Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, а именно биотехнологии вакцинных препаратов, и может быть использовано для профилактики сальмонеллезного аборта у овец.
Среди инфекционных болезней, снижающих эффективность овцеводства в Таджикистане, значительное место занимает сальмонеллезный аборт овец (Salmonella abortus ovis), который причиняет значительный экономический ущерб животноводству [1,2,4,6].
На текущий момент известно более 2500 серотипов сальмонелл. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), количество возбудителей этой инфекции увеличивается из года в год [1,3].
Многолетний опыт использования убитых вакцин с применением гидроокиси алюминия в качестве адъюванта показал их недостаточную эффективность. Согласно данным В.Ф. Свириденко и соавт. [3], концентрированная формалиновая вакцина против сальмонеллезного аборта овец, применяемая в многих овцеводческих хозяйствах, оказалась неэффективной. Аборты сальмонеллезной этиологии регистрировались одинаково часто как среди привитых, так и среди не привитых стад.
Известна инактивированная вакцина против сальмонеллеза овец [8], изготовленная из штаммов Salmonella abortus ovis № 876; Salmonella dublin № 1449; Salmonella typhymurium №159, а также в качестве иммуностимулятора штамма Rodococcus equi № 2.
Известна также аттенуированная (ослабленная) живая вакцина, разработанная в Казахстане, которая представляет собой ослабленную культуральную вакцину [2,6].
Недостатками этой вакцины являются высокая остаточная реактогенность и возврат клеток вакцинных штаммов к исходному вирулентному состоянию. Кроме того, отсутствуют генетические маркеры (марки), которые позволяли бы отличать их от естественных прототипов.
Для специфической профилактики сальмонеллезного аборта овец также используется поливалентная формалиново-тиомерсаловая вакцина [7].
Вакцина содержит антигены трех сероваров: Salmonella abortus ovis; Salmonella dublin; Salmonella typhymurium, производимая Армавирской биофабрикой. Вакцину вводят дважды перед случкой и однократно ревакцинируют за 1 месяц до окота. Из-за высокой реактогенности овец не вакцинируют в последний месяц беременности и первую неделю после окота, а ягнят в возрасте до 20 дней. Эта вакцина из-за низкой иммуногенности не широко используется в практике.
Предложенная вакцина включает антигены трех сероваров сальмонелл: Salmonella abortus ovis, Salmonella typhimurium, и S. dublin. В дополнение содержится физиологический раствор, формалин и адъювант — маслинная взвесь клеток родококка в качестве иммуностимулятора. Однако, согласно данным многих исследователей, основным возбудителем сальмонеллеза овец является Salmonella abortus ovis, в редких случаях обнаруживается Salmonella typhimurium. Автор исследовал минеральное масло с безводным ланолином в соотношении 83:17 в качестве адъюванта [7].
Целью изобретения является повышение иммуногенных свойств вакцины и эффективности методов профилактики сальмонеллезного аборта овец с использованием местных штаммов Salmonella abortus ovis koshon/2020.
Поставленная цель достигается за счет использования бактериальной массы штамма Salmonella abortus ovis koshon/2020 при следующем соотношении компонентов, масс. %:
Бактериальная масса штамма Salmonella abortusovis koshon/2020 50-60
Сурковый жир с ланолиновым маслом (87:13) 17-18
Формалин 0,2-0,3
Физиологический раствор 22,7-31,8
Схема приготовления вакцины осуществляют следующим образом.
o Используют питательную среду для культивирования сальмонелл (бульон Хоттингера или среда Кауфмана или МПБ).
o Проводят посев штамма Salmonella abortus ovis koshon/2020.
Пример 1. Питательные среды (бульон Хоттингера или среда Кауфмана или МПБ) для культивирования штамма Salmonella abortus ovis koshon/2020.
Культивацию сальмонелл проводят на бульоне Хоттингера, среде Кауфмана или МПБ с добавлением сыворотки крови лошадей до конечной концентрации 5% и глюкозы до конечной концентрации 2%.
Определение бактериальной массы на 1 кубический сантиметр может достигать 1,0-2,0 миллиарда микробных клеток.
Процесс приготовления адъюванта начинают с взятия жира сурка и безводного ланолина в соотношении 87:17. Ланолин расплавляют в необходимом количестве и добавляют к жиру сурка. Затем смесь перемешивают и стерилизуют при температуре 115°C в течение 1 часа.
Адъювант проверяют на стерильность путем высева в 2 пробирках на каждую из следующих сред: МПА, МПБ, Китта-Тароцци и Сабуро. Посевы выдерживают при температуре 37°C в течение 10 суток (среда Сабуро при температуре 22-24°C). Не должно быть роста культур микроорганизмов на всех средах.
Пример 2. Подготовка посевного материала
Перед получением бактериальной массы необходимо пересеять культуру 3-4 раза с интервалом 1 суток на среде Кауфмана, Хоттингера или в МПБ. Культивацию осуществляют при температуре 37°C в течение 24-48 часов.
Получение бактериальной массы штамм Salmonella abortus ovis koshon/2020 проводилось
в стеклянных баллонах (20 л) или в реакторах (100 л), инактивированных формалином до конечной концентрации 0,2% или 0,3% в течение 3 суток при температуре 37°C. В процессе использовали технический формалин согласно ГОСТу 1625-75, содержащий 37% формальдегида.
После завершения инактивации бактериальной массы проверяли на стерильность путем высева в 2 пробирки на каждую из следующих сред: МПА, МПБ, Китт-Тароцци и Сабуро. Посевы на стерильность выдерживают при температуре 37°C в течение 10 дней (среда Сабуро при температуре 22-24°C в течение 20 дней).
Инактивированную культуру Salmonella abortus ovis koshon/2020 после инактивации сохраняют при температуре от +4°C до +10°C и используют для изготовления вакцины.
Инактивированные бактериальные суспензии концентрируют с помощью центрифугирования при скорости 5000-6000 оборотов в течение 15 минут до достижения конечной концентрации 60 миллиардов микробных клеток в 1 кубическом сантиметре.
Масло (жир сурка) и ланолиновую смесь (в соотношении 87:17) соединяют с бактериальной суспензией сальмонелл в соотношении 1:1 в бутылях. Затем смесь перемешивают в эмульгаторе со скоростью 6000 оборотов в минуту в течение 10-15 минут.
Эмульгированную вакцину разливают в бутыли для упаковки в стеклянные флаконы по ТУ 10-09-202-86 объемом 100 кубических сантиметров, которые тщательно закрывают резиновыми пробками по ТУ 38006-108-78 и запечатывают алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-909-86.
Одна иммунизирующая доза эмульгированной вакцины для молодняка составляет 1 мл, а для овцематок — 2 мл подкожно.
Пример 3. Определение безвредности
Вакцину вводят подкожно морским свинкам с массой тела 250-300 г в объеме 0,5 мл в области спины. В течение 10 суток после введения, вакцина не должна вызывать заболеваний или приводить к гибели животных.
По данной схеме было изготовлено 4 экспериментальных серии вакцин против сальмонеллезного аборта овец. Контроль вакцин на стерильность, безопасность и активность проводился с использованием общепринятых методов. Вакцина была апробирована в экспериментальных и производственных условиях на 1540 головах мелкого рогатого скота в трех сериях опытов.
Опыты проводились на базе подсобного хозяйства «Душанбе» Министерства обороны Республики Таджикистан. В первом опыте было использовано 231 серонегативных овцематок, не имеющих антител к возбудителю сальмонеллезного аборта овец. Животные были разделены на 3 группы.
Овцематок первой группы (121 голову) вакцинировали гидроокисалюминиевой вакциной экспериментальной серии № 1, изготовленной 30.06.22 года, подкожно в дозе 2 мл.
Овцематок второй группы (100 голов) иммунизировали подкожно однократно вакциной «ОКЗ» производства ООО «Агровет» Российской Федерации, инактивированной и в дозе 1,0 мл (прототип).
Овцематок третьей группы (10 голов) вакцинировали внутримышечно экспериментальной серией вакцины № 1, эмульгированной, изготовленной 30.06.2022 года, в дозе 2 мл.
У овцематок первой группы наблюдалось незначительное повышение температуры тела до 40,5-40,8 °C на 3-5-й сутки (см. таблица 1).
После введения вакцины "ОКЗ" от ООО "Агровет" РФ (контрольная группа), у овцематок второй группы наблюдалось незначительное повышение температуры тела до 40,2-40,8°C на 2-4-й сутки (см. таблица 2). При введении экспериментальной эмульгированной серии вакцины (третья группа), у овцематок также отмечалось незначительное повышение температуры тела до 40,2-40,9°C на 4-6-й сутки (см. таблица 3).
При серологическом исследовании сыворотки крови овцематок первой группы в реакции агглютинации (РА) были обнаружены антитела к возбудителю сальмонеллезного аборта овец в титрах от 1:25 до 1:800 у 25,6% животных.
У овцематок второй группы были обнаружены антитела в реакции агглютинации (РА) в титрах от 1:50 до 1:500 у 23% животных.
Среди овцематок третьей группы до вакцинации не было обнаружено антител к возбудителю сальмонеллезной инфекции. Все овцематки из этой группы были серонегативными до вакцинации.
У овцематок первой группы, где использовалась гидроокисьалюминиевая вакцина (ГОА) в качестве контрольной, антигемагглютинирующие антитела к возбудителю сальмонеллезной инфекции овец были обнаружены на 14 и 30 сутки в следующих титрах соответственно: 1:460 и 1:1480 (см. таблица 4).
При серологическом исследовании сыворотки крови овцематок второй контрольной группы были обнаружены антигемагглютинины к возбудителю сальмонеллезного аборта овец на 14 и 30 сутки в следующих титрах соответственно: 1:330 и 1:1080 (см. таблица 5).
Как видно из данных таблицы 5, у 50% вакцинированных овцематок второй группы вакциной производства ООО «Агроветсервис» Российской Федерации были обнаружены антитела только в титрах 1:100 и выше.
Результаты экспериментальных исследований по специфической профилактике сальмонеллезного аборта овец с использованием инактивированной эмульсин вакцины показали её безвредность и высокую иммуногенность для овцематок случного возраста. Антитела в сыворотках крови животных третьей группы в реакции агглютинации (РА) на 14 и 30-е сутки достигали титров 1:740 и 1:2240 соответственно, что значительно выше, чем в двух контрольных группах.
Определение эффективности опытной серии эмульсинвакцины проводилось на беременных овцематок в период с января по апрель 2023 года.
В результате исследования установлено, что среди овцематок, вакцинированных первой группой (контроль №1), случаи абортов, мертворождений и гибели произошли лишь в 14% случаев, что свидетельствует о высокой эффективности инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины (прототип) — эффективность составила 86%.
Эффективность вакцины «ОКЗ», произведённой ООО «Агровет» Российской Федерации, в данном опыте составила 84%.
Таким образом, предложенная эмульгированная вакцина, изготовленная Институте ветеринарной медицины, обладает следующими преимуществами:
· она слабореактогенна, что минимизирует негативные реакции после вакцинации;
· обеспечивает высокий уровень иммунитета против сальмонеллезного аборта овец;
· снижает количество случаев абортов у беременных овцематок;
· предотвращает передачу сальмонеллезной инфекции на молодняк овец, обеспечивая их защиту.
Эти преимущества делают данную вакцину эффективным инструментом в борьбе с сальмонеллезным абортом и защите стада овец.
Создание данной вакцины, способствует защите овец от сальмонеллезного аборта путём использования оптимальных пропорций компонентов, включая бактериальную массу, жир и ланолин для эмульсии, формалин для инактивации и физиологический раствор для создания желаемой консистенции и стабильности вакцины.
