СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА ИНФЕКЦИОННОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ПЕРЕПЕЛОК.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к вирусологии.
Сущность изобретение заключается в изучении и разработки наиболее эффективных методов диагностики и профилактики, изучения клинических и патоморфологических признаков (описание развития и последствия заболевания), а также серологического и гистологического исследования патологического материала, для исследования формирования у перепёлок иммунитета к остро-протекающему вирусному заболеванию, сдерживающему рост и развитие перепёлок, снижающему их продуктивность и имеющему отрицательные экономические последствия.

Изобретение относится к области ветеринар-ной медицины, а именно к вирусологию. Получения штаммов энцефаломиелита перепёлок имеет важное значение для изучения наиболее эффективных методов диагностики и профилактики остро-протекающего вирусного заболевания-энцефаломиелита, сдерживающего рост и развитие птицы, снижающего ее продуктивность, имеющего отрицательные экономические последствия.
Аналоги не выявлены.
Целью изобретения является получения, т.е. выделения штамма инфекционного энцефаломиелита от головного и спинного мозга больных перепелят.
Цель достигается тем, что от исходного материала-головной и спинной мозг больных перепелят путём многократного пассажа было выделено штамм инфекционного энцефаломиелита перепёлок.
Важность изобретения - изучение структуры соответствующих штаммов для получения вакцины, которая должна войти в схему вакцинопрофилактики вирусной инфекции перепёлок. Также можно в дальнейшем более подробно изучить физико-химические свойства и антигенную структуру вируса энцефаломиелита перепёлок, а также изучить все стороны этиологии, патогенеза, диагностики, профилактики и других параметров болезни.
Эпизоотологию энцефаломиелита были изучены согласно эпизоотологических рекомендации Бакулева И.А [1].
Научная техническая новизна предлагаемого изобретения состоит в том, что впервые в РТ (на одной из перепеловодческих ферм, 2007-2008 гг.) диагностирован инфекционный энцефаломиелит перепёлок, выявлена вариабельность проявления клинических признаков инфекционного энцефаломиелита перепёлок, а также зависимость между клиническими симптомами и патологоанатомическими изменениями.
При получении штамма использовании гистологическое исследование патологического материала, реакция гемаглютинации (РГА), серологический анализ, иммуноферментный анализ (ИФА) с наборами «BioChek», с обработкой результатов с помощью компьютерной программы «BioChek» в соответствии с исследования и«Временным наставлением по применению набора для обнаружения в ИФА антител к инфекционному энцефаломиелиту птиц», разработанному фирмой «BioChek» совместно с (ФГУ ВГНКИ)Федеральное государственное учреждение, Всероссийский научно-исследовательский контрольный институт.
Обнаружения возбудителя(вируса) и его идентификация является главным и наиболее надёжным методом диагностики инфекционного энцефаломиелита перепёлок и вообще птиц. Надёжным источником для выделения вируса является головной мозг [2]. Для выделения вируса чаще используют кусочки различных отделов головного и спинного мозга[3]. Поджелудочная железа и двенадцатиперстная кишка помимо мозга, являются, как обнаружил Мьяменадежным источником вируса[4]. Вирус можно выделить и из помёта больных птиц, но ввиду преобладания других микроорганизмов и других обстоятельств, выделение из помёта имеет меньшее диагностические значение[5].
Для проведения гистологического исследования, из 3-х вынужденно убитых 13-дневных перепелят с клиническими признаками энцефаломиелита-поражение центральной нервной системы (ЦНС), были изъяты патологические материалы (головной мозг, поджелудочная железа, сердце, ткань из железистого и мышечного желудка) в конце инкубационного периода, т.е, начало момента парализации. Здесь важно помнить, что вирус в максимальных концентрациях содержится в тканях центральной нервной системы, именно в этот период[6].
Вскрытие перепелят проводили по общепринятой методике. Патологический материал поместили в раствор забуференный 50%-ный глицерин (рН 7,4). Также брали для гистологического исследования кусочки различных отделов головного и спинного мозга и тут же были погружены в 10%-ный забуференный формалин. Головной мозг извлекая целиком, помещали в глицерин (фиксирующую жидкость), выдерживали в 5%-ном растворе нейтрального формалина в течение 12 часов, затем помещали в 10%-ный раствор формалина (объём фиксирующей жидкости превышает объём материала в 10 раз).
Ход работы. Из кусочков ткань различных отделов головного и спинного мозга готовили 10%-ную суспензию (на фосфатно-буферном растворе), предварительно материал отмывали от глицерина, так как материал был консервирован глицерином. Суспензию дважды замораживали и оттаивали, затем центрафугировали при 5тыс об/мин. в течение 30 мин. Надосадочную жидкость обрабатывали пенициллином 1тыс ЕД+ синтомицина 500 мкг на 2мл, и выдерживали в течение 1ч. При комнатной температуре, проверяли на отсутствие бактериальной микрофлоры, затем использовали для заражения культуры клеток.
Выделение вируса в культуре клеток. Материал каждого испытуемого образца вносили по 0.1мл в 4 пробирки с культурой клеток после адсорбции (при t37* C 30 мин.) В каждую пробирку заливаем поддерживающую среду по 0.9 мл. Для контроля 4 пробирки с культурой клеток оставляли незараженными. При первых пассажах цитопатическое действие слабо выражены, поэтому приотсутствие деструкции заражённой культуры на 7-й день её замораживали и оттаивали, затем этим же материалом заражали свежее монослойные культуры (по 0,2мл). Материал каждого испытуемого образца пассировали 3-4 раза.
Цитопатическое изменения, вызываемые в клетках культуры вируса (выражается) в скопление округлившихся клеток с повышенной светопреломляемость (рефрактильность), которое становятся заметными на 3-5 день после заражения. Пораженные клетки отделяются от поверхности стекла: по мимо очагов дегенерации, появляются участки, лишённые клеток.
В результате гистологического исследования выявлена характерная для инфекционного энцефаломиелита перепёлок микроскопическая патология обнаружено изменения, выражающихся в зернистости и ацидофилии протоплазмы, конденсации хроматина и эксцентричном положение ядра.
В ганглиозном слое мозжечка отмечено характерные поражения клеток Пуркинье, ядро которых увеличено и смещено к периферии клетки. Часть клеток Пуркинье подвергалась дегенерации и некрозу, а на месте распавшихся образовались гомогенные ацидофильные гранулы. В результате пролиферации и очагового скопления клеток нейроглии образовались глиальные узелки.
В продолговатом мозге отмечены различные поражения двигательных нейронов-центральный хроматолиз, смещенное к периферии клетки ядра, некроз, нейрофагия. Контуры части ядер размыты, отдельные клетки подвергались полному распаду.
От поджелудочной железы, сердца, железистого и мышечного желудка было отобрано кусочки тканей размером 1см2 и толщиной 0,2-0,5см, помещали в консервирующий раствор, приготовленный по методу Кальтера С.С. Срезы изготовлены на микротоме и были окрашены по Нисслю (гемотоксилин+эозин).
Гистологические срезы исследовали методом тёмнопольной микроскопии. Для микроскопического исследования (темнопольная микроскопия) гистологических срезов применяли световой микроскоп.
В срезах поджелудочной железы в междольковой соединительной ткани и в области островков Лангерганса наблюдали лимфоидно-клеточный пролиферат в виде округлого, увеличенного, ограниченного от окружающей ткани лимфоцитарного фолликула. Муфты, состоящие из 3-4 слоев клеток свидетельствующие о периваскулярной клеточной инфильтрации вокруг сосудов, обусловленной скоплением лимфоцитов, лимфобластов, гистиоцитов и плазматических клеток, присутствуют в срезах мышечного желудка. Характерным дляинфекционного энцефаломиелита перепёлок является и скопление лимфоцитов в мышечной стенке железистого желудка.
Постановка РГА (реакция гемаглютинация) с аллантоисной жидкостью от инфицированных эмбрионов. Эритроциты для постановки РГА готовят из крови петуха и получают ее дефибрированием с использованием стеклянных шариков (бус). (РГА ставят на плексигласовых титрационных планшетах. Общепринятым способом в лунках готовят двукратные разведения вируссодержащего материала (аллантоисной жидкости), начиная с 1: 2 до 1: 2048. После раститровки планшет оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. Через установленное время во всех лунках планшета наблюдают скопление осевших эритроцитов в центре лунок в виде «пуговки» с ровными краями, что указывает на отсутствие агглютинации. Сыворотка. Отбор проб крови брали из подкрыльцовой вены, в количестве 25 проб от каждой партии. Кровь собирали в пробирках. Пробирки с кровью прогревали в термостате при t = + 370С в течение 20 мин. Затем стеклянной палочкой отделяли сгусток от стенок пробирки. Пробирки отстаивали в холодильнике при t = + 80С в течение 4 часов и отсасывали сыворотк.
Сыворотку в пробирках инактивировали на водяной бане приt = + 560С в течение 30 мин.
Проведение серологического анализа - исследование (500 проб сывороток крови) проведено в лаборатории болезней птиц Института ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук (ТАСХН) на оборудовании и наборах фирмы BioChek. Первое исследование этой партии перепелят проведено на 15 день после вспышки болезни (во время начала яйцекладки). Средний геометрический титр составляло 7146 (CV 60%, разброс титров 306-11689), что в соответствии с методикой интерпретации результатов свидетельствовало о недавнем действии вируса и подтверждало результаты гистологического исследования. Передача вируса от родительского стада была исключена отрицательными результатами ИФА(иммуноферментный анализ) еще во время вспышки болезни.
Результаты исследования крови перепелят на инфекционный энцефаломиелит методом ИФА.
Таблица 1
Возраст, нед. 5 (начало яйцекладки) Возраст, нед.
10 (пик яйце-носкости) 40 (перед убоем)
Ср. геом. титр 7146 9356 14478
СV, % 60 41 23
Разброс титров 306 - 11689 405 - 13456 4025 - 19034

Результаты серологических исследований выражают в обратных значениях титров.
Патологоанатомическая картина. У павших перепелят наблюдали плотное скопление лимфоцитов в результате пролиферативных процессов в мускулатуре мышечного желудка, гиперимия поджелудочной железы. Определить точный диагноз болезни очень трудно, потому что многие характерные клинические симптомы, патологоанатомические изменения, которые наблюдаются при инфекционном энцефаломиелите присуще другим болезням и некоторым авитаминозам.
Поэтому важно дифференциация диагноза болезни - эпизоотологические, клинические данные и другие виды исследований в условиях лаборатории, так как патологоанатомические признаки выражены плохо, ясное выделение отсутствует.
ИЭП диференцируют от кормовой Энцефаломаляция, гипо и авитаминозов Е, В1, В2, Д3, перозиса, подагры, нефрита, болезнь Марека, ньюкаслской болезни, церебрального аспергилёза, бактериальных инфекций, стрептококкоза, пастереллёза и других болезней, отравления мышьяковистыми препаратами/5,6/.

Дифференциация инфекционного энцефаломиелита перепёлок от сходных с нимболезней

Таблица 2.
№
п/п Болезни Эпизоотология болезни
1. Энцефаломиелит Поражается центральная нервная система (ЦНС), гиперимия поджелудочной железы, интерстициальный панкреатит
2. Болезнь Ньюкасла Поражается периферическая нервная система
3. Болезнь Марека Поражается периферическая нервная система и лимфоматозвнутренних органов
4. Энцефаломаляция Развивается на 2-3 недели позже энцефаломиелита
5. Авитаминоз Нарушение функции нервной системы
Преимущество. Исследование эпизоотического процесса, патогенеза, клинических симптомов, патологоанатомических изменений инфекционного энцефаломиелита у перепёлов дало возможность описать клинические симптомы, этиологические факторы, серологические и патологоанатомические изменения инфекционного энцефаломиелита у новорожденных птенцов в возрасте 7-21 дней и у взрослых перепёлок.
Преимуществом является также изучении эпизоотологии, течение, патологоанатомические изменения и др. особенности среди перепёлок условиях лаборатории и производства, профилактика болезни, разработка инструкций и наставлений, руководство по профилактике и ликвидации болезни. Кроме того получение штамма энцефаломиелита даёт возможность разработки соответствующей вакцины против этой болезни и тем самым можно предупредить снижение продуктивности- яйценоскости, качество скорлупы яиц, снижение выводимости племенных яиц, увеличение отхода птенцов 8-20 дневного возраста и т.п..

1. Бакулев И. А. Рекомендации по методике эпизоотологического исследования».Покров, 1975, 67с.
2. Adamstone F.B. The effects of vitamin E deficiency on the testis of the male foul (Gallus domesticus) / F.B. Adamstone, L.E. Card. // J. Morfhol. – 1934. – Vol. 56. – P. 339 – 359.
3. «Болезни домашных и сельскохозяйст-венных птиц», под ред. Б.У.Кэльнека и др., пер. сангл. 10.с. изд. М. Аквариум, 2003, стр. 621-635.
4. Miyamae T. Invasion of avian encefalomyelitis virus from the gastrointestinal tract to the central nervous system in young chickens / T. Miyamae // Am. J. Vet. Res. – 1983. – Vol. 44. – P. 508 – 510.
5. Дмитриева М.Е. «Рекомендации по диаг-ностике и профилактике инфекционного энцефало-миелита птиц (ИЭП). (Дмитриева М.Е., Джавадов Э.Д., Соколова Л.Н., СПб.,2005,36с.
6. Коровин Р.Н. Справочник ветеринарного врача птицеводческого предприятия, под ред. Р.Н.Коровин.-СПб., 1995, Т1-160с.