Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно для биотехнологии вакцинных препаратов и может быть использовано для повышения специфической профилактики сальмонеллёзного аборта овец.
В настоявшее время для специфической профилактики сальмонеллёзного аборта у овец используются разные импортируемые вакцины, которые не всегда оказывают достаточный эффект.
Сальмонеллёзы широко распространены в природе и наносят значительный экономический ущерб овцеводству. В настоящее время известно более 2500 серотипов сальмонелл.
Среди инфекционных болезней, снижающих эффективность овцеводства в Таджикистане, значительное место занимает сальмонеллёзный аборт овец (salmonella abortus ovis) и причиняет большой экономический ущерб животноводству.
Сальмонелла, палочковидная грамотрицательная бактерия, относящаяся к семейству Enterobacteriaceae, является возбудителем сальмонеллеза. Cальмонеллы имеют сравнительно высокую вирулентность среди животных соответствующего вида [1].
Сальмонеллёз овец чаще наблюдается за 1—1,5 месяца до окота или вовремя окотной кампании. Болезнь может стать массовой и сопровождаться абортами и гибелью овцематок от послеродового сепсиса. Аборт возникает внезапно, но обычно до него наблюдаются беспокойство овец, отек половых губ, из влагалища выделяются кровянисто-слизистые массы. После аборта овец могут быть задержание последа, эндометрит. Нередко сальмонеллез у овец протекает бессимптомно. Абортировавшие овцематки представляют наибольшую опасность, так как вместе с плодом, плацентой, оболочками и плодными водами выделяют вирулентные культуры сальмонелл во внешнюю среду [2, 3].
Известен штамм бактерии В-0066 Salmonella abortus ovis АН 9/2, используемый для получения инактивированной вакцины против сальмонеллезного аборта овец [4].
Недостатком данного штамма является недостаточная вирулентность по сравнению с выделенным нами местным штаммом.
Также известен штамм бактерий Salmonella abortus ovis (ВГНКИ), используемый для изготовления фабричного антигена производства Курской биофабрики [5].
Недостатком известного штамма является возможность утраты вирулентности вследствие длительных пересевов и отсутствие пассажей на восприимчивых животных (овцематках).
Целью нашего изобретения является получение и использование местного высоковирулентного штамма Salmonella abortus ovis с типичными культурально-морфологическими, биохимическими, антигенными свойствами для разработки вакцин отечественного производство.
Изобретение было направлено на выделение эпизоотического штамма Salmonella abortus ovis, обладавшего патогенностью для любого возрастного состава овец, находящегося на территории Республики Таджикистан.
Идентификацию штамма бактерий проводили по основным культурально - морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю Bergey s (1997, том 1, стр. 192-193).
Штамм бактерий «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/ депонирован в лаборатории биотехнологиии ветеринарных препаратов Института ветеринарной медицины ТАСХН с целью приготовления вакцины против указанной инфекции.
Вирулентные свойства выделенного штамма достаточно высоки, что позволяет эффективно его использовать для производства вакцины, а также изучения иммуногенности вакцины.
Штамм «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/ характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки
Штамм «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/ в мазках из суточных культур, выращенных на жидкой или плотной питательной среде, представляет собой короткие прямые или слегка изогнутые палочки, грамотрицательные, неспороносные, с закруглёнными концами. На обычных питательных средах пышно растут в гладкой форме, колонии на плотных средах выглядят округлыми, блестящими, выпуклыми с ровной поверхностью. Salmonella abortus ovis – палочка с закруглёнными концами, по сравнению с другими сальмонеллами несколько меньшего размера, длина ее 0,8 -3,0, ширина 0,4-06 мкм. На обычных средах развивается довольно скудно, формируя мелкие (с булавочную головку) просвечивающие колонии с приподнятым центром. На бульонах (Хотингера и Мартена с сывороткой крови, аминопептидном, гидролизном) растёт пышно, бактериальные клетки более крупные и не отличаются от других сальмонелл. На бульоне образует умеренное помутнение и незначительный осадок. На полужидком агаре наблюдается рост по всей толще среды.
На среде Эндо колонии белого цвета (неферментируют лактозу), слегка розоватые, прозрачные, блестящие с ровными краями; на висмут - сульфитном агаре мелкие черные колонии с металлическим блеском с окрашиванием участка среды под колониями в чёрный цвет, на среде Плоскирева - бесцветные колонии, на среде Левина - малинового цвета.
Физико-биологические свойства. Salmonella abortus ovis способна расти в микроаэробных условиях. Оптимум pH 7,2 при температуре 37°С.
Биохимические свойства.
Штамм «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/– сбраживает глюкозу, маннит, с образованием кислоты и очень слабо газ; лактозу, сахарозу, дульцит, сорбит, рамнозу не сбраживает; индол не выделяет; желатин не разжижает; мочевину не разлагает, нитраты редуцирует, сероводород образуется слабо, лизин декарбоксилирует. Имеет отрицательную реакцию по Фогес-Проскауэру, не образует ацетилметилкарбинол.
Патогенность.
Штамм высоко патогенен для белых мышей и восприимчивых овец. Штамм «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/ был патогенен для белых мышей при внутрибрюшинном заражении в дозах 0,2- 0,5 мл на голову.
При экспериментальном заражении данным штаммом, заболевание протекает среди овец с ярко выраженной клинической картиной, характерной для сальмонеллёзного аборта овец.
Антигенные свойства.
Salmonella abortus ovis / koshon/2020/ вызывает образование антител, которые отличаются по характеру агглютината вследствие присутствия двух основных антигенных комплекса: О-антиген (соматический) термостабильный; Н – антиген, а также - О- и Н- антигены сальмонелл.
Для проведения О- агглютинации культуру брали с верхней части пробирки. О – агглютинация характеризуется зернистостью, соединение клеток происходит полярными поверхностями, в результате образуются мелкие частицы, О антиген- 4, 12, Н-с (1-я фаза), 1,6 (2-я фаза).
Для проведения Н - агглютинации культуру брали со дна пробирок. Н - агглютинация характеризуется образованием хорошо видимых крупных хлопьевидных рыхлых частиц агглютината, в результате соединения клеток своими жгутиками и полного их обездвиживания.
Род сальмонелла подразделен на 4 подрода: I – IV. Каждый подрод отличается между собой по биохимическим признакам. Данные биохимических показателей варьируют в зависимости от вида, типа, а также штамма возбудителя.
Сальмонеллы объединены в 5 серологических групп, которые подразделяются на: А, В, С, Д, Е. Принадлежность к каждой группе определяется общностью соматических антигенов штаммов.
По классификации штамм Salmonella abortus - ovis относится к серологической группе В.
На основании особенностей Н - антигенов сальмонелл проводится дифференциация внутри группы. Таким образом, 1 -я фаза обозначена строчными буквами латинского алфавита. У Salmonella abortus – ovis 1 - я фаза обозначена - С; а 2-я фаза обозначена арабскими цифрами 1,6.
С диагностическими сальмонеллезными агглютинирующими сыворотками, при типизации с поливалентной (А, В, С, Д, Е), О - сывороткой 1, 4, 12 и Н -сыворотками 1 –я фаза с, 2 -я фаза 1,6 штамм имеет постоянную реакцию.
Штамм Salmonella abortus ovis / koshon/2020/ - эпизоотический, по клиническим признакам обладает свойствами вызывать аборты у овцематок. При экспериментальном подкожном введении овцам 500 млрд м. к./ см3 штамм Salmonella abortus ovis / koshon/2020 также вызывает аборты.
При проведении биологических тестов на белых мышах (250 тыс. м. к. при подкожном введении суточной бульонной культуры) отмечена высокая вирулентность и. гибель всех экспериментальных мышей.
Штамм Salmonella abortus - ovis хранится в биобанке, в лабораторных условиях, при этом нами не отмечены изменения культурально- морфологических, биохимических свойств. Данный штамм сохраняет свою вирулентность, патогенность и антигенную структуру.
При исследовании антигенов, приготовленных на основе штамма «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/ обнаружен максимальный титр соответствующих антител.
Выделенный штамм сальмонеллы предлагается использовать для контроля иммуногенности вакцины и разработки специфических профилактических, а также диагностических препаратов против сальмонеллёза овец.
Пример 1
Изолят салмьонеллы, послуживший источником для получения штамма Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/, был выделен в Институте ветеринарной медицины ТАСХН из абортировавших плодов овец, полученных в феврале-марте 2020 года, от подозреваемых в заболевании сальмонеллёзным абортом овец из дехканского хозяйство «Ходжи-Шариф» района Кушониён Хатлонской области.
В мясопептонный бульон (МПБ) засевали пастеровской пипеткой кусочки паренхиматозных органов абортированных плодов. В термостате при 370С культивировали 18 - 24 часа. По истечении срока отмечалось равномерное помутнение МПБ. Далее с МПБ проводили посевы на мясопептонный агар (МПА), на среду Эндо, висмут - сульфитный агар.
Отмечалось накопление бакмассы при пересеве их в МПБ при 20 часах инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке 1,0 см3 на 10,0 см
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/ возбудитель сальмонеллёза овец, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной микробиологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов.
-штамм «Salmonella abortus ovis» / koshon/2020/, получен в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, пригоден для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных, безвредных вакцинных препаратов.
Следовательно, предлагаемый штамм соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
