 104 - 108, 1978).
Трансформанты из отдельных колоний инокулировали в среду ферментации и выращи-вали в течение 24 ч при 30°С. В течение 24 ч добавляли глюкозу к культурам, обеспечивая при этом конечную концентрацию 2%. Культуры выращивали в течение 24 ч при 30°С.
Среда ферментации, г: NZ амина типа А 20
КН2РО4 7
NH4SO4 6
МgSO4 2
Твердые частицы растворяли в воде и объем доводили до 1 л. Раствор обрабатывали в автоклаве в течение 25 мин. После обработки в автоклаве добавляли 2 мл/л раствора микро-элементов (состав приведен ниже), 3 мл раствора витаминов (состав приведен ниже), 2 М сукцината натрия, рН 5,5, до конечной концентрации 0,1 М, и 50%, глюкозы до конечной концентрации 2% .
Раствор микроэлементов
9,45 мг ZпSO4
284,8 мг Fе2(SO4)3
48 мг СuSO4·5Н20
Твердые частицы растворяли в дистиллированной воде и доводили конечный объем до 100 мл. Осуществляли стерилизацию фильтрованием.
Раствор витаминов:
420 мг рибофлавина
5,4 г пантотеновой кислоты
6,1 г ниацина
1,4 г пиридоксина
60 мг биотина
40 мг фолиевой кислоты
6,6 г инозита
1,3 г тиамина
При этом растворяли в дистиллированной воде и доводили до конечного объема 1 л, за-тем осуществляли стерилизацию фильтрованием.
Клетки удаляли из среды путем центрифугирования. Поверхностные слои затем филь-тровали через фильтр с диаметром отверстий 0,45 мкм, в результате чего удалялись всякие клетки или отходы от клеток. Профильтрованные поверхностные слои культур подвергали анализу на митогенез, как описано авторами Rаinеs аnd Ross (Меthods in Еnzymology, 109, 749 773, 1985). Результаты, выраженные в нг активности РDGF на мл культуральной среды, при-ведены в табл. 3.
РDGF-аналоги, продуцированные трансформированными дрожжевыми клетками, вы-деляли из концентрированных поверхностных слоев культур очисткой с помощью разных стадий хроматографии и концентрации.
Поверхностные слои культур концентрировали, применяя Мillipоге Реllicаn Саssettes (Мilliроге, Веdfогd, Маss.), и концентраты подвергали гранулированию путем центрифуги-рования в центрифуге типа Весkman J-6В (Весkman Instruments, Inс., Вгеа, Сalif.) при 4200 оборотов/мин в течение 30 мин, в результате чего устранено помутнение. Затем добавляли EDTА, вследствие чего конечную концентрацию доводили до 10 mМ, и добавлением 5 М NaОН рН смеси доводили до рН 5,5. После этого концентраты разбавляли водой для того, чтобы проводимость составляла примерно 10 миллимхоз.
Полученные концентраты подвергали хроматографии на колонке типа S-Sерhагоsе Fаst Flow (Рharmacia, Рiscatawау, N.J.). Колонку промывали 20 мM фосфата натрия, 0,1 М хлорида натрия, причем рН составляет 7,3. Затем колонку элюировали 20 мM фосфата натрия, 1М хлорида натрия, причем рН составляла 7,3. При этом наблюдали кривую спектрального по-глощения элюата при 280 нм и пиковые фракции собирали и объединяли.
Элюаты замораживали при -20°С и потом их оттаивали.
Материалы в виде частиц удаляли из элюатов путем центрифугирования. Собирали по-верхностные слои и добавлением 0,87 М уксусной кислоты доводили до рН 3,0. Затем элюаты концентрировали, причем применяли фильтр типа Аmicon YM10 (Аmicon, Dаnvers, Маss.) Разбавляли концентрированные элюаты 5 объемами 1 М уксусной кислоты для того, чтобы снизить концентрацию хлорида натрия до примерно 0,2 М.
Элюаты подвергали хроматографии на второй колонке типа S-Sерhагоsе. Затем промы-вали колонку 1 М уксусной кислотой и наблюдали кривую спектрального поглощения элюа-тов при 280 им, пока кривая не возвратилась к основной линии. Затем элюировали колонку 1 М уксусной кислоты, 1,5 М хлорида аммония, причем рН составляла 4,8 - 5,0. После этого наблюдали кривую А280 элюатов и собирали РDGF как последний пик А280. Пиковые фракции собирали и концентрировали с помощью фильтра типа Аmicon YМ10.
Концентрированные элюты затем пропускали через колонку типа Sерhаdех G-50 Suрегfine (Рarmacia, Рiscataway, N.J.), причем использовали образец в объеме, составляющем примерно 1% объема колонки. Колонка работала при скорости потока 5 см/ч в 1 М ацетата аммония, причем рН равен 9,0. При этом собирали самые чистые фракции, установленные путем электрофореза на SDS-геле, и добавлением уксусной кислоты доводили рН до 4,0.
Пример X. Использование лидера ВАR1 для секреции эпидермального фактора роста и трансформирующего альфа- фактора роста. Кодирующие последовательности для эпи-дермального фактора роста (ЕGF) и трансфор-мирующего альфа- фактора роста (ТGFα) полу-чали из синтетических олигонуклеотидов. Затем последовательности использовали для по-лучения единиц экспрессии, включающих промотор и терминатор ТРI1 и лидер ВАR1 и по-следовательности третьего участка.
Кодирующая ЕGF-последовательность сконструирована из олигонуклеотидов ZС1734, ZС1735, ZС1534 и ZС1535. Пары олигонуклеотидов (ZС1734+ZС1735 и ZС1534+ZС1535) отдельно подвергали отжигу путем инкубации при 100°С в водяной ванне в течение 5 мин с последующим медленным охлаждением в водяной ванне в течение 60 мин. Подвергнутые отжигу пары затем соединяли и сшивали. Собранный кодирующий фрагмент клонировали в М13mр19 для подтверждения последовательности. Полученный клон обозначали как pZY77.
Последовательность ТGFα сконструировали из пар олигонуклеотидов ZС1732+ZС1733 и ZС1198+ZС1200 по способу, в основном описанному выше для ЕGF. Собранная кодирую-щая последовательность клонировалась в М13mр19, в результате чего образовалась рZY78.
Последовательности EGF и ТGFα присоединяли к терминатору ТРI1. Клоны фагов pZY77 и рZY78 обрабатывали Есо RI и Хbа I и очищали соответствующие фрагменты фак-торов -роста. Плазмиду рВ170SW, включающую фрагмент Sаl l-Ваm Нl, который в свою оче-редь включает 3' участок последовательности В-цепи РDGF и терминатор ТРI1, клонирован-ный в рlС19R, обрабатывали Хbа l и Ваm Нl, и выделяли фрагмент терминатора ТРI1. Каж-дый из фрагментов факторов роста присоединяли к терминатору ТРl1 и к рUС18, обработан-ной Есо Rl и Ваm Нl, в результате сшивки трех частей. Полученные плазмиды обозначали как рZY80 (ЕGF) и рZY81 (ТGFα).
Последовательности факторов роста присоединяли к промотору ТРl1 и к сигналу секре-ции ВАR1. Каждую плазмиду рZY80 и рZY81 обрабатывали Есо Rl и Ваm Нl и очищали фрагменты терминаторов факторов роста. Плазмиду рSW195 обрабатывали Нind III и Есо Rl, и выделяли фрагмент промотора ТРl1-ВАl1 (около 1,4 kb). Фрагменты терминаторов факто-ров роста присоединяли к фрагменту промотора ВАR1 в плазмиде рUС18, обработанной Ваm Нl и Hind III.
Полученные плазмиды обозначали как рZY83 (ЕGF) и рZY84 (ТGFα).
Для конструирования векторов экспрессии каждую из рZY83 и рZY84 обрабатывали с Вg1 l и Sst l, и выделяли фрагменты единиц экспрессии. Эти единицы вставляли в плазмиду рRРОТ (пример III), обработанную Sst l Ваm l, для того, чтобы сконструировать рZY85 (ЕGF) рZY86 (ТGFα). Вторую совокупность векторов экспрессии конструировали путем вставки единиц экспрессии Ваm Hl-Sst l плазмид рZY83 и рZY84 в плазмиду рMРОТ2 (пример III), обработанную Sst l и Ваm l. Полученные векторы экспрессии обозначают как рZY89 (ЕGF) рZY90(ТGFα).
Для экспрессии ЕGF ТGFα плазмиды рZY85, рZY86, рZY89 и рZY90 трансформирова-ли в штаммы S.сегеvisiае ZМ120 и ZМ122 (оба сiг°, диплоиды а/ α, leu2 uгаЗ tpi::LEU2 рер4::URА3 bаг1). Трансформанты культивировали по существу, как описано в примере lll. Поверхностные слои культур подвергали анализу по митогенетической активности ЕGF и ТGFα согласно описанию авторов Rаines аnd Ross (Меthods in Еnzymology, 109, 749-773, 1985) при использовании ЕGF-стандарта (см. табл. 4).
Пример XI. Очистка проинсулина из трансформированных дрожжей.
Клетки S.сегеvisiaе ХР635-10С, трансформированные мазмидой рZYЗ0 или рZYЗ1 (см. пример 1), выращивали при 30°С в культурах объемом 1 л с использованием среды, в кото-рой отсутствует лейцин (-leu среда). Эта среда содержала, в расчете на 1 л, 20 г глюкозы, 6,7 г "Васto'' азотного основания для дрожжей, не содержащего аминокислот (Difco), 40 мг аде-нина, 30 мг L-аргинина НСl, 50 мг L-аспарагиновой кислоты, 20 мг L-гистидина, 60 мг L-изолейцина, 40 мг L-лизина НСl, 20 мг L-метионина, 60 мг L-фенилаланина, 50 мг L-серина, 50 мг L-тирозина, 40 мг урацила, 60 мг L-валина, 150 мг L-треонина и 40 мг L-триптофана. Культуры инкубировали в течение 34 ч, после чего добавляли α8 -фактор. Культуры инкуби-ровали еще 11 ч и затем собирали путем центрифугирования.
Проинсулин очищали от лизатов дрожжевых клеток и надосадочных жидкостей куль-туральной среды с помощью афинной хроматографии с использованием моноклонального антитела против инсулина.
В целях получения антитела мышей иммунизировали свиным проинсулином с прове-дением иммунизации каждые две недели в течение 6 нед (50 мкг на 1 иммунизацию). Через 5 дн после проведения последней иммунизации удаляли селезенку и клетки селезенки сливали с линией клеток NS-1 миеломы (АТСС ТlВ-18) с подиэти-ленглоколем. После слияния выде-ляли одну гибридому, продуцирующую антитела, которые вступали в реакцию со свиным инсулином, свиным проинсулином и человеческим инсулином, что подтверждается осажде-нием 125J-меченых инсулинов. Оказывается, что моноклональное антитело представляет со-бой IgG1, который, по-видимому, не содержит NS-1k-легкой цепи. Эту гибридому (5.4.4.1) клонировали и выращивали в асците. Атитело 5.4.4.1 выделяли из асцитической жидкости путем афинной хроматографии на белок-А-сефарозе и получали антиинсулин-афинную мат-рицу за счет присоединения антитела к GNВг-акти- вированной сефарозе.
В целях очистки проинсулина образцы концентрировали на колонке типа Lichroргер RР-18. Элюат из колонки лиофилизировали и опять растворяли в 1 мл фосфатбуферного бу-фера (РВS), содержащего 0,5М NaС1. Затем образец пропускали через колонку для афинной хроматографии объемом 0,5 мл, содержащую антитело 5.4.4.1. Колонку промывали 5 мл РВS, 0,5 М NаСl и затем 5 мл Н20. Образец элюировали 2 мл ЗМ уксусной кислоты, содержащей 0,5 мг ВSА на 1 мл. Элюат лиофилизировали и опять растворяли в 150 мкл 45 %-нoго рас-твора СН3СN с 0,1% ТFА. Элюат из колонки подвергали анализу путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРLС) на колонке, содержащей Varian Мicrо Раc SР-С18-белок. В качестве растворителей использовали 0,1% ТFА в Н20 и 0,07% ТFА в СН3СN (А и В, соот-ветственно). Образец элюировали линейным градиентом от 10% В до 45% В в течение 30 мин при скорости протока 1,0 мл/мин.
При этом собирали фракции и подвергали их анализам на IRI и IRС описанным ранее способом.
Пример XII. Использование ВАR1 для секреции t-РА.
В целях использования последовательностей ВАR1 для экспрессии тканевого активато-ра плазминогена (t-РА) участок гена ВАR1 сначала присоединяют к промотору АDНI дрожжей в плазмиду рZY24 в соответствии с примером 2. Затем конструируют плазмиду, включающую последовательность ВАR1, присоединенную к последовательности, кодирую-щей Sег-t-РА, (сайт Вgl ll гена ВАR1 (фиг. 19. pDR1107 (включающую терминатор ТРl S. сегеvisie, клонированный в рUС18, расщепленную с Хbа l + Ваm Нl) и рDR1296 (включаю-щую Вgl ll-Хbа l кодирующую t-РА последовательность в рUС18; она депонирована в кол-лекции АТСС как трансформ Е. сoli JМ 83 и имеет номер депонирования 53347) трансфор-мировали в Е.соli G-48 (dam-). Плазмиды получали и расщепляли с помощью Хbа l и Ваm Нl в буфере Хbа l. Фрагмент терминатора ТРl (600 bр) из pDR1107 и фрагмент t-РА + вектор (4,3 kb) плазмиды рDR1296 подвергали головой очистке. Эти два фрагмента лигировали при комнатной температуре в течение ночи и использовали для трансформации Е. соli RR1. Плазмидную ДНК получали из трансформантов и расщепляли с помощью Хba l и Ваm Нl в буфере Хbа l для определения положительных клонов. Один из этих клонов обозначали рJНЗЗ.
Плазмиду рJНЗЗ расщепляли с помощью Вg1 ll и SPh l в "uni" буфере (0,05 Триc рН 7,4, 0,006M МgСl2, 0,05М NаС1). t-РА-ТРl-терминаторный + секторный фрагмент (5,1 kb) подвер-гали гелевой очистке. рZY24 расщепляли с помощью Sрh l + Вg1 ll в "uni" буфере и фрагмент промотор АDНl-ВАR1 (800 bр) подвергали гeлeвой очистке. Фрагмент Вg1 ll-Sрh l (5,1 kb) лигировали с фрагментом промотор АDНl- ВАR1 (800 bр) из рZY24 при комнатной темпера-туре в течение ночи. Смесь, полученную в результате лигации, трасформировали в Е.соli RRl. Плазмидную ДНК отбирали путем обработки Sрh l+ Вg1 ll и Sрh l + Ваm Нl. Выбирали одну положительную плазмиду и обозначали ее рJНЗ5.
Затем конструировали дрожжевую плазмиду рJНЗ9, включающую кодирующую t-РА последовательность в слиянии с последовательностью ВАR1 в положении 1025 (аминокис-лота N 114) плазмиды ВАR1. В результате этого слияния получали первичный продукт трансляции, состоящий из участка Баррьер полипептида, присоединен-ного к Sег-t-РА, при-чем Агg остаток одной аминокислоты 5' заменяли на Sег в t-РА. В целях конструирования плазмиды рJНЗ9, плазмиды рJНЗ5 и YEр13 расщепляли Sрh l и Ваm Нl в "uni" буфере. Фраг-мент YЕр13 и вставку (3 kb) из рJНЗ5 (включающей промотор АDНl, фрагмент слияния ВАR1-t- РА и терминатор ТРl) подвергали гелевой очистке и затем их подвергали лигирова-нию в течение ночи. Полученную в результате плазмиду обозначали рJНЗ9 (фиг. 19).
Вектор экспрессии дрожжей рJНЗ9 использовали для трансформации штамма S.сегеvisiае Е8-11с. Клетки выращивали в среде без leu (пример 6) + 6% глюкозы, содержа-щей 0,1 М гидрогенфталата калия, рН 5,5, при 30°С в течение 26 ч. Сырые экстракты подвер-гали анализу ЕLISА и фибринолитическому анализу, получали следующие результаты (табл. 5).
t-РА выделяли из экстрактов дрожжевых клеток путем афинной хроматографии с ис-пользованием моноклонального антитела против участка Крингл 1 t-РА, присоединенного к СNВг-активированной сефарозе. Образцы доводили до 1М NаСl и пропускали через колонку для иммуно-афинной хроматографии. Колонку затем промывали калий-фосфатным буфером (25 mМ фосфата калия, 0,2М NаС1, -2°/„ Тwееп-80 и 0,5°/о азида натрия) при рН 8,5, пока спектральная поглощательная способность элюата при А280 не достигла стабильной основной линии. Затем колонку подвергали предварительному элюированию калийфосфатным буфе-ром при рН 10,0. После достижения стабильной основной линии для А280 в промывной жид-кости t-РА элюировали с колонки калийфосфатным буфером при рН 11,5. Собирали фрак-ции, содержащие t-РА, очищенный афинным способом, и добавлением уксусной кислоты рН доводили до 7,0. После очистки образцы хранили при -80С.

Патент ЕПВ № 0121884., кл. С12 N 15/00, 1983