Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, представляет собой штамм Salmonella dublin для приготовления инактивированной моновакцины против сальмонеллеза, ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза телят, а также диагностикумов.
Известен аттенуированный штамм Salmonella dublin ВГНКИ 9-16/2 [1], обладающий стабильной низкой остаточной вирулентностью, высокой иммуногенностью и используемый для приготовления моно- и бивалентной вакцины против сальмонеллеза телят. Особенностью штамма является наличие в его геноме наличие двух мутаций (в гене Su-Str и стрептомициновом локусе) независимо одна от другой снижающих вирулентность и обеспечивающих стабильность низкой остаточной вирулентности. Штамм ВГНКИ 9-16/2 обладает морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами присущими роду Salmonella и агглютинировался с монорецепторными О сыворотками: 1, 9, 12 и Н – сыворотками первой фазы – gp.
Известен штамм Salmonella dublin 1449, используемый в качестве антигена серовара Salmonella dublin в инактивированной эмульсин – вакцине против сальмонеллеза телят [2]. По морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам и относится к роду Salmonella. Штамм агглютинируется с О –сыворотками: 1, 9, 12; H –g, p. Патогенность штамма (ЛД50) для белых мышей составляла 5х103 микробных клеток при внутрибрюшинном введении.
Анализ выше указанных изобретений показывает на то, что указанные серогруппы сальмонелл менее распространены в условиях Республики Таджикистан и эффективность изготовленных, из этих штаммов, вакцин при профилактике сальмонеллезной инфекции будет ниже.
Наиболее близким к заявляемому является штамм Salmonella dublin 19, который по биологическим свойствам штамм отнесен к семейству Enterobacteriaceae, к роду Salmonella и выделен научно-исследовательской лабораторией биотехнологии МГАВМИБ из фекалий теленка [3]. Указанный штамм агглютинируется с сальмонеллезной монорецепторной сывороткой 09 и Н - сывороткой g, p. При внутрибрюшинном введении штамма Salmonella dublin белым мышам ЛД50 составляет 3,2 х106 микробных клеток. Штамм Salmonella dublin 19 используется для изготовления вакцин и диагностических препаратов.
Анализ данного изобретения показывает, что несмотря на то, что вакцина против сальмонеллеза телят изготовлена из слабовирулентного штамм Salmonella dublin 19, но он редко циркулирует в животноводческих хозяйствах республики и профилактическая эффективность вакцины будет значительно ниже.
Цель изобретения является изыскание наиболее распространенного местного штамма Salmonella dublin, обладающий низкой патогенностью, высокой иммуногенностью для изготовления моновакцины против сальмонеллеза, ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза телят, а также диагностикумов.
Поставленная цель достигается тем, что при исследовании 185 проб патологического материала больных и павших от пневмоэнтеритов телят из различных регионов республики этиологическая роль сальмонелл установлена в 25 (13,5%) случаев (табл.1). При серотипизации изолятов сальмонелл выявлено, что в животноводческих хозяйствах чаще всего циркулирует штамм Salmonella dublin, агглютинирующий монорецепторными 0-сыворотками: 1,9,12 и Н - сывороткой первой фазы - gp.
Выделенный, из паренхиматозных органов павшей с синдромом пневмоэнтерита телят принадлежащей ООО «Баракат» г.Гиссар, штамм Salmonella dublin SD 5 TJ хранится в Национальном центре коллекции патогенных микроорганизмов Института проблем биологической безопасности и биотехнологии Таджикской академии сельскохозяйственных наук под № 05.
Особенностью штамма является то, что он наиболее распространен в животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан, стабильно растет на питательных средах, обладает низкой патогенностью для белых мышей и высокой иммуногенностью.
Културально - морфологические свойства штамма и генетические особенности штамма. Штамм Salmonella dublin SD 5 TJ хорошо окрашивается анилиновыми красками и представляет собой мелкие грамотрицательные палочки без спор и капсул. Длина палочек составляет 1,6 - 1,9 мк, ширина – 0,3 – 0,4 мк. Микробные клетки подвижные с петрихиально расположенными жгутиками.
Условия культивирования на питательных сред, PН –среды. На мясопептонном бульоне образуют равномерное помутнение спустя 10 - 12 ч роста при температуре 37°С; на мясопептонном агаре через 24 ч при температуре 37°С образуют прозрачные, круглые, гладкие, выпуклые колонии диаметром 1 – 1,8 мм.
Физико – биохимические свойства штамма Salmonella dublin SD 5 TJ. Бактерия сбраживает глюкозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу и сорбит с образованием кислоты и газа. Образует сероводород, не сбраживает сахарозу, лактозу и раффинозу. Не свертывает молоко, не разжижает желатину и не образует индол.
Биологические свойства на лабораторных животных (патогенность). Патогенен для лабораторных животных. Бактериальный антиген агглютинируется монорецепторными 0 – сыворотками: 1,9,12 и Н - сывороткой первой фазы – gp.
При внутрибрюшинном заражении белых мышей ЛД50 составляет 5 х 106 микробных клеток. При пероральном введении штамма Salmonella dublin в дозе 2 х 109 микробных клеток у телят на 5-6 сутки наблюдается синдром диареи.
Пример 1. С целью изготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза телят, первичную культуру штамма Salmonella dublin SD 5 TJ засевали в МПБ и инкубировали в течение 24 ч при температуре 370С. Спустя 24 ч в маточной культуреизучали тинкториальные и морфологические свойства бактерии, определяли однородность культуры и ее стерильность. Затем для получения биомассы, в реакторе изготовили питательную среду, содержащей мясопептонный бульон с дрожжевым экстрактом и засевали маточной культурой из расчета 100 млн м. к. на мл среды и при 37оС инкубировали в течение 36 - 48 ч. После изучения однородности культуры, бактериальную массу инактивировали формалином и определяли полноту инактивации. Затем в биомассу добавили гидроокись алюминия, изучили стерильность и безвредность изготовленной вакцины.
В результате посева вакцины на питательных средах: МПБ, МПА, МППБ и Сабуро установлено, что развития посторонней микрофлоры: бактерии и грибов не отмечается.
Безвредность вакцины проверяли на белых мышах и кроликах. С этой целью, препарат белым мышам (10 гол) ввели подкожно, по 0,2 мл и кроликам ( 6 гол) – по 1 мл, и за подопытными животными вели наблюдение в течение 10 дней. Результаты наблюдения показывают, что привитые животные остаются здоровыми.
Таким образом, проведенные исследования показали, что изготовленная вакцина является стерильной и безвредной для животных.
Пример 2. Иммуногенные свойства инактивированной вакцины против сальмонеллеза изучали путем вакцинации десяти белых мышей (16 -18г) подкожно в дозе 0,5 мл двукратно, 6 кроликов живой массой 2,5 - 3 кг двукратно в дозе 2 мл подкожно с интервалом 14 дней. Контролем служили десять голов не вакцинированных белых мышей и шесть голов кроликов. Через 14 дней после двукратной вакцинации лабораторных животных заражали внутри брюшинно минимальной смертельной дозой суточной бульонной культурой Salmonella Dublin SD 5 TJ, заранее подтитрованной для белых мышей в дозе 200 млн м. к., для кроликов в дозе - 1 млрд м. к. Вакцину считали иммуногенной при выживании не менее 8-9 белых мышей из десяти и пятеро кроликов из шести в течение 10 дней после заражения.
Результаты опытов показали, что из числа вакцинированных белых мышей и кроликов после заражения заболели сальмонеллезом по одной головы с каждой опытной группы. Тогда как, все животные контрольных групп, после заражения заболели сальмонеллезом и пали.
Таким образом, разработанная на основе штамма Salmonella dublin SD 5 TJ вакцина при двукратной вакцинации обеспечивает формирование напряженного иммунитета, создающего в среднем 87,7% защиту лабораторных животных.
Пример 3. Опыты по изучению иммуногенной активности штамма Salmonella dublin SD 5 TJ проводили в неблагополучных по сальмонеллезу телят хозяйствах. С этой целью 35 голов телят 20 - 25 дневного возраста 2-х кратно, подкожно иммунизировали инактивированной вакцинной против сальмонеллеза в дозе 2 мл. За животными наблюдали в течение 6 месяцев после ревакцинации. Отмечали случаи заболевания подопытных животных сальмонеллезом. В результате наблюдения за опытными животными было установлено, что из 35 голов иммунизированных животных сальмонеллезом заболела одна голова (табл. 2).
Таким образом, профилактическая эффективность испытуемого препарата составила 97,2 %.
