ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТА INULA RHIZOCEPHALA SCHRENK ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА И МИГРАЦИИ КЛЕТОК ЭНДОМЕТРИОЗА IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной биологии и медицины, в частности, к применению растительных экстрактов для подавления жизнедеятельности патологических клеток, ассоциированных с эндометриозом, в условиях in vitro.

Известен способ оценки клеточной жизнеспособности с использованием системы xCELLigence, которая совместно с традиционными анализами жизнеспособности клеток для оценки цитотоксических эффектов, использует специализированные микротитровальные пластины с интегрированными золотыми микроэлектродами для неинвазивного измерения электрического импеданса клеточной культуры. Этот импеданс используется как индикатор жизнеспособности клеток в реальном времени и без меток. Система позволяет различать нарушения жизнеспособности, такие как старение, клеточную токсичность и снижение пролиферации . Однако у известного способа выявлены следующие недостатки: способ не применялся для клеток эндометриоза, что ограничивает ее использование в данной области медицины; отсутствует использование в способе фитопрепаратов и растительных экстрактов, обладающих потенциалом для терапии; не реализован комплексный подход с использованием нескольких методов оценки жизнеспособности, адгезии, миграции и апоптоза; не учитывается динамика клеточного ответа на препараты с разной кинетикой воздействия [1].                                   Из уровня техники известно ингибирующее действие некоторых видов растений рода Inula на злокачественные клетки.                                                                                                                                   Известно ингибирующее воздействие растительных экстрактов двух видов девясила (Inula macrophylla Kar. et Kir. и Inula rhizocephala Schrenk) на клетки опухолевого происхождения, а также цитотоксическое влияние экстрактов Inula rhizocephala на линии раковых клеток. Из известного источника не известно влияние при воздействие указанных экстрактов на эпителиальные клетки эндометриоза, а также не применяются методы комплексного клеточного анализа, такие как оценка адгезии, миграции, мониторинг в реальном времени и индукция программируемой клеточной гибели (апоптоза). Таким образом, указанный источник может рассматриваться как прототип, но он не раскрывает специфического применения экстракта Inula rhizocephala в отношении клеток эндометриоза [2].               Целью изобретения является разработка способа ингибирование роста, миграции, пролиферации и жизнеспособности клеток эндометриоза in vitro c использованием как неинвазивного мониторинга в реальном времени, так и классических методов оценки клеточного состояния.                                                                                                                                      Поставленная цель достигается применением экстракта корня девясила корнеголового (Inula rhizocephala Schrenk), полученного мацерацией в 70% этаноле в соотношении сырья к экстрагенту 1:10 (масса/объём), при инкубации в течение 4 недель в тёмном месте с периодическим перемешиванием и последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 1 часа, в качестве средства для ингибирования роста и миграции клеток эндометриоза in vitro. Обработку клеток проводят супернатантом экстракта в разведениях от Х500 до Х2000.  Экстракт вызывает снижение жизнеспособности, пролиферации, адгезии клеток эндометриоза, а также индукцию апоптоза и некроза, что находят свое подтверждение методами Alamar Blue, xCELLigence, wound healing, TUNEL и проточной цитометрии.                      Осуществимость заявленного изобретения подтверждается результатами серии лабораторных экспериментов in vitro. В качестве активного агента использовался экстракт корня девясила корнеголового (Inula rhizocephala Schren), приготовленный мацерацией в 70% этаноле в соотношении 1:10 (м/об) с инкубацией в течение 4 недель в тёмном месте с периодическим перемешиванием. После цетрифугирования при 5000 об/мин в течени чавса , полученный супернатант применяли в разведениях  от Х500 до Х2000.                                                        Целевым объктом исследования служила клеточная линия 12Z (человеческие эпителиальные клетки эндометроидной ткани), выращенная в стандарстных условиях. Влияние экстракта оценивали по следующим параметрам.

1. Оценка жизнеспособности клеток:

Влияние растительных экстрактов на жизнеспособность клеток эндометриоидной линии человека 12Z оценивали через 24 и 48 часов инкубации с использованием теста AlamarBlue.                                                                                                                                                                                                   Для эксперимента использовали экстракты девясила кореноголового (Inula rhizocephala Schrenk), обозначенные как pl-1, pl-5, pl-6 и pl-9, в разведении 1:1000 (X1000). Культуральную среду без добавления экстракта применяли в качестве отрицательного контроля, а препарат M2YN — в качестве положительного контроля.                                                                                                          Результаты представлены в виде относительных единиц флуоресценции (RFU). Как представлено на рис. 1, экстракты pl-5, pl-6 и pl-9 вызывают достоверное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с контролем, особенно при 48-часовой инкубации. Это свидетельствует о наличии цитотоксического эффекта, подтверждённого снижением метаболической активности клеток в тесте AlamarBlue.            

2. Оценка пролиферации клеток.                                                                                               Пролиферативную активность клеток эндометриоидной линии 12Z оценивали в реальном времени с использованием импедансной системы xCELLigence. Клетки инкубировали с

растительными экстрактами pl-1 – pl-10 в разведении X1000. В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду без добавления экстрактов, а в качестве положительного контроля — препарат M2YN. Как показано на рис.2, экстракты девясила корнеголового  pl-5, pl-6 и pl-9 вызывали значительное снижение индекса клеточного импеданса по сравнению с контролем, что указывает на подавление пролиферации эндометриальных клеток. Данные получены в динамике и отражают непрерывный мониторинг клеточной активности.

3. Оценка клеточной адгезии:                                                                                                                    Влияние растительных экстрактов на адгезию клеток линии 12Z исследовали в условиях клеточной культуры, выращенной на полистирольных ячейках, предварительно обработанных 0,05% раствором бычьего желатина. Для оценки использовали экстракты pl-1 – pl-10 в разведениях 1:500 и 1:1000 (X500 и X1000).                                                                                        Подсчёт адгезированных клеток проводился методом оптической микроскопии с последующей визуализацией и анализом изображения с помощью программного обеспечения. В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду, а в качестве положительного контроля — препарат M2YN.                                                                                                             Результаты представлены на рис. 3 и рис 4, где: на рис. 3 показаны микроскопические изображения клеток, прикреплённых к подложке, а на рис. 4 приведены количественные данные по числу адгезированных клеток.                                                                                                                                  Как видно из результатов, экстракты девяила корнеголового вызывают выраженное подавление клеточной адгезии по сравнению с контролем. Причём эффект был более выраженным при разведении 1:500, что указывает на дозозависимое усиление ингибирующего действия.

4. Исследование миграции клеток.                                                                                                           Миграционная активность клеток линии 12Z исследовалась методом заживления ран (wound healing assay) в условиях in vitro. Клетки выращивали в полистирольных культуральных ячейках до формирования монослоя, после чего в центральной части создавали механический разрыв (scratch), имитирующий "рану".                                                                                  После нанесения "раны" клетки инкубировали с экстрактами   девясила конеголового pl-1 – pl-10 в разведении 1:2000 (X2000). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду без добавок, в качестве положительного контроля — препарат M2YN.           Ход миграции оценивали с помощью оптической микроскопии в динамике. Расстояние между краями раны измеряли до и после инкубации, и рассчитывали процент закрытия раны. Результаты представлены на рисунках, где: на рис. 5  представлены визуальные данные микроскопии, иллюстрирующие эффект экстрактов на миграцию клеток. На рис.6- представлена количественная оценка степени закрытия раны под действием различных экстрактов.                                                                                                                                                                                  Согласно полученным данным, экстракты Inula rhizocephala Schrenk  pl-5, pl-6 и pl-9 вызывают значительное ингибирование миграции клеток по сравнению с контролем, что выражается в замедленном закрытии "раны". Максимальный эффект наблюдался при разведении 1:2000, что подтверждает наличие выраженной антимиграционной активности у данных образцов.

5. Оценка апоптоза и некроза клеток.

Для оценки индукции апоптоза в клетках линии 12Z под действием экстрактов девясила корнеголового (Inula rhizocephala Schrenk) pl-5, pl-6 и pl-9 был проведён анализ методом TUNEL и проточной цитометрии.

В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду с добавлением 70% этанола в разведении 1:500, а в качестве положительного контроля — препарат M2YN.

TUNEL-анализ (определение апоптоза)

Проведён флуоресцентный TUNEL-анализ, результаты которого представлены на Рис. 7.

Положительные клетки TUNEL визуализируются в виде флуоресцентных зелёных точек (FITC), указывающих на фрагментацию ДНК — признак апоптоза.

DAPI использовался для контрастного окрашивания ядер всех клеток.

Совмещение сигналов FITC и DAPI интерпретируется как апоптотические клетки.

Количественная оценка числа апоптотических клеток представлена на рис. 8. Экстракты pl-5, pl-6 и pl-9 демонстрируют значительное увеличение числа TUNEL-положительных клеток по сравнению с контролем.

Подтверждение индукции клеточной гибели было получено методом проточной цитометрии с использованием красителей Annexin V-FITC (апоптоз) и йодида пропидия (PI) (некроз).

На рис. 9 представлены результаты анализа клеточной популяции после обработки экстрактами.

Н рис.10 количественная оценка апоптоза. Экстракт pl-5 показал наибольшее апоптотическое действие.

На рис. 11 оценка некроза по PI-позитивным клеткам. Экстракты pl-5 и pl-9 вызывали значительное повышение уровня некроза по сравнению с контролем.

На рис. 12 обобщённый график распределения клеточной популяции по состояниям: живые, преапоптотические, апоптотические и некротические. Результаты демонстрируют, что pl-5 обладает выраженным некротическим и апоптотическим эффектом на клетки эндометриоидной линии 12Z.