Изобретение относится к области производства серицина из отработанных коконов тутового шелкопряда для применения его в различных областях пищевой и медицинской промышленности.
Серицин отделяется от фиброина в шелковой промышленности для улучшения гладкости, блеска, легкости и окрашиваемости волокон. Поскольку серицин является основным компонентом сырого шелка, было подсчитано, что из 400 тысяч тонн сухих коконов, произведенных во всем мире, около 50 тысяч тонн серицина обычно выбрасываются в качестве отходов в канализацию, представляя собой опасность для окружающей среды [1].
Известно, что серицин имеет широкий спектр применения, включая антибактериальные, антиоксидантные, противораковые, антитирозиназные, противовоспалительные и антивозрастные свойства. Были описаны несколько применений серицина, а также его комбинация с другими биоматериалами, с потенциальным применением в пищевой промышленности. Будучи белком, серицин в пищевых продуктах не вызывает побочных эффектов и аллергии, следовательно, его можно исследовать для применения в качестве функционального продукта питания, пищевой добавки и во многих других областях. Более того, разработанные покрытия/плёнки на основе серицина продемонстрировали высокую эффективность при хранении фруктов и овощей [2].
Применение серицина в пищевой промышленности описано в 56 патентах [2], это относится к способу приготовления напитков из серицина; использование пептида серицина для производства продуктов питания и в качестве ингредиента для изготовления пробиотических конфет с декстрозой и низким содержанием сахара, которые подходят для употребления диабетиками и различные композиции для фармацевтики. Эти изобретения показывают, насколько серицин является важным продуктом для пищевых и медицинских целей.
Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами США (FDA) уже одобрило глобулярный белок серицина и его производные для включения в общепризнанный список безопасных веществ (под уведомлением GRAS GRN 1026), без каких-либо доказательств того, что он вызывает аллергию при пероральном приеме и без цитотоксических эффектов в качестве ингредиента косметики, и такие применения серицина шелка очевидны в развитых странах, таких как США, Япония, Австрия, Китай, Италия и Румыния [3, 4]. В последнее время использование серицина в пищевой промышленности, в основном, сосредоточено на использовании в качестве пищевой добавки из-за его легкой доступности, нетоксичности и функциональных свойств [1, 2].
В процессе дегуммирования серицин обычно отделяется от фиброина и выбрасывается, и только фиброин используется в качестве шелка [04]. Дегуммирование шёлка можно проводить с использованием традиционных методов, таких как: высокая температура и давление, мыло, щелочь и кислоты [5]. Предлагаются также более экологические методы выделения серицина, такие как: сверхкритическая флюидная экстракция с помощью CO2 [6]. Из-за отсутствия сильной кислоты и щелочи в процессе дегуммирования сверхкритическая жидкость CO2 менее разрушительна для белков и обеспечивает лучшее качество поверхности. Однако для этого требуется специализированное оборудование, способное нагревать и сжимать CO2 выше критической температуры и давления. Серицин, полученные этими методами в растворе, в основном, принимает конформации случайных спиралей и в меньшей степени в нём присутствует структура b-листа [7].
Следовательно, для каждого применения необходим селективный подход для его экстракции, что является предметом данного изобретения.
Известен способ получения серицина и фиброина шёлка из оболочек коконов тутового шелкопряда [8] путем гидролиза, нейтрализации, фильтрации, отличающийся тем, что гидролиз проводят при температуре 103-105°С в течение 2,5-3,0 часов водным раствором содержащим 2,6-2,8% гидроокиси калия, полученный гидролизат после нейтрализации фильтруют, подвергают микрофильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,10 мкм для получения серицина с сахароснижающим эффектом и молекулярной массой 5.0-6.0 кДа, а осадок на фильтре промывают разбавленной соляной кислотой (HCl) и деминерализованной водой для получения фиброина кардиотропного действия с молекулярной массой 140.0-150.0 кДа.
Данный подход с применением большой концентрации щелочи и длительного времени гидролиза не позволяет получить серицин определённой структуры, а именно содержащего преимущественно β-слоистую структуру, (b-листа), что снижает многие его полезные свойства для практического применения.
Патент США [9] раскрывает идею о том, что молекулярная структура изолированного серицина может быть изменена путем облучения его раствора γ- излучением (радиации), с целью получения высокомолекулярного белка с улучшенной способностью захвата радикалов и ингибирующими способностями к тирозиназе. По данному решению можно получить максимум 50% белка со структурой b-листа. Серицин с изменённой молекулярной структурой может быть использован в производстве различных продуктов для улучшения антиоксидантных и ингибирующих способностей тирозиназы, которые включают пищевые продукты, косметику и/или фармацевтические продукты и препараты.
Однако, применение радиации требует сложну технику и нежелательно на предприятиях пищевой и косметической промышленности, что усложняет внедрению данной технологии.
Согласно Китайскому патенту [10] способ извлечения серицина из коконов шелкопряда включает следующие этапы: во-первых, очистка и сушка коконов шелкопряда, разрезание коконов на фрагменты, добавление фрагментов в устройство для перегонки, нагревание и перегонка абсолютного этанола, фумигация фрагментов парами этанола, добавление обезжиренных фрагментов в дихлорметан, нагревание и перегонка дихлорметана, очистка фрагментов деионизированной водой и сушка; затем добавление фрагментов коконов шелкопряда в реакционный котел, добавление 30% этанола в воде, равное 80-100 весовым частям фрагментов коконов шелкопряда, нагревание и перемешивание для реакции в течение 150-200 минут под вакуумом, фильтрация полученного продукта и сушка при пониженном давлении на фильтрате для получения серицина.
Согласно предлагаемому изобретению, серицин из коконов шелкопряда может быть эффективно извлечён; операция надежна, при этом эффективность извлечения значительно улучшена, степень извлечения достигает более 82,6% и серицин может быть использован в различных применениях.
Недостатком этого способа является сложная процедура экстракции серицина с использованием органических растворителей, что ограничивает его внедрение в современных предприятиях.
Наиболее близким решением к данной уровню техники является патент Японии [11], который раскрывает способ получения серицина в виде гидрогеля. На первом этапе экстрагируется серицин с молекулярной массой более 50 кДа, путем перемешивания слоя сажи и экстракционного растворителя и проведение экстракции растворителем. В настоящем изобретении, экстракт серицина с высокой молекулярной получают разными растворителями и его выделяют из разбавленного или концентрированного раствора спиртом. Такой серицин в водном растворе проявляет поглощение в области 1641 см-1 в ИК-спектрах, что относится к амиду I, и указывает на наличие белка в структуре b-листа и случайных клубков. Обнаружено, что серицин в спирте превращается в гидрогель проявляющий поглощение при 1620 см-1, что преимущественно (> 85%) принадлежит структуре b-листа. Добавление этанола стимулирует образование водородных связей между молекулами серицина, и в результате образуется трехмерная сеть, образующая гидрогель серицина.
Предложенное решение является очень простым, однако серицин, полученный по данному способу, используется для косметических продуктов и не может применяться в растворе, что ограничивает его использование в других областях.
Целью изобретения является разработка эффективного способа получения серицина из коконов тутового шелкопряда с высоким молекулярным весом и содержанием b-листа, обладающий превосходную биологическую активность для различных применений.
Поставленная цель решается путём эффективной экстракции серицина из кокон тутового шелкопряда, после предварительной подготовки сырья и последующей его экстракции водой, а для интенсификации процесса гидролиз и экстракция серицина проводится за достаточно кроткое время с примением действие высокого давления.
Сущность изобретение заключается в том, что примытие образцы от жиров и механических примесей коконы шёлкопряда подвергали первой очистке деминерализованной водой при температуре 20 -30°C и затем горячей водой при температурах 50-70°C; затем коконы подвергли второй очистке этанолом при температурах 40-45°C, удалили этанол прессом, остаток промыли и высушили. Экстракцию серицина проводили с использованием флэш-метода в автоклаве [12] следующим образом: 50 гр. очищенных и измельченных отходов коконов помещали в мешочек, который затем размещали в автоклаве и заливали деминерализованной воды в соотношение очишенные коконы: вода 1:15 - 1:20, затем экстрагировали в течение 5 -10 мин при температурах 110-130оС и давлении 1.5-2.0 атм. После окончания экстракции полученный раствор концентрировали на роторном испарителе до ½ объёма экстракта. В концентрированный раствор добавляли этиловый спирт в соотношении 1:3 и оставляли для осаждения серицина на 24 часа. Через сутки осадок серицина отфильтровали через плотную ткань и полученную массу промывали спиртом, высушивали при комнатной температуре и измельчали на шаровой мельнице. Серицин, полученные таким способом в растворе имеет правильной структуры в форме β-листа с высоким процентом, более 80%. Спиртовый раствор упаривали досуха и получали спирторастворимую часть белка серицина для других применений.
Для иллюстрации данного преимущества нами проводилась экстракция серицина из шелковых отходов с использованием различных методов для сравнительной оценки вторичной структуры белка. Пример 1 — в солевом растворе; Пример 2 — в деминерализованной воде; Примеры 3 и 4 — в солевом и водном растворе в автоклаве за короткое время; Примеры 5 и 6 — предварительная обработка коконов ультразвуком с последующей экстракцией согласно Примерам 1 и 2.
Пример 1: Экстракцию серицина проводили деминерализованной водой. В стеклянную посуду засыпали 50 гр. разрезанных на мелкие фрагменты, очищенные от жиров и других механических примесей оболочки бракованных коконов и заливали 1000 мл щелочного раствора. Полученный раствор при комнатной температуре кипятили на водяной бане в течение 3 часов. Выделение серицина из раствора экстракта проводилось после концентрирования отфильтрованного экстракта при низком давлении на роторном испарителе до ½ объема. Далее в концентрированный раствор определенного объёма добавляли этиловый спирт в соотношении 1:3 и оставляли для осаждения серицина на сутки. Конечная концентрация этанола в смеси составила в среднем 60,0±1,7%. Через сутки осадок серицина отделяли центрифугированием, декантировали спиртом, высушивали при комнатной температуре и измельчали на шаровой мельнице.
Данный пример принят за прототип [11], хотя в прототипе не указан конкретный растворитель серицина, нами использована водная экстракция для сравнения с решением данного изобретения.
Пример 2. Экстракцию серицина из очищенных коконов проводили как в примере 1 с таким отличием, что вместо воды использовали солевой раствор карбоната натрия с концентрацией 0.5%. Разрезанные на мелкие фрагменты 50 гр. оболочек бракованных коконов кипятили в 1000 мл. деминерализованной воды в течение 3 часов на водяной бане при 90оС. Полученный экстракт фильтровали через тканевый мешочек и концентрировали на роторном испарителе. В концентрированный раствор добавляли этиловый спирт в соотношении 1:3 и оставляли для осаждения серицина на 24 часа. Через сутки осадок серицина отфильтровали через плотную ткань и полученную массу промывали спиртом. Затем раствор экстракта серицина, центрифугировали, высушивали при комнатной температуре и измельчали на шаровой мельнице. Спиртовый раствор упаривали досуха и получали спирторастворимую часть белка серицина.
Пример 3. Экстракцию серицина водным раствором проводили с использованием флэш-метода в автоклаве [12] следующим образом: 50 гр. очищенных и измельченных отходов коконов помещали в мешочек, который затем размещали в автоклаве и заливали 1000 мл деминерализованной воды, затем экстрагировали в течение 5, 7 и 10 мин (Примеры 3.1; 3.2; и 3.3) при температуре 120оС и давлении 1.5 атм. После окончания экстракции полученный раствор концентрировали на роторном испарителе до ½ объёма экстракта. В концентрированный раствор добавляли этиловый спирт в соотношении 1:3 и оставляли для осаждения серицина на 24 часа. Через сутки осадок серицина отфильтровали через плотную ткань и полученную массу промывали спиртом, высушивали при комнатной температуре и измельчали на шаровой мельнице. Спиртовый раствор упаривали досуха и получали спирторастворимую часть белка серицина.
Пример 4. Экстракцию серицина аналогично проводили в автоклаве с использованием 0,5% солевого раствора, как по Примеру 3 (Примеры 4.1 и 4.2).
Пример 5. Экстракцию серицина проводили водной экстракцией как в Примере 2, но с предварительной обработкой раствора с коконами ультразвуковом (УЗ) на аппарате CPX130PB (Cole Parmer, США) при частоте 40 Гц. 5 гр. измельчённых оболочек коконов, предварительно очищенных от жиров и восковых веществ, помещали в стакан со 100 мл деминерализованной воды или 0,5% раствора Na₂CO₃ и оставляли на 20 минут для замачивания, после чего стакан помещали в ультразвуковой аппарат на 10 минут при частоте 40 Гц. Затем, экстракцию серицина водным и солевым раствором проводили, как описано в Примерах 1 и 2.
Пример 6. Экстракцию серицина проводили солевым раствором, согласно методике, описанной в Примере 1, но с предварительной обработки раствора с коконами ультразвуковом (УЗ) аппарате, как в Примере 5.
Таким образом, после завершения экспериментов были рассчитаны: выход серицина, молекулярная масса (Mw) и молекулярно-массовое распределение (ММР) образцов серицина. Анализ этих параметров проводился с использованием высокоэффективной эксклюзионной жидкостной хроматографии (ВЭЭЖХ), а вторичную структуру белка оценивали по структуре амида I с помощью ИК-Фурье спектроскопии из сухих образцов серицина.
В таблице, для сравнительных анализов параметров и свойств серицина из оболочек коконов при различных условиях экстракции, приведены выход серицина в процентах, его молекулярная масса (Мw, кДа), полоса поглощения в ИК-Фурье спектрах в области амида I, содержание b-листа в %.
Выход серицина в процентах, его молекулярная масса (Мw, кДа), полоса поглощения в ИК-Фурье спектрах в области амида I, содержание b-листа в %, (по калибровочному графику), а также условия их получения В настоящем документе термин «b (бета)-лист» относится к части молекулярной структуры, образованной путем соединения двух или более b-цепей водородными связями. Конформация β-цепи представляет собой удлинённый участок полипептидной цепи, длиной от 3 до 10 аминокислот.
Содержание b-листа в образце серицина было рассчитано учитывая, что поглощение в ИК-спектрах при 1617 cм-1 в сухом экстракте серицина преимущественно, около 95%, находится в структуре b-листа, а при 1660 cм-1 он переходит в структуру α-спирали. Используя эти данные и данные литературы [07, 13], мы построили калибровочную кривую для расчета содержания b-листа в образцах серицина по спектрам поглощения амида I, по следующей формуле:
b-листа (%) = -2,1758хn + 3618,2,
где n - максимум поглощения амида I.
На Фиг. 1 показан калибровочный график зависимости значения полос поглощения ИК-спектров образцов серицина и содержание b-листа.
Из анализа полученных результатов, данной таблицы, можно увидеть, что обычная водная экстракция (Пример 1 по прототипу), хотя имеет высокое содержание b-листа, не позволяет получить максимальный выход продукта. Выход спирто-нерастворимой части экстракта, т.е чистый серицин при трехчасовой экстракции водой составляет всего 4.72%. Низкомолекулярный белок - серицин при этом частично переходит в спирторастворимую часть вместе с другими низкомолекулярными веществами.
При этом солевая экстракция (Пример 2) обеспечивает больше выход продукта до 12.16%, однако, по оценке содержания b-листа (40.7%) качество такого продукта низкое.
Действие УЗ-аппарата несколько увеличивает выход водорастворимого продукта до 9.97% при водной экстракции (Пример 5) и до 13.19% , в случае с солевым экстрагентом (Пример 6). При этом и увеличивается выход спирторастворимой фракции до 16.3%, что нежелательно для производства белка-серицина, предназначенного для ряда применений.
Результаты, полученные при экстракции коконов флэш-гидролизом в автоклаве, отличаются от традиционных методов. Анализ полученных данных показывает, что наибольший выход высокомолекулярного серицина (23.2%) достигается при экстракции коконов водой в автоклаве при 120оС, давлении 1.5 атм. в течение 7 мин (Пример 3.2). При этом получен качественный серицин со средним молекулярным весом 46.3 кДа и содержанием b-листа в нем около 83%. В то время, увеличение времени гидролиз- экстракции заметно снижает выход серицина до 16.04% при 10 минутной обработкой коконов (Пример 3.3) и его Мw снизилась до 24.8 кДа, а также содержание b-листа уменьшилось до 70%.
Однако, экстракция серицина из коконов солевым раствором в автоклаве заметно приводила к деструкции белка: выход высокомолекулярного белка снизился до 2.88% в то время выход низкомолекулярных пептидов (белков) вырос до 27.3% при 7 минутной и до 29.61% при 10 минутной обработкой. Молекулярная масса серицина при этом уменьшилась до 14.6 кДа и 8.7 кДа соответственно.
Из данных таблицы следует, что при водной экстракции 70-90% серицина преимущественно находится в структуре b-листа. При применении щелочных солей содержание данной структуры резко падает до 26-40 % в зависимости от процедуры экстракции.
Согласно решению данного изобретения в вышеуказанном процессе предпочтительно, чтобы водная экстракция серицина из коконов шелкопряда выдерживалась при температуре приблизительно 120 °C в течение 5-10 минут, предпочтительно 7 минут. Согласно настоящему изобретению, при экстракции серицина в указанных условиях можно получить продукт, содержащий в растворе от 80 до 88% доли β-листа во вторичной структуре белка.
Таким образом, предложенное изобретение обладает рядом преимущества перед существующим уровнем техники. В данном техническом решении мы использовали автоклав, где применяется высокое давление для разрушения волокон фиброина шёлка, что позволяет интенсифицировать экстракцию серицина водой за короткое время 5-10 мин вместо традиционного гидролиза-экстракции в течение более часа. Растворимость шелковых белков в любой системе растворителя, как правило, основана исключительно на способности природы растворителя разрушать межмолекулярные водородные (H)-связи фиброиновых цепей, что приводит к полной дисперсии отдельных молекул. Поэтому для того, чтобы растворитель имел возможность проникать внутрь волокон, не вызывая неблагоприятных эффектов, таких как деполимеризация или дериватизация, мы применяли небольшое давление 1.5 – 2.0 атм.
Этот метод позволяет изолировать серицин из шёлка с очень высоким содержанием (>80%) β-слоя в его вторичной структуре. Продукт, полученный по данному способу, демонстрирует значительно лучшее качество по сравнению с серицином, извлечённым известными методами, и обладает потенциалом для применения в различных областях пищевой и медицинской промышленности.
Таким образом, причино-следственная связь межу новым признаками и достигнутым положительным эффектом состоит в том, что при использование автоклава, серицин можно экстрагировать водой и при этом достигается выделение качественного белка для различных применений, имеющие правильной структуры в форме β-листа с высоким процентом, более 80%.
Серицин с изменённой молекулярной структурой может быть использован в производстве новых пищевых продуктов, улучшая антиоксидантные свойства и ингибирующие способности ферментов, а также в косметических и фармацевтических продуктах. Применение флэш-гидролиза в автоклаве также способствует значительному сокращению времени экстракции, что, в свою очередь, повышает экономическую эффективность метода.
