СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА

Использование: генетическая инженерия, получение лейкоцитарного интерферона. Сущность изобретения: способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической и биологической активностью ЧеИФН-α. Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ДНК последовательности Z-pBR 322 (Pst) HCIF-4с, Z-pBR 322 (Pst), HIF-2h, Z- pBR 322 (Pst) HclF-SN-35, Z- pBR 322 (Pst) HclF-SN-42, Z-pKT 287 (Pst) HcIF-2h-AH6, a также последовательности, которые гибридизуются с изложенными вставками.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению человеческого лейкоцитарного интерферона.
Известен способ получений лейкоцитарного интерферона, предусматривающий
культивирование штаммов культивируемых клеток животных, выделение и очистку целе.вого продукта.
Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта.
В данном способе осуществлено обнаружение последовательностей ДНК кодирующих ЧеИФН- α в клетках E.coti.
С, помощью данного способа получают полипептид (ы), проявляющие иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН- α.
Настоящий способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК
и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид. облада-ющий иммунологической или биологической активностью ЧеИФН- α.
Получены рекомбинантные ДНК содержащие ДНК последовательности Z-рBR322 / Pst) (HCIF4c. Z-pBR322 (Pst) / HclF-2h. Z-pBR322/Pst/HclF-SN З5. Z-pBR322/Pst/HclF-SN42. Z-pKT287/Pst/HclF-2h-АН6, а также ДНК последовательности, которые гибридизуются с упомянутыми вставками.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Человеческие лейкоциты стимулируют в течение 5 часов при З7°С
вирусом Сендай и экстрагируют смесь поли(А)РНК, содержащей мРНК человеческого
лейкоцитарного интерферона (ЧеИФН- α мРНК). Стимулированные лейкоциты собирают и 1011 клеток суспендируют в 1 л раствора, содержашего 8 r NaCI, 0,2 г КCl. 1,15 г Na2HPO4·2H20 и 0,2 г КН2РО4, растворенных в 1 л. воды (‘’PBS"), и добавляют при
интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ Трис-НСl (рН 7,5). 1 мМ Эдтук (‘’Е’’-буфер"), 2% додецилсульфата натрия (ДСН) в делительную воронку емкостью 50 л. Прибавляют проназу к 200 µ г/мл и перемешивают раствор в течение 1 ч при комнатной температуре. Прибавляют 106отсч./мин 125 l-глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2М Трис-HCI (рН 9) в количестве, равном 1/20 от общего объема (''1/20 объемн"), и смесь экстрагируют при энергичном перемешивании 15 л повторно перегнанного фенола в течение 10 мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин. После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу, всего 19,1 л объединяют с 60 г ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водной фазы 1/10 обьемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5,5) и 2 объемами этанола.
После хранения в течение ночи при 20°С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито. Этот материал затем перемешивают с 200 мл ТНЕ (50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 100 мMNaCl, 5 мМ ЭДТУК), содержащего 0,5%
ДСН. Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора. Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуге Сорволл RC-3 в течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл THE, содержащего 0,5% ДСН. Оба раствора THE объединяют, экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола, 3 раза 1/2
объема эфира и 3 раза 1 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК.
Поли (А) РНК смеси выделяют адсорбцией на олиго(dT)целлюлозе. Прибавляют
2,7 r олиго(dT)целлюлозы к 500 мл. После перемешивания в течение часа при комнатной температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(dT)целлюлозе, центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК, связанных с ней, промывают один раз 50 мл
THE и второй раз 15 мл THE. Затем связанную поли(A)РНК элюируют пятью последовательными промывками 2 мл Н20. Получают 860 µ г поли(A)РНК. Надосадочный раствор РНК из первой адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции. При второй и третьей адсорбциях получают 600 µ r и 170 µ г РНК.
РНК испытывают на ЧеИФН-α активность путем инъекции в ооциты Xenopus laevis, PHK растворяют в 15 мл Трис-НСl (рН 7,5), 88 мМ NaСl (ТНК буфер), чтобы получить
концентрацию около 1 мг/мл. Инъецируют 50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов.
Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкубированные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастора в трубке
для центрифуги Эппендорфа емкостью 1,5 мл в 0,5 мл 52 мМ трис-глицеринового буфера (рН 8.9). Смесь центрифугируют в течение 2 мин в центрифуге Эппендорфа, надосадочный слой сливают и замораживают при -20°С для испытаний. Одна единица ИФН-α снижает количество вируса на пластине на 50%. Активность препарата ИФН-α
выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН- α 69/19. Экстракт ооцитов имеет активность 300 lU ИФН- α на µ г РНК, при этом ooциты инкубируют в
течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(A)РНК добавляют 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) к поли(A)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 мм ЭДТУК. Полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом THE-насыщенного фенолом и 5 раз равным объемом эфира. Затем его пропускают через колонку с 0,1 мл. нагретую за 90 с до 100°С, и слоем в 13 мл с градиентом сахарозы 5 – 23%, содержащей 50 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК, 0,2 М NaCI. В качестве маркера добавляют 10000 спм 5’ концевого 32 р-меченых фрагментов ДНК, произведенных при одновременном усвоении pBR 322 и эндонуклеаз Hind Ill и Pst l.
Центрифугирование проводят в SW 40 роторе при 10°С и 35000 об/мин в течение 16 ч.
Фракции (0,6 мл) собирают с градиентом ISCO коллектором при 1 мл/мин. Испытывают фракции на ЧеИФН- α мРНК, их положение по отношению к32 Р-ДНК маркерам. При
последующем центрифугированни фракции, содержащие ЧеИФН- α мРНК, идентифицируют относительно маркеров Фракции с активностью ЧеИФН- α мРНК содер-
жат 80 µ г поли(А)РНК. Их смешивают с 2 объемами THE содержащего 0,5% ДСН и
0,02% поливинилсульфата (в последних приготовлениях поливинилсульфат был исключен), при этом применяют колонку с 50 µ л олиго(dT)целлюлозы. После промывки
колонки 40, µ г смеси РНК элюируют 4 промывками 0,6 мл дистиллированной воды.
После осаждения этанолом РНК растворяют в 1 мг/мл в 0,5 мМ ЭДТУК.
Испытание на активность ЧеИФН- α мРНК проводят, как описано выше на порции осадка поли(А)РНК. Он имеет удельную активность 3600 IU интерферона/µг. Следовательно, градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно 10-кратно по отношению к ЧеИФН- α мРНК. Получают приготовление с примерно 40-кратным обогащением.
Синтез с ДНК смеси, содержащей ЧеиФН-α с ДНК.
Поли(А)РНК, обогащенную ИФН-α мРНК, используют в качестве шаблона (модели) для получения однониточной комплементарной ДНК (сДНК). 800µ л реакционной смеси содержит 40 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 30 мМ NаСl, 5мМ МgСl2, 0,5 мМ ДТТ, 20 мг/мл
олиго(dТ)12 - 18, 5 мМ dGTP, dCTP и dTТР, 5 мМ 32 P-dATP (HЕН, удельная активность
10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(A)РНК и 280 ед. обратной транскриптазы. После инкубации в течение 1 ч при 37°С прибавляют 0,5 М ЭДТУК и 20% ДСH (перекристаллизо-
ванного) к 10 мМ ЭДТУК и 0,1 % ДСН. Смесь экстрагируют 1 объемом фенола (перегнан-
ного). Фенольную фазу промывают 200 µ л 200 мM Триc-HCI (рН 7,5), 1 мM ЭДТУК и 0,1% СДН, объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс G-100 в THE. Собирают фракции по 0,1 мл при 0,3 мл/мин. Фракции, показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова), объединяют и прибавляют ЗМ. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20°С образцы центрифугируют, отбрасывают надосадочный слой. Осадок растворяют в 180 µ л дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа. Прибавляют 20
µ л 5MNaOH и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин. Прибавляют
20 мл 5М ацетата натрия. 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола. После ох-
лаждения в течение ночи при -20°С собирают полученный осадок центрифугированием при силе, эквивалентной 10000-кратной силе тяжести (10000xg) в течение 20
мин при 0°С. Выход однониточной сДНК составляет 10 µr.
Однониточный продукт сДНК находится в реальной сложной смеси большого числа различных сДНК транскрибированных из соответствующих мРНК имеющихся в смеси поли(A)РНК. Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН-α, например HilFN- α сДНК.
Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза
малого на щелочном 2%-ном геле агарозы с использованием 30 мМ NaOH. 2мМ ЭДТУК
в качестве электролита. 32Р-сДНК имеет длину 600 - 1000 нуклеотидов, относящихся
к однониточному глобину СДНК. 32Р-меченые фрагменты ДНК используют в качестве
маркеров размера.
Пример 2. Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК полимеразой 1. Осажденную однонитевую сДНК растворяют в 200 µ л Н20 нагретой до
100°С в течение 2 мин и инкубируют в 500µ л 0,1 М нагретого денатурированного
калийфосфатного буфера (рН 6,9) 10 мМ МgСl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ каждого из dATP,
dGTP и dCTP, I мМ 3H-dTTP (HЕН, удельная активность 100000 спм/нмоль) и 150 ед./мл
E=coli ДНК полимеразы 1. После 6,5 ч при 15°С прибавля ют 0,5 ЭДТУК и 20 % ДСН к 10
мМ ЭДТУК и 0,1 % ДСН. Затем смесь экстрагируют 500 µл фенола, фенольную фазу по-
вторно экстрагируют 250 µл 20 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 5 мМ ЭДТУК (ТЕ буфер). Обе водные фазы объединяют и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс G-100 в тех же самых условиях. Прибавляют ЗМ aцетат натрия к 0,3 М и 2,5 объемам этанола, смеши
вают для осаждения ДНК. Всего собирают 13 µг ДНК.
ДНК обрабатывают нуклеазой S1. Осажденную ДНК растворяют в 250 мл буфера
(0,2 М NaCI, 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5). 10 мМ сульфата цинка и нагревают при 37°С
в течение 30 мин. Прибавляют 1,5 µл S1 фермента (11 единиц/µл), смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Прибавляют ДСН и ЭДТУК к 0,1 % ДСН и 5 мМ ЭДТУК и
экстрагируют смесь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 ulTE буфера. Объединяют водные фазы и хроматогрaфируют на колонке с Сефадексом G -100 в THE, собирают фракции по 0,1 мл при скорости 0,3 мл/мин и определяют радиацию Черенкова
для каждой фракции. После осаждения из этанола и ацетата натрия собирают 8 µ г
двойной спирали ДНК.
Пример 3. Обрабатывают плазмиду (в частности, рВR 322) эндонуклеазой Pst l и
добавляют dGMP хвосты концевой трансферазой, dGMP добавляют к 5' концу плазмиды для регенерации Pst l сайта и лигируют с сДНК фрагментом, несущим комплементарные хвоcты. Двунитевую с ДНК удлиняют при добавлении dCMP хвостов к 3' концевому. Затем плазмиду и сДНК обрабатывают лигазой, чем обеспечивается введение сДНК в подходящий сайт плазмиды и получение гибридной ДНК.
Пример 4. Плазмиду pBR322 (20 r) гидролизуют 21 единицами Pst l эндонуклеазы в 150 мл 10 мМ Трис-НСl (рН 7,5) 6 мМ МgСl2, 50 мМ NaCI, 6 мМ МgСl2, 50 мМ NaCI, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 200 мг/µл бычьего сывороточного альбумина (БСА). После 2 ч при З7°С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (1:1) и 1 объемом эфира и осаждают этанолом.
Добавление гомополимерных хвостов dGMP с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансферазы (TdT) осуществляют в 328 мл реакционного объема, содержащего 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 10 мМ NaH2PO4, 5 мМ МgСl2, 1 мМ dGTP, 50 мг/мл БСА и 3 - 6 ед. TdT (очищенного как указано выше) на 1 Mr ДНК. Инкубируют при 37°С в течение 20 мин. Прибавляют ЭДТУК к 10 мM, смесь экстрагируют как указано выше и диализуют два дня против буфера THE.
Двунитевую ДНК удлиняют остатками dCMP по стандартной методике. Инкубируют 150 мл двунитевой сДНК, описанной выше, а 8 µл 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2),
2,5 мМ CoCl2, 50 µг/мл БСА, 0,2 мМ dCTR, содержащего 3 - 6 ед. очищенного TdT на мг
ДНК, в течение 8 мин при 27°С, а затем замораживают при -20°С.
Инокулируют одну колонию E.coli Хl776 в 100 мл триптоновой среды с добавкой 100 µг/мл диаминопимелиновой кислоты, 10, г/мл налидиксовой кислоты и 10 µr/мл тетрациклина. Выращивают культуру при 37°С до кажущейся оптической плотности
0,6 при 650 нм (ОД650) и охлаждают на льду в течение 30 мин. Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе, клетки промывают 50 мл 10 мМ NaCl, отделяют на центрифуге и повторно суспендируют в 20 мл 100 мМ СаСl2. Суспензию охлаждают на
льду в течение 30 мин, центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ
СаСl2 и хранят на льду в течение ночи для использования. Аликвоты (0,5 мл) хранят замороженными при -70°С.
Смешивают 3 нг dCMP-удлиненной ДНК с 22 нг dCMP-удлиненной Pst l, обработанной pBR322 в 50 мл THE-буфера. Инкубируют при четырех последовательных стадиях при 65, 46, 37 и 20°С. Прибавляют 20 µл 100 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 100 мМ CaCl2, 100 мM MgCl2 и 50 µл THE буфера, смесь охлаждают на льду 20 мин.
Рекомбинантные молекулы РНК добавляют к 100 µл обработанных Са клеток E.coli и смесь охлаждают нa льду в течение 20 мин. нагревают до 20°С в течение 10 мин. и прибавляют 0,6 мл триптоновой среды. Смесь помещают на 2 пластины с триптоновой агаровой средой, подготовленные как описано ранее. Эффективность трансфекции составляет 3,3 · 104 колоний на µг закаленной pBR322 трансфецилованной ДНК, нативная рВR322 дает 3 · 106 колоний на µr.
Так как плазмида pBR322 включает ген устойчивости к тетрациклину. E.coli реципиент, который был трансформирован плазмидой, будет расти в культуре, содержащей такой антибиотик, в отличие от нетрансформированных, таким образом, бактерий. Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию организмов-хозяев, трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или
рециклизованным вектором.
После 48 ч при 37°С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл
триптоновой среды (подготовленной, как описано выше) в углублениях микротитерных пластин. После инкубации при 37°С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40%-ного глицерина. Пластины выдерживают при -20°С и готовят набор из 100000 индивидуальных клонов трансформированной E.coli Х1776.
Пример 4. Рекомбинантные молекулы ДНК расщепляют, денатурируют и гибриди-
зируют с лейкоцитами поли(А)РНК, содержащими ИФН-αмРНК Гибриды рекомбинантных молекул ДНК-поли(А)РНК отделяют от негибридизиро ванной поли(А)РНК (стадия С). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают (стадия Д). Выделенную РНК испытывают на активность ИФН-αмРНК (стадия Е). Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов, способной гибридизироваться с поли(А)РНК в жестких условиях гибридизации a также вызывает образование ИФН-α в ооцитах. Еcли группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировывают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают. Этот процесс продолжают до тех пор, пока не будет идентифицирован единичный клон. Однако полученные рекомбинантные клоны не содержать полную последовательность с ДНК ИФН-α.
Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой. После инкубации при 37°С каждый клон разрастается в колонию несколько миплиметров в диаметре. Все колонии отмывают с пластин и собирают, получают инокулум, использованный для инокулирования 1 л триптоновой среды, заполнившей, как описано
выше, 2 л колбу Эрленмейера. Культуру встряхивают при 37°С до появления ОД650
примерно 0,8 (оценено визуально). Один объем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170 µг/мл прибавляют к культуре, которую снова встряхивают при 37°С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформа и культуру cновa встряхивают 10 мин при З7°С, чтобы удалить бактерии. Культуру декантируют с хлороформом, клетки собирают центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин при 4°С. Получают примерно 1 – 2 r клеток из каждого литра рецептуры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 мМ Трис-НCl (рН 7,5), центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин и 4°С, повторно суспендируют а 30 мл 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5). Прибавляют 0,25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трис-НСl (рН 7,5)), после охлаждения в течение 10 мин при 0°С прибавляют 0,33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-НСl-культур), 0,5 М ЭДТУК (рН 8,0), осторожно перемешивают без встряхивания. Еще через 10 мин при 0°С прибавляют 1/16 oбъема (снова считая на первоначальный объем) 2% Тритона X-100. Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0°С в роторе. Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и
прибавляют 3 М NaOH при перемешивании до тех пор, пока не будет достигнут рН 12,5
измеряя при 20*, используя стеклянный электрод и рН-метр, стандартизированный
стандартным карбонатным буфером Бекманн рН 10 (N°3505). После перемешивания
в течение 10 мин при 20°С устанавливают рН 8,5. После еще 3 мин перемешивания
прибавляют 1/9 объема 5М NaCI и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного
9,5 М NaCi) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0°С в течение 10 мин. Надосадочный слой, содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК), осторожно удаляют из промежуточной фазы (которая содержит однониточную ДНК) и 3 раза экстрагируют хлороформом. (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии). Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантные молекулы ДНК (рВR 322-сДНК вставка), первоначально использованные для трансформации этих клеток организма-реципиента, которые образуют часть 512 клонов, выбранных для испытания.
Прибавляют панкреатическую РНКазуА (5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85°С) к форме 1 ДНК до концентрации 20µ г/мл и инкубируют смесь в течение 60 мин при 37°С. Прибавляют 1/5 объема 5 М NaCl и смесь обрабатывают 30% полиэтиленгликолем 6000 до окончательной концентрации 7,5% ПЭГ. После 2 - 16 ч. при -10°С собирают осадок в роторе в течение 20 мин при 8000 об/мин и 0°С, растворяют в 0,075 М NaCl, 0,0075 М нитрата натрия до поглощения 20 при 260 нм и доводят до 0,5% ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при 37°С с 0,5 мг/мл проназы (20 мг/мл. 2 ч при
З7°С) и 3 раза экстрагируют 1 объемом перегнанного фенола и 2 раза 1 объемом хлороформа. Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте
сахарозы от 5 до 23% в 50 мМ Трис-НС! (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК в течение 15 ч при 21000
об/мин и 15*. Собирают фракции и контролируют ОД260. Собирают фракции, содержащие ДНК и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20 –100 µг смеси ДНК.
20 µг ДНК обрабатывают в 150 µл 10мМ Трис-НСl (рН 7,5), 6 мМ MgCI2, 50 мМ NaCI,
6 мМ 2-меркаптоэтанола, 200 µг/мл БСА или желатина и 20 единиц Hind Ill. Эндонуклеазой Hind lll расщепляют плазмиду pBR 322. После 2 часов при 37°С аликвоты (1 %) подвергают электрофорезу на 1 % агарозном геле в 50 мМ триc-ацетате (рН 7,8), 2 мМ ЭДТУК в течение 1 ч при 50 мА, чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработка не закончена прибавляют еще Hind Ill и продолжают инкубацию еще 2 ч. Когда ДНК полностью расщеплена, прибавляют проназу, ЭДТУК и ДСН в количестве 0,5 мг/мл, 10 мМ и 0,5% соответственно. После 30 мин при 37°С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (1:1). Промывают 50 µл р-ра 20 мМ Трис-НС) (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК. объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром, фильтруют через колонку 0,1 мл обработанную ЭДТУК, и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2,5 объемами этанола. После хранений в течение ночи при -20°С ДНК собирают центрифугированием.
Готовят две гибридизирующие смеси. Смесь 1 содержит 4 µл 10-кратно концентрированного буфера (4М NaCI, 0,1 ПИПС (рН 6,4, 1,4-пиперазиндиэтансульфокислота). 50 MM ЭДТУК, 0,5 µл (около 5 нг 125J-глобин
мРНК (5000 спм) и 6 мл индуцированной лейкоцитарной поли(А)РНК (2 µr / µл). Смесь ll содержит 10 µr обработаннои Нind lll ДНК и 0,1 µr Pst-Z-pBR322 (H3)Rc βG 4,13 ДНК
(производная pBR322, которая содержит последовательность β-глобина в Hind lll сайте). Обе смеси сушат в парах газообразного азота. Прибавляют 40 мл 80% формамида к
остатку смеси ll и денатурируют раствор в течение 10 мин при 100°С и быстро охлаждают на льду. Денатурированный раствор используют для растворения смеси l, а полученный раствор инкубируют при 56°С в течение 4 ч.
После разбавления до 1 мл холодным 0,9 М NaCI, 0,09 М нитратом натрия и 100%-ным формамидом до 4% (по объему), раствор фильтруют при 0,5 мл/мин через фильтр Миллипор (размер пор 0,45 мм), сначала фильтр испытывают на его способность удерживать гибриды ДНК/РНК, потому что не все фильтры, полученные от производителя, в равной мере эффективны.
Погружают указанный выше фильтр с гибридами поли(А)РНК в 1 мл 0,15 М NaCl. 0,015 М нитрат натрия, 0,5% ДСН в течение 10 мин при 37°C, промывают 50 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 10 мМ МgСl2, 2 мМ СаСl2 и помещают в 0,6 мл свежего буфера. Добавляют 5µ л ДНКазы, обработанной иодацетатом (5 мг/мл). Фильтр инкубируют при 37°С в течение 10 мин. Удаляют фильтр и экстрагируют раствор 1 объемом фенола и 1 объемом эфира и пропускают через колонку с 0,1 мл. Прибавляют к раствору 5 µг РНК-носителя (РНК очищенных дрожжей) и осаждают РНК ацетатом натрия и этанолом. Осадок собирают центрифугированием при 10000xg, растворяют в 100 мл 1 мМ ЭДТУК, нагревают 90 с nри 100° С и прибавляют ТНЕ и ДСН до 2 THE и 0,5% ДСН. Адсорбируют РНК на колонке с 100 µг олиго dТ/целлюлозы, элюируют четырьмя промывками 0,З мл дистиллированной воды и осаждают ацетатом натрия и этанолом. После 16 ч при -20°С осажденную РНК отделяют центрифугированием и растворяют в 2 мл буфера ТНК.
Раствор поли(А)РНК, полученный ранее, инъецируют в 40 ооцитов (примерно 5 нл в ооцит). Ооциты инкубируют при 23°С в течение 24 - 48 ч. гомогенизируют и центрифугируют (или инкубируют собранную среду] и испытывают, как описано ранее для ИФН- α.
Проводят большинство последующих опытов с рекомбинантной молекулой ДНК из одного клона с ДНК, связанной с бумагой ДВМ или ДРТ. Бумага ДРТ дает меньший фон.
Листы ватмановской бумаги 540 (20 г) перемешивают 16 ч при 20°С со смесью 70 мл 0,5 М NaOH, 2 мг/л NaB Н4 и 30 мл 1,4-бутадиендиглицидилового эфира. Затем бумагу переносят в раствор 10 мл 2-аминотиофенола в 40 мл ацетона и перемешивают 10 ч. Отмывают ацетоном. 0,1 н.НС1, Н20, 0,1 н.НС1, Н20, сушат. Бумагу APT диазотируют до бумаги ДРТ.
ДНК (до 15 µr) связывают на 50 мм2 диазотированной АВМ (ДВМ) или диазотированной APT (ДРТ) бумаги.
Гибридную плазмиду ДНК гидролизуют Pstl, обрабатывают 500 проназы на мл 0,5% ДСН и 10 мМ ЭДТУК в течение 30 мин при З7°С, экстрагируют фенолом и эфиром.
пропускают через колонку 0.1 мл и осаждают этанолом. Инкубируют денатурированную нагреванием ДНК (до 5 µг с малыми количествами добавленной 32Р-ДНК в качестве метки) при 0°С в течение ночи с 1 см2 бумаги ДВМ или ДРТ в 200 µл 25 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5), фильтры промывают 3 раза по 5 мин при комнатной температуре 50 мМ калийфосфатным буфером (рН 6,5), 1% глицина и 3 раза 99%-ным
перекристаллизованным формамидом. Далее инкубируют в 99% формамиде в течение 2 мин при 68°С, потом 3 раза промывают в 50 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,5) при
20°С и два раза промывают в 0.4М NaOH при 37°С в течение 10 мин. На фильтрах остается около 40 - 60% радиоактивности. Фильтры инкубируют 3 ч при 38°С в предварительно гибридизованной среде А, заполненной 1% глицина, используя 330 µл на
фильтр. Среда А содержит 50% формамида. 5хССК, 0,4% поливинилпирролидона, 0,04%
фикола, 0,1% ДСН, 25 µг поли(А) (Р и Z) и 100 µr дрожжевой РНК/BДH, экстрагированная
6 раз фенолом и осажденная этанолом. Фильтры дважды промывают в среде А, а
затем гибридизуют в течение 16 ч при 38°С (поли(А)РНК, как указано, обычно 5 - 8 мг) в
среде А в парафиновом масле. Прибавляют РНК следующим образом: один влажный фильтр ДНК промокают и кладут в стерильную чашку Петри. 20 - 40 µл раствора РНК
наносят пипеткой на этот фильтр, а второй фильтр ДНК (или дубликат или контроль)
кладут наверх и сэндвич покрывают стерильным парафиновым маслом. После гибридизации фильтры последовательно промывают в среде А (2 раза) в растворе, содержащем 1хССК, 0,2% ДСН. 1 мМ ЭДТУК (3 раза, 10 мин при 20°С каждый, среде А (2 ч при 38°С) и в 50 % формамиде. 5хССК, 0,1% ДСН (3 раза, 10 мин при 20°С). Гибридизованную РНК элюируют при нагревании в течение 1 мин при 100°С в 200 µл 10 мМ Трис-НСl (рН 7,4), 1 мМ ЭДТУК и 0,1% ДСН.
Отбирают клон Ш-4-С, который содержит рекомбинантную молекулу ДНК, способную гибридизовать ИФН-α и РНК.
Рекомбинантная молекула ДНК в этом клоне обозначена: Z-pBR322(PstllHclF- 4c/Hif-4c), а бактериальный штамм, содержащий ее: E.coti Х1776 (Z-pBR322)Pst HclF04C(E.coli Hif-4c).
Пример 6. "Так как первичные клоны из трансформированных клеток иногда содержат более одного вида рекомбинантных молекул ДНК, Hif-4c выделяют и E.coli Х1776 (Hif-40 клонов и очищают. Oразцы Hif-4C и pBR322 гидролизуют PstI и анaлизируют электрофорезом на 1% агарозном геле.
E.coli HB101 трансформируют Hif-4C ДНК. Отбирают 6 клонов трансформированных бактерий, стойких к тетрациклину, выделают из них ДНК, очищают и анализируют с помощью Pstl гидролиза, электрофорезом на агарозном геле. Одну ДНК обозначают Z-pBR322/Pst (HclF-4c (Hif-4C) и используют.
Hif-4C и вставку гибридизуют с ИФН-α и РНK, подвергают гидролизу 125 единицами PstI, эктрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. Аликвоту (10 µr растворяют в 100 µл 50 мМ Трис-НCl (рН 7,5), пропускают его через 0,1 мл колонку и
обрабатывают его 0,6 единицами бактериальной щелочной фосфатозы в течение часа
при 65°С. Добавляют 10 кратно концентрированный буфер THE (40 мл) и раствор экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола и 3 раза 1 объемом хлороформа. ДНК осаждают 2 объемами этанола при -20°С в течение ночи и собирают центрифугированием. Для дальнейшей очистки образец в 0,5 мл ТНА адсорбируют на 0,25 мл ДЕАЕ целлюлозы, которую предварительно промывают 2 мл 150 мМ NaCl, 50 мМ Триc-HCl (рН 7,5), 2 мМ ЭДТУК (НЕТ-буфер), промывают 2 мл НЕТ буфера, элюируют 0,4 мл 1,5 М NaCl, 20 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 2 мм ЭДТУК и осаждают этанолом. Д Н К инкубируют с γ32 Р-АТФ (удельная активность около 5000 кюри/ммоль) и полинуклеотидкиназой и очищают хроматографически на 3 мл колонке Сефадекс G-50 в ТНЕ. Элюированные фракции собирают и осаждают 32Р-ДНК этанолом.
Смешивают 90 µr немеченной расщепленной Pstl Hif-4c ДНК с 6·105 дпм 32Р-меченной расщепленной Pstl Hif-4c ДНК и роводят электрофорез через 10х20х0,7 см.
2% горизонтальный агарозный гель в 50 мМ трис-ацетатного буфера (рН l 7,8) используя
гель 2,5 см. Пленку на геле экспонируют Х-лучами и определяют положение фрагмента 320-вр. Полосу геля, содержащую радиоактивную полосу (1,3·105 дпм), вырезают, измельчают, продавливая через 2 мл пластиковый шприц, и экстрагируют в течение ночи при 4°С при перемешивании 10 кратным по отношению к объему геля объемом буфера НЕТ. ДНК адсорбируют на 0,1 мл колонке гидроксиапатнта. предварительно промытой 1 мл НЕТ буфера. Колонку промывают 1 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 7,5) и элюируют ДНК 0,2 мл 1 М калийфосфатного буфера (рН 7,5). Элюат разбавляют 10-кратным объемом стерильной дистиллированной воды и адсорбируют ДНК и элюируют из ДЕЛЕ, осаждают этанолом. Такая ДНК называется "Hif-4c фрагмент".

Фрагмент Hif-4c (120 нг) связывают с бумагой ДРТ (0,5х0,5 см). Для контроля 120 нг фрагмента β-глобина сДНК обрабатывают с Hind Ill из гибридной плазмиды Rcβ
G-4,13 Z-pBR322 и обрабатывают аналогично. Гибридизацию двойных фильтров к поли(А) РНК (В 20 мкл). промывку фильтров и выделение РНК с фильтров проводят как описано выше. После введения в асциты определяют следующие значения активности ИФН- α:

Фрагмент ДНК Количество лейкоцитной поли(а)РНК (мкг) Время гибридизации (часы) Активность ИФН-а (1v/мл) (повторный анализ)
Hif –4c
в-глобин сДНК
Hif –4c
н-глобин сДНК
Hif –4c
в-глобин сДНК 2,5
2,5
7,5
7,5
7,5
7,5
16
16
16
16
5
5 250 : 100
4 : 1
3000 : 1000
4 : 30
1000 : 1000
10 : 1

*) 1мкг этой РНК дает 4600 lU /мл
**) Надосадочный ооцит после 48 ч инкубации, анализ по снижению цитопатического
эффекта

Пример 7. Вставка сДНК в рекомбинантной молекуле Hif-4c составляет только около 320 вр или треть от оценочного размера ИФН-дмРНК. Описанный выше очищенный фрагмент Hif-4c используют в качестве зонда для отбора бактериальных клонов, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК имеющие родственные вставки гибридной ДНК.
Описанные выше 64 бактериальных клона, составляющих подгруппа λ-lll дробят на миллипористой мембране (диаметр 8 см), помещают на пластинку агара (с добавкой диаминопимеллиновой кислоты налидиксовой кислоты и тетрациклина, как указано выше) инкубируют в течение 24 ч при З7°С. Фильтр помешают на 0,75 мл каплю 0,5 М раствора NaOH и через 2 - 3 мин переносят на бумажное полотенце, чтобы удалить избыток жидкости, эту стадиют повторяют. Фильтр нейтрализуют, используя буфер 1,5 М Трис-НCl (рН 7,5) и промывают смесью 1,5М NaCI-0,5 М Трис-НО (рН 7.4) и высушивают на воздухе. Фильтр окунают в 0,3 М раствор NaCI, высушивают на воздухе и нагревают в вакууме 2 ч при 80°С.
Фрагмент Hlf-4c Pst(30нг) метят изотопом 32Р посредством трансляции метки, используя β32Р dАТФ и а 32Р dЦТФ (удельная активность, 40 Кюри/ммоль для каждого).
Фильтр, несущий λ-Ill колонии, предварительно гибридизуют в 4 х СЕТ (СЕТ-это 0,15 М NaCI, 30 мМ Трис-НО (рН - 8), 1 мМ ЭДТУК). 0,1% (вес/объем) фиколла, 0,1%
поливинилпирролидина, 0,1% (вес/объем) альбумина бытьей сыворотки (АБС) 0,5% ДCH и 200 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося в течение 7 час при 68°С и гибридизуют с 2,10 срм меченого 32Р фрагмента Hif-4c в 4 х СЕТ, 0,02 % (вес/объем) фиколла, 0,02 % поливинилпирролидина, 0,02% (АБС, 0,5% ДСН и 2300 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосоля при 68°С в течение 16 час). Фильтр промывают смесью СЕТ-0,5% ДСН при комнатной температуре, промывают 2 х СЕТ-0,5% ДСН в течение 5 ч при 68°С, заменяя один раз раствор, и 3 мМ основания Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч, заменяя один раз раствор. После высушивания фильтра рентгеновскую пленку экспонируют этим фильтром в течение 80 ч. применяя экран. Три колоннии дают сильный положительный сигнал, а именно λ-lll- 7D λ-lll-2H и λ -lll-4с, и две колонии - слабый сигнал, а именно λ-lll-lЕ и λlll-3D. z
Малые культуры готовят из родственных Hif-4c клонов, форму 1 ДНК очищают, расщепляют с PstI и анализируют посредством электрофореза на геле агарозы. Все формы 1 ДНК создают большой фрагмент (плазмидная pBR 322 функциональная группа) и малый фрагмент (гибридная вставка). Молекулы рекомбинантной ДНК λ-lll-2H содержат наиболее крупную вставку, а именно приблизительно 900 млрд.ч. Эту молекулу pекомбинантной ДНК обозначают Z-pBR 322 (Pst)/HCIF-2H/(Hif-2H), а ее вставку "Hif-2H фрагмент".
Определяют споcобность Hff-2H связывать ИФН-α мРНК посредством гибридизации по отношению к поли(А) РНК (0,3 мкг/мкл).
В последующем эксперименте готовят дополнительный набор клонов Е.соli, содержащих молекулы рекомбинантной ДНК, и определяют гибридизацию колоний к мече
ному фрагменту Hif-4c. Для того, чтобы обеспечить высокий выход плазмид с длинными вставками сДНК, часть меченной 32Р лейкоцитной сДНК. полученной энзиматически из лейкоцитной поли(А) РНК. фракционируют по размеру посредством центрифугиования через градиент плотности сахарозы, иcпользуя методику, аналогичную описанной для центрифугирований поли(А) РНК. Фракции, содержащие сДНК, со скоростью cедиментации, соответствующей 600 млрд.ч. фрагмента ДНК или более, обьединяют и после осаждения этиловым спиртом выделяют сДНК. Эту сДНК удлиняют остатками dCMP. pBR322, удлиненную dGMP, расщепляют Pstl и гибридную ДНК используют для трансформации штамма Е.coli НВ101. Бактерии наносят на миллипористые фильтры диаметром 8 см. помещают на пластинки агара триптоновой среды (содержащие 10 мкг/мл тетрациклина) и выращивают, пока не появляются малые колонии. Фильтр реплики готовят прессованием свежего, влажного миллипористого фильтра на фильтр, содержащий колонию, помещают его лицевой стороной нaвepx агаровой пластины, содержащей 4,4 % глицерина, и инкубируют его, пока не появились малые колонии. Этот содержащий колонии фильтр покрывают дополнительным миллипористым фильтром, замораживают при 55°С и хранят. Готовят 18 фильтров, содержащих, в общем, около 5000 колоний. Одну реплику каждого фильтра используют для гибридизации к меченому 32Р Pst Hit-4c фрагменту ДНК. На авторадиограмме идентифицируютоколо 185 положительных колоний, которые субклонируют на миллипористых фильтрах и идентифицируют повторно посредством гибридизации. 95 клонов, дающих наиболее сильный отклик гибридизации, обозначают от Z-рBR 322 (Pst)/HclF-SNI до SN95 и используют для дальнейших исследований.
Очевидно, при наличии способности Hif-2 продуцировать полипептид. проявляющий иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН, Hif-2h и другие родственные последовательности оснований ДНК, могут применяться в этом способе отбора клонов, содержащих последовательности основания ДНК, кодирующих интерферон α2.
Пример 8. Расщепленный фрагмент Z pBR322(H3)RcβG 4,13 динатурируюг в смеси 10 мкл 80% (об.) деионизированного формамида-20 мм буфера Пайпес (рН 6,4) в течение 10 мин при 80°. Раствор добавляют в трубку Эппендорфа, в которой высушивают смесь лейкоцитной поли(А) РНК (5 мкг), NaCi (4 мкмоль) и ЭДТУК (10 нмоль). Смесь нагревают в течение 7 ч при 48°С под слоем парафинового масла, охлаждают и разбавляют 20 мкл воды. Два ообразца разделяют на равные части и каждую из них нагревают 30 с при 100°. Нуклеиновые кислоты осаждают этанолом, растворяют в 3 мкл воды и анализируют на активность ИФН-α мРНК в ооцитах.
При гибридизации Hif-2h поли(А) РНК ингибируется трансляция ИФН-α мРНК в поли(А) РНК после денатурирования гибрида, ИФН α мРНК снова может транслироваться. Этот эксперимент подтверждает, что Hif-2h содержит последовательность, комплементарную к ИФН-αмРНК.
Получают плазмидную ДНК и обрабатывают различными рестриктазами за исключением того, что альбумин бычьей сыворотки в ферментном буфере заменяют на 200 мкг-мл желатина.
Леаниризованную ДНК (20 мкг) экстрагируют фенолом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 0,05 М растворе буфера Трис-НСl (рН 8) и пропускают через небольшую колонку Челекс-100. Фрагменты с 5'-липкими концами дефосфолируют путем
обработки с 0,2 единицами телячьей кишечной щелочной фосфатозы на пмоль концов 5' ДНК в 200 мкл 0,02 М раствора Трис-HC2 (рН 8) в течение 60 мин при З7°С. Фермент дезактивируют нагреванием при 65°С в течение 60 мин. Для фрагментов ДНК с 3'-липкими концами используют бактериальную щелочную фосфатазу, с тем исключением, что инкубируют при 65°С в течение 30 мин, фосфорилированную ДНК очищают путем адсорбции и элюирования ДЕАЕ-целлюлозы или подвергают полиакриламидному
гельэлектрофорезу. Фрагменты, выделеные из геля полиакриламида (или агарозы) в 0,15М растворе NaCI, 0,05 М-Трис-НСl (рН 8), адсорбируют на 0,1-миллилитровой оксиапатитовой колонке, промывают 4 раза 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7) и элюируют 0,3 мл 1М калий-фосфатного буфера (РН 7). Раствор разбавляют десятикратно, и адсорбированную на ДЕАЕ-целлюлозе ДНК выделяют.
После осаждения этиловым спиртом ДНК метят 5'-терминально с помощью [γ32Р]АТР(12 - 34 мкКюри на пмоль 5'-концов (ДНК), а полинуклеотидную киназу ДНК не денатурируют до реакции киназы. Получают удельные активности 1 – 1,5 мкКюри 32Р фосфата на пмоль концов-5’-ДНК.
Для определения последовательности аминокислот меченые фрагменты расщепляют вторым ограничивающим ферментом, и продукты выделяют электрофорезом через 5%-ный полиакриламидный гель в буфер триc-борат-ЭДТУК. Целевые фрагменты экстрагируют из геля и очищают. Различные фрагменты для определения последовательности аминокислотных остатков готовят следующим образом:
1) расщепление Нif-2h с помощью В Spl, выделение В Sрl-В Sрl-232 и B Spl-B Spl-949
посредством гель-электрофореза через 5% полиакрламида в буфере Доенинга:
2) расщеплеие Hif-2h с помощью B Spl введение метки, расщепление с помощью PstI, выделение Bspl*-PstI-83 и BSpl*-Pst1-227;
3) Расщепление Hif-2h с помощью Bglll, введение метки, расщепление с Pstl, выделение Bglllx-Pst 1-336 и Bglll*-Pst1-570;
4) расщепление Hif-2h с помощью Mb011, введение метки, гидролиз с помощью Pst1 и Hindll, расщепление фрагмента pBR322, 350 млрд.ч., выделение МЬо11*-Pst 1-519 и Mbo11 *-Pst I –351;
5) Расщепление Hif-2h с помощью EcoR1, введение метки, расщепление с Pst1, выделение EcoR1*-Pst 1-707 и EcoRl*Pstl-198:
6) расщепление Hif-2h с помощью Pst1, введение метки, расщепление с Bglll, выделение Pst1*-Bglll-570 и Pst1*-Bglll-336:
7) расщепление Hif-2h с Avall, введение метки, расщепление с Pst1 и Bglll, выделение Avall*-Pst 1-186 и Avall*-Bgll-147.
8) Расщепление Hif-2h с Pvull, введение метки, расщепление с Pstl и Bglll, выделение Pvull-Pstp-486.
Продукты фракционируют на 0,1х25х36 см 12% полиакриламидных гелей (акрилaмид/бисакриламид = 18/1) в 50 мМ триc-бората, 1 мМ ЭДТУК (рН 8,3) с длительностью операций 2, 8, 18 и 26 ч при 90 в с предварительной выдержкой 6 ч при 700 в. Наилучшие результаты получают, когда гели до использования выдерживают при комнатной температуре 2 - 3 суток.
Определяют нуклеотидную последовательность к ДНK вставки.
Причем гетерополимерную часть вставки заслоняю сбоку остатками 23G на 5'-конце и остатками 7А (вероятно, относящимися к концевой группе поли(A)мРНК), за которыми следуют остатки 15С на концах-3'. Вставку пронумеровывают от первого нуклеотида после dG-хвоста к последнему нуклеотиду до остатков поли(A).
Определено, что АТС, расположенная в нуклеотидах 57 - 59, является фактически первой АТС, аутеничной мРНК.
Кодон в Hif-2h фрагменте, соответствующий первой аминокислоте из лимфобла-
стоидного интерферона, представляет собой 22 кодна из первого AuG (и 14 кодонов из второго), что указывает на то, что последовательности, кодирующей интерферон, может предшествовать последовательность, определяющая сигнальный пептид, состоящий из 23 (или, что менее вероятно, из 15) аминокислот. Более длинные из предполагаемых сигнальных последовательностей содержат непрерывно серии из 11 гидрофобных аминокислот (а более короткие из 6 гидрофобных аминокислот).
По-видимому. нуклеотидная последовательность, соответствующая "созревшему" ИФН-α полипептиду, включает в себя 498 нуклеотидов, кодирующих 166 аминокислот. Основной состав кодирующей последовательности соответствует 50% GC.
Цепь ДНК, имеющую ту же последовательность, что и м-РНК, обозначают как плюс-цепь, а ее комплемент как минус-цепь. Hif-2h ДНК расщепляют рестиктазой Bglll, концевую группу метят 32Р-фосфатом и ДНК переваривают Pst1, в результате получают более длинный фрагмент 545 bр./570 bр. и более короткий 340 bр радиоактивный фрагмент. Эти фрагменты денатурируют и превращают в поли(А) РНК из индуцированных лейкоцитов в 80% формамиде, 0,4 М NaCI, т.е. в условиях, в которых не происходит вторичной ассоциации ДНК-ДНК (см. выше). Нуклеиновые кислоты расщепляют нуклеазой Sl, которая разрушает все одноцепочечные нуклеиновые кислоты, особенно негибридизованную 32Р-ДНК, и продукты разделяют на полиариламидном геле.
Проводят такой же эксперимент, как описано в предыдущем разделе, но используют поли(А) РНК из неиндуцированных лейкоцитов человека, получаемых по той же методике, что и индуцированые вирусом лейкоциты Sendai. По сравнению с результатами предыдущего раздела поли(A) РНК из неиндуцированных клеток содержит
1/20 количества способной гибридизации в Hif-2h м-РНК, содержащегося в поли(А) РНК
из индуцированных клеток.
Находящийся в pBR322 Pst1-сайт находится в β-лактамазном (пенициллиназном)
геле. Следовательно, если кодирующий ДНК-сегмент (например с-ДНК, включающая весь ген или часть гена) расположен в позиции с соответствующей ориентацией, то в результате получают "липкий" (fused) белок. Белок состоит из амино-концевой части β-лактамазы и последующей аминокислотной последовательности, которая кодирует целевой белок. Для гарантии того, что Hif-4c вставлена в нужную рамку считывания для экспрессии β-лактамазонового гена, используют набор производных pBR322, а именно рКТ279, рКТ280 и рКТ287. Каждое из этих производных имеет Pst1, локализованный таким образом, что гетерогенная ДНК, встроенная в этом сайте будет находиться в правильной рамке считывания. Pst1 -изъятую вставку из Hif-2h получают также, как описано для фрагмента Hif-4c, Hif-2hPst фрагмент (10 нг) смешивают с Pst1 -расщепленным pBR322, рКТ279, рКТ280 или рКТ287 в каждом случае 10 нг в 20 микролитрах 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), 6 мM MgCI2, 100 мМ NaCl, 6 mM β-меркаптоэтанола, 200 микрограмм/мл желатины и 0,1 мМ АТФ и инкубируют с 0,1 единицей Т4 ДНК-лигазы в течей не 16 ч п ри 10°С. Результирующие молекулы рекомбинантной ДНК обозначают как Z-pBR322(Pst) (HclF-2h Z-pKT279(Pst)(HclF-2h Z-pKT280(Pst) HclF-2h и Z-pKT287(Pst)(HclF-2h), E.coli HB101 трансформируют каждой из этих рекомбинантных молекул ДНК и трансформированные колонии отбирают из содержащих тетрациклин агаровых пластинах. Такие устойчивые к тетрациклину клоны трансформированных бактерий содержат рециклизованный вектор, бактериальные колонии каждого набора выращивают из миллипоровских фильтрах и колонии, гибридизованные 23P--меченым Hlf-4c фрагментом идентифицируют и отбирают так,
как описано выше. Штаммы описываются следующим образом:
E.coli НВ101 (Z-pBR322/Pst(HclF-2h-АН1) до (-АН3);

E.coli HB101 (Z-pBR322(Pst)HclF-2h-АН1) до (-АН3);

E.coli HB101 (Z-pKT279(Pst)/HclF-2h-АН1) до (-АН8);

E.coli HB101 (Z-pKT280(Pst)/HclF-2h-АН1) до (-АН8):

E.coli HB101 (Z-pKT287) (Pst)/HclF-2h-АН1) до (-АН8).

Экстракты некоторых вышеприведенных штаммов, а также некоторые из штаммов Z-PBR 322/Pst/(HclF-SN1 к 95) испытывают на активность ИФН-α. Бактерии выращивают на триптоновой среде до стационарной фазы, собирают, прорывают 1/20 объема (по отношению к объему культуры) 50 мМ трис-HCI (рН 8), 30 mMNaCI и замораживают. После оттаивания клетки снова суспендируют в указанном ниже объеме вышеуказанного буфера и добавляют лизоцим до 1 мг/мл. Через 60 мин и при 0°С суспензии замораживают (в бане этанол-сухой лед) и оттаивают при 37°С) 5 раз и центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин на центрифуге. В некоторых случаях часть надосадочного слоя далее центрифугируют при 100000g на центрифуге и выделяют надосадочные слои. Такие надосадочные слои испытывают на активность ИФН-α с помощью определения снижения цитопатического эффекта. Колонии, дающие положительную реакцию в примере 1, подвергают новому определению вместе с 49 клонами из серии Z-pBR322 HclF-SN-1 до SN-95.
Некоторые из приведенных наиболее активных производителей проверяют более
тщательно. Культуры выращивают до поздней логарифмической фазы (наблюдаемое
0Д650 равно приблизительно 0,9) и клетки лизируют в 1/50 объема культуры. Обнаруживают следующие активности с использованием в качестве отрицательного контроля Z-pBR 322(Pst)(HclF SN32).

Источник экстракта: E.coli HB 101 трансформированная с помощью: Получение
№ Активность ИФН-α (IU/мл) (двойное определение)
Z-KT279(Pst) /HclF-2h-AH8
Z-KT280(Pst) /HclF-2h-AH3
Z-KT287(Pst) /HclF-2h-AH6
Z-pBR322(Pst) /HclF-SN 35
Z-pBR322(Pst) /HclF-SN 42
Z-pBR322(Pst) /HclF-SN 32 S 30. S 100
S 30. S 100
S 30. S 100
S 30. S 100
S 30. S 100
S 30. S 100 100: 300
1000: 1000
200: 200
1000: 1000
300: 100
0: 0

Полученные белки обладают иммунологической или биологической активностью ИФН.
Плазмиду Hlf-SW35 обрабатывают Pst1, LAC-Alu фрагмент встраивают в плазмиду. Определяют структуру модифицированной плазмиды Z-pBR322(Pst) (HclF-SN35-AHI6), а также аминокислотную последовательность с концевым амином для белка, получаемого в Е.соli. Нуклеотидная конструкция соответствует такой последовательности, в которой фрагмент LAC-Alu присоединен к первой аминокислоте из ИНФ-α 1(SN 35). Аминокислотная последовательность амино-концевой части полученного в E.coli протеина подтверждaет, что получают "липкий" белок, имеющий шесть аминокислот, встроенный в последовательность ИФН- α l(SN 35). Однако штамм, трансформированный модифицированной плазмидой, производит приблизительно в 100 раз больше полипептида, обладающего биологическими и иммунологическими свойствами человеческого лейкоцитарного интерферона по сравнению с организмом хозяина, трансформированным немодифицированным Z-pBR322(Pst) (Нсl F-SN35).
Гибридную плазмиду расщепляют BSpl. После термической инактивации (65°С, 30 мин) фермента смесь доводят до концентрации 50 мМ трис-HCI (рН 8) и нагревают (37°С, 30 мин). После экстракции фенолом и эфиром самый крупный фрагмент 1 сДНК выделяют при низкой температуре на желатинизированной агарозе (0,8%) и присоединяют связующие Hind lll. 3aтeм модифицированный фрагмент присоединяют к расщепленной Hind lll плазмиде HS-pBR322/EcoRI/ α acuv5-150/LAC-150/ выделением из содержащих фрагмент гелевых частиц (каждая приблизительно по 20 микролитров) при 65°С, охлаждением до З7°С и добавлением 20 ед/мл Т4 ДНК-лигазы. Через 16 ч при 15°С в отвердевшем геле происходит связывание. Одну десятую объема 100 мМ трис-НСl (рН 7,5),100 мМ СаСl2, 100 мМ MgCI2 добавляют в образец, нагревают 5 мин при 65°С и охлаждают до З7°С. Образцы затем используют для трансформации обработанной Cа2+ Е.соliHB101, инкубируют при 0°С в течение 20 мин, нагревают при 42°С в течение 1 мин и в течение 10 мин при 20° С. После добавления 1 М триптоновой среды образцы инкубируют 60 мин при З7°С и помещают на агаровые пластинки, содержащие ампициллин. Затем от этих культур отделяют плазмиду ДНК и гибридную плазмиду, содержащую ИФН-α 1 с его присоединенным по 5' -концу LAC-фрагментом, идентифицируют ограничительным анализом. Затем плазмиду расщепляют с помощью EcoRI и переваривают экзонуклеазой BaL-31 (0,06 ед/мл. 2 - 4 мин при 30°С) для удаления выступающего EcoRI конца фрагмента LAC и для укорачивания β-галактизидазного кодирующего сегмента.
Плазмиду расщепляют Bglll, самый большой фрагмент отделяют на агарозном геле
(0,8%). Затем этот фрагмент объединяют с фрагментом BSpl-Bglll из Z-pBR322/Pst/
/HclF-SN35 и результирующую гибридную плазмиду используют для трансформации
E.coli HB101. Трансформированные колонии подвергают отборочным испытаниям на
ИФН-активность и выбирают один клон, имеющий высокую ИФН-активность. Этот клон обозначают E.coli HB 101(C8-ИФН-α1), а его гибридную плазмиду С8-ИФН- α1.

Анализ С8-ИФН-с1 последовательности ДНК показывает, что кодирующая последовательность, следующая за инициирующим триплетом, определяется
первыми семью аминокислотами β-гадлактозидазы, остаток Pro образован слиянием
аминокислот от 16 до 23 в сигнальной последовательности ИФН- α1 последовательности ИФН- α1 (SN 35). Миниклеточные штаммы E.coli (DS 410), трансформированные гибридной плазмидой С8-ИФН- α1 производят приблизительно 50 миллионов единиц ИФН на литр, или приблизительно в 2500 раз больше полипептида, обладающего иммунологической или биологической активностью ЧеИФН по сравнению с миниклетками, трансформированными немодифицированным Z-pBR322(Pst)(Hif SN 35).
Аминокислотная последовательность полипептида, полученного с помощью плазмиды С8-ИФH- α1 подтверждает, что продукт представляет собой "липкий" белок, имеющий семь аминокислот из β-галактозидазы, одну кислоту, образовавшуюся в результате
слияния аминокислоты 16 - 23 из сигнальной последовательности ИФН- α1 входящей
в ИФН- α1.
Пример 9. 50 микролитров образцов аутеничных ЧеИФН- α (специфическая активность 1,2x106U (мr, 50U), экстракты S100, описанных выше E.coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HclF-2h AHC(“Hif-287-6-экcтракты") (200U/мл, 10U) и E.coli HB101
(Z-pBR322(Pst)/HclF-SN 35) (“Hif-35 экстракты") (1000U/мл, 50U) инкубируют с различным количеством трипсина, как показано ниже, в течение 30 мин при З7°С. Так как экстракты S 100 имеют высокое содержание протеина, а ЧеИФН- α нет. то смесь ЧеИФН-α и контрольный экстракт S100Hif-32 испытывают параллельно:

Получение ИФН- α Трипсин (микрограммы) ИФН-α активность (единицы)
ЧеИФН-α (50 единиц в 50 микролитрах Hif-32 S 100 экстракте)



Hif-287-6S 100 экстракт (10 единиц) 0
0,1
1
10
50
0
0,1
1
10
50 50
50
50
5
0
15
15
5
1
0


Следовательно, ИФН-α экстрактов чувствителен к трипсину и следовательно, к протеину.
Hif-35 S100 экстракт
(50 единиц) 0 30
0,1 20
1 20
10 2
50 0
Экстракт Hif-35 (1 мл) и экстракт S100 E.coli HВ101 (Z-pBR322(Pst) (HclF-SN32)
("Hif-32 экстракты'') хроматографируют на 32 мл колонке Сефадекс G-100 при 4°С в 50 миллимолях К-фосфатного буфера (рН 7,4). Скорость потока составляет 2 мл/ч и отбирают фракции объемом 1,0 мл. Определяют поглощение при 280 нанометров, 405 нанометров (цитохром с) и ИФН-α активность. ИФН-α активность Hif-35 экстрактов элюируют перед цитохромом с величиной кд 0,45. Следовательно, кажущийся молекулярный вес вещества составляет от 20000 до 30000 в фракциях контрольного экстракта Hif-32 активности не было обнаружено.
ЧеИФН-α (специфическая активность 1,2х106 lu/мr) и Hif-35-Hif-287-6 S100 экстракты инкубируют с различными разбавленными растворами антисыворотки овцы против ЧеИФН-α (специфическая активность 450000 единиц/мл) в 100 микролитрах модифицированной среды Eagles (МСЕ) с 10% сыворотки теленка в течение 30 мин
при 37°С и 45 микролитов анализируют на ИФН-активность путем редукционного анализа цитопатического действия.


Препарат ИФН-α (единицы) Антитело антилейкоцитар-ного интерферона Остаточная активность ИФН-α (1U)
ИФН-α (10)



Hif-35 экстракт (25)



Hif-287-6 экстракт (25)



Нет 0
0,18
9
450
0
0,18
9
450
0
0,18
9
450
0
450 5
~ 0,5
< 0,1
< 0,1
15
15
< 0,1
< 0,1
15
15
< 0,1
< 0,1
< 0,1
< 0,1


Антитела, направленные против ЧеИФН-α, специфически ингибируют ИФН- активность полипептидов, полученных в E.coli трансформацией с некоторыми рекомбинантными молекулами ДНК, содержащими HclF-2h ДНК последовательность. Пониженное воздействие антитела на ИФН-α, полученное в E.coli, может отражать структурные различия между последним и натуральным ЧеИФН-α например, отсутствие углеводородного фрагмента, присутствие сигнальной последовательности, или слияние с частью β-лактамазной последовательности,
Клетки человека CCL23 или клетки мыши L-929 обрабатывают экстрактами E.coli ЧеИФН-α (специфическая активность 1,2х106 единиц/мг) или ИФ мыши, инфицируют вирусом и ИФН-α активность определяют путем анализа цитопатического эффекта.

Добавление
ИФН активность (единицы/мл)
система человека система мыши
Интерферон мыши (120 ед/мл)
Hif-35 экстракты

Hif-287-6 экстракты

ЧеИФН-α (100 ед/мл)
ЧеИФН-α (1000 ед/мл) -
100
1000
30
300
100
1000 120
13
120
4
40
4
40


Эти результаты показывают, что Hif-35 и Hlf-287-6 экстракты проявляют защитное действие на клетках человек и на клетках мыши проявляется слабый эффект (~10%), как это типично для интерферона человека.
Экстракты E.coli HВ101 (Z-pBR322(Pst)/Hif-SN 3-АН 6 сравнивают с аутентичным ИФН по его действию на некоторые функции клетки. ИФН-α, полученный из E.coli. проявляет следующие свойства натурального ИФН-α:(1) он увеличивает активность уничтожения лимфоцитов человека, (2) он усиливает цитотоксичность зависимой от антиела промежуточной клетки, (3) он подавляет ингибирование антиген и митоген-наведенной миграции лейкоцитов, и (4) он проявляет возрастание ИФН-чувствительности клеток. Эти свойства индуцированы активностью ИФН-α I’s синтезированным E.coli против опухолей и рака человека.
Пример 10. ИФН-α без амино-концевых последовательностей получают в E.coli
и подтверждают, что он проявляет активность в соответствии с активностью ИФН.
Для того, чтобы получить соответствующую рекомбинантную молекулу ДНК, плазмиду Htf-2h гидролизуют EcoRI и BamHI и фрагмент, содержащий ИФН-dα кодирующую последовательность, отделяют на агарозном геле и сливают с последовательностью, кодирующей → не-ИФН-α l-EcoRI/BamHI фрагмент плазмиды Hif-SN 35, в которой отсутствует Pst1 сайт, примыкающий к 3' концу гибридной вставки по сравнению с Hif-2h. Полученную плазмиду обрабатывают рестриктазой Pstl/Bgll амино-концевого фрагмента ИФН-α1 кодирующей последовательности. На его место встраивают ряд ИФН-α1 фрагментов, полученных гидролизом плазмиды Hif-2h с Pvu ll, обработкой Ва1 экзонуклеазы, присоединением Pst 1 линкеров с последующей обработкой Bgl Il. Полученные таким образом плазмиды содержат последовательности, кодирующие ИФН- α1, в которых отсутствуют различные части их аминоконцевых последовательностей. Плазмиду 2Н-М8 гидролизуют Pstl и определяют ее нуклеотидную последовательность. Плазмида 2Н-М8 содержит несколько нуклеотидов между Pst сайтом и первым кодоном ИФН-α1. Плазмиду 2Н-М8, гидролизованную PstI, обрабатывают полинуклеатидкиназой/dАТР, Sl экзонуклеазой и Sal 1. Эти фрагменты помещают под контроль LAC присоединением их к LAC фрагменту, полученному из плазмиды Lac 38 обработкой EcoRI эндонуклеазой S1 и Sal1. Кодирующие последовательности ИФН-α1 полученных таким образом ряда плазмид, испытывают недостаток различных частей на амино-конце, соединенных в направлении против часовой стрелки путем AUG с фрагментом, содержащим LAC промотор.
В клетках E.coli (DS 410) обе этих плазмиды экспрессируют полипептиды, которые проявляют ИФН-активность.
Проверяют клоны, которые проявляют слабую гибридизацию к фрагменту Hif-4c и идентифицируют клон E.аoii НB101 (Z-pBR322(Pst)/HclF-11-206).
Гибридная плазмида Z-pBR322(Pst) HclF-11-206 ("HCIF-11-206') из клона и его вставка ''Hif-11-206" слабо гибридизуется к Hif-4c и Hif=2h фрагменту. Трансформация
клеток E.coli плазмидой Hif-ll-206 обеспечивает получение полипептидов, проявляющих биологическую или иммунологическую активность ЧеИФН-α.
Нуклеотидную последовательность Hif-11-206 фрагмента (Pstl) фрагмент плазмиды
ДНК размером 790 вр. выделенной из культуры HclF-Y определяют с помощью общеизвестных методов.
Гидролизованную ДНК (обычно 10 микрограмм) метят по 5'. Меченые фрагменты разделяют вторым рестрикционным ферментом, продукты отделяют электрофорезом через 5% полиакриламидный гель в трис-борэт-ЭДТУК буфере, экстрагируют из геля и очищают. Получают следующие различные фрагменты:
25 и 26 - расщепление Hif-l 1-206 с помощью Pvu ll, мечение, расщепление с помощью Bg Ill, выделение PstI*-Bgl ll фрагмента (257 вр) (''25”) и PstI*Bglll фрагмента (279 вр) (“26”).
21, 22 и 23 - расщепление Hif-11-206 с помощью Pvull, мечение, расщепление с помощью Bglll, выделение Pvull*-Bglll фрагмента, (88 вр) ("21") Pvull*-Bgllt фрагмента (176 вр) (''22'') и PstI*Bg lll фрагмента (214 вр) (“23”).
11, 12, 13 и 14 - расщепление Hif-11-206 с помощью Bglll, мeчение, расщепление с помощью Pstl, выделение Bglll*-PstI фрагмента (279 вр) ("14") и комигрейтная смесь Bglll- Pstl фрагмента и Bglll*-Bglll* фрагмента. Расщепление смеси с помощью Pvu Il и выделение Bglll*-Pstl фрагмента (257 вр) (''13"),Bglll*-Pvu ll фрагмента (176 вр) (“12”) и Bglll*-Pvull фрагмента (88 вр) (''11”).
27L, 27U, 41, 43, 44 и 45-расщепление Hif-11-206 с помощью Hinfl, мeчение исходных фрагментов: Hinfl*-Hinfl* (113 вр) ("27”), Hinfl*-Hinfl* (146 вр) ("28'']: Hinfl*-Hinfl* (159 вр) (“30Р”). Hinfl*-Hinl* (379 вр) (''31 Р") и Hinfl*-Hinfl* (1522 вр) (''32Р''). Расщепление 28Р с помощью Мво11 и выделение фрагмента Hinfl* Mвo11 (112 вр) (''41”). Расщепление 30Р с помощью Мво11 и выделение фрагмента Hinfl*-Mвoll(125 вр) ("43']. Расщепление 31Р с помощью Pstl и выделение фрагмента Hinfl*-Pstl, (151 вр) (''44"). Расщепление 32Р с помощью Pstl и выделение фрагмента Hinfl*-Pstl (139 вр) (''45”). Разделение тяжа 27Р с получением двух тяжей ("27u” "27L").
Из сравнения аминокислотной последовательности вставок видно, что Hif-11-206 фрагмент кодирует интерферонподобный протеин, имеющий на одну аминокислоту меньше, чем фрагмент Hif-2h (аминокислота 44 (Asp), присутствующая в Hif-2h, не содержится в Hif-11-206). Кроме того, различны 10% нуклеотидных последовательностей и 17% остатков производных аминокислот двух фрагментов. Сравнение 35 амино-концевых аминокислот с лимфобластоидным интерфероном показывает, что вставка Hif-11-206 кодирует протеин, который отличается 5 остатками. Следовательно, должны
существовать по крайней мере три различных ИФН гена лейкоцитного типа (альфа типа)-Hif-2h фрагмент.
Клетки E.coli HB101, содержащие гибридную плазмиду, выращивают в реде триптона при встряхивании до ОД650 1 - 2 раза. Клетки собирают, взвешивают, вновь суспендируют в отношении 1/100 или 1/20 от первоначального объема культуры и лизируют. Надосадочные жидкости S-30 испытывают редукционным анализом СРЕ в микротитровочных пластинках. Экстракты из контрольных клеток были отрицательны (< 1 l.U./мл). Клетки CCL23 человека и клетки бычьей эмбрионной почки (БЭП) (FLOW) выращивают в MEM-10% плодной сыворотки теленка. Клетки инфицируют соответствующим разбавленным раствором вируса Менго через 24 ч. Количество белка оценивают визуально относительно частично очищенного лейкоцита ИФН (препарат PIF)
известного титра. Этот препарат был в три раза активнее на клетках человека по сравнению с клетками быка.
Следовательно, ИФН-α1 примерно в 30 раз менее активна на клетках человека, чем ИФН-α2. Они оба проявляют одинаковую активность на бычьих клетках. Таким образом, ИФН могут быть, в дополнение к их использованию в качестве антивирусных и антиопухолевых или антираковых агентов в человеке использованы в лечении этих заболеваний у крупного рогатого скота. Например, препараты ЧеИФН-α применяют в лечении FMDV и других хорошо известных вирусных инфекций крупного рогатого скота. Это даже более приемлемо для ИФН-α1, так как его активность на клетках быка
примерно в 20 раз больше, чем активность на клетках человека.
Улучшенный выход достигается в случае ИФН-α1 с конструкцией С8 (указано выше), такую же конструкцию получают и для ИФН-α 2, Z-pBR322(Pst)/Hif-11-206 расщепляют полностью с помощью Bspl и частично с помощью Pvull и фрагмент 867 вр выделяют из 6% полиариламидного геля. Этот фрагмент затем лигируют до 2590 вр Pvull фрагмента
С8-ИФН-α1*. Полученной гибридной плазмидой трансформируют E.coli HB101 и клоны
отсеивают на ИФН активность. Один клон, проявляющий высокую активность, отбирают и вводят в E.coli НВ(С8-ИФН-α2).
ДНК-последовательность гибридной плазмиды С8-ИФН-α2 обрабатывают таким образом, чтобы она подобно C8-ИФН-α1 имена кодирующую последовательность после инициаторного триплета, которая определялась сначала семью аминокислотами β- галактозидазы, остатком Рго и 16 – 23 ИФН-α2 сигнальной последовательности.
Клетки, трансформированные с этой плазмидой, дают 100 - 200 миллионов единиц на литр ИФН и выход ИФН-α2 был в 20000 - 40000 раз выше, чем при использовании клеток, трансформированных в немодифицированным Z-pBR322 (Pst)/Hif-11- 206.
Сравнение выходов С8-ИФН-α1(50х 106 единиц/л) и С8-ИФH-α2 (100 - 200 миллионов единиц/литр) на первый взгляд является неожиданным, так как ИФН-α 2 примерно в 30 раз более активен, чем ИФН-α1 на клетках человека (показано выше). Однако сравнение количества 2 протеинов, полученных в результате культивирований клеток, трансформированных двумя С8 плазмидами показывает, что в С8-ИФН-α1 протеина в 5 -6 раз больше, чем в C8-ИФН-α2.
Плазмиду, содержащую LACAlu фрагмент, получают в результате обработки известного Lac промотора с Alul и достройкой фрагмента с EcoRI линкерами. Полученный фрагмент встраивают в BR322 при EcoRI сайте и маленький фрагмент EcoRI-EcoRl удаляют из конструкции. Полученную плазмиду обозначают 404, расщепляют c Hindlll и Pvull для вставки ИФН-2 содержащеrо фрагмента. Этот фрагмент ИФН-α2 получают частичным гидролизом Z-pBR322(Pst)/HclF-11-206(''206"), достройкой Sau3A фрагмента с помощью Hindltl линкера и расщеплением с Bsp1. После сшивают фрагмент Hindlll-Pvull плазмиды 404, полученную плазмиду гидролизуют Hindlll и RcoRI, обрабатывают S1 нуклеазой для приближения LAC промотора к ИНФ-α 2 гену и вновь лигируют. Эта конструкция идентифицирована как плазмида LAC-AU (α2) имеет ИФН-α2. ДНК последовательность под контролем LAC промотора. Кроме того, ИФН-α2 последовательность расположена сразу же после инициирующего AUG колена этого промотора. Следовательно, по крайней мере часть ИФН, полученного с помощью этих плазмид, будет зремым ИФН, например, ИФН без каких-либо аминокислот сигнальной последовательности. В миниклетках выход ИФН-α2, полученного с плазмидой LAC-AUG (α 2) составил 5 - 10 миллионов единиц на литр.
Генетический маркер из pBR322 связыва ют с AUG и ИФН-α 2 геном из Нif-11-206. Эту конструкцию получают в результaтe гидролиза pBR322 с помощью Мво11, обработки S1, присоединения линкера как это сделано ранее, и повторно реклонирования
фрагмента в EcoRl сайт pBR322 и удаления сайта EcoRI. Полученную плазмиду ("β-Lac-AUG плазмида”) соединяют с Hindlll линкер-Bspl фрагментом 206, обоработанным S1. После расщепления с помощью EcoRI и обработки S1 и фосфатазой, выделяют плазмиду экспрессии β-Lac-AUG (α 2). Конструкции с другими генами получают подобным слиянием с помощью β-Lас-АUG плазмиды для клонировзния других генов или конструкций с использованием сайта Sau 3А в плазмиде β-Lac-AUG (α 2).
Эта плазмида, обозначена как β-Lac-AUG (α 2) при трансформации клеток реципиента позволяет получать ИФН-α 2 без слияния с другими протеиновыми последовательностями. В клетках наблюдают выходы 50 - 100 миллионов единиц на 1 л. Предпочтительно использование штамма E.coli DS 410.
Пример 11. Конструируют ряд гибридных молекул ИФН-α 1 и ИФН-α 2, обнаруживают, что эти гибридные конструкции отличаются количественно различными
свойствами и активностями по сравнению с каждым из родственных ИФН-α1 или ИФН-α2.
Плазмиды l, ll, lll, и IV в этих конструкциях обрабатывают рестриказами Bspl. Частичное расщепление ДНК проводят при пониженных количествах фермента. После тепловой инактивации (65°C, 30 мин) рестриказы, образцы доводят до 50 мм Трис-НСl (рН 8) и в случае необходимости добавляют щелочную фосфатазу кишечника теленка (1 объем на мкг ДНК). Спустя 30 мин при 37°С образцы экстрагируют фенолом и простым эфиром. В большинстве случаев фрагменты ДНК выделяют на низкотемпературной желирующей агарозе (0,8%). Для связывания кусочки желе, содержащие фрагмент (около 20 мкл каждый), расплавляют при температуре около 65°С, охлаждают до 37°С и добавляют 20U на мкл Т4 ДНК лигазы. Полученную смесь выдерживают при 15°C в течение 16 ч и в отвержденном геле получают связывание. Затем добавляют одну десятую объема от 100 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 100 мМСаСl2, 100 мМ MgCI2, образец нагревают 5 мин при 65°С и охлаждают до 37°С. Затем образцы добавляют к обработанным Са2+ клеток, инкубируют при 0°С в течение 20 мин. нагревают 1 мин при 42°С и 10 мин при 20°С, и добавляют 1 мл триптоновой среды. После инкубирования в течение 60 мин при 37°С культуры помещают на агаровые пластинки, содержащие соответствующие антибиотики.
Гибридную молекулу l, α-1/Pvull/ α-2 гибрид конструируют путем частичного расщепления С8-ИФН-α1 (С8-α1) Pvull, дефосфорилирования, гидролиза PstI и выделяют Pstl-Pvull (Р2) фрагмент размером 1346 вр. Этот фрагмент связывают с 2135 вр Pstl (а)-Pvull(P2) фрагментом, полученным в результате расщепления С8-ИФН-α 2(Supra) (С8- α 2) Pvull и обработкой Pstl.
Гибридную молекулу ll α-1 (Bgl) α-2 конструируют, расщепляя гибридную молекулу Bglll. После дефосфорилирования большой фрагмент BgllI выделяют и связывают с маленьким фрагментом C8-ИФН-α 2. После клонирования гибридную плазмиду, содержащую маленький Bdlll фрагмент в правильной ориентации, идентифицируют рестрикционным анализом.
Гибридную молекулу lll α-2/Pvull/ α-1 конструируют обработкой C8-ИФН-α 1 Pvull, дефосфилированием, расщеплением Aval им выделением 1686 вр Pvull(P2)Aval и 3233 вр Pvull (Р1)-Aval фрагментов. Эти фрагмены связывают с 300 вр Pvull(P1)-Pvull(P2) фрагментом HclF-11-206 и плазмиду, содержащую маленький фрагмент Pvull, идентифицируют проверкой трансформированных штаммов E.coli на ИФН-α активность.
Гибридную молекулу IV α-2/Bglll/α-1 сконструируют в результате гидролиза С8-ИФН-α1 Bglll Aval м выделения фрагмента 1776 вр. Этот фрагмент связывают с фрагментом 3543 вр BglQ-Aval гибридной молекулы III.
Выращивают культуры клеток (DS410), трансформированные различными плазмидами, и бактерии, собранные центрифугированием, промывают PBS, суспендируют в PBS (около 1 /20 от исходного объема), инкубируют в течение 60 мин при 0°С с 1 мг/мл лизоцима, 10 мМ ЭДТУК, замораживают и оттаивают четыре раза, скашивают, пропуская пять раз через шприц и расщепляют центрифугированием.
Активность клеток человека, мыши, морской свинки и быка были следующими.
Источник протеина Относительные активности ИФН
Человек (FS4) Бык (ВЕК) Мыш (L) Морская свинка
С8-lFN-α 2
C8-lFN-α 1
Гибрид l
Гибрид ll
Гибрид lll
Гибрид lV
Отритцат.
контроль 1
0,03
0,001
0,001
1
0,1

- 1
1
1
1
1
1

- 0,01
0,3
0,003-0,008
0,001
1
2

- 0,03
0,03
0,003-0,01
0,01
0,3
0,1-0,005

-

Сказалось, что все интерфероны имеют приблизительно одинаковую активность по отношению к бычьим клеткам, но ИФН-α1 и дв гибридных ИФН' а (I и II), у которых есть два конечных аминофрагмента ИФН-α1, 5 обладаютот около 10 - до 1000-кратно меньшей активностью по отношению к человеческим клеткам, нежели ИФН-α2 и два гибридных ИФН'а (Ill и IV), содержащих концевые аминофрагменты ИФН-α2. Два гибридных ИФН (l и ll) с концевыми аминочастями ИФН-α1 обладают более низкой активностью по oтношению к человеческим клетками нежели у самого ИФН-α1. Один из гибридов (III) с концевыми аминочастями ИФН-α2 обладает приблизительно такой же активностью по отношению к клеткам человека, что и сам ИФН-α2.
Пример 12. Получают коллекцию гибридных фагов, полученных из фрагментов хромосомных ДНК зародыша человека, частичным гидролизом Haelll и Alul, присоединением EcoRI связующих к λ Харон 4А ветвям. Этот генный банк скринируют по
способу "in situ", используя в качестве зонда вставку меченного 32P ИФH-α1 сДНК,
вырезанную из pBR322/Pst/Hif 2h. Шестнадцать положительно гибридизованных фаговых клонов выделяют из 240000 бляшек повторной очисткой бляшек. Десять гибридных фагов препаратов ДНК расщепляют Hindlll, Tacl, Hhal, Baml, E.coRI и Bglll, полученные фрагменты выделяют электрофорезом на агарозном геле, переносят на мембраны Миллипор и гибридизуют с меченной 32Р Hif-2h с ДНК вставкой.
Клоны chr-3 и chr-26 представляют собой сегменты ДНК, которые перекрываются по большей части своей длины, так как они имеют несколько фрагментов EcoRI и Hindlll общих. Гибридизирующая часть chr-l и одна из гибридизирующих частей chr-10 такие же, как фрагменты Hind Ill-Hindlll и EcoRI-EcoRI, которые гибридизуются с Hif-2h зондом и имеют одинаковую длину (3,2 кв. и 0,95 кв., соответственно). Гибридизующаяся часть chr-l6 идентична гибридизующейся части chr-35, хотя ориентирована в противоположном направлении, поскольку каждый из двух клонов содержит фрагмент 1,4 Bglll-Bglll размером 1,4 и 2 EcoRl-EcoRI, 2 кв. которые гибридизуются с Hif-2h сДНК зондом. Следовательно, вставки chr-IGh chr-35 перекрываются.
Геном индивидуального человека содержит не менее чем 10 различных ДНК последовательностей. которые перекрестно гибридизуются с Hif-4h. Этот вывод подкрепляется тем фактом, что соотношение фрагментов Hif-2h гидролизирующихся, определенных в клоповом банке, составляет около 1 на 16000.
Так как ИФН-α1 и ИФНα-2 сДНК имеют 1 и 2Bglll сайты, соответственно, внутри их кодирующих последовательностей. повидимому Hif-chr 35 является копией одного из двух ранее клонированных интерфероновых генов. Hif-chr 35 сильно гибридизующийся 3' Нif-2h сДНК фрагмент (содержащий только 3' некодирующую область) при сравнении с более слабой гибридизацией с другой хромосомной ДНК этого зонда подтвержает близкое соответствие Hif-chr 35 и Hif-2h.
Для дальнейшего анализа Hif-chr 35 Hindlll-BamHI выделяют из chr-35. Этот фрагмент (3,4 кв) содержит гибридизующую часть ("Hif-chr 35") chr-35. Данный фрагмент субклонируют в PstI сайт рВR322, используя известную dC-dG-методику, и E.coli HB101 трансформируют полученной рекомбинантной молекулой ДНК.
Клоны этих трансформантов скринируют in situ гибридизацией колонии с меченым 32Р Hlf-2h фрагментом и затем плазмиду ДНК Z-pBR322(Pst)/Hchruф-35HB"Hchr-ИФ-35НВ" выделяют из положительных клонов. Ориентацию гибридной вставки "Hchr ИФ-35НВ фрагмента" в плазмиде по отношению к β-лактамазному гену рВR322 определяют по EcoRf расщеплению и размерам полученных фрагментов. Вставку, ориентированную в правильной рамке считывания с β-лактамазой, обозначают α, а противоположно ориентированную β.
Культуры этих положительных клонов выращивают до кажущегося ОД650 = 0,8, бактерии собирают и лизируют по способу лизоцим-замерзание-оттаивание. Семь из 10 исследованных клонов демонстрируют ИФН-α активность порядка 75 - 500 единиц/г клеток (цитопатичный эффект восстановительного анализа).
ДНК вставку одного из этих семи ИФН-продуцирующих клонов E.coli HB101 (Z-рBR322 (Pst) Hchr ИФ-35НВ α характеризуют далее рестрикционным анализом и определением нуклеотидной последовательности. Плазмиду Д Н К (Нchr ИФ-35НВ) пoлучают из клона и определяют рестрикционные сайты. Hchr ИФ-35НB α обрабатывают EcoRI, метят no концу 5' и гидролизуют Вglll и Pstl для отщепления ненужного фрагмента около 1 кв. 1,04 кв Ecorl-Bglll (3' проксимальный) и 0,96 кв EcoRl-Bglll (5'-проксимальный) фрагменты выделяют электрофорезом на агарозном геле. Оба фрагмента частично гидролизуют Hinfl, Bspl и Мвоll соответственно и полученные продукты выделяют на 1% агарозном геле в Трис-ацетатном буфере (рН 7,8), содержащем 1 мкг/мл этидиумбромида. После выстаивания радиоактивные полосы обнаруживают авторадиографически. Аналогичным образом определяют BstNl и HgiAl сайты на 1,04 в 3' проксимальном фрагменте.
Для определения нуклеотидной последовательности Hchr ИФ-35ГВ α расщепляют различными растриктазами, полученные продукты выделяют электрофорезом через 5% полиакриламидный гель в Трис-боратном-ЭДТУК буфере и экстрагируют из геля и очищают.
Определяют последовательность нуклеотидов следующим образом: 1 и 2 - отщепление Hchr -ИФ-35НВ α с помощью Bglll, внесение метки, расщепление EcoRI и Pstl
и выделение Bglll*-EcoRI фрагмента (940 вр) (''1”) и Bglllx*-EcoRI(360 вр)("2''); 3 и 4 отщепление Hchr ИФ-35НВ α помощью EcoRI, внесение метки, расщепление Bspl и выделение фрагмента EcoRI*-Bspl (680вр) ("З") и фрагмента EcoRI-Bspl (880 вр) ("4''); 5, 6, 7 и 8 отщепление Hchr ИФ-35НВ α с помощью Pvull, внесение метки, расщепление Вglll и
EcoRI и выделение Pvull*-EcoRI фрагмента (780 вр) ("5''), фрагмента Pvull*-Bglll (215вр) ("6"), фрагмента Pvull*-Bglll (90 вр) ("7") и фрагмента Pvull - EcoRi (290 вр)(''8'');
9 и 10 отщепление Hchr ИФ-35 HВ α помощью EcoRI, выделение электрофорезом на 1% агарозном геле в трис-боратном ЭДТУК буфере фрагмента с 1300 вр EcoRI-EcoRI, дальнейшее расщепление Hinfl и выделение Hinfl-Hinfl фрагмента (459 вр), и
фрагмента Hinfl-Hinfl (180 вр), внесение метки большего Нinfl-Нinfl фрагмента и расщепление Мbоll позволило выделить Hlnft*-Mboll (190 вр) ("9''). Внесение метки более короткого Hinfl-Hinfl фрагмента и расщепление Avail позволило выделить Hinfl*-Avall фрагмента (150 вр):
11 - отщепление Hchr ИФ-35НВ α с помощью Mboll, внесение метки расщепление Bglll и выделение Мbоll*-Bglll фрагмента (465 вр)(''11'');
12, 13 и 14 отщепление Hchr ВФ-35НВ α с помощью Bspl м BgllI, выделение электрофорезом на агарозном геле как описано ранее фрагмента 1200 вр Bspl-Bspll(a) расщепление HgiAI, внесение метки, расщепление Mboll и выделение HgiAI*-Mboll фрагмента (300 вр) ("12") и фрагмента HgiAI-Mbolll (360 вр) (''13''), или (b) расщепление BstNI, внесение метки, расщепление EcoRl и выделение BstNI*-EcoRl фрагмента (380 вp)(''14"). Последовательности в различных фрагментах определяют по способу Максам-Гильберта.
Сравнение последовательности нуклеотидов кодирующей области Hchr ИФ-36НВ α и последовательности Hif-2h (кодирующая область) показывает, что они идентичны. В частности, удивительно, что нет указания на наличие нитронов внутри кодирующей последовательности Hchr ИФ-35НВ α фрагмента, т.е. между Hinfl центром в 5' некодирующей области и EcoRI центров в 3' некодирующей области.
Содержащие гены chr-3 и chr-26, которые, по-видимому, идентичны по данным гетеродуплексного анализа, отличают одним Bglll сайтом, исследуют на нуклеотидную
последовательность. Пять нуклеотидов отличаются в 725 основных парах. По-видимому, Hlf-chr3 и Hif-chr 26 являются аллельными формами одного и того же гена, так как не только гены, но, по крайней мере 3,5 квр предшествующие и 6,0 квр последующие им образуют прекрасный гетеродуплекс из-за относительно небольшого отличия, которое охвaтывает только изменения 2 аминокислот. Они обозначены ИФН- α4a(Hlf-chr 3 и ИФН- α 4b/Hifchr26). Нуклеотидную последовательность и соответствующую последовательность аминокислот ИФН- α 4в определяют по обычной методике.
При этом белки, закодированные каждой из последовательностей, отличаются друг от друга примерно в 15% их остатков. Такое расхождение типично для продуктов неаллельных генов, которые разошлись уже 20 - 90 миллионов лет назад.
Пример 13. Плазмиду Z-pBR322 (Pst) (Hchr ГИФ-35HB а) используют в качестве источника Нif-chr 35 фрагмента для экспpeссии в клетках мыши. Эту плазмиду гидролизуют PstI и обрабатывают 5' экзонуклеазой для удаления 5'dG хвостов. Затем этот фрагмент встраивают в 5dG -Kpnl фрагмента плазмиды, полученной присоединением Bam HI-Bam Hl фрагментов pBR322 и ДНК полинома. Полученный вектор используют для трансформации мышинных ЭТЗ клеток. Эти трансформированные клетки обозначают мышь ЗТЗ (полинома Hif chr 35). Cпустя 20 - 40 ч определяют активность ИФН-α порядка 300 ел/мл ИФН-α на клетки человека и около 300 ел/мл на бычьи клетки.
Лизаты E.coli HB101 инфицируют десятью гибридными лямбда-фагами и анализируют на присутствие ИФН. Семь из одиннадцати фагов (все, кроме chr-10, chr-12, chr-19 и chr-27) дают лизаты, содержащие ИФН с активностью в интервале от 3 до 50 ел/мл. В случае chr-10 и chr-12, гибридизующие (к Hif-2h) Hindlll-Hindlll или EcoRl-EcoRl фрагменты субклонируют в PsTI сайт pBR322 и экспрессируют активности ИФН-α в E.coli.

Proc. Natl. Acad. Sсi., USA 76. p. 640-644,1979