СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности получения оздоровленного безвирусного и продуктивного исходного материала, используемого для производства семенного картофеля.

Картофель является важнейшей пищевой  и технической культурой в Таджикистане и  дает в 3 раза больше белка, чем пшеница, и в 1-1,5 раза больше, чем кукуруза. Белок картофеля содержит ряд аминокислот, которые по пищевой ценности превосходят все растительные белки. Но в последние годы, в результате глобального изменения климата, происходит тенденция падения урожайности и его качества  по причине засоления пахотной почвы и усиление вешние вредоносных вирусов, а также других бактериальных и грибных болезней. Вместе с тем население в  мире достигнет более 10-млрд, к 2030 г что требует изыскание  новых путей  решения продовольственной безопасности. Производство продукции в первую очередь зависит от обеспечения сельхозпроизводителей собственным качественным семенным материалом. В последние годы при производстве семенного материала широко используется получение оздоровленного исходного материала с применением приёмов биотехнологии. Это подчеркивает актуальность решения пищевой безопасности государства посредством разработки новых способов оздоровления картофеля от вирусов и других патогенов, поскольку они снижают урожайность картофеля на 40-60%. Биотехнологический подход позволяет в кратчайшие сроки обнаружить формы растений, обладающие стресс-толерантностью и продуктивностью, что создает базу  для производства оздоровленного семенного картофеля и интенсифицирует товарное производство с меньшими затратами.

Отечественный сорт картофеля «Таджикистан» высокоурожайный, красноплодный, имеет отличные вкусовые характеристики, отличается высокой товарностью, способен давать стабильно-высокий урожай разных в экологических картофелеводческих  (горных, предгорных) зонах. Сорт отличается устойчивостью к высокой температуре и засолению почвы, аккумулирует в клубнях двухвалентного FeСl₂, что полезно для людей с низким содержанием гемоглобина в крови. Сорт картофеля «Таджикистан» принят как стандартный сорт, решением Министерства сельского хозяйства РТ что служило в свою очередь  объектом наших исследовании для решений продовольственной безопасности.

    Известен способ микроразмножения картофеля, включающий культивирование  оздоровленных растений in vitro путем микрочеренкования на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей макро- и микроэлементы, витамины по Уайту, сахарозу, глицерин, НУК, агар; получение меристемных растений и растений-регенерантов, которые  подвергаются ежесуточному воздействию температурой +4+5С^о в течение 2ч в течение 6-7 дней [1].

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является  способ микроклонального размножения картофеля in vitro сорта картофеля  «Алена», включающий стерилизацию, культивирование растений картофеля in vitro, путем микрочеренкования на среде Мурасиге-Скуга по прописи, витамины по Уайту, получения микроклубней in vitro, оздоровления исходных растений картофеля от вирусов стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацита в течение 3-5минут, промывкой стерильной водой [2]. 

Недостатком данного способа размножения картофеля является низкая скорость роста растений-регенерантов in vitro, низкий выход микрорастений,  высокий уровень содержания вирусов в растениях-регенерантах, и высокий процент мутантных регенератов, что отрицательно сказывается на выживаемости растений в последующих поколениях и нестабильности получения урожая, что в сваю очередь  снижает себестоимость растений-регенерантов.

Целью изобретения является получение безвирусных растений картофеля in vitro с использованием росто-регулируемого   препарата фолиевой кислоты и антивирусного препарате 1,β-d-рибофуранзил-1,2,4-тиазол-3-карбоксамид ( рибаверин) из этиолированных ростков картофеля.

Сущность разработки способа оздоровлений картофеля и его микроклонального размножения in vitro, при котором из этиолированных ростков вычленяется апикальная часть (0,3-0,5мм), стерилизуется в 0,15% хлориде меркурий  7 минут, промывается 70% этиловым спиртом, и далее промывается  трехкратно стерильной дистиллированной водой. Далее верхушки ростков (0,2-0,5мм) культивируют в среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением фолиевой кислоты (5мг/л) и антивирусного препарата  рибаверина-1,β-d-рибофуранзил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (8мг/л), полученном  оздоровленного  растения, и последующим  микрочеренкованием в стеклянной пробирке (2х28см) и выращивание в условиях фитотрона при 16/8ч фотопериоде  (см. табл. 1). Причем антивирусного препарата рибаверина стерилизуют через антибактериального фильтра и добавляют после автоклавирования питательной среды МС

Технологическим результатом заявляемого изобретения является получение оздоровленного (безвирусного) сорта картофеля  и рекомендуется также для перспективных существующих в мире  сортов картофеля, повышение коэффициента размножения регенератов, обеспечение технической простотой  и снижение себестоимости. Конечным результатом изобретения является обеспечение импортозамещения зарубежных сортов и  налаживания  семеноводства картофеля на безвирусный основе.  Указанный технический результат микроразмножения in vitro достигается следующим образом: 

Таблица 2.

Эффект режима стерилизации ростков картофеля

 При таких способах стерилизации процент живых стерильных эксплантов в условиях культивирования in vitro в среде Мурасиге-Скуга (МС) достигает при обработке смесью 76% этилового спирта и 20% перекиси водорода до-58%. 0,15% меркурий хлоридом 89%, что является важным для достижения поставленной цели (таблица 2). При более низких концентрациях стерилиантов очень высок процент заражения питательных сред микробными и грибными патогенами. При более длительном воздействии стерилианты оказывают губительное действие на рост эксплантатов, причем независимо от сорта и степени оздоровленности клубней картофеля. При планировании работы также необходимо учитывать особенности генотипа и степень их оздоровленности. Как видно из данных табл.3, уровень оздоровленности клубней резко увеличивает процент живых эксплантов при стерилизации различными стерилиантами. Кроме того, при длительном клонировании полученные ростковые регенеранты in vitro способствуют сохранению генотипа по сравнению с меристемными регенерантами, где кратность клонирования ограничена 4 или 5 черенкованиями. Для росткового клонирования in vitro рекомендуется использовать только оздоровленные клубни картофеля. Для данной цели  впервые нами использован антивирусный препарат рибаверин, который способствует полному освобождению растений картофеля от вирусов и фолиевую кислоту в качестве стимулятора роста. Содержание вирусов в нашем способе составляет 0.02-0.08%  (табл.3).

Таблица 3.

Количество живых эксплантов в зависимости от оздоровленности

генотипа картофеля с добалением рибаверина (8мг\л)

При использовании ростков от клубней массовой репродукции процент живых эксплантов в два раза ниже, чем при использовании ростков от клубней оздоровленного материала. Следует отметить, что ростки от клубней массовой репродукции не гарантируют освобождения растений-регенерантов от вирусных инфекций. Разработанный нами способ полностью освобождает растения от вирусов и других инфекций, а также дает возможность получения в короткий срок больших количеств растений-регенерантов, что важно для производства элитного семеного картофеля.

Настоящее изобретение обладает целым рядом преимуществ перед существующим. Сочетание процесса предварительной обработки экспланта раствором хлорида меркурия  и их регенерация  с добавлением фолиевой кислоты в культура явную среду  позволяет более эффективно выявить нежизнеспособные экспланты, получить более перспективные и пригодные для  получения микро- растения,  в дальнейшем микро-растение будут использованы для обработки раствором антивирусного препарата  рибаверина, гарантирующим освобождение материала от вирусов и других инфекций. Данный способ отличается от существующих:

а) высокой приживаемостью в условиях in vitro;

б) сокращение сроков получения растений-регенерантов in vitro в несколько раз

в) низкий уровень мутантных растений-регенерантов по сравнению  с меристемной культурой 

г) более эффективное освобождение от вирусов (до 100%).

Пример 1.

Использовали культуры апикальных меристем в среде Мурасиге –Скуга (МС) pH 6,7-6,9 с добавлением фитогормонов (кинетин, 6-БАП, НУК, ИМК) и большой концентрации сахарозы (7000-8000г/л.) В этих условиях из апикальных меристем  получаем регенеранты в течение 6-9 месяцев. И затем их амплифицировани в нужном количестве микро-растений с целью получения оздоровленных от вирусов и инфекций растений. Недостаток данного спо

Пример 2.

Использовали среду МС с добавлением 2000-3000г/л сахарозы для культивирования апикальных меристем в условиях  in vitro. В этих условиях  не корректировали pH культуральной среды. При использований в среде МС макроэлементов, таких как KH₂PO₄ или  NaH₂PO₄, значение pH сильно падает до 3,5-4,0. В этих условиях ризогенез и органогенез регенератов из апикальной меристемы сильно замедляется и формируются многочисленные бесхлорофильные  регенераты, что также затрудняет отбор растений, характерных материнским.

Полученные этим методом регенераты теряют формирование микроклубней in vitro, которое является основой семеноводства картофеля, свободного от вирусов и инфекций и также является малопродуктивным.

Предлагаемое нами решение    получения свободных от вирусов и инфекций регенератов из апикальной части этиолированных ростков размером 0,3-0,5мм устраняет недостатки вышеупоменутых методов и является универсальным для всех без исключения сортов картофеля, что способствует получению оздоровленных регенератов-растений и способствует ускоренному получению высококачественного семенного картофеля.

Пример 3.

Использование для получения растений–регенерантов картофеля в   системе in vitro столонов картофеля. В этих целях применяли среду Мурасиге – Скуга (МС) с добавлением с среде культивирования in vitro сахарозы 2000г/л, ИМК и рибаверина в концентрации 20мг/л. Недостаток этого способа заключается в том, что для этой цели обязательной процедурой является использование столонов из регенератов,  свободных от вирусов и индукции в системе in vitro, что требует дополнительного дорогостоящего оборудования. Более того, регенерация растений из столонов в культуре занимает более 3-5 месяцев, что также способствует образованию мутантных растений, а это негативно сказывается на процесс амплификации регенерантов.

Разработанное нами решение является более простым и дешевым с большим экономическим эффектом.                                                                                  

Ни в одной из известных публикаций, посвященных данной области биотехнологии, не описано предлагаемое в изобретении решение. В сельском хозяйстве Таджикистана существует потребность в разработке упрощенного, экономичного, экологически безопасного и более эффективного способа получения оздоровленного семенного элитного картофеля. А потребность в семенном оздоровленном картофеле в мире из года в год увеличивается. Данный способ является востребованным в системе картофелеводства  Таджикистана, так как отсутствует система получения  элитного материала. Таким образом предлагаемый нами метод- является новым и эффективным способом получения безвирусного картофеля in vitro.

Изобретение позволяет получить в короткие сроки, оздоровленные  сорта  картофеля, повысить коэффициент размножения растений, ускорить рост эксплантов, снизить содержание вирусов до минимума (0,02-0,03%), обеспечить техническую простоту культивирования и снизить себестоимость микрорастений (Фиг 1-2, табл. 1-3).

В таблице  4 приводятся результаты выхода оздоровленных регенерантов из культуры верхушки побегов (0,3-0,5ммм)  заявляемым способом, а также для сравнения по способам, приведенным в аналогах и прототипе (табл.3).

    Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать в большом количестве микро-растения in vitro, полностью свободные от вирусов, что делает возможным его применение в картофелеводстве для всех сортов для интенсификации производства семенного и пищевого картофеля, что в будущем будет базовой отраслью для обеспечения пищевой безопасности населения Таджикистана и мира в целом, с низкой себестоимостью (5-7 сомони шт/растений) по сравнению с  существующим меристемным (18-25 сомони) (таблица 4).

Таблица 4.

Сравнительная характеристика способов оздоровления картофеля

in vitro

В результате исследований нами был усовершенствован протокол микроразмножения картофеля, включающий следующие этапы:

а) Из этиолированных ростков клубней картофеля получили первичные экспланты. Для изолирования первичных эксплантов оптимальным является  использование 10-15 дневных ростков клубней картофеля, выращенных в темноте при температуре 20-22^оС. Этиолированные ростки обрабатывали 0.15% раствором меркурий хлорида (оптимальным является 7 мин), в качестве первичного экспланта использовали апикальную часть ростков размером 0.3-0.5мм и культивировали по прописи МС и с добавлением антивирусного препарата рибаверина (8мг\л) и в качестве ускорителя ростовых процессов использовали фолиевую кислоту (50мг\л).

б) Инструкцию побегообразования из первичного экспланта ростков осуществляли на культурной среде МС с микро-и макроэлементами, витаминами, сахарозой и агаром по прописи МС, но без добавления кинетина и 6-БАП-а (бензиламинопурин). Применение данного протокола обеспечивает регенерацию от 73 до 89%

в) Для максимального освобождения от вирусов и других инфекций следует культивировать на среде МС по прописи и с добавлением ИМК (2мг\л); рибаверин (8мг\л); фолиевая кислота (50мг\л). Такой протокол обеспечивает получение регенерантов, свободных от вирусов (до 98.99%), а также получения от 3800 до 6000 микрорастений с одного экспланта за 8 циклов культивирования в системе in vitro.   

Использование заявленного способа  микроразмножения картофеля in vitro позволяет получить свободные от вирусов и патогенов растения–регенеранты отечественного сорта картофеля «Таджикистан» с высоким потенциалом и выход растений-регенерантов с низкой себестоимостью. Предлагаемый способ очень прост в использовании и не требует специального оборудования. Предложенное техническое решение экологически безопасен и может быть использован в картофелеводстве и является универсальным для всех сортов. Имеющиеся в литературе методы  получения безвирусных побегов растений с использованием рибаверина сообщается также для плодовых культур (яблонь), а для картофеля -2-тиоурацил (6-7) который является мутагеном