СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАРУШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОГО ЗДОРОВЬЯ

Изобретение относится к области медицины, в частности, физиологии и патологии репродукции, и может использоваться для мониторинга риска нарушений репродуктивного здоровья у клинически здоровых женщин фертильного возраста в доклинический период.
Для осуществления способа у женщин на основе специального анализа крови определяют 2 интегральных маркера риска нарушений репродукции (ИМНР1 и ИМНР2). Если величина ИМНР1

Изобретение относится к области медицины, в частности, физиологии и патологии репродукции, и может использоваться для мониторинга риска нарушений репродуктивного здоровья у клинически здоровых женщин фертильного возраста в доклинический период.
Репродуктивное здоровье женщин, будучи важнейшей медико-социальной проблемой, в настоящее время довольно детально исследуется с экономической, социальной, психологической, экологической и медицинской точек зрения [1, 2, 3, 4]. Медицинский аспект проблемы предусматривает изучение рисков нарушений репродуктивной функции, связанных с гормональными сдвигами [5], иммуногенетическами признаками [6], развитием аутоиммунного компонента, влияющего на течение и исходы беременности [7,8]. Существуют отдельные попытки перейти на количественный уровень оценки отдельных факторов риска нарушений репродуктивной функции у женщин, в том числе без существенных отклонений лабораторных показателей, путем внедрения шкал, интегрирующих наиболее информативные критерии риска [9,10].
Прототипом данного изобретения может служить способ прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья, предназначенный для донозологической диагностики нарушений репродуктивной функции у женщин широкого возрастного диапазона и мужчин [11]. Для реализации данного способа предлагается определять коэффициенты, выраженные в баллах, для оценки профессионально-производственных, анамнестических, медико-биологических факторов женщины и мужчины с последующим расчетом диагностических показателей риска (R1-4) по специальным формулам. При этом при значении R1>1>R2,3,4 судят о преимущественно высоком риске развития мертворожденности, при значении R2>1>R1,3,4 - врожденных пороков развития, при значении R3>1>R1,2, - ранней неонатальной смерти ребенка, при R4>1>R1,2,3 - спонтанных выкидышей, соответственно, при величине R1-4<1 - судят об отсутствии риска развития вышеописанных состояний.
Достоинством способа можно считать его доступность, поскольку он базируется на таких качественных характеристиках как возраст, место проживания, профессия партнеров, акушерско-гинекологический анамнез женщины. Наряду с этим, у прототипа имеются недостатки, главный из которых заключается в отсутствии в перечне регистрируемых данных объективных показателей здоровья женщины, и соответственно, количественных характеристик репродуктивной функции. Еще один важный недостаток прототипа - это невозможность прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья при отсутствии акушерского анамнеза, то есть у нерожавших женщин.
Задачей заявленного изобретения является повышение достоверности и точности прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья у клинически здоровых женщин фертильного возраста.
Особенностью данного изобретения является то, что для достижения технического результата используется набор лабораторных количественных показателей репродуктивного здоровья женщин фертильного возраста с расчетом на этой основе 2-х интегральных маркеров репродуктивных нарушений (ИМНР1 и ИМНР2), которые учитывают «вклад» каждого показателя в нарушение репродуктивных функций. Эти интегральные маркеры разработаны авторами данного завяленного изобретения для прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья женщин фертильного возраста проживающих в Республике Таджикистан. Способ основан на клинико-лабораторных данных, полученных на доклинической стадии заболевания и исключает неоднозначное толкование результатов.
Расчет интегральных маркеров репродук-тивных функций производится по следующим формулам:

ИМНР1 = -9,049 + 0,537*[число ЕК] -0,208*[число В-лимфоцитов]
ИМНР2 = 2,179 + 0,288*[ IgG] + 0,453*[АТ к β2-ГП]

где, ЕК - процент CD16+CD56+ лимфоцитов среди всех лимфоцитов крови; число В-лимфоцитов - процент CD19+ лимфоцитов среди всех лимфоцитов крови; IgG - уровень иммуноглобулина класса G в миллиграммах в 1 миллилитре сыворотки крови; АТ β2-ГП - уровень IgG-аутоантител к β2-гликопротеину-1 в единицах в 1 миллилитре сыворотки крови.
Для осуществления способа у женщин на основе специального анализа крови определяют 2 интегральных маркера риска нарушений репродукции (ИМНР1 и ИМНР2). Если величина ИМНР1 >14 и/или ИМНР2 >8.5, женщину относят к группе риска по нарушению репродуктивной функции.
Для осуществления способа у женщин натощак делают забор двух образцов венозной крови: 5 мл - в пробирку с ЭДТА, 10 мл - в сухую пробирку. Образец из пробирки с ЭДТА подвергают исследованию методом проточной цитофлуориметрии, например, с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) после автоматизированной пробоподготовки цельной крови с помощью станции автоматической пробоподготовки BD FACS Sample Prep Assistant II (Becton Dickinson, США) в соответствии с инструкцией по применению приборов и моноклональных антител.
Для определения относительного числа лимфоцитов различных популя-ций/субпопуляций крови (относительного числа СD16+/CD56+ клеток, CD19+ клеток) целесообразно использовать стандартизи-рованный комплект моноклональных антител (МКАТ) BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences), содержащий меченные PerCP-Cy5.5 anti-CD45 МКАТ, меченные FITC anti-CD3 МКАТ, меченные PE-Cy7 anti-CD4 МКАТ, меченные APC-Cy7 anti-CD8 МКАТ, меченные APC anti-CD19 МКАТ, меченные PE anti-CD16/anti-CD56 МКАТ.
Второй образец крови в сухой пробирке отстаивают при комнатной температуре до формирования сгустка, полученную сыворотку крови удаляют отсасыванием с последующим центрифугированием при 3000 об/мин на холоде в течение 10 минут, ее образцы при необходимости хранят при температуре -20оС. Для определения уровней IgG-аутоантитела к суммарным фосфолипидам, АТ к β2-гликопротеину-1 устанавливают методом твердофазного иммуноферментного анализа, на анализаторе для иммунного анализа BioRad производства Sanofi Diagnostics Pasteur, (Франция – США) с помощью набора антител, входящих в тест-системы фирм «Monobind», «DRG» и «DSL». Исследование осуществляют в соответствии с инструкциями по применению прибора и антител.
После определения величин всех показателей их подставляют в формулы для расчета ИМНР1 и ИМНР2. Если величина ИМНР1 >14 и/или ИМНР2 >8.5, женщину относят к группе риска по нарушению репродуктивного здоровья.
В таблице 1. представлена система расчета индивидуальных значений каждого интегрального маркера нарушений репродукции (ИМНР1 и ИМНР2) у каждой из 29 нерожавших женщин таджикской популяции и проведено сопоставление этих индивидуальных значений с катамнестическими данными, полученными в результате наблюдения этих женщин в течение 3-х последующих лет.
Индивидуальные данные и результаты определения интегральных маркеров нарушений репродукции у нерожавших женщин таджикской популяции
Таблица 1
№ п/п Исходные данные и результаты расчета ИМНР1 (прогностически значимый диапазон > 14) Исходные данные и результаты расчета ИМНР2 (прогностически значимый диапазон > 8,5) Акушерский 3-
летний катамнез
1 2 3 4
1. -9,049 + 0,537*10,9 - 0,208*12,2 = 12,4 2,179 + 0,288*6,3 + 0,453*7,2 = 7,3 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
2. -9,049 + 0,537*9,8 - 0,208*14,0 = 11,4 2,179 + 0,288*6,8 + 0,453*7,2 = 7,4 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
3. -9,049 + 0,537*15,1 - 0,208*13,2 = 14,4 2,179 + 0,288*6,4 + 0,453*7,1 = 7,2 Отмечено невынашивание беременности
4. -9,049 + 0,537*10,2 - 0,208*11,8 = 12,1 2,179 + 0,288*6,4 + 0,453*7,3 = 7,3 Две беременности
завершились рождением здоровых детей
5. -9,049 + 0,537*10,5 - 0,208*10,6 = 12,5 2,179 + 0,288*6,8 + 0,453*7,4 = 7,5 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
6. -9,049 + 0,537*11,1 - 0,208*13,7 = 12,2 2,179 + 0,288*7,3 + 0,453*7,6 = 7,7 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
7. -9,049 + 0,537*9,6 - 0,208*12,7 = 11,6 2,179 + 0,288*5,8 + 0,453*7,6 = 7,3 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
продолжение таблицы 1.
8. -9,049 + 0,537*10,4 - 0,208*14,0 = 11,7 2,179 + 0,288*6,7 + 0,453*6,9 = 7,2 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
9. -9,049 + 0,537*10,7 - 0,208*11,1 = 12,5 2,179 + 0,288*8,6 + 0,453*9,2 = 8,8 Одна беременность завершилась прежде-временными родами выжившего ребенка
10. -9,049 + 0,537*9,9 - 0,208*11,2 = 12,0 2,179 + 0,288*7,2 + 0,453*7,4 = 7,6 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
11. -9,049 + 0,537*15,3 - 0,208*12,4 = 14,7 2,179 + 0,288*8,3 + 0,453*6,5 = 7,5 Отмечено невынашивание беременности
12. -9,049 + 0,537*10,3 - 0,208*11,9 = 12,1 2,179 + 0,288*6,4 + 0,453*7,1 = 7,2

Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка

13. -9,049 + 0,537*10,5 - 0,208*13,7 = 11,8 2,179 + 0,288*7,0 + 0,453*6,7 = 7,2 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
14. -9,049 + 0,537*9,7 - 0,208*16,1 = 10,9 2,179 + 0,288*6,1 + 0,453*7,1 = 7,2 Две беременности
завершились рождением здоровых детей
15. -9,049 + 0,537*10,4 - 0,208*12,5 = 12,0 2,179 + 0,288*6,5 + 0,453*7,0 = 7,2 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
16. -9,049 + 0,537*10,5 - 0,208*14,3 = 11,7 2,179 + 0,288*6,2 + 0,453*6,9 = 7,1 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
17. -9,049 + 0,537*10,8 - 0,208*11,4 = 12,5 2,179 + 0,288*6,9 + 0,453*6,6 = 7,2 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
18. -9,049 + 0,537*9,0 - 0,208*13,5 = 11,1 2,179 + 0,288*6,1 + 0,453*7,9 = 7,5 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
19. -9,049 + 0,537*10,9 - 0,208*15,8 = 11,6 2,179 + 0,288*6,1 + 0,453*8,0 = 7,6 Две беременности
завершились рождением здоровых детей
20. -9,049 + 0,537*9,9 - 0,208*9,0 = 12,5 2,179 + 0,288*6,2 + 0,453*8,1 = 7,6 Две беременности
завершились рождением здоровых детей
21. -9,049 + 0,537*9,8 - 0,208*8,4 = 12,6 2,179 + 0,288*6,3 + 0,453*8,0 = 7,6 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
22. -9,049 + 0,537*10,5 - 0,208*7,9 = 13,0 2,179 + 0,288*6,6 + 0,453*5,6 = 6,6 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
23. -9,049 + 0,537*10,9 - 0,208*8,7 = 13,1 2,179 + 0,288*7,0 + 0,453*7,1 = 7,4 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка

продолжение таблицы 1.

24. -9,049 + 0,537*10,2 - 0,208*8,1 = 12,8 2,179 + 0,288*6,5 + 0,453*6,2 = 6,9 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
25. -9,049 + 0,537*10,8 - 0,208*8,8 = 13,0 2,179 + 0,288*9,0 + 0,453*8,6 = 8,7 Имеется невынашивание беременности
26. -9,049 + 0,537*9,9 - 0,208*15,0 = 11,2 2,179 + 0,288*7,3 + 0,453*6,9 = 7,4 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
27. -9,049 + 0,537*10,5 - 0,208*11,9 = 12,2 2,179 + 0,288*6,4 + 0,453*6,6 = 7,0 Одна беременность завершилась рождением здорового ребенка
28. -9,049 + 0,537*9,8 - 0,208*9,5 = 12,3 2,179 + 0,288*6,9 + 0,453*8,5 = 8,0 Две беременности
завершились рождением здоровых детей
29. -9,049 + 0,537*10,8 - 0,208*10,9 = 12,6 2,179 + 0,288*6,9 + 0,453*7,5 = 7,6 Две беременности
завершились рождением здоровых детей
В процессе разработки способа под наблюдением находились 90 женщин, проживающих на территории Таджикистана (г.Файзабад), имеющих в анамнезе беременности, в возрасте от 20 до 43 лет. Все женщины были клинически здоровы, что подтвердили результаты их диспансерного наблюдения. Анализ акушерско-гинекологического анамнеза с участием специалиста акушера-гинеколога позволил подразделить женщин на 2 группы. В первую группу вошли 30 женщин с сохранной репродуктивной функцией, у которых предшествующие беременности завершились рождением в срок здоровых детей (контроль). Во вторую группу условного риска входили 60 женщин, у которых при наличии физиологической нормы по лабораторным показателям имелись нарушения репродуктивной функции (невынашивание беременности, тяжелые гестозы, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, синдром задержки внутриутробного развития плода, антенатальная гибель плода и др.). Все женщины прошли детальное лабораторное обследование на состояние гормонального статуса (содержание в крови фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, пролактина, эстрогена, прогестерона, тестостерона, дигидроэпиандростерона, 17-ОН-прогестерона, тиреотропного гормона, общего трийодтиронина, общего тироксинеа, кортизола), иммунного статуса (доля наличия в крови Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, ЕКТ, естественных киллеров, В-лимфоцитов, уровней IgM, IgG, IgA), наличие аутоиммунного процесса (cодержание в крови IgG-аутоантител к тиреоглобулину, тиреопероксидазе, суммарным фосфолипидам, β2-гликопротеину-1, аннексину V, протромбину, волчаночного антикоагулянта). Статистическая обработка данных проводилась на основе пакета программ SPSS (версия 21).
Результаты кластерного анализа, проведенного на основе полученных лабораторных данных, позволили выделить внутри группы с нарушениями репродуктивной функции две равные подгруппы - (1) с особенностями показателей иммунного статуса и (2) с особенностями аутоиммунных показателей, хотя и те и другие наблюдались в рамках физиологической нормы. Для данных, показавших статистически достоверные отклонения величин, в каждой подгруппе был выполнен регрессионный анализ и получены 2 уравнения линейной регрессии, каждое из которые было использованы для получения 2-х интегральных маркеров нарушений репродукции (ИМНР1 и ИМНР2).
Возможная прогностическая значимость ИМНР1 и ИМНР2 оценивалась путем их вычисления у каждой из 90 женщин с последующим определением 95% доверительных интервалов и построением ROC-кривых соотношения чувствительности и специфичности тестов, позволяющих охарактеризовать их прогностическую значимость в величинах площади под ROC-кривой - AUROC, которые представлены в приложениях 1и 2. Этот анализ показал, что при значениях ИМНР1 больше 14 и ИМНР2 больше 8.5, вероятность нарушений репродуктивной функции можно предсказать с
почти абсолютной вероятностью (AUROC, соответственно, 0,999 и 0,998).
Предложенный способ иллюстрируется фигурами 1 и 2, а также примерами его использования.
Фиг. 1 - 95% доверительные интервалы величин ИМНР1 в группах сравнения и ROC-кривая прогностической значимости показателя
Фиг. 1 - 95% доверительные интервалы величин ИМНР2 в группах сравнения и ROC-кривая прогностической значимости показателя
Пример 1. Женщина В., 21 год, вступила в брак и планирует беременность. Ранее беременностей не было. При исследовании ее венозной крови был получен следующий результат:
Естественные киллеры (СD16+CD56+), % - 15,1% (норма 13,0 ± 3,7%)
В-лимфоциты(CD19+), % - 13,2% (норма 12,7 ± 5,9%)
IgG – аутоантитела к суммарным фосфолипидам - 6,4 мг/мл (норма 8,8 ± 3,1мг/мл)
IgG - аутоантитела к β2-гликопротеину-1 - 7,1 ЕД/мл (норма 8,85 ± 2,75ЕД/мл)
ИМНР1 = -9.049+0.537*15,1-0,208*13,2= 14,4
ИМНР2 = 2,179+0.288*6,4 + 0,453*7,1 = 7, 2
Как следует из расчета интегральных маркеров нарушений репродукции у женщины В. ИМНР1 >14, а ИМНР2 <8.5, то есть по величине ИМНР1 ее можно отнести в группу риска. Последующее наблюдение в течение 3-х лет показало, что через 2 года после исследования у этой женщины развилась беременность, но на 16-й неделе она закончилась невынашиванием плода.
Пример 2. Женщина С., 28 лет, повторно вступила в брак и планирует беременность. В первом браке беременностей не было. При исследовании ее венозной крови был получен следующий результат:
Естественные киллеры (СD16+CD56+), %- 12,6% (норма 13,0 ± 3,7%)
В-лимфоциты(CD19+), % - 7,9% (норма 12,7 ± 5,9%)
IgG-аутоантитела к суммарным фосфолипидам 10,3 мг/мл (норма 8,8 ± 3,1мг/мл) IgG-аутоантитела к β2-гликопротеину-1 - 6,2 ЕД/мл (норма 8,85 ± 2,75ЕД/мл)
ИМНР1 = -9.049+0.537*10,7-0,208*11,1= 12,5
ИМНР2 = 2,179+0.288*8,6 + 0,453*9,2 = 8, 8
Как следует из расчета интегральных маркеров нарушений репродукции, у женщины С. ИМНР1 <14, а ИМНР2 >8.5, то есть по величине ИМНР2 ее можно отнести в группу риска. Последующее наблюдение в течение 3-х лет показало, что в течение 1 года после исследования у этой женщины развилась беременность, роды носили преждевременный характер и наступили на 30-й неделе. Несмотря на то, что ребенка удалось спасти, по существующим в акушерстве оценкам имелось нарушение репродуктивной функции.

1. Barut M.U., Agacayak E., Bozkurt M. et al. (2016) There is a positive correlation between socioeconomic status and ovarian reserve in women of reproductive age. Med Sci Monit 22: 4386–4392.
2.Данишевский К.Д. (2013) Репродуктивное здоровье: глобальные цели развития и экономический потенциал России. Медицина N 2: 13-28.
3.Rebello K., Silva J., Brito R.C.S. (2014) Fundamental factors in marital satisfaction: An assessment of Brazilian couples. Psychology. 5: 777–784.
4.Shougong W.; Rui Z. (2016) Female reproductive system pastes with ecological health care with detoxicating bacteriostasis. Patent CN205515196. publ. 31.01.2016.
5.Болдоносова Н.А., Дружинина Е.Б. (2014) Фолликуло- и оогенез: химические свойства и биологическое действие лютеинизирующего гормона. Сибирский медицинский журнал. 129: 28-31.
6.Clark M.M., Chazara V., Sobel E.M. et al. (2017) Human birth weight and reproductive immunology: testing for interactions between maternal and offspring KIR and HLA-C genes. Hum Hered. 81: 181-193.
7.Доброхотова Ю.Э., Джобава Э.М., Озерова Р.И. (2010) Неразвивающаяся беременность: тромбоэмболические и клинико-иммунологические факторы. М.: ГЭОТАР-Медиа. 144.
8.Kwak-Kim J., Skariah A., Wu L. et al. (2016) Humoral and cellular autoimmunity in women with recurrent pregnancy losses and repeated implantation failures: A possible role of vitamin D. Autoimmun Rev. 15: 943-947.
9.Терехова М.Н. (1996) Способ прогнозирования нарушения развития гонад потомства. Патент РФ 94012697, опубл. 10.07.1996.
10.Bertolaccini M.L., Sanna G. (2016) Recent advances in understanding antiphospholipid syndrome. F1000Res. 5: 2908-2923.
11.Иванова М.К., Ситдикова И.Д., Вазиев И.К., Халимова Д.Р. (2009) Способ прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья. Патент РФ 2367354, опубл. 20.09.2009.