СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПАТОГЕНОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Изобретение относится к способам количественного определения чувствительности патогенов, вызывающих болезни животных и птиц, к отдельным антимикробным препаратам и их сочетаниям, может быть использовано в ветеринарной медицине и микробиологии.

Инфекционные болезни, возбудителями которых являются патогенные микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы), распространенные среди поголовья животноводческих и птицеводческих хозяйств различных форм собственности, в том числе личных подсобных хозяйств Республики Таджикистан. Возбудителей инфекции диагностируют как в отдельности, так и в различных ассоциациях, а доминирование последних обусловливает необходимость комплексности лечебно-профилактических мероприятий, эффективность которых определяется чувствительностью патогенов к антимикробным препаратам. При проведении ветеринарных мероприятий особую значимость имеет проблема широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов среди животных и птиц в результате бессистемного применения различных классов и поколений этих препаратов.

Чистую культуру возбудителя болезни выделяют и идентифицируют в течение не менее 5 сут, тогда как инфекционный процесс в зависимости от вирулентности патогена может развиваться значительно быстрее, учитывая плотность поголовья, особенно в птицеводстве, в котором ежедневный падеж может превышать несколько тысяч птиц. Поэтому разработка доступного и экономичного, в том числе ускоренного способа количественного определения чувствительности патогенов к антимикробным препаратам и их комбинациям имеет научно-практическую, включая экономическую значимость.

Известны методы серийных разведений в агаре или в бульоне, причем в зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют способы серийных макро- и микроразведений. В автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов используется способ, основанный на использовании только пограничных значений МПК [1].

Несмотря на точность и информативность, постановка в практических лабораториях методов серийных разведений сопряжена со значительными методическими трудностями, являющимися недостатками этих методов: использование субстанций антибиотиков с известным уровнем активности, строгое соблюдение режимов хранения и тщательный контроль качества питательных сред, определение чувствительности только чистой культуры патогена, невозможность определения помежуточно-устойчивых патогенов

Известен диффузионный метод – Е-тест – для количественного определения чувствительности, основанные на диффузии из носителя в плотную питательную среду антибактериального препарата (АБП), подавляющего рост испытуемой  чистой монокультуры патогена в зоне, в которой концентрация АБП превосходит МПК [2,3].

Недостатками этого метода являются недоступность по цене, определение чувствительности только  чистой монокультуры патогена, невозможность применения способа при определении чувствительности микроорганизмов и их ассоциаций из патматериала, бактерицидной активности антибиотиков при комбинированном использовании

Известен способ, взятого в качестве прототипа настоящего изобретения, определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам, при котором осуществляют забор биологического материала, инкубацию содержащихся в нем микроорганизмов на обогащенной плотной питательной среде, введение в питательную среду исследуемого антимикробного вещества до начала культивирования микроорганизмов в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала, оценку результата после появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве [4].

Недостатками этого способа, являются значительные трудовые и материальные затраты, определение только чувствительности микроорганизмов из биологического материала к максимальной дозе антимикробного препарата, невозможность выявления промежуточно-устойчивых микроорганизмов, неиспользование метода при определении чувствительности чистых культур, определении активности антимикробных препаратов при комбинированном применении.

Настоящее изобретение позволяет количественно определить действенную дозу антимикробного препарата для повышения эффективности лечебно-профилактических мероприятий при инфекционных болезнях животных и птиц.

В соответствии с настоящим для определения чувствительности патогенов  (бактерий) к антимикробным препаратам, патологический материал или чистую монокультуру патогена засевают в бульон Китта–Тароцци, обогащенный белково-минеральными веществами, 6 ч инкубируют (37°С), после чего суспензию культур микроорганизмов (концентрация –  м.к./мл) вносят в обогащенный белково-минеральными веществами теплый (48 – 50°С) агар Китта–Тароцци, перемешивают и разливают засеянную плотную питательную среду в чашки Петри по 25 мл, в которую (48 – 50°С) сразу по диаметру чашки на расстоянии 10 мм друг от друга вводят 8 концентраций (по 0,1 мл) антимикробного препарата, 16 – 18 ч инкубируют (37°С).

При определении чувствительности патогенов (грибов) к антимикробным препаратам, патологический материал или чистую монокультуру  патогена (гриба) засевают в бульон Сабуро, обогащенный минеральными веществами, культуральную суспензию грибов через 12 ч инкубации (25°С) вносят в теплый (48 – 50°С) агар Сабуро, обогащенный минеральными веществами, разливают засеянную плотную питательную среду по 25 мл в чашки Петри, сразу вводя в нее (48 – 50°С) по диаметру чашки на расстоянии 10 мм друг от друга 8 концентраций (по 0,1 мл) антигрибкового препарата, 36 – 48 ч инкубируют (25°С).

Результаты количественного определения чувствительности антимикробных препаратов интерпретируют по критериям соответствия пограничных значений диаметров зон подавления роста (мм) и минимальной подавляющей концентрации (МПК, мкг/мл).

  Заявителем не выявлены способы определения чувствительности патогенов к антимикробным препаратам, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию «Новизна».

Принципиально новой основой заявленного способа является оригинальный метод количественного определения чувствительности микроорганизмов из патологического материала и чистой монокультуры патогена к отдельным и комплексным антимикробным препаратам.

По разработанной методике при количественном определении чувствительности к антимикробным препаратам размножение патогенов – микроорганизмов патматериала  или чистой монокультуры – происходит в благоприятных условиях: сначала в жидкой для достижения необходимой концентрации, затем в обеспечивающей равномерный рост плотной питательной среде. Введение восьми различных концентраций антимикробного препарата в теплую (48 – 50°С) засеянную плотную питательную среду в количестве 0,1 мл обеспечивает равномерное распределение.

Выявленные новые свойства заявленного способа свидетельствует, о его соответствии требованию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Практическое применение заявленного способа подтверждают следующие опыты.

Пример 1. Содержимое кишечника и соскобы с её слизистой оболочки павшего от диареи теленка разводили физиологическим раствором (1:10), надосадочную жидкость засевали в бульон Китта–Тароцци, обогащенный белково-минеральными веществами, 6 ч инкубировали (37°С). В мазках из бульонной культуры, окрашенных по Граму, выявлены грамотрицательные и грамположительные палочки, кокки и стафилококки.

Указанную культуральную суспензию вводили в теплый (48 – 50°С) обогащенный белково-минеральными добавками агар Китта–Тароцци, засеянную плотную питательную среду по 25 мл разливали в чашки Петри; сразу по 0,1 мл вводили в нее по диаметру чашки на расстоянии 10 мм друг от друга 8 концентраций (от 200 до 1,5 мг/мл) антибиотика оксипрол.

Контроль: а) чистый агар Китта–Тароцци, б) засеянный агар Китта–Тарроци без антибактериального препарата.

Через 16-18 ч инкубации зона задержки роста культур микроорганизмов при концентрации оксипрола 25 мкг/мл составила 23 мм, что свидетельствует о чувствительности к нему испытанных патогенов.

Пример 2. Опыт проводили аналогично примеру 1, используя комбинацию антибиотиков оксипрол и эритромицин (соотношении – 3:1) в концентрациях от 200 до 1,5 мг/мл.

Спустя 16- 18 ч инкубации зона задержки роста культур микроорганизмов при концентрации комбинации оксипрола и эритромицина 12,5 мкг/мл составила 24 мм: патогены оказались чувствительны к меньшей в сравнении с результатами примера 1 концентрации, что определяет целесообразность комплексного применения этих антимикробных препаратов.

Пример 3. Опыт проводили анологично примеру 1, используя в качестве чистой культуры штамм ЕС 19 TJ Escherichia coli, зона задержки роста которого через 16-18 ч инкубации при концентрации оксипрола 12,5 мкг/мл составила 24 мм, что указывает на чувствительность этого штамма.

Пример 4. Штамм SD 05 TJ Salmonella dublin засевали в бульон Китта–Тароцци, обогащенный белково-минеральными веществами, 6 ч инкубировали (37°С); культуральную суспензию вводили в теплый (48 – 50°С) обогащенный белково-минеральными веществами агар Китта–Тароцци, засеянную плотную питательную среду по 25 мл разливали в чашки Петри, сразу по 0,1 мл вводили в нее по диаметру чашки на расстоянии 10 мм друг от друга 8 концентраций (от 200 до 1,5 мг/мл) комбинации антибиотиков оксипрол и эритромицин (соотношение – 3:1). Контроль аналогичен описанному в примере 1.

Спустя 16-18 ч инкубации зона задержки роста испытанного штамма при концентрации испытанной комбинации антибиотиков 6,2 мкг/мл составила 26 мм, что свидетельствует о его чувствительности.

Пример 5. Штамм Cch 23 TJ Clostridium chavoei засевали в бульон Китта–Тароцци, обогащенный белково-минеральными веществами, 6 ч инкубировали (37°С); культуральную суспензию вводили в теплый (48 – 50°С) обогащенный белково-минеральными веществами агар Китта–Тароцци, засеянную плотную питательную среду по 25 мл разливали в чашки Петри, сразу по 0,1 мл вводили в нее по диаметру посуды на расстоянии 10 мм друг от друга 8 концентраций (от 200 до 1,5 мг/мл) комбинации антибиотиков оксипрол и эритромицин (соотношение – 3:1). Контроль аналогичен описанному в примере 1.

После 18 ч инкубации (37°С) в анаэростате зона задержки роста испытанного штамма при концентрации испытанной комбинации антибиотиков 12,5 мкг/мл составила 26 мм, что указывает на его чувствительность. 

Пример 6. Изолят Candida albicans засевали в бульон Сабуро, обогащенный минеральными веществами, культуральную суспензию через 12 ч инкубации (25°С) вносили в теплый (48 – 50°С) агар Сабуро, обогащенный минеральными веществами, разливали засеянную плотную питательную среду по 25 мл в чашки Петри, сразу вводя в нее (48 – 50°С) по диаметру чашки на расстоянии 10 мм друг от друга по 0,1 мл 8 концентраций (от 1000 до 15,6 ЕД /мл) нистатина.