ШТАММ О №1/ТАДЖИКИСТАН/2016 ВИРУСА ЯЩУРА APHTAE EPIZOOTICAE ТИПА О ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА О.

Изобретение представляет собой штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа O, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов Национального центра коллекции штаммов патогенных микроорганизмов при ГУ Института проблем биологической безопасности ТАСХН под регистрационным номером вирус ящура штамм О №1 /Таджикистан/2016 (производственный), для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О, характеризующийся тем, что он получен в течение последовательного пассирования в культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения, обладает высокой биологической активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную активность после инактивации.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и профилактики ящура типа О.
Ящур - опасная острая высоко контагиозная вирусная болезнь, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, меж копытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Имеет довольно широкое распространение в ряде стран земного шара и наносит значительный экономический ущерб животноводству. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность.
Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, имеет 7 серотипов: А, О, С, Азия-1, Sat-1, Sat-2, Sat-3 и множество антигенных вариантов[1,2].
Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах, экспонированных на поверхности капсидных белков.
Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики [2,3].
Известен штамм типа О №1736/Абхазия/ 2000, выделенный от КРС в Гальском районе Абхазии, О №1964/Монголия/2004, выделенный от КРС в феврале 2004 г. в Восточного Бийском аймаке Монголии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [4].
В апреле 2000 г. на территории РФ в Приморском крае в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района от свиней был выделен изолят, из которого получен штамм типа О №1734 «Приморский-2000» [5,6].
Производственный штамм №1734 «Приморский-2000» использовался в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.
Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят в антигенных отличиях от изолятов вируса ящура типа О, выделенных в различные временные промежутки, а приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.
Целью изобретения является – расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура типа О, обладающих высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную активность после инактивации, пригодных для изготовления чувствительных и высоко-специфичных диагностических препаратов.
Указанная цель достигается получением штамма О №1/Таджикистан/2016 (авторское наименование) вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О/Таджикистан/2016, был выделен в марте 2016 года от больного крупного рогатого скота (КРС) в ч/х Гиссарского района.
Штамм вируса ящура типа О №1/Таджикистан/2016 получен путем последовательных пассажей на чувствительных культурах клеток.
Штамм вируса ящура типа О депонирован в 2018 году в Национальном центре коллекции штаммов патогенных микроорганизмов при ГУ Института проблем биологической безопасности ТАСХН под регистрационным номером: вирус ящура типа О №1/Таджикистан/2016.
Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, приведенная на рисунке, отражающая филогенетические взаимоотношения штамм вируса ящура типа О №1/Таджикистан/2016 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмме основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP 1.
Штамм О №1/Таджикистан/2016 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм О №1/Таджикистан/2016 вируса ящура принадлежит к роду Aphtovirus семейству Picomaviridae и представляет собой небольшую частицу, состоящую из одноцепочечной молекулы РНК. Вирионы представляют собой мелкие частицы диаметром 23-25 нм. Они состоят из внутренней части, представленной РНК и белковой оболочки, которая состоит из 32 структурных компонентов. В вирионе содержится 31,5% РНК и 68,5% белка.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм О №1/Таджикистан/2016 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной анти сывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующий активности.
У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микро нейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №1/Таджикистан/2016 вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей которое показано на дендрограмме, свидетельствует, что штамм О №1/Таджикистан/2016 принадлежит к генетической линии вируса ящура О-ПанАзия-2, топотипа Средний Восток-Южная Азия.
При изучении в РМН антигенного соответствия штамма О/Таджикистан/2016 другим штаммам установлено, что он отличается от производственного штамма О/Приморский/2000 (показатель r1 был менее 0,3), однако данный штамм имеет антигенное родство со штаммами О1 Маниса и О-ПанАзия-2 (показатель r1 был больше 0,3).
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1.
При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1≤0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса.
Культуральные признаки
Данный штамм адаптируется в течение 3-х пассажей в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и почки свиньи (IB-RS-2). Вирус вызывает ЦПД в течение 20-24 часов после заражения и накапливался с титром инфекционной активности от 4,85 до 5,15 lg ТЦД50/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм О/Таджикистан/2016 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 3 пассажей.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О/Таджикистан/2016, был выделен в Институт проблем биологической безопасности ТАСХН и в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в марте 2016 года от подозреваемой в заболевании ящуром крупного рогатого скота из ч/х Гиссарского района.
При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура. Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение вируса и его адаптацию.
Выделение вируса на культуре первично трипсинизированной клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопробы на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лак альбумина (ГЛА) и антибиотикамипо стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000g в течение 15 минут.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.
Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма О №1/Таджикистан/2016 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакциях: РСК (1:8), ИФА (1:16) с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3).
Пример 2
Штамм О №1/Таджикистан/2016 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О, пред-назначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250-300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000-10000000 ИД50/1 см3 с антибиотиками, вводят по 0,2-0,3 см3 в 20-40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20-30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцем. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в РСК на тип специфичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1.
Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.
Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 104,0 ИД50/0,1 см3. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°С-40°С).

Таблица 1
Результаты определения антигенного соответствия (r1) штамма вируса ящура типа О/Таджикистан/2016 производственными штаммами типа О в РМН

Штамм Показатель, r1
О1 Маниса О/Приморский/2000 O-ПанАзия-2
№1/Таджикистан/2016 0,77 0,21 0,76

Таблица 2
Адаптация штамм О/Таджикистан/2016 вируса ящура к различным клеточным культурам

Система репродукции вируса ящура
СП ПСГК-30 IB-RS-2
ЦПД
час Титр
lg ЦПД 50/мл ЦПД
час Титр
lg ЦПД50/мл ЦПД
час Титр
lg ЦПД50/мл
21 4,85 20 5,15 24 5,15

Таблица 3
Типовой принадлежности штамма типа О №1/Таджикистан/2016 в РСК и ИФА

Антиген РСК ИФА
А22 О1 Азия-1 А22 О1 Азия-1
№1/Таджикистан/2016 - 1:8 - - 1:16 -
Положительный контроль 1:64 1:64 1:64 1:128 1:128 1:256
Отрицательный контроль - - - - - -
9 1110 10

Косумбеков М.И. (TJ); Джумаев Ш.Н. (TJ); Махмудов К.Б. (TJ); Турдиев Ш.А. (TJ); Бобоев Г.Ю. (TJ); Зуурбекова О.С. (TJ)