СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОПЕНТИНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммунной системы организма.
Целью изобретения является способ получе-ния тимопентина, приводящий к более высокому выходу конечного пептида.
Указанная цель достигается тем, что тимопентин синтезируют методом активированных (пентафторфениловых) эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната, путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных препаратов для регуляции и стимуляции деятельности иммун-ной системы организма.
Известен [1] способ получения тимопентина, пентапептида с последовательностью аргинил-лизил-аспартил-валил-тирозин и представляюще-го собой фрагмент 32-36 молекулы тимопоэтина, заключающийся в проведении фрагментной кон-денсации но схеме 2+3. Для защиты α-аминогрупп используют карбобензоксигруппу, ε-аминогруппу лизина и гуанидиновую группу аргинина также блокируют карбобензоксигруппой; для защиты β-карбоксилыюй группы аспарагиновой кислоты применяют бензилоксигруппу, а тирозин вводят в виде метилового эфира со свободной фенольной ОН-группой. Защитные группы с С-концевого трипептида удаляют одновременно длительным действием бромистого водорода в уксусной кис-лоте с добавлением 10% воды и последующей обработкой ионообменной смолой Dowex-1 (в ОН-форме). Конденсацию фрагментов проводят с по-мощью комплекса F; защишениый пентапептид получают с выходом 40%. После удаления защит-ных групп каталитическим гидрогенолизом в при-сутствии палладия на активированном угле, про-дукты очищают хроматографией на Sephadex G-25 с применением градиента пиридинацетатного буфера и последующей лиофилизацией; выход лиофилизата 19%.
Недостатком данного способа является низ-кий выход конечного свободного пентапептида.
Известен [2] способ получения тимопентина ступенчатым наращиванием пептидной цепи кар-бодиимидным методом с использованием в каче-стве конденсирующего реагента дициклогексил-карбодиимида и в качестве нуклеофильной добав-ки 1-гидроксибензотриазола. Наращивание пеп-тидной цепи проводят с С-конца. Для защиты α -карбоксильной группы тирозина, β -карбоксильной группы аспарагиновой кислоты используют сложноэфирную бензильную группу, ε -аминогруппу лизина и α -аминогруппу аргинина защищают карбобензоксигруппой, гуанидиновую группу аргинина блокируют нитрогруппой. Для временной защиты α -аминогруппы валина, аспа-рагиновой кислоты, лизина используют трет-бутилоксикарбонильную группу, которую на про-межуточных стадиях синтеза удаляют обработкой трифторуксусной кислотой. Выход защищенных пептидов на стадиях конденсации составлял 70-90%. Окончательное деблокирование защищенно-го пентапептида проводят обработкой фтористым водородом в присутствии смеси анизол-тиоанизол-о-крезол (1:1:1). Свободный пентапеп-тид переводят в соответствующий ацетат с помо-щью ионообменной смолы Амберлит СG-4В (аце-татная форма) и очищают колоночной хроматографией на сефадексе G-10. Выход свободного пентапептида составляет 93%.
К недостаткам данного способа можно отне-сти использование токсичного дициклогексилкар-бодиимида, необходимость проведения трудоем-кой операции многократного переосаждения для удаления дициклогексилмочевины, а также ис-пользование для деблокирования фтористого во-дорода, для чего необходимо специальное обору-дование.
Прототипом заявляемого является способ по-лучения тимопентина методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептид-ной цепи начиная с С-конца [3]. Для защиты α -аминогрупп и гуанидиновой группы аргинина используют карбобензоксигруппу, которую на промежуточных и конечной стадиях синтеза уда-ляют каталитическим гидрированием в присут-ствии 10%-ного палладия на активированном угле. ε -Аминогруппу лизина защищают трет-бутилоксикарбонильной группой, β -карбоксильную группу аспарагиновой кислоты защищают превращением в трет-бутиловый эфир; эти защитные группы с конечного защищенного пентапептида удаляют действием смеси трифто-руксусная кислота-анизол-метилэтилсульфид (425:50%25). α -Карбоксильную группу тирозина защищают превращением в этиловый эфир, кото-рый снимают щелочным гидролизом 1 н раство-ром гидроксида натрия в течение суток на холоду. Выход защищенного дипептида Z-Val-Tyr-OEt составил 80%. Трипептида Z-Asp(OBut)-Val-Tyr-OEt – 90,2% , Z- Lys(Boc)-Asp(OBut)-Val-Tyr-OEt - 79,8%, Z3-Arg-Lys(Boc)-Asp(OBut)-Val-Tyr-OEt - 55,1%. При использовании данного выбора за-щитных групп пептиды после удаления аминоза-щитной группы вводят в реакцию конденсации без выделения, что позволяет избежать дополнитель-ных стадий очистки промежуточных пептидов и упростить очистку конечного свободного пептида, которую осуществляют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хрома-тографии. Выход свободного пентапептида со-ставляет 97%. Общий выход свободного пента-пептида составляет 30,8%.
К недостаткам данного способа можно отне-сти относительно невысокий общий выход конеч-ного свободного пентапептида и использование при его очистке высокоэффективной жидкостной хроматографии как метода, требующего специ-ального оборудования.
Целью изобретения является способ получе-ния тимопентина, приводящий к более высокому выходу конечного пептида.
Указанная цель достигается тем, что тимо-пентин синтезируют методом активированных (пентафторфениловых) эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната, путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начи-ная с С-конца.
Для защиты α -аминогрупп и гуанидиновой группы аргинина используют карбобензоксигруп-пу, которую на промежуточных стадиях и в конце синтеза удаляют каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного палладия на активирован-ном угле, β -карбоксильную группу аспарагиновой кислоты защищают сложноэфирной трет-бутильной группой, ε -аминогруппу лизина защи-щают трет-бутилоксикарбонильной группой, ко-торую в конце синтеза удаляют обработкой сме-сью трифторуксусная кислота-анизол-метидэтилсульфид (425:50%25). α -карбоксильную группу тирозина защищают сложноэфирной этильной группой, которую в конце синтеза уда-ляют щелочным гидролизом обработкой 1 н рас-твором гидроксида натрия в течение суток на хо-лоде. Активированные пентафторфениловые эфи-ры соответствующих N-защищенных аминокислот получают с помощью дипентафторфенилкарбона-та и в реакцию конденсации с аминокомпонентом вводят без выделения из реакционной смеси и до-полнительной очистки. Образующиеся защищен-ные ди-, три- и тетрапептиды сразу после обычной обработки кислыми и основными реагентами под-вергают каталитическому гидрированию для уда-ления карбобензоксигруппы и после упаривания растворителя вводят в реакцию конденсации с пентафторфениловым эфиром соответствующей N-защищенной аминокислоты. Контроль всех стадий проведения синтеза осуществляют тонкослойной хроматографией на пластинках «Silufol UV-254 (Чехия)» в следующих системах: А - хлороформ-метанол-32%-ная уксусная кислога (60:45:20), Б - хлороформ-этилацетат-метанол-уксусная кислота (9:3:1:0,3), В - н-бутанол-пиридин-уксусная кисло-та-вода (5:5:1:4), Г - н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (30:20:6:24). Окончательное дебло-кирование защищенного пентапептида осуществ-ляют последовательным проведением каталитиче-ского гидрирования, обработки смесью трифто-руксусная кислота-анизол-метилэтилсульфид и щелочного гидролиза. После окончательного де-блокирования свободный пептид очищают на колонке с сефадексом G-25 в градиенте концен-трации пиридин-ацетатного буфера. После лио-филизации общий выход свободного пентапепти-да составляет 39,8%.
Применение предлагаемого способа позволя-ет:
1. Увеличить выход тимопентина до 39,8% по сравнению с 30,8% в прототипе.
2. Исключить использование для очистки ко-нечного пснтапептида высоко-эффективной жид-костной хроматографии как метода, требующего специального оборудования.
ПРИМЕР
а) К 2,51 г (10 ммоль) карбобензоксивалина и 1,45 мл (10,5 ммоль) триэтиламина в 20 мл этила-цетата добавляли 4,0г (10,5 ммоль) дипентафтор-фенилкарбоната, перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Этилацетат упари-вали, остаток растворяли в 20 мл диметилформа-мида, к полученному раствору добавляли 2,1 г (10 ммоль) этилового эфира тирозина. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 часа при комнат-ной температуре. Диметилформамид упаривают, остаток растворяют в этилацета-те.последовательно промывают 0,4 М раствором лимонной кислоты, водой, 0,5 н раствором бикар-боната натрия и сушат безводным сульфатом натрия. Этилацетат упаривают. Rf 0,91 (А), 0,48 (Б). Остаток растворяют в 20 мл метанола и гид-рируют над 10%-ным Pd/С катализатором. Ката-лизатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 10 мл диметилформамида.
б) К 3,23г (10 ммоль) Z- Asp(OBut)-ОН и 1,45 мл (10,5 ммоль) триэтиламина в 20 мл этилацетата добавляют 4,0г (10,5 ммоль) дипентафторфенил-карбоната и перемешивают 30 мин при комнатной температуре, этилацетат упаривают. Остаток растворяют в 10 мл диметилформамида и к полу-ченному раствору прибавляют раствор, получен-ный по методике «а», перемешивают при комнат-ной температуре в течение часа. Далее реакцион-ную смесь обрабатывают аналогично методике «а». Rf- 0,85 (А), 0,71 (Б). Фильтрат, полученный после удаления катализатора, упаривают, остаток растворяют в 10 мл диметилформамида.
в) К 3,6 г (10 ммоль) Z- Lys(Boc)-OH и 1,45 мл (10,5 ммоль) триэтиламина в 20 мл этилацетата добавляют 4,0 г (10,5 ммоль) дипентафторфенил-карбоната и перемешивают при комнатной темпе-ратуре в течение 30 мин, этилацетат упаривают. Остаток растворяют в 10 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляют раствор, полученный по методике «б», перемешивают 1 час при комнатной температуре. Затем реакционную смесь обрабатывают аналогично методике «а». Rf 0,91 (А), 0,63 (Б). Остаток, полученный после упа-ривания этилацетата, растворяют в 20 мл метано-ла и гидрируют над 10%-ным палладием на акти-вированном угле. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Полученный остаток рас-творяют в 10 мл диметилформамида.
г) К 5,76 г (10 ммоль) трикарбобензоксиарги-нина, 1,45 мл (10,5 ммоль) триэтиламина в 20 мл этилацетата добавляют 4,0 г (10,5 ммоль) дипен-тафторфенилкарбоната, перемешивают при ком-натной температуре в течение 30 мин, эти л ацетат упаривают. Остаток растворяют в 10 мл диметил-формамида и добавляют раствор, полученный по методике «в», перемешивают при комнатной тем-пературе в течение часа. Диметилформамид упа-ривают, остаток растворяют в 100 мл этилацетата и последовательно промывают 0,4 М раствором лимонной кислоты, водой, 0,5 н раствором бикар-боната натрия и снова водой до нейтральной ре-акции промывных вод. Rf 0,53 (А), 0,57 (Б). Эти-лацетат упаривают, остаток растворяют в этано-ле, добавляют 20 мл 2 н раствора гидроксида натрия и оставляют смесь на холоду в течение суток. Затем смесь подкисляют уксусной кисло-той, упаривают. Остаток растворяют в 20 мл сме-си трифторуксусная кислота-анизол-метилэтилсульфид (425:50:25) и перемешивают в течение 40 мин при комнатной температуре. Рас-творитель упаривают, остаток
растворяют в метаноле и гидрируют над 10%-ным палладием на активированном угле в течение 3 часов. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Основной продукт очищают на колон-ке (2,0x50 см) с сефадексом G-25 в градиенте кон-центрации пиридин-ацетатного буфера. Выход 2.7 г (39,8%) аморфного продукта, Rf 0,28 (В), 0,79 (Г), [α ]D20= -26,92° (С 1, МеОН). Аминокислотный ана-лиз: Arg 0,98, Lys 0,96, Аsр 0,95, Val 1,0, Туr 0,98.
Иммуностимулирующую активность синте-зированного тимопентина определяли по увеличе-нию титра противотейлерийных антител у телят, иммунизированных противотейлериозной вакци-ной. Для этого 5 телят 5-6-месячного возраста иммунизировали живой противотейлериозной вакциной ВИЭВ в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток) на голову. Через 3-5 дней с начала поствакци-нальной реакции на введение вакцины (через 15-17 дней после иммунизации) опытным животным вводили тимопентин в виде водного раствора в дозе 200 мкг на 100 кг живого веса. Контролем служили 5 аналогичных иммунизированных телят, которым тимопентин не вводили. Через 35 дней после вакцинации у опытных и контрольных жи-вотных определяли в сыворотке крови наличие и уровень противотейлерийных антител реакцией длительного связывания комплемента (РДСК) и иммуноферментным анализом (ИФА). Результаты показали, что в крови опытных животных титр противотейлерийных антител составлял 1:5-1:40 в РДСК и 1:100-1:1600 в ИФА, титр антител в сыво-ротке контрольных животных составлял 1:5-1:20 в РДСК и 1:50-1:800 в ИФА, что говорит о высокой иммуностимулирующей активности тимопентина.

1. US 4369137 A, (Orto Pharmaceutical Corporation), 18.01.1983.
2. В.Ф. Мартынов и др. «Иммуноактивные пептиды. Синтез активных фрагментов некоторых пептидных гормонов тимуса». Журнал общей химии, 1989, том 59 (121), вып. 10, стр. 2369-2377.