СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ ФОТОСИНТЕЗА ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА

Изобретение относится к биологии, а именно к биотехнологии и биохимии растений получению растении хлопчатника сорта 108-Ф с повышенной активностью ключевых ферментов фотосинтеза - рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, фосфорибулокиназы, рибозофосфатизомеразы и образующих их мультиферментный комплекс.

По современным представлениям фотосинтезу принадлежит ведущая роль в продукционном процессе. Интенсивность же фотосинтеза обусловлена активностью ключевых ферментов фотосинтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (КФ 4.1.1.39) фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19) и рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6.). Фосфорибулокиназа катализирует конечную реакцию регенерации акцептора углекислоты - рибулозо - 1,5 бисфосфата.

Известно, что фитогормоны повышают интенсивность фотосинтеза, оказывают влияние на структурную организацию пластид, индуцируют синтез белка в хлоропластах и способствуют накоплению в них хлорофилла (1).

Главной мишенью цитокининов в растительной клетке являются пластиды, цитокинины способствуют превращению этиопластов в хлоропласты, формированию системы внутренних мембран и сборке компонентов электрон-транспортной цепи хлоропластов, возрастанию синтеза хлорофилла, синтеза многих ферментов, особенно рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (2- 4).

Очень успешно цитокинины находят практическое применение. В агропроизводстве их используют для усиления кущения растений, изменения формы и увеличения размеров ряде плодов, повышения доли женских цветков (огурцы и др.), всхожести семян, устойчивости к абиотическим стрессом и болезням, предуборочной дефолиации (хлопчатник и др.) и т.д. Совместно с ауксинами цитокинины применяют в биотехнологии при выращиваний клеточных и каллусных линий в стерильной культуре и при получении трансгенных растений.

Работы по созданию растений с направленными изменениями гормональной регуляции имеют огромные перспективы для получения новых форм полезных растений с хорошей защитной реакцией.

Техническим результатом изобретения является способ повышение активности ключевых ферментов фотосинтеза листьев хлопчатника.

Технический результат достигается тем, что с помощью добавления различных концентраций кинетина в экстракты из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, выделенные в разные фазы развития растений, 5-6 настоящих листьев, бутонизации и цветения повышается активность мультиферментного комплекса.

Для определения влияния кинетина на ферменты  мультиферментного комплекса цикла Кальвина экстракты из листьев растений хлопчатника различного возраста инкубировали в течение 20 мин с 2мкмоль кинетина и реакционной смесью без субстрата при температуры 25ºС. Реакция начиналась при добавлении субстрата  рибозо-5-фосфат. Продолжительность реакции 1 мин. Реакция останавливали 6% трихлоруксусной кислотой (ТХУ). При переходе растительного организма с одной стадии развития на другую изменяется его гормональный гомеостаз. Фитогормоны в онтогенезе растений являются тем инструментом, который геном управляет процессами роста, развития и покое растений. При этом фитогормоны участвуют и в регуляции таких физиологических процессов, как фотосинтез, транспорт веществ и отложение их в запас.

Для успешного получения растений с направленными изменениями гормональной регуляции необходимы  углубленные исследования их действия на активность и синтез фотосинтетических ферментов, ответственных за фиксацию углекислоты и синтез первичных органических соединений, т.е. ферментов цикла Кальвина. Ведь при участии фотосинтеза происходит синтез фитогормонов, с которым связаны первичные механизмы роста.

Пример 1. Для изучения влияния различных концентраций кинетина в реакционной среде на карбоксилазную активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) мультиферментного комплекса в экстракте из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе развития растений 5-6 настоящих листьев. Субстрат – рибозо -5 - фосфат+АТФ

Результаты определения карбоксилазной активности рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы мультиферментного комплекса в экстракт из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, выделенного в фазе развития растений 5-6 настоящих листьев приведены в табл. 1. 

Таблица 1.

Из табл.1 видно, что в ситуации, при которой кинетин вносился в реакционную среду в концентрациях 1 мкмоль/мл, карбоксилазная активность РБФК/О становилась на 24% больше. А в ситуации, при которой кинетин вносился в реакционную среду в концентрациях 1,5 мкмоль/мл, карбоксилазная активность РБФК/О становилась на 51% больше. Что касается ситуации, при которой кинетин вносился в реакционную среду в концентрациях 2-3 мкмоль/мл, то карбоксилазная активность РБФК/О увеличивалась более чем на 200%. Если же использовались такие концентрации кинетина, которые превышали 3 мкмоль/л, то здесь активирующее воздействие, с которым сталкивался фермент, несколько снижалось и составляло 212 - 192-141% соответственно.

Результаты определения фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев при добавлении различных концентраций кинетина в реакционную среду при использовании собственного специфического субстрата фермента рибулозо-5-фосфата и рибозо–5-фосфата+АТФ - субстрата первого фермента мульти ферментного комплекса – рибозофосфатизомеразы приведены в табл. 2.

Таблица 2.

Зависимость от использования различных субстратов влияния разных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназную (ФРК) активность мультиферментного комплекса в экстракте из листьев хлопчатника сорта 108-Ф (фаза развития растений 5-6 настоящих листьев)

Из представленных в табл. 2 данных видно, что независимо от использованного субстрата фосфорибулокиназная активность возрастала при концентрации кинетина 0,5-5мкмоль/мл реакционной среды. Величины же активирующего действия кинетина зависит от использованного субстрата. В присутствии собственного специфического субстрата – рибулозо-5-фосфата наибольшее активирующее действие кинетина проявлялось при концентрации кинетина 3-4 мкмоль/мл реакционной среды -170-155% соответственно, при применении рибозо-5-фосфата в качестве субстрата величины фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса при всех концентрациях кинетина были значительно выше 133-191%. В присутствии рибулозо-5-фосфат +АТФ кинетин в концентрации 1 мкмоль/мл реакционной среды увеличивая фосфорибулокиназную активность на 21%, а при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ – на 45%. При содержании кинетина в реакционной среде 2мкмоль/мл реакционной среды фосфорибулокиназная активность в присутствии собственного специфического субстрата рибулозо-5-фосфата + АТФ возрастала на 24%, а при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата +АТФ – на 48%. При концентрации кинетина 3мкмоль/мл реакционной среды фосфорибулокиназная активность в присутствии рибулозо-5- фосфата + АТФ увеличивалась на 70%, а при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ на 91%. Концентрация кинетина 4 мкмоль/мл реакционной среды вызывала возрастание фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса при использовании рибулозо-5-фосфата + АТФ на 55%, а в присутствии рибозо-5-фосфат + АТФ на 70% концентрация кинетина 5 мкмоль/мл реакционной среды приводила к возрастанию фосфорибулокиназной активности в присутствии рибулозо–5-фосфата +АТФ на 22%, а при использовании рибозо-5-фосфата + АТФ на 34%.

Независимо от использованного субстрата при концентрациях кинетина 10 и 15 мкмоль/мл реакционной среды происходило ингибирование фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса.

Полученные данные свидетельствуют о том, что мультиферментный комплекс обладает большей чувствительностью к кинетину, значительное активирующее действие которого проявляется уже при концентрации 1-2 мкмоль/мл реакционной среды.

Следовательно, регуляция кинетином активности фосфорибулокиназы, встроенной в мультиферментный комплекс при использовании первого субстрата метаболической цепи является более быстрой и эффективной.

Пример 2. На основании полученных результатов дальнейшие исследования проводились при использовании в качестве субстрата фосфорибулокиназы  рибозо - 5 - фосфата + АТФ.

Результаты определения при добавлении в реакционную среду различных концентрации кинетина фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника, выделенных в фазе бутонизации растений приведены в табл. 3.

Таблица 3.

Влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназную (ФРК) активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе бутонизации растений (субстрат: рибозо-5-фосфат+АТФ)

При сравнении величин фосфорибулокиназной активности мульти ферментного комплекса в фазе развития хлопчатника 5-6 настоящих листьев и в фазе бутонизации, активность в фазе бутонизации возросла на 30%.

Добавление кинетина в реакционную среду в концентрации 1-2 мкмоль/мл реакционной среды в фазе бутонизации растений вызывало активацию фосфорибулокиназной активности на 26-36% соответственно.

При концентрации же кинетина 3мкмоль/мл реакционной среды фосфорибулокиназная активность возросла на 91%.

При концентрации кинетина 4мкмоль/мл реакционной среды активирующее действие кинетина несколько снижалось и достигало 67%.

Концентрация кинетина 5мкмоль/мл реакционной среды не оказывала влияния на фосфорибулокиназную активность мульти ферментного комплекса.

Концентрации кинетина 10-15 мкмоль/мл реакционной среды подавляли фосфорибулокиназную активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника.

Пример 3. Результаты определения при добавлении в реакционную среду различных концентраций кинетина на фосфорибулокиназную активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника, выделенных в фазе цветения представлены табл. 4.

Сравнение величин фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев, выделенных в фазе бутонизации растений и в фазе цветения выявили значительные различия в действии кинетина при концентрациях 4-5 мкмоль/мл реакционной среды.

В концентрации 4 мкмоль/мл реакционной среды кинетин оказывал активирующее действие на 67% на фосфорибулокиназную активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев, выделенных в фазе бутонизации растений.

Концентрация же 5мкмоль/мл реакционной среды не оказывала никакого влияния, т.е. не увеличивала и не подавляла фосфорибуло-киназную активность.

Таблица 4.

Влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназную (ФРК) активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе цветения растений (субстрат: рибозо-5-фосфат+АТФ)