СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО СОХРАНЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ ШТАММА CLOSTRIDIUM CHAUVOEI

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к длительному сохранению биологических свойств коллекционных и производственных штаммов Clostridium chauvoei.

Одними из актуальных задач обеспечения эпизоотического благополучия животноводческих хозяйств являются выделение и идентификация возбудителей инфекционных болезней животных, подбор иммуногенных штаммов для производства ветеринарных биопрепаратов, причем особую значимость при коллекционировании патогенных микроорганизмов имеет долговременное хранение штаммов и передача их производству для изготовления вакцин и диагностикумов.

Главным биологическим свойством производственных штаммов является патогенность для восприимчивых сельскохозяйственных и лабораторных животных, которая определяет антигенную и иммуногенную активность вакцины. Поэтому изыскание эффективных методов длительного сохранения биологических свойств штаммов патогенов имеет научно-практическую значимость в микробиологии и биотехнологии.

В настоящее время штаммы микроорганизмов хранят в течение 6–12 мес. в нативном виде в жидких и плотных питательных средах под минеральным маслом, длительное время в замороженном состоянии при низких температурах и в высушенном виде при лиофилизации [1, 2].

Аналогичными методами хранения штаммов микроорганизмов в сухом виде являются адсорбция спорообразующих бактерий на различных носителях — почве, песке, бумаге, желатине, активированном угле [1,3]. В указанных способах не приведены данные о сроках хранения и результаты динамического исследования патогенности штаммов Clostridium chauvoei при хранении.

Известен контактно-сорбционный метод высушивания на бентоните Bacillus subtilis [3], которую 48 ч выращивают (37°С) в мясо-пептонном бульоне (МПБ), затем 48 ч при 50°С одновременно культивируют и высушивают бактериальную массу в обогащенном бентонитом МПБ. Указанный способ применяют для высушивания бактериальной массы при изготовлении пробиотика Субтилбен на основе непатогенной Bacillus subtilis, поэтому в результатах исследований приведены данные о бактерицидности пробиотика.

Прототипом заявленного изобретения является общепринятый способ длительного хранения патогенных штаммов клостридий, включающий культивирование бактерий на мясо-пептонном печеночном бульоне (МППБ) в течение 24 ч при температуре 37°С в анаэробных условиях и последующее лиофильное высушивание бактериальной массы с использованием защитных сред [4]. Недостатками этого способа являются его высокая стоимость, необходимость использования дорогостоящего лиофильного оборудования, трудоемкость процесса подбора защитных сред для предварительной заморозки биомассы, а также риск снижения биологической активности штаммов в процессе дегидратации.

Целью предлагаемого изобретения является длительное сохранение патогенных свойств коллекционных и производственных штаммов для изготовления высокоантигенных и иммуногенных вакцин против эмфизематозного карбункула (эмкар) рогатого скота.

Поставленная цель достигается тем, что коллекционный штамм Cch 33 TJ Clostridium chauvoei, выращенный (48 ч) на обогащенном белково-минеральными веществами МППБ до концентрации 5–6 млрд м.к./мл, адсорбируют на бентоните (1:10) во флаконах, закрытых ватными пробками, затем 48 ч инкубируют (37°С); после замены ватных пробок резиновыми адсорбированную культуру хранят при комнатной температуре (18–25°С) или в холодильнике (4–8°С) в течение длительного времени.

Сущность способа заключается в том, что при адсорбции вегетативных форм бульонной культуры штамма Cch 33 TJ Clostridium chauvoei на бентоните обеспечивается их переход в споровую форму в максимальном объеме. В качестве адсорбента использовали бентонит месторождения «Каратаг» (Республика Таджикистан) для длительного сохранения биологических свойств спор Clostridium chauvoei.

Заявленный способ позволяет длительное время сохранять биологические свойства, в том числе патогенность штамма, исключает периодический пересев производственных штаммов и заражение лабораторных животных каждые 4–6 мес., предотвращает риск контаминации посторонней микрофлорой и сохраняет иммуногенную активность бактерии. Доступность (не требуется специальное оборудование) и экономичность разработанного способа обусловливают его широкое практическое применение в лабораториях коллекционных штаммов микроорганизмов и производственных отделах биопредприятий.

Заявителем не выявлены способы длительного сохранения патогенности штаммов Clostridium chauvoei, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию «Новизна». Техническое решение характеризуется максимальным переходом бактерий в споровую форму, длительное время сохраняющую в носителе тинкториальные, морфологические, культуральные, биохимические и патогенные свойства, что соответствует «Изобретательскому уровню».

Практическое применение заявленного способа подтверждают следующие опыты.

Пример 1. Коллоидную фракцию бентонита (месторождение «Каратаг», Республика Таджикистан) по 100 г во флаконах стерилизовали (160°С) в сушильном шкафу в течение 1, 2, 3, 4 и 5 ч. соответствующие серии бентонитов засевали на: а) МПБ и мясо-пептонный агар (МПА) (24 ч культивировали при 37°С в аэробных условиях); 

б) обогащенный МППБ (48 ч культивировали при 37°С в анаэробных условиях); в) агар Сабуро (4 сут инкубировали при 25°С в аэробных условиях). В пробах нестерилизованной и стерилизованных в течение 1, 2 и 3 ч серий бентонита наблюдали рост непатогенной микрофлоры в МПБ и МПА, который отсутствовал в пробах стерилизованных 4 и 5 ч серий. В посеянных на обогащенный МППБ пробах нестерилизованного и стерилизованных в течение 1, 2 и 3 ч серий бентонита также отмечен рост бактерий, отсутствовавший в пробах серий, стерилизованных в течение 4 и 5 ч. Грибы отсутствовали как в нестерилизованной, так и во всех стерилизованных пробах серий бентонита, посеянных на агар Сабуро. Учитывая полученные результаты, при адсорбции культуры штамма Cch 33 TJ Clostridium chauvoei использовали бентонит, стерилизованный (160°С) в сушильном шкафу в течение 4 ч.