ПРОТЕИН С НИТОКИНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ЭТОТ ПРОТЕИН, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ И МИКРООРГАНИЗМЫ

Настоящее изобретение относится к протеину с активностью цитокинового типа, или к предшественнику этого протеина, который включает последовательность следующих аминокислот (а 1):

Предметом настоящего изобретения является новый протеин с цитокнновой активностью, методы генной инженерии для его продуцирования, а именно метод рекомбинантной ДНК, вектор экспрессии, несущий эту рекомбинантную ДПК. прокариоты и эукариотические клетки, содержащие эту реко.мби- натную ДНК, а также лекарственное средство, использующееся в качестве иммуномодуля гора, содержащее в качестве активного ингредиента этот протеин.
Хорошо известно, что иммунная система включает клеточные элементы и растворимые вещества, секретируемые цитокинами. Они представляют собой протеины, которые обеспечивают связывание между эмитрической клеткой и соответствующей клегкой-мшненью, либо в иммунной системе, либо в другой биологической системе организма. Цитокины обычно обладают биологической, так называемой плейотропной активностью: они могут оказывать множественные воздействия на клетку-мишень, как: пролиферация, дифференциация, цитолиз, активация, хемотаксис и т.д. Множество из этих молекул уже нашло применение в герапии: например, как интерлейкин-2- или а-интерферон, используемые для лечения некоторых опухолей путем иммунотерапии, и миелопоэтические факторы, такие, как GCSF (стимулирующий гранулоцитную колонию фактор) или GMC5F (стимулирующий гранулоцитную моноцит- ную колонию фактор), которые стимулируют рост и дифференциацию клеток крови и таким образом способствуют обогащению крови, обедненной этими клетками, например, вследствие химиотерапии.
О цитокинах имеются следующие сведения:
1) Они способствуют секретируемым протеинам. Секрецию протеина, следовательно, в особенности цитокина, чаше всего происходит по механизму, который включает гидролиз аминоконцезой гидрофобной области преобразуемого протеина, называемой предпептидной последовательностью или сигнальным пептидом, во время экскреции зрелого протеина в среде (Von Heijne G., 1986, Nuel, Ac. Res., 14., 4683-4690). Большинство пептидных последовательностей известных цитокинов включает по существу один сигнальный пептид.
2) Цитокины обычно соответствуют протеинам, индуктируемым либо другими цитокинами (К.Matsushima и др. 1988, J. Exp. Med 167, 1883- 1893;.Shimizu и др., 1990, Mol. Cell. В Lol., 10, 561568), либо химическими активаторами пролиферации и дифференциации клеток, такими, как липополисахариды, кальций-ионофоры, например, калимп- цин. циклический дибутнрил-аденозин-5- монофосфаг, димети.теульфокепд, ретиноевая кислота. конканавалин А, фигогемап люгипин (РНА-Р) и сложные эфиры форбола. например, 2-миристат-З- анстат форбола (РМА) (Muegge К. и Ducun S.K. 1990, Cytokine 2, 1-8; С.В. Thompson и др., 1989. Proc. Nall, Acad. Sei.. 86, 1333-1337); либо антителами против поверхностных молекул, таких, как поверхностные антигены CD2, CD3. CD28 и CD40 (Tompson
С.В., и др., вышеуказанная ссылкащ Roussel F. и др., J. Exp., Med. 173. 703-710).
3) При временной индукции цитокинов информационные (матричные) РНК цитокинов являются нестабильными. В случае большинства цитокинов они имеют области, обогащенные А и U, особенно последовательность AUUUA обобщающая типичная нестабилная последовательность выявлена D. Caput и др., 1986, Ргосс. Natl. Sci. США, 83. 1670-1674; G. Shaw и др., 1986, Cell, 46., 659-667; также, как К. Peppel и др.. 1991, J. Exp., Med., 173,349-355.
4) Преобладающее большинство известных цитокинов синтезируются клетками иммунной системы, особенно моноцитами и вспомогательными Т- лимфоиитами периферической крови (Ullman К. и др., 1989, Ann. Rev. Jmm. 8, 421-452 и работа “Мас- rofage derived cell regulatory factors" C.Sorg, опубликованная в 1989 г. Karger - Bale - Suisse), Их синтез индуктируется указанными в п. 2) индукгорами.
Кроме того, известно, что из мононуклеарных клеток периферической крови, образованных в основном лимфоцитами и моноцитами, культивированных и стимулированных с помощью различных индукторов, таких, как фитогемагглютинин. 2-миристат-З-анетат форбола и моноклональное антитело против CD2, можно сконструировать банк комплементарной ДНК без убиквитарных последовательностей комплементарной ДНК в клетках животных, и, следовательно, обогащенный комплементарной ДНК, кодирующей цитокины (Н.С. Chang и др. Eur. J. Jmntun, 1989, 19, 1045-1051; P.F. Zippel и др., 1989, Mol, Cell. Biol., 9, 1041-1048).
С другой стороны, известно (С.В. Tompson и др.,
1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 1333-1337; и Zindsten
T. и др.. 1989, Science, 244. 339). что продуцирование цитокинов (называемых лимфокинами) Т- лимфоцитами является белее значительным, следовательно, соответствует гораздо большим количествам информационных РНК, при стимуляции с помощью бинарной комбинации: 2-миристат-З-ацетат форбола и фитогемагглютинин или
2-миристат-З-ацетат форбола и апти-Си28-антитсло, чем только с помощью 2-миристат-З-ацегат форбола; и с помощью бинарной композиции: 2-миристат-З- ацетат форбола и фитогемагглютинин, чем с тройной комбинацией: 2-мприетат-З-ацетат форбола, фитогемагглютинин и циклоспорин А. причем циклоспорин А очевидно оказывает ингибирующее воздействие на транскрипцию информационных РНК цитокинов ( Tompson и др., вышеуказанная ссылка, Manila и др.,
1990,
ЕМВО J.. 9. 4425-4433).
Эта дифференциальная экспрессия информационных РНК цитокинов в различных условиях стимулирования может служить "просеиванием", называемым "дифференциальным просеиванием" (cribbagc differenticl), банка комплементарной ДНК, содержащей последовательности, кодирующие цитокины, с целью селекционирования этих последних последовательностей (см. особенно Dworkin и др., 1980. Dev. Biol . 76, 449-464; Cochran В.М. и др.. 1983.
Cell, 33, 939-947; и Zippel P.F. и др., 1989, Mol. Cell. Biol.. 9, 1041-1048). В самом деле, из двух информационных РНК, соответствующих двум состояниям стимуляции клеток, называемых здесь состояние стимуляции I и состояние стимуляции 2. причем состояние стимуляции 2 считается более обогащенным информационными РНК, кодирующими цитокины, чем состояние 1, можно сконструирован, два радиоактивных зонда, называемых соответственно зонд 1 и зонд 2, которые являются транскриптами, получаемыми с помощью обратной транскриптазы этих двух информационных РНК. Эти два зонда гибридизируют с бактериальными колониями, содержащими последовательности комплементарной ДНК банка. Бактериальные колонии, содержащие комплементарную ДНК, где информационная РНК преобладающе изменяется между двумя состояниями активации, дают дифференциальные сигналы с двумя зондами, причем гибридизация более значительная для "захваченных" клонов (которые соответствуют
индуктируемым протеинам) в случае зонда 2, чем зонда I.
Кроме того, известно, что клетки COS, клетки обезьяньих ночек, экспрессирующие Т-антиген вируса SV 40 Glugman Y„ Cell, 23 1981, 175-182), которые допускают репликацию векторов, содержащих источник репликации ДНК вируса 5V40, выбирают для изучения экспрессии генов в клетках животных и секреции эксиримированных (экспрессированных) протеинов. Секреция протеина в этих клетках указывает, что его секретирует (выделяет) клетка, которая его естественно продуцирует (Н.С. Chang и др., Sur. .1. Jmmun, 1989. 19, 1045-1051: и W.Y. Wetser и др., 1989. Free. Natl. Acad. Sci США: 86. 75227526).
Предметом настоящего изобретения является протеин с активностью цитокинового типа, или предшественник этого протеина, который включает следующую аминокислотную последовательность (аг):
в которой Хаа обозначает Asp или Gly, или последовательность, имеющую высокую степень гомологии с последовательностью (Э|).
Высокая степень гомологии здесь означает гомологию идентичности (соотношение между идентичными аминокислотами и общим числом аминокислот) по крайней мере на 80%, и предпочтительно по крайней мере па 90%, аминокислотных последовательностей, когда их сравнивают по максимальной гомологии, согласно методу оптимального согласования последовательностей Needleman и Wunscli 1970,. JI... Mol. Biol.. 48, 443-453. Этот алгоритмический метод, согласно которому рассматривают все возможные согласования и создают согласованный ряд, в котором как можно больше идентичных аминокислот подбирают под пары н число пропусков в
согласованных последовательностях является минимальным, особенно используют в программном обеспечении UWGCG университета в Висконсине: Dew- ereux и др. 1984, Nucl. Ac. Res. 12 8711-8722 - версия GAP.
Уже известной пен I одной последовательностью, наиболее близкой к таковой последовательности (aj из 112 аминокислот, является последовательность из 132 аминокислот, полученная из комплемен!арной ДНК протеина Р600 мыши, описанная K.D. Brown и др., 1989. .1. Omni, 142, 679-687 (протеин, эксприми- рованный ТН2-лимфоци1ами мыши, функция которого не выяснена). Сравнение этих пептидных последовательностей с помощью метода Neeolcman и Wunsch. 1970. J. Mol. Biol., 4 8. 443-453. показывает, что 63 аминокислоты из 1 12 идентичны, или гомология идентичности составляет около 56%.
Предметом настоящего изобретения является протеин, секретируемый Т-лимфоцитами и индуктируемые в них 2-миристат-З-ацегагом форболом, причем индукция цитокина (см. вышеприведенный текст) осуществляется под действием фитогемагглютинина или моноклонального анти-CD 28-антитела, причем терминирующее действие на амплификацию оказывает стимулирование фитогемагглютинином в присутствии циклоспорина А. Протеин согласно изобретению, называемый протеином NC3O, следовательно, представляет собой новый человеческий лимфокин. обладающий иммуномодуляторными активностями цитокинового типа (пролиферация клеток, активация клеток, хемотаксис и регуляция синтеза других цитокинов). Он воздействует, по крайней мере, на два вида ключевых клеток иммунной системы: моноциты и f) —лимфоциты. Следовательно. речь идет о новом интерлейкине. Некоторые из его свойств являются общими с интерлейкином-4: ингибирование синтеза интерлейкина- !|3 и ин герлей- кина-6 моноцитами периферической крови, активированными ЛПС (липополисахарид), и модуляция экспрессии антигена CD23 в Р-лимфоцитах миндалин, Эти два свойства также присущи интерлейкину- 4 ( W Paul, 1991, Blood, 77, 1959; и Waal Malefyt и др., 1991, J. Exp. Med., 174, 1199-1220).
Протеин согласно изобретению является новым интерлейкином лимфокинового типа. Он представляет интерес в качестве активного начала лекарственного средства, пригодного для обработки путем иммуномодуляции опухолей и лечения некоторых инфекционных или воспалительных заболеваний.
1 IporcuH согласно изобретению может включать, непосредственно выше последовательности (а|), одну или несколько аминокисло г, в особенности последовательность: Ser -Pro.
Этот протеин предпочтительно находится в форме, которая имеет кажущуюся молекулярную
массу, определяемую путем электрофореза на полиакриламидном I еле в присутствии додецилеульфата натрия (SDS), 9,0±2 или 16,0±2 KDa. Он предпочтительно N-гликозилирован, в особенности когда он имеет кажущуюся молекулярную массу 16,0±2 KDa.
Представляет интерес то, что этот протеин имеет степень чистоты, определяемую путем электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и проявления серебром, выше 70%, и предпочтительно выше 90%.
Предметом изобретения также является рекомбиназная ДНК, которая кодирует вышеуказанный протеин, полученный из клеточного лизата, или, предпочтительно, кодирует предшественник вышеуказанного протеина. Этот предшественник предпочтительно включает сигнальную последовательность.
Функцией этой сигнальной последовательности, выбираемой в зависимости от клетки-хозяина, является стимулирование экскреции рекомбинантного протеина из цитоплазмы, что позволяет рекомбинантному протеину принимать конформацию, близкую к таковой природного протеина, и заметно облегчает его очистку. Эта сигнальная последовательность может быть гидролизована либо в несколько стадий с помощью сигнальной пептидазы, которая высвобождает зрелый протеин, либо в несколько стадий, когда эта сигнальная последовательность включает, кроме последовательности, удаляемой с помощью сигнальной пептидазы, называемой сигнальным пептидом или предпоследовательностью, последовательность, удаляемую позднее в процессе одного или нескольких протеолитических событий, называемую про-последовательностью.
Кодирующей зрелый протеин последовательностью является, например, одна из следующих (Nа|) или (Na-J последовательностей:
Для экспрессии в прокариотах, таких, как, например, Escherichia coLi эта сигнальная последовательность может представлять собой либо последовательность, являющуюся производной последовательности, кодирующей природный предшественник протеина, экспортируемого прокариотом (например, сигнальный пептид OmPA (Ghrayeb и др., 1984, ЕМВО Journal 3, 2437-2442) или сигнальный пептид щелочной фосфатазы (Michaelis и др. J. Bact., 1983,
154, 366-374), либо неэндогенную последовательность,. происходящую от последовательности, колирующей эукариотический предшественник (например, сигнальный пептид одного из природных предшественников гормона человеческого роста), либо последовательность, кодирующую сигнальный синтетический пептид (например, таковой, описанный в заявке на патент Франции № 2 636 643), с последовательностью:
Met
1
Ala
Pro
Ser
Gly
5
Lys
Ser
Thr
Leu
Leu
10
Leu Leu Phe Leu Leu Leu
15
Cys
Leu
Pro
Ser
Trp
Asn
Ala
Gly
Ala
20
25
Для экспрессии в эукариотических клетках, таких, как аскомицеты, например, дрожжи Saccharo- myces cerzvisiae или филаментозный гриб Cryphon- cstria parasitica, эта сигнальная последовательность предпочтительно является последовательностью, происходящей от последовательности, кодирующей
природный предшественник секретируемого этими клетками протеина, например, в случае дрожжей предшественник инвертазы (европейская заявка на патент 0123289) или предшественник пре-пропоследовательности альфа-феромона (заявка на патент Дании 2484/84), или в случае Cryphonestria parasitica предшественник пре-про-последовательности эндотиапепсина, с последовательностью:
Для экспрессии в клетках животных, в качетве сигнальной последовательности используют либо сигнальную последовательность в отношении экспортирования из животных клеток протеина - например, последовательность, кодирующую сшналь- ный- пей гид одного из природных предшественников
человеческого гормона роста, уже известную с точки зрения возможности секреции интерлейкина-2 (см. заявку на патент Франции 2 619 71 Г), либо одну из следующих четырех последовательностей (б 1), (б 2), (б 3) и (б 4):
Изобретение относится также к вектору экспрессии, включающий вышеуказанную рекомбинантную Д1IK.
Экспрессии прокариотов, в особенности в Escherichia col., осуществляется путем включения рекомбинантной ДПК в вектор экспрессии, содержащий эффективный промотор, следующий за сайтом фиксации рибосом выше экснримируемо! о гена, также, как эффективную в отношении терминации транскрипции последовательность ниже эксприми- руемого гена. Эта плазмида также должна включть
источник репликации и маркер селекции. Все эти последовательности должны выбираться в зависимости от кле1 ки-хозяина.
Для экспрессии в эукариотических клетках, экспрессирующий вектор сотласно изобретению включает вышеуказанную рекомбинантную ДНК со средствами. необходимыми для ее экспрессии, ее репликации в этих клоках и селекции трансформированных клеток. Предпочтительно, этот вектор включает маркер селекции, выбираемый, например, для комплементации муташш эукариотических рецепторных клеток, который позволяет осуществлять селекцию клеток, которые интегрированы рекомбинантной ДИК, в виде повышенного числа копий, либо в их геноме, либо в мулыикоиийном векторе.
Для экспрессии в эукариотических клетках, таких, как дрожжи, например, Saccharomyces cerevisiae, следует встраивать рекомбинантную ДНК между, с одной стороны промотором и, с другой стороны, терминатором транскрипции. Совокупность промо- тор-кодирующая последовательность-герминатор, называемую кассетой экспрессии, клонируют либо в монокопийном или поликопийном плазмидном векторе. либо в виде мультикопии интегрируют в геном дрожжей.
Дтя экспрессии в эукариотических клетках, таких, как клетки филаментозных грибов, группы аскомицетов, например, таковых родов Ashergillus. Podcspora, Trichoderma, Neurospera или Cryphonectria, экспрессирующий вектор согласно изобретению включает вышеуказанную рекомбинантную ДНК со средствами, необходимыми для его экспрессии, и возможно маркер селекции и/или телометрические последовательности. В самом деле, можно селекционировать трансформанты, интегрированные целевой ДНК, с помощью маркера селекции, находящегося либо в том же векторе, что и целевая ДНК, либо в другом векторе, причем тогда эти два вектора вводятся путем котрансформации. Рекомбинантная ДНК согласно изобретению может быть либо интегрирована в геном филаментозных грибов, либо сохранена во внехромосомной форме благодаря последовательностям, допускающим репликацию и расщепление этой ДНК.
Дтя экспрессии в клетках животных, особенно в клетках яичников китайского хомячка СНО, рекомбинантную ДНК предпочтительно встраивать в плазмиду (например, происходящую от pBR 322), включающую либо одну единицу экспрессии, в которую встроена рекомбинантная ДНК, согласно изобретению, и возможно маркер селекции, перед эффективным промотором, либо две единицы экспрессии. Первая единица экспрессии включает вышеуказанную рекомбинантную ДНК, предшествующую эффективному промотору (например, ранний промотор SV 40). Иницирующую последовательность около ATG (анппимоцигарный глобулин) предпочтительно выбирают в зависимости от обобщающей типичной последовательности, описанной Kozak (М. Kozak (1978), Cell, 15, 1109-1123). Нитроновая последовательное гь, например, интрон а-глобулина мыши, может быть включена выше рекомбинант нои ДНК. также, как последовательность, включающая сайт полиаденилирования, например, Поспеловагель- ность полиадени.шрования SV 40, может быть включена ниже рекомбинантного гена. Вторая единица экспрессии включает маркер селекции, например, последовательность ДНК, кодирующую дигодрофо- латредуктазу (фермент, ниже сокращенно называемый Д1 ФР). Плазмиду трансфектируют в клетки животных, например, клетки СНО dht'r- (неспособные экспримирова! ь Д! ФР). Линию (клеток) селекционирую! по ее резистентное!и к метогрекенпу:
интегрируют в ее геном повышенное число копий рекомбинантной ДНК и экспрессируют эту последнюю на достаточном уровне.
Изобретение также относится к прокариошым микроорганизмам, трансформированным вышеуказанным вектором экспрессии, в особенности таковым вида Escherichia coli. также, как к эукариотическим клеткам, которые содержат вышеуказанную рекомбинантную ДНК. Ее можно вводить путем трансформации за счет вышеуказанного экспрессирующего вектора или в виде самой по себе рекомбинантной ДНК согласно изобретен и нт, которая иногда может быть интегрирована прямо в геном в локусе, который допускает ее экспрессию.
11редставляющие интерес эукариотические клетки являются клетками животных.
Рекомбинантную ДНК, например, можно вводить в эти клетки путем трансфекции за счет вышеуказанного экспрессирующего вектора, путем инфекции с помощью вируса или ретровируса, содержащего ее, или путем микроинъецирования. Предпочтительными животными клетками являются клетки СНО, в особенности клетки СНО dhfr-, из которых можно получать высокопродуцирующие протеин согласно изобретению линии. Клетки COS также представляют собой предпочтительного хозяина для получения этого протеина.
Другими, представляющими интерес эукариотическими клетками являются дрожжевые клетки, в особенности клетки Saccharomyces cerevisiae.
Изобретение также относится к способу получения вышеуказанного протеина, который включает стадию культивирования вышеуказанных животных клеток или клеток дрожжей, с последующими стадиями выделения и очистки рекомбинантного протеина.
Изобретение также относится к рекомбинантному протеину, который может быть получен способом, включающим стадию культивирования этих животных клеток или клеток дрожжей, с последующими стадиями выделения и очистки рекомбинантного протеина.
Следовательно, предметом изобретения также является лекарственное средство, использующееся особенно в онкологии и при лечении иммуномодуляцией некоторых инфекционных состояний и некоторых воспалительных состояний, которое содержит в качестве активного ингредиента вышеуказанный протеин в фармацевтически приемлемом эксципиенте. Они могут быть использованы индивидуально или в сочетании с друтими активными агентами, например, с одним или несколькими цитокинами.
Изобретение подробнее поясняется в нижеприводимом описании, представляемом в виде разделов, которое включает экспериментальные результаты и их обсуждение.
Некоторые из этих разделов относятся к экспериментам, осуществляемым с целью реализации изобре1ения, другое примеры реализации изобретения даются, разумеется, чисто в иллюетра говном плане.
Большая часть совокупное!и описанных в лих разделах приемов (методов), хорошо известных специалисту, подробно описана в работе Sambrook, Fritsch и Maniatis: "Molecular cloning: a Zaboratory manual'’, опубликованной в 1989 г. издателями Cold Spring Harbor Press в Нью-Йорке (2-е издание).
Нижеследующее описание для лучшего понимания сопровождается рисунками 1а, 16, 1в, 2, 3, 4, 5, б и 7.
На фиг. 1а представлена обитая генетическая карта плазмиды pSEI, являющейся плазмидой клонирования в E.coli и экспрессии в клетках животных, причем сайты, исчезающие за счет лигирования, указаны в скобках. Используемые на этом рисунке символы уточняются в описании этой плазмиды (раздел 2).
На фиг. 16 представлена последовательность синтетического фрагмента "сайт связывания Hind III" - Hind III, используемого для конструирования плазмиды pSEI.
На фиг. 1в представлена последовательность синтетического фрагмента Hind III - "сайт связывания ВатНГ.
На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность кДНК NC3O и напротив - выведенная аминокислотная последовательность, где подчеркнуты два Met, способные инициировать трансляцию, причем возможные места расщепления сигнального пептида указываются вертикальными стрелками, а четыре возможных области N-гликозилирования подчеркнуты пунктирной линией.
На фиг. 3 и 4 представлены соответственно согласование по максимальной гомологии согласно методу Needleman и Wunsch, 1970, .1. Med. Biol. 48, 443-453, аминокислотной последовательности, выведенной из кДНК NC30 (верхний ряд) и последовательное ги, выведенной из кДНК протеина РбОО мыши (нижний ряд), и согласование согласно этому методу кодирующей части кДНК ЫСЗО (верхний ряд) и кодирующей части кДНК протеина 1’600 (нижний ряд).
На фиг. 5 представлена последовательность фрагмента В, причем область молчащей мутации по отношению к кДНК NC30 указывается звездочкой.
На фиг. 6 и 7 представлены изменение оптической плотности и/илн плотности клеток линии В9 в зависимости or концентрации очищенного npoien- на NC3O. продуцированного из супернатанта клеток C'OS (фиг. б), и происходящего от дрожжей (фиг. 7).
РАЗДЕЛ 1
Культивирование и стимулирование с помощью РМА и РНА-Р мопопуклеарных клеток периферической крови.
Получение информационной РНК, используемой для создания банка комплементарной ДНК
1)
Культивирование и ст имулирование моно- нуклеарных клеток периферической крови:
Из алпквог периферической крови (отобранной у грех здоровых доноров в центре переливания крови), предварительно подвергнутой шиафорезу и градиенту Фпколла ( Pharmacia. Воушп. А. 1968.
Scand. .1. Clin. Zab. Invest., 21, с. 77-89), отбирают фракцию клеток, обогащенную моноиуклеарнымп клетками ирпферической крови PBMNC (мононукле- арные клетки периферической крови) следующего - приблизительного состава: 70% лимфоцитов, 25% моноцитов и 5% гранулоцитов (подсчет клеток проводится с помощью счетчика клеток Couiter модель S- Plus 1Y).
Клетки помещают в колбу емкостью 250 мл, затем центрифугируют в течение 10 минут при 37°С при 300 g.
Супернатант удаляют и осадок клеток промывают 50 мл среды, включающей глюкозу, минеральные соли, аминокислоты и витамины, называемой средой R PMI (среда R РМ1 1640 фирмы Гибко BRL), затем снова центрифугируют в тех же условиях.
Осадок клеток затем обрабатывают с помощью 500 мл среды R РМГ, дополненной 10% плодной телячьей сыворотки (Гибко BRL - стандартное обозначение: 013-06290Н), с добавленными 10 единицами пенициллина и 10 мкг стептомицина (раствор пенициллина со стрептомицином, фирма Гибко, стандартное обозначение: 043-05140) на 1 мл среды, также, как L-глутамином (Гибко BRL - стандартное обозначение: 043-05030) вплоть до конечной концентрации 2 ммоль.
Одну часть суспензии клеток распределяют, с целью разделения адгезивных клеток и неадгезивных клеток, примерно по 100 мл на чашку (камеру), в четыре большие квадратные чашки для культивирования (размером 245x245x20 мм; Nunc; стандартное обозначение: 166508) и инкубируют в течение 1 часа при 37°С. Известно, что большинство моноцитарных клеток прилипают к чашке для культивирования, тогда как большинство лимфоцитарных клеток остаются в суспензии.
11садгезивные клетки отбирают с помощью пинетки и культивируют в колбах для культивирования типа Falcon с поверхностью 175 см' в присутствии среды RPMI, дополненной как описано выше, к которой добавлено 10 ш/мл
2-миристат-З-ацегат-форпола (РМА) (Сигма, стандартное обозначение: 1’8139) и 5 мкг/мл фитогеман- лювипша (РНА-Р) (Сигма, стандартное обозначение: 1.8754), при 37°С в присутствии 5% СО? в течение 24 часов.
К адгезивным клеткам снова добавляю! 100 мл среды RPM1, дополненной как описано выше, дополнительно включающей К) нг/мл РМА и 5 мкт/мл РНА-Р. Клетки инкубируют при 37°С в присутствии 5% (но объему) С0; в течение 5 часов.
Остаток суспензии клеток, называемый ниже полными (целыми) клетками, распределяют в четыре большие квадратные чашки для культивирования и инкубирую! в присутствии среды PPMI, дополненной как описано выше, к которой добавлено К) нг/мл РМА и 5 мкг/мл РНА-Р. при 37°С в присутствии 5% (по объему) С(>2 в юченис 5 часов для первых двух чашек и 24 часов для двух других чашек.
Примерно за 2 часа до окончания инкубации, в культуральную среду этих различных клеток добавляют 10 мкг/мл циклогексимида (Сигма, оандартное обозначение С6255) (ингибитор трансляции, который повышает стабильность РНК цитокинов: см. Lindsten и др., 1989, Science 244, 339-344) и инкубацию продолжаю! в течение 2 часов при 37°С.
2)
11олучение информационной (матричной) РНК:
а) Извлечение информационной РНК:
Клетки рекуперируют следующим образом:
-
адгезивные (прилипшие) клетки промывают 2 раза буфером ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор, стандартное обозначение 041040040 - Гибко BRL), затем соскребают с помощью скребка из каучука и цинтрифугируют. Таким образом получают осадок клеток, называемый осадок А;
-
для неадгезивных клеток, после перемешивания в колбе, содержащей суспензию клеток, суспензию клеток отбирают и центрифугируют. Таким образом получают осадок клеток, называемых осадком клеток НА;
-
для полных клеток, адгезивную фракцию промывают 2 раза буфером ЗФР и соскребают как описано выше, затем центрифугируют. Неадгезивную фракцию центрифугируют. Два полученных осадка клеток впоследствии объединяют. Их объединение называют осадком клеток Т (5 часов) для полных клеток, инкубированных в течение 5 часов, и Т (24 часа) для полных клеток, инкубированных в течение 24 часов.
Осадки клеток А, ПА, Т(5 часов) и Т (24 часа) замораживают и хранят при -80°С.
Каждый замороженный осадок клеток суспендируют в лизисном буфере следующего состава: 5 моль тиоцианата гуанидина; 50 ммоль грис- (гидроксиметил) аминомегана, pH = 7,5; 10 ммоль ЭДТК. Суспензию обрабатываю! ультразвуком с помощью ультразвукового дегинтегратора Ultra Turax № 231 256 (Janke и Kunkel ) с максимальной мощностью в течение 4-х циклов по 20 секунд. Добавляю! р -меркаптоэтанол до 0,2 моль и снова осуществляют цикл обработки ультразвуком в течение 30 секунд. Добавляют хлорид лития вплоть до 3 моль. Суспензию охлаждают до 4°С и оставляют стоять при этой температуре в течение 48 часов. РНК затем выделяют путем центрифу! ирования в течение 60 минул. Осадок РНК промывают один раз с помощью ЗМ раствора хлорида лития, снова центрифугирую!, затем обрабатывают буфером следующего состава: 1% додецплсульфата натрия, 5 ммоль ЭДТК и К) ммоль Трис-НС1, pH = 7,5, с добавлением 1 мг.'мл протеиназы К (Boehringer. Майнхайм, Гмбх). После инкубации при 40°С в течение 1 часа, раствор РНК экстрагируют с помощью смеси фенола с хлороформом. При -20 °C содержащуюся в водной фазе РНК осаждаю! с помощью 0,3 М раствора ацетат аммония и 2,5 объемов этанола. Центрифугируют при 15 000 g в течение 30 минут и осадок храня!.
б) Очистка фракции поли А РНК
Осадок обрабатывают с помощью I мл буфера состава Трис-1 IC1, 10 ммоль, pl 1=7.5, и ЭДТК, 1 ммоль, называемою буфер ТЕ, и суспендируют путем перемешивания с помощью вихревой мешалки. Олиго-бТ-целлюлозу типа 3 (выпускаемая в продажу Collaborative Research. Inc., Biomedicals Product Division) готовят согласно рекомендациям изготовителя. РНК помещают на олиго-бТ-цел.чюлозу, осторожно перемешивают для суспендирования шариков, затем нагревают в течение 1 минуты при 60°С.
Суспензию дополняют с помощью 0,5 моль NaCl. затем осторожно перемешивают в течение 10 минут. После этого суспензию центрифугируют в течение 1 минуты при 1000 g, супернатант удялют, осадок промывают 2 раза по I мл буфера ТЕ, содержащего 0,5 моль NaCl. Супернатанты удаляют. Элюирования иолиаденилированной фракции РНК (состоящей из информационных РНК) достигают путем суспендирования шариков в 1 мл буфера ТЕ, затем нагревания этой суспензии при 60°С в течение 1 минуты, с последующим перемешиванием в течение 10 минут на встряхивателе. Затем центрифугирую! в течение 1 минуты при 1000 g, что позволяет рекуперировать супернатант, содержащий свободные информационные РНК в растворе. Совокупность вышеуказанных операций (начиная с элюирования) повторяют 2 раза. Таким образом полученные супернатанты объединяют, удаляют остаточные шарики путем центрифугирования и супернатант осаждают с помощью 3 объемов этанола и раствора NaCl с конечной концентрацией 0,3 моль.
Таким образом из осадков клеток A, NA, Т(5 часов) и Т(24 часа) получают четыре образца РНК - А , называемые далее как PIlK-polyA -А; РНК-pylyA - NA;PllKpolyA И (5 час.) и РНК-polyA -Т(24час).
РАЗДЕЛ 2:
Получение банка комплементарной ДНК, обогащенного специфическими последовательностями мононуклеарных клеток периферической крови
I)
Конструирование клонирующего вектора pSEI:
В используемой стратегии прибегают к использованию фрагментов, получаемых из общедоступных плазмид, и фрагментов, получаемых путем синтеза но обычно используемым в настоящее время методам. Применяемые способы клонирования представляют собой такие, которые описаны Sambrook и лр., в "Molecular Cloning, a Laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratopry, 1989). Синтез олигонуклеотидов осуществляют с помощью синтезатора РНК - Biosearch 8700.
Нижеприводимое описание для лучшего понимания иллюстрируется рисунком 1а.
Эту плазмиду конструируют путем последовательных лигировании следующих элементов:
а) фрагмент Pvull - Pvull, обозначаемый -++++++ на фиг. 1а, из 2525 пар оснований, получают путем переваривания плазмиды pTZlSR (Фармация) ферментом рестрикции Pvun. Этот фрагмент содержит источник репликации фага П (обозначаемый на фгп. 1а как OR1E1), ген (обозначаемый на
фиг. la как AmpR); обладающий резистентностью к ампициллину, и источник репликации (обозначаемый на рисунке 1а как ORI pBR322), позволяющий осуществлять репликацию этой плазмиды в E.coli. Первый свободный сайт PvuN исчезает за счет лигирования со свободным сайтом EcoRV (который также исчезает) фрагмента, описанного в п. ж);
б) фрагмент PvuN - Нра! - обозначаемый на фиг. 1а - из 1060 пар оснований ДНК аденовируса типа 5 между положениями 11299 (сайт рестрикции Pvun) н 10239 (сайт рестрикции llpal) ( Bekker и Van Ormondt, Gene, 21, 1984, 115-120), содержащий информацию для РНК VA-1 и VA- II. Свободный сайт Hpal исчезает за счет лигирования со свободным сайтом Pyul.l (который также исчезает) фрагмент, описанного в в. Сайт Apal в положении 11218 удаляю! путем расщепления с помощью фермента Apal, обработки с помощью экзонуклеазы: ДНК- полимеразы фага Т4 и нового лигирования;
в) фрагмент Pvun- Hind 111 - обозначаемый IIШИII на фиг. 1а - из 344 пар оснований, происходящий от ДНК вируса SV40, получаемый путем переваривания с помощью ферментов рестрикции Pvun и Hind 111. Этот фрагмент включает источник репликации и ранний промотор ДНК вируса SV40 (B.J. Вуте и др. Proc. Natl. Acad. Sci. США (1983), 80,721-725).
Сайт Hind 111 исчезает за счет лигирования с сайтом связывания Hind HI, описанным в п.г).
г) синтетический фрагмент "сайт связывания Hind Ill - Hind III - обозначаемый на фиг. la как ==== - из 419 пар оснований, последовательность которого, представленная на фиг. 16, содержит последовательность, близкую к непреобразованной s - последовательности вируса I1TLV1 (R. Weiss и др. "Molecular Biology of Tumor Viruses — часть 2, 2-е издание, 19856 Cold Spring Harbor Laboratory, c. 1057), и периферический ннгрон гена u-глобина мыши (Y. Nishioka и др. 1979, Cell., 18, 875-882);
д) синтетический фрагмент Hind III -"сайт связывания Bamlll" - обозначаемый как ХХХХХХХ на фиг. 1а -, содержащий промотор РНК-полимсразы фага Т7, также, как полилинкер, содержащий особенно сайты клонирования Apal и BamHl. последовательность которого представлена на рисунке 1в;
е) фрагмент BamHl - Bell из 240 пар оснований - обозначаемый АААААЖна фиг. 1а -, маленький фрагмент, получаемый путем переваривания, ферментами BcN и Ват 111 вируса SV 40, которые содержит сай г его полиаденилирования (М. Fitzgerald и др.. Cell. 24, 1981. 251-260). Сайты Bamlll и Bell исчезают за счет лигировании соответственно с "сайтом связывания Bamlll" фрш мента, описанного в н.д.)., и сайтом Bamlll (который также исчезает) фрагмента, описанного вп. ж;
ж) фрагмент Bamlll - EcoRV - обозначаемый как оооооо на фиг. 1а - из 190 пар оснований, маленький фрагмент, происходящий от плазмиды pBR322 после полного переваривания ферментами EcoRV и Bamlll.
Плазмида pSEI, следовательно, включает элементы, необходимые для ее использования в качестве клонирующею вектора в E.coli (источник репликации
в E.coli и ген устойчивости к ампициллину, происходящий от плазмиды pfZ18P), также как в качестве вектора экспрессии в клетках животных (промотор, интрон, сайт полиаденилирования, источник репликации вируса SV40) и для ее копирования в виде простой нити с целью секвенирования (источник репликации фаага I !).
2)
Конструирование банка комплементарной ДНК, обогащенного специфическими последовательностями мононуклеарных клеток периферической крови:
Используемым способом клонирования, описан Caput и др., (способ праймер-адаптер): Caput и дррКОС. Natl. Acad. Sci. США, 1986. 83, 1670-1674.
Он состоит, с одной стороны, в ферментативном гидролизе вектора pSEI с помощью Apal, добавления "хвоста polydC к прогуберантному З’-концу, затем в ферментативном гидролизе таким образом полученных плазмид с помощью эндонуклеазы Barn Hl. Соответствующий вектору фрагмент очищают на колонке с сефарозой С1АВ (Фармация). Следовательно, он включает "хвост" polyde на одном конце, причем другой конец является когезивным, типа Ват Н1.
С другой стороны, полученные в конечном итоге раздела 1 PHK-poly А’ подвергают обратной транскрипции, исходя из праймера, последовательность которого следующая:
5 ' < GATCCGGGCCCTTTTTTTTT ТТТ < 3'.
Так, кДИК содержат на своем 5' - конце последовательность GATCC, комплементарную когезивному концу BamHl.
Гибридные РНК-ДНК, получаемые путем воздействия обратной транскриптазы, подвергают щелочному гидролизу, который позволяет удалить РНК. Однонитевые кДНК затем подвергают обработке терминальной трансферазой, чтобы добавить в 3' polyd G-, и очищают с помощью двух циклов пропусканий через колонку с сефарозой CL4B.
Эти кДНК гибридизируют с PHK-poly А , происходящей из клеток линии COS3 (линия клеток обезьяньих почек, экспримнрующих антиген Т вируса SV40: см. Gluz.man, 1981, Cell., 23, 175-182), получаемых как описано в Разделе 12).
llei ибридизованные кДНК выделяют (фракция, обогащенная ДНК, комплементарной информационным специфическим РНК мононуклеарных клеток периферической крови).
Эти кДНК в однонтневой форме вставляют в векюр pS El. Второй олигонуклеотид (адаптер), комплементарный праймеру, для генерации требует сайга Bamlll на З'-конпе кДНК. После гибридизации вектора. кДНК и адаптера, рекомбинантные молекулы циркуляризирун?" путем воздействия лит азы фага Т4. Однонитсвые учаежи тогда укрепляют благодаря Д1 IK-полимеразе ([тага Т4. Таким образом полученный пул плазмид служит для трансформации штамма E.coli МС 1061 ( Casabadan. S. Cohen. .1. Bad. (1980), 143. 971-980) путем электропорации.
Протокол получения банка комплементарной ДНК'
а) Получение комплементарной ДНК
Из 5 мкг РНК-polyA мононуклеарных клеток периферической крови, полученных в итоге Раздела 1, следующего состава:
РНК-polyA Л: 0,5 мкг; РНК-polyA’ NA: 2 мкг; РНК-polyA Т (5 час): 2 мкг; и РНК-polyA Т (24 час): 0,5 мкг, получают комплементарную одноните- вую ДНК, маркированную 32p-dCTP (полученная комплементарная ДНК имеет удельную активность 3000 импульсов в мин/нг), с помощью синтетического праймера со следующей последовательностью (включающий сайт BamHl):
5 ’ GATCCGGGCC СТТТТТТТТТ ТТТ 3 ’
в объеме 100 мкл буфера состава: 50 ммоль Трис- НС1, pH = 8,3; 5 ммоль хлорида магния; 10 ммоль дитиотрентола, содержащего по 0,5 ммоль каждого из дезоксинуклеотидгрифосфатов, 100 микрокюри ОСТР «32р и 100 ед. Pnasin (Промега). После инкубации в течение 30 минут при 46 °C со 100 единицами фермента обратной транскриптазы Genofit -El 022), добавляют 4 мл 0,5 М ЭДТК. Первый раз экстрагируют фенолом (насыщенный буфером ТЕ), затем -во второй раз экстрагируют хлороформом. Добавляют 10 мкг транспортной РНК телячьей печени, 1/10 объема 10 М раствора ацетата аммония и 2,5 объема этанола для осаждения комплементарной ДНК. Центрифугируют, осадок после центрифугирования растворяют в 30 мкл буфера ТЕ, затем удаляют маленькие молекулы, такие, как соли, фенол и хлороформ, путем эксклюзивной хроматографии на колонке с полиакриламидом 1’10 (Биогель I’ 10; ЗОО- ТОО меш; стандартное обозначение: 1501050; Биорад).
б) Щелочной гидролиз матричной РНК
Добавляют 4,6 мкл 2 н раствора гидроксида натрия, инкубируют в течение 30 минут при 68°С, затем добавляют 4,6 мкл 2н уксусной кислоты и полученный раствор пропускают через колонку с полиакриламидом Р10.
в) Гомополимерное присоединение dG
Удлиняют комплементарную ДПК по З'-концу с помощью "хвоста" dG с 66 единицами концевого фермента трансферазы (Фармация; 27073001). Инкубируют в 60 мкл буфера следующего состава: 30 ммоль Трис-1 IC1, pl 1=7,6; 1 ммоль хлорида кобальта; 140 ммоль какодиловой кислоты; 0,1 ммоль дитиот- реитола. I ммоль dGTP; в течение 30 минут при 37°С. ЗЭ1СМ добавляют 4 мкл 0,5 М ЭДТК.
г) Очистка на колонке с сефароюй CL4B
Для того, чтобы удалить синтетический праймер, комплсмешарную /(НК очищают на двух последовательных колонках с 1 мл сефарозы CL4B (Фармация), уравновешенных с раствором, содержащим 30 ммоль гидроксида натрия на 2 ммоль ЭДТК.
Первые tpn радиоактивные фракции (около 80 мкл каждая) объединяют и осаждают с помощью 1'10 объема 10 И раствора ацетата аммония и 2,5
объема этанола. Количество комплементарной ДНК составляет I мкг.
д) Г норидизация
Осадок комплементарной ДНК суспендируют в 25 мкл буфера ТЕ, добавляют 15 мкг РНК-ро1уА\ извлеченной из клеток линии COS, затем 0,1 объема ЗМ раствора хлорида натрия. 2.5 объема этанола и оставляют осаждаться при -20°С.
Центрифугируют, промывают 70%-ным этанолом, высушивают, осадок растворяют в 5 мкл буфера следующего состава: 0,1 моль Трис-ПС1. pH = 7,5; 0,3 моль хлорида натрия; 1 ммоль ЭДТК; полученный раствор помещают в капиллярную трубку, которую герметически закрывают (запаивают), затем инкубируют при 65°С в течение 40 часов.
Содержимое капилляра разбавляют с помощью 100 мкл буфера ТЕ, к которому добавляют 300 мкл 50 мМ натрийфосфатного буфера, рН=6,8. Полученный раствор пропускают через колонку с гидроксиапатитом (Биорад; стандарт ное обозначение: 130.0520) при 60 °C, уравновешенным с этим фосфатным буфером. Выделяют простую (одинарную) нить (комплементарная негибридизованная ДНК) и двойную нить (информационная РНК COS / гибри- дизованпая с комплементарной ДНК) с помощью градиента 0,1 М -0,2 М фосфатного буфера при пропускании через колонку с гидроксиапатитом. Объединяют соответствующие фракции с однонигевой комплементарной ДНК (25% масс, элюированной кДНК, что соответствует обогащению примерно в 4 раза специфическими последовательностями мононуклеарных клеток периферической крови), добавляют 20 мкг транспортной РНК, весь полный объем осаждают с помощью 0,1 объема 10 М раствора ацетата аммония и 2,5 объема этанола. Центрифугируют, осадок после центрифугирования растворяют в 200 мкл ТЕ, остаточный фосфат удаляют на полиакриламиде Р 10, снова осаждают с помощью 0,1 объема К) М раствора ацетата аммония и 2,5 объема этанола.
Осадок растворяют в 30 мкл раствора с 30 ммоль НаОН /2 ммоль ЭДТК. Комплементарную ДНК загружают в колонку с, сефарозой CL4B (Фармация) объемом 1 мл, уравновешенной с раствором, содержащим 30 ммоль NaOII, 2 ммоль ЭДТК, чтобы удалить остаток синтетического праймера. Объединяют первые три радиоактивные фракции объемом около 80 мкл каждая. Содержащуюся в этих фракциях кДНК осаждают с помощью 0,1 объема 10 М раствора ацетата аммония и 2,5 объема этанола. Таким образом полученное количество комплементарной Д1IK составляет 20 иг.
е) Конъюгация клонирующего вектора PSEI и комплементарной ДНК в присутствии адаптера
Центрифугируют, осадок растворяют в 33 мкл буфера ТЕ. добавляют 5 мкл (125 нг) клонирующего вектора pSEI, 1 мкл (120 нг) адаптера со следующей последовательностью (включающий сайт Apal):
5’ АААААААААА AAAGGGCCCG 3'.
10 мкл 200 мМ раствора хлорида натрия, икубируют в течение 5 минут при 65 °C, затем реакционную смесь оставляю! охлаждаться до комнатной температуры.
ж) Лигирование
Клонирующий вектор и однонитевую кДНК лигируют в объеме 100 мкл с 32,5 единицами фермента ДНК-лигазы фага Т4 (Фармация; стандартное обозначение: 27087002) в течение ночи при 15°С в буфере следующего состава: 50 ммоль Трис-I 1С1. рН=7,5; 10 ммоль хлорида магния, 1 ммоль адено- зпн-5'-трифосфа та.
з) Синтез второй нити кДНК
Протеины удаляют путем экстракции фенолом с последующей экстракцией хлороформом, затем добавляют 0,1 объема 10 мМ раствора ацетата аммония, потом 2,5 объема этанола. Центрифугируют, осадок растворяют в буфере следующего состава: 33 ммоль Трис-ацетата. рН=7,9; 62,5 ммоль ацетата калия, 1 ммоль ацетата магния и 1 ммоль дигиотреи- тола (ДТТ); вторую нить комплементарной ДНК синтезируют в объеме 30 мкл с 30 единицами фермента ДНК-полимеразы фаза Т4 (Фармация; стандартное обозначение: 27-0718) и смесью по 1 ммоль четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов dATP, dCTP, dGTP и dTTP, также, как с двумя единицами протеина гена 32 фага Т4 (Фармация; стандартное обозначение: 27-0213), в течение 1 часа при 37°С. Экстрагируют фенолом и следы фенола удаляют при использовании колонки с полиакриламидом Р 10 (Биогель Р 10; 200-400 меш; стандартное обозначение: 15011050, Биорад).
и) Трансформация путем электропорации
Клетки E.coli МС1061 (Ciontech) трансформируют при помощи вышеполученнои рекомбинантной ДНК путем электропорации с помощью аппарата Biorad Gene Pulser (БИ0РАД) на 2,5 киловольт в предписываемых изготовителем условиях, затем выращивают бактерии в течение 1 часа в так называемой среде LB Sainbrook, цитировано выше) следующего состава: бактотриптон, 10 г/л; дрожжевой экстракт, 5 гл: NaCI, 10 г/л; затем в течение 6,5 часов в среде LB, к которой добавлено 100 мкг/мл ампициллина.
Определено число независимых клонов путем внесения в разбавлении 1/1000 среды для трансформации после первого часа инкубации в чашку со средой LB, к которой добавлено 1,5% (вес/обьем) агара и 100 мкг/мл ампициллина, называемой впоследствии агаровой LB средой. Число независимых клонов составляет 500 000.
РАЗДЕЛ 3:
Просеивание выделенною банка комплементарной ДНК и отбор клона NC30
1)
Реализация реплик бактериальных колоний банка кДНК на найлоновом фильтре Примерно 40 000 рекомбинантных бактерий банка кДНК распределяют по чашкам Петри (245 х 245 мм), содержащим агаровую среду LI3 (около 2 000 колоний па чашку).
Из каждой из этих чашек осущест вляю! перенос колоний на найлоповую мембрану (Hvbond N - Амерсхам) путем помещения мембраны на поверхность чашки и ставят метки путем прокалывания мембраны с помощью иглы. Мембрану затем удаляют и помещают на поверхность новой чашки Петри, содержащей агаровую среду LB. Оставляют на несколько часов при 37°С, чтобы подучить вырастание колоний. Из этой первой мембраны реализуют четыре реплики на новых мембранах (предварительно помешенных на агаровую среду LB для их увлажнения) путем последовательных контактов с первой мембраной. Полученные на мембране реплики, наконец. помещают на чашки с агаровой средой LB и инкубируют в течение ночи при 30°С,
Реплики на мембране с колониями кверху помешают на лист ватмана ЗММ, насыщенный раствором состава, 0,5 моль NaOll, 1.5 моль NaCI; на 5 минут, что позволяет лизировать бактерии и фиксировать ДНК. Реплики на мембране затем помещают на второй лист ватмана 3 мМ, насыщенный на этот раз нейтрализующим раствором состава, 1,5 М NaCI; 5 М Трис-НС), рН=8,0; на 5 минут. Реплики на мембране затем погружают в раствор 2 х SSC (состав раствора SS С:0,15 М NaCI; 0,015 М цитрата натрия) и остатки бактерий частично удаляют, осторожно потирая (соскребывая) с помощью ваты для очистки.
Затем реплики (отпечатки) на мембране обрабатывают протеиназой К (Boehringer Mannheim GmbH), в концентрации 100 мкг/мл в растворе следующего состава: 10 ммоль Трис-НС1, pH = 8; 10 ммоль ЭДТК; 50 ммоль NaCI; 0.1% додецилсульфата натрия; по 20 мл на мембрану. Инкубируют в течение 30 минут при 37°С и при перемешивании. Реплики на мембране снова погружают в раствор 2х SSC для окончательного удаления всех следов остатков бактерий. Наконец, их высушивают на фильтровальной бумаге в течение нескольких минут, затем в течение 30 минут в вакууме при +80°С. Таким образом, на каждую чашку получают 4 реплики на мембране, нашиваемые впоследствии реплика 1. реплика 2, реплика 3 и реплика 4.
2)
Получение РНК, используемой для конструирования зондов кДНК:
а) Культивирование и стимулирование моно- нуклеарных клеток периферической крови с помощью РМА, (РМА и ант-С£28), (РМА, РНА-Р и циклоспорин А) или (РМА и РНА-Р):
I (садгезивные клетки получаю! как описано выше (раздел 1.1). Г1х культивируют в течение 5 часов в колбах типа Falcon с поверхностью 175 см2 в присутствии среды RPMI, дополненной 10% плодной телячьей сыворотки (Гибко BRL -стандартное обозначение: 013-0629011), с добавлением 10 единиц пенициллина и 10 мкг стрептомицина (раствор псни- циллина/етрептомицина Гибко; стандартное обозначение: 043-05140) на 1 мл среды, также, как L- глутампна (Гибко BRL - стандартное обозначение: 043-05030) вплоть до конечной концентрации 2 ммоль. Клетки стимулирую! в течение 5 часов при
одном из следующих условиях стимуляции 1), 2), 3) и 4):
1)
в присутствии 10 нг/мл 2-миристат-З- ацетат-форбола (РМА) (Сигма, стандартное обозначение: P8I39);
2)
в присутствии 10 hi/мл РМА и 1 мкг/мл моноклонального анти-С1>£-28- антитела ( Reaclif's и Systems S.A., стандартное обозначение: ACM0280HCOS0);
3)
в присутствии 10 нг/мл РМА, 5 мкг/ мл фитогемагглютинина (РНА-Р) (сигма; стандартное обозначение: 1.8754) и 1 мкг/мл циклоспорина А (Сандоз);
4)
в присутствии 10 нг/мл РМА и 5 мкг/мл РНА-Р.
В самом деле, известно, что добавление анти- СЭ28-антитела увеличивает количество информационной РНК некоторых цитокинов, особенно 1 L-2y- IFN, ct-TNF и GMC SF, за счет повышения стабильности их информационных РНК (Lindsten Т. и др. (1989), Science, 244, 339) в Т-лимфоцитах, и что иммуносупрессор циклоспорин А ингибирует увеличение информационных РНК цитокинов, индуктируемых путем активации с помощью РМА и РНА-Р в Т-лимфоцитах ( Thompson С.В. и др., Proc. Natl, Akad. Sci, США, 86, 1333-1337).
Клетки собирают в вышеуказанных условиях стимулирования и сохраняют осадки клеток, называемые, соответственно, осадок клеток 1, осадок клеток 2, осадок клеток 3 и осадок клеток 4.
б) Получение PHK-poly А+
Из вышеуказанных осадков клеток экстрагируют РНК и фракцию polyA очищают как описано в разделе 1-2) а) и б). Таким образом получают четыре фракции PHK-poly А*, называемые, соответственно, франкции polyA'l, фракция polyA’2, фракция polyA 3 и фракция polyA 4.
3)
Получение радиомаркированных зондов кДНК:
Радиомаркироваппые (меченые радиоактивным изотопом) зонды кДНК, называемые, соответственно, зонд 1, зонд 2, зонд 3 и зонд 4, синтезируют из четырех вышеуказанных фракций РНК-polyA’, под- ютовлясмых как описывается ниже: 1 мкг РНК- polyA гибридизируют с 200 нг олиго-бТ??.^ (Фармация) в 2-3 мкл буфера следующего состава: 50 ммоль Трис-1КД, рН=7,5; и 1 ммоль ЭДТК; путем инкубации в течение 2 минут при 65°С и охлаждения вплоть до комнатной температуры. Синтез радимар- кированной кДНК осуществляют в реакционном обьеме 10 мкл буфера следующего состава: 50 ммоль Трис-HCI, рН=8,3; 5 ммоль МаСЬ; 10 ммоль дитиот- реитола. содержащего по 500 мкмоль каждого из трех дезоксинуклеотид грифосфатов dATP, dc-TP и 01 ГТР (Фармация), 10 мкмоль dCTP и 150 микрокюри а-32 P-dCTP (3000 кюри на ммоль; Амерсхам) н 40 единиц PNasine (ингибитор Rnase, Genofit). Реакцию осуществляют при 4б°С в течение 30 минут в присутствии 10-20 единиц обратной 1ранскриптазы (Genofit). За ним сишезом следует щелочной гидролиз
РНК с помощью 0,3 М раствора NaOII в конечном объеме 20 мкл в течение 30 минут при 65°С. Нейтрализуют путем добавления ЗМ уксусной кислоты. Доводят объем до 50 мкл с помощью среды ТЕ. Проводят экстракцию таким же объемом фенола с последующей второй экстракцией таким же объемом смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соответствующих пропорциях 24/1. u32-P-dCTP, не включившийся во время синтеза нити кДНК, удаляют путем эксклюзионной хроматографии на колонке с полиакриламидом РЮ (Биогель; 200-400 меш; Биорад).
Количество кДНК составляет 60-100 пг, с удельной активностью 1 х 10ч импульсов в мину- ту/мкг.
4)
Гибридизация реплик колоний бактерий с зондами кДНК:
Реплики на мембране предварительно гибриди- зуют в течение 2 часов при 42°С в буфере следующего состава: 50% формамида, 6 х SSC; 5 х раствор Denhardt; 0,1% додецилсульфата натрия и 100 мкг/мл ДНК подвергнутой обработке ультразвуком спермы лосося, добавляемой после денатурации в течение 10 минут при 100°С. Реплики на мембране гибридизи- ругсг в течение двух дней: реплику 1 с зондом I, реплику 2 с зондом 2, реплику 3 с зондом 3 и реплику 4 с зондом 4, причем эти зонды используют в концентрации 4 нг/мл в вышеуказанном буфере. 5 х Раствор Denhardt (см. Sambrook, цитировано выше) имеет следующий состав: 1 г/л Ficoll (тип 400; Фармация); поливинилпирролидон, 1 г/л; и 1 г/л бычьего сывороточного альбумина (BSA).
Предварительную гибридизацию и гибридизацию осуществляют в пробирках в печи для гибридизации (Hybaid) соответственно, с 25 мл и 10 мл буфера на мембрану.
Затем реплики на мембране промывают последовательно несколько раз в течение 15 минут при 20°С в буфере состава: 2 xSSC; 0,1% додепилсульфа- та натрия; затем два раза в течение 15 минут в растворе 0,1 x5SC, 0,1% додецилсульфа та натрия; при 55°С, после чего высушивают на бумаге Ватман ЗММ и подвергают рентгенографии на пленках Kodak XAR 5.
5)
Гибридизация со смесью олигонуклеотидов, соответствующих большинству известных ни гокипов:
Для идет ификации клонов, которые содержат комплементарные информационным РНК ДНК известных цитокинов, другую серию реплик па мембране. полученных как описано выше, i ибридизиру- ют со смесью, называемой смесью С, из 28 олию- нуклеотидов, включающих, каждый, 20 нуклеотидов, соотве1ствующих комплементарным ДНК следующих цитокинов:
Интерлейкин-1 n( Furutani Y. и др., 1985, Nucl. Ac. Res., 13, 5869-5882), Ингерлейкин-1 p(Auron Р. и др.. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7907-7911), Нпгерлейкин-2 (Degrave W. м др., 1983, EMBO J., 2, 3249-3253). Иптерлейкин-3 (Yang Y.C. и др.. Cell. 1986. 47. 3-10), Интерлейкин-4 (Yokoto T. к др.. 1986,
Proc. Ntl. Acad. Sci., 83, 5894-5898), Интерлейкин-5 (Hirano T. и др., 1986. Nature. 324, 73-75), Ингерлей- кин-6 (May L.u др.. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 8957-8961), Интерлейкин-7 (Namen Л. и uR, 1988, Nature, 333, 571-573), Ингерлейкин-8 (Matsushima К.п др.., 1988, J. Exp. Med., 167, 1883-1893), Интерлейкин-9 (Yang Y.C. и др. 989, Blood, 74, 1880-1884), TNEa (Penniea D. и др.Д984, Nature, 312, 724-729), TNFO (Gray P. и др., 1984, Nature, 312, 721-724), GCSF (Nagata S-и др.. Nature,. 1986, 319, 415-418), MCSF (Kawasaki Ей др.', 1985, Science. 230, 291-296). GMCSF (Wong G.u др.. 1985, Science, 228, 810-815), LIE (Gough N. и др., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2623-2627). Интерферон.
... и др.. 1981, Nature. 290, 20-26), Ингерферон- |31 (Taniguchi T. и др., 1980, Gene, 10, 11- 15),Интерферон-у (Gray P. и др., 1982, Nature, 295, 503-508), TGFa (Derynck R. и Др,;1984, Cell, 38, 287297), TGFpl (Derynck R.IUP., 1985, Nature. 316. 701705). bFGF (Prats Н.п др. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 1836-1840),Эритропоэтин (Jacobs К.и др., 1985, Nature, 313, 806-810). BCGF (Shanna S. и др., 1987, Science, 235, 1489-1492), MIF (Weiser W. и др., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 86, 7522-7526), MCP- 1, (Yoshimura Т.н др.. FEBS Lett., 244, 487-493), Oh- костатин-М (Malik N. и др, 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 2847-2853). EDF (Murata M. и др., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2434-2438).
Эти олигонуклеотиды, полученные с помощью синтезатора ДНК Bicseorch 8700. связывают с пероксидазой хрена ЕС 1.11.17 ( Baehrinder Mannheim; стандартное обозначение: 814-407) согласно следующему протоколу:
-
в колонке для синтеза олигонуклеотиды вводят во взаимодействие с карбонилдиимидазолом (Oldrich - 11, 553 - 3) и 1,6- диаминогексаном (Oldrich - Н 1. 169-6), согласно методу Wachter и др., 1986, Nucl. Ac. Res. 14, 7985 - 7994;
-
после удаления защитных групп оснований и расщепления носителя путем обработки аммиаком, олигонуклеотиды очищают при использовании ионообменной смолы (Quiagcn - Diagen - 500051) с обменом противоиона аммония на ион лития;
-
5' - амино-олигонуклеотиды связывают с пероксидазой хрена (Boehrinder Mannheim - 814 407) согласно методу М. Urdea и др., Nucl. Ac. Res., 1988, 16,4937-4956?
Смесь олигонуклеотидов гибридизустся примерно с 10% клонов банка.
Клопы, дающие ауторентгенографический сигнал более сильный с зондом 2, чем с зондом 1, более сильный с зондом 4, чем с зондом 1, и более сильный с зондом 4, чем с зондом 3, и не гибридизирующиеся со смесью С, частично секвснированы как описывается в разделе 4 ниже. Два из этих клонов, называемых далее клонами NC3O и NCJO-бис, таким образом сохраняются. Эти клоны содержат соответственно плазмиду, называемую pSEl-NC3O, и плазмиду, называемую pSE 1 -NC'30-бис.
РАЗДЕЛ 4:
Экспрессия информационной РНК клона НС-30 в мононуклеарных клетках периферической крови
Неадгезивные клетки (образованные в основном лимфоцитами) получают как описано в разделе 1-1) и стимулируют как описано в разделе 3-2)-а), кроме контрольных нестимулируемых клеток (условия стимулирования 0)). Информационные РНК этих клеток получают при 5 условиях стимулирования, как описано в примере 1-2)-а), и анализируют путем электрофореза на 1%-ном агарозном геле в присутствии формальдегида (Sambrook, цитировано выше) с последующим переносом на найлоновую мембрану (Hyband N’; Амерсхам) и гибридизацией согласно описанному выше протоколу.
Эту мембрану гибридизируют с радио- маркированным с помощью u-32p-dCTP зондом, получаемым из кДНК NC30 (Амерсхам) путем частичного разреза згой последней с помощью ДНКяе 1, с последующей полимеризацией с помощью фермента ДНК-полимеразы (так называемый метод "ник- трансляции” или смешения цезуры), как описывается Somnforcck и др., цитировано выше. Гибридизацию проводят при 42 °C в течение 16 часов в водной среде, содержащей 50 % формамида 1 моль NaCl, раствор 5 к Denhard и 0,1% додецилсульфата натрия. Мембраны промывают несколько раз при комнатной температуре раствором 2 х SSC, содержащим 0,1% додецилсульфата натрия, затем промывают два раза при 50 °C в течение 15 минут с помощью раствора 0,1 xSSc, содержащего 0,1% додецилсульфата натрия. Раствор 5 х Denhard имеет следующий состав: 1 г/л Ficoll (тип 400; Фармация), 1 г/л поливинилпир- ролидона и 1 г/л бычьего сывороточного альбумина. Раствор 1 х SSC содержит 0,15 моль NaCl и 0,015 моль цитата натрия.
Для нестимулироваиных клеток и для клеток, стимулированных в условиях 1), 2), 3) и 4), устанавливают ауторадиографическую полосу, соответствующую РНК длиной примерно 1.4 т.п.н, (тысячи пар нуклеотидов). Экспрессия этой РНК увеличивается в присутствии РМА (полоса интенсивности по крайней мере, в 5 раз сильнее для условия стимулирования 1), чем для условия стимулирования О)), причем это увеличение усиливается с дополнительным присутствием РНА-Р или анги-С1)28 (полосы интенсивности примерно в 5 раз сильнее для условий стимулирования 2) и 4), чем для условия стимулирования 1)) и не изменяется с дополнительным присутствием РНА-Р и циклоспорина (полосы интенсивности подобны таковым для условий стимулирования
1)
И 3)).
Также в другом эксперименте, осуществляемом с популяцией очищенных Т-лимфоцитов (до чистоты выше 95%), устанавливают экспрессию информационной РНК NC30 после совместной стимуляции с помощью РМА и aitrn-CD28.
РАЗДЕЛ 5:
Секвенирование и анализ последовательности кДНК клона NC30
1)
Секвенирование кДНК клона НС-30:
а) Получение однонитевой ДНК:
Клон МСЗОсодержит вектор pSEl, который включает кДИК между сайгами Лра] и BamHI. называемый впоследствии кДНК - NC30.
Вектор pSEl, который содержи! источник репликации фага fl, позволяет продуцировать одноните- вую ДНК путем культивирования клона NC30 в присутствии бактериофага М13К07 (Фармация; стандартное обозначение, 27-1527). следующим образом:
-
Клон НС-30 культивируют в пробирке емкостью 15 мл при перемешивании и при 37°С в 2 мл среды 2 х YT состава: 16 г/л бакготриптона. 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлорида натрия (описано Sainbrook и др„ цитировано выше), дополненной 0,001% тиамина и 100 мкг/мл ампициллина до оптической плотности при 660 нм около 0.60.
-
100 мкл этой культуры инфицируют с помощью бактериофага MI3K07 (Фармация; стандартное обозначение: 27-1524) с мультиплетностыо инфекции порядка 10, в пробирке емкостью 15 мл. Культуру перемешивают при 37°С.
-
По истечении 1 часа, добавляют 2 мл среды. Культуру
тогда инкубируют в течение примерно 16 часов при 37°С
и при перемешивании.
-
1,5 мл Культуры центрифугируют, в микропробирке, в течение? минут при 15 000 g.
-
1 мл Супернатанта переносят в микропробирку и добавляют 250 мкл 20 %-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000, содержащего 2,5 моль NaCI. Смесь инкубируют в течение 5 минут при 4 °C для облегчения осаждения фага, затем центрифугируют в течение 5 минут при 15 000 с. Супернатант удаляют и осадок фага снова суспендируют в 500 мкл буфера состава: 10 ммоль Трис- HCl.pl 1=8; 1 ммоль ЭДТК.
-
Суспензию экстрагируют один раз фенолом, насыщенным 100 ммоль Трис-HCl, рН=8, затем два раза хлороформом.
-
Препарат затем осаждают путем добавления 1/10 объема ЗМ раствора ацетата натрия, pH = 4,8, и 2,5 объема этанола. Осаждение осуществляют при - 20°С в течение минимально 20 минут. ДПК отделяют путем центрифугирования в течение 10 минут при 15 000 о, осадок после центрифугирования промывают 70%-ным раствором этанола, затем снова суспендируют в 30 мкл буфера состава: 10 ммоль Трис-11С1, 1 ммоль ЭДТК.
б) Секвенирование
Реакции секвенирования осуществляют с помощью набора для секвенирования United States Biochemical (стандартное обозначение: 70770), используя метод Sander и др. Proc. Natl. Acad. Sci., C1IIA, 1977, 14, 5463-5467. Используемыми праймерами являются олигонуклеотиды из 18 нуклеотидов, комплементарных или вектору pSEl в области непосредственно
у 5’-конца кДНК-МСЗО, пли последовательности кД 11K-NC30.
2)
Анализ последовательности кДНК-Г4С30:
Нижеприводимое описание для лучшего понимания иллюстрируется рисунками 2, 3 и 4.
1)
k/THK-NC30 включает 1282 нуклеотида и заканчивается последовательностью polyA.
2)
Это число нуклеотидов согласуется с величиной соответствующей информационной РНК (около 1,4 т.п.н.) (см Раздел 4).
3)
В положении 1264-1269 последовательности ЛАТАЛА, которая соответствует обобщающей типичной последовательности, описанной М. Birnstiel. и др., 1985, Cell, 41, 349, имеется сигнал полиаденилирования. В положениях 855-861, 872-878, 11331139 и 1152-1158 находятся последовательности из 7 нуклеотидов: ТЛТТТАТ, ТАТТТЛА, ААТТТЛТ и ТЛТТТАА, содержащие последовательность АТТТА, соответствующую консенсусному элементу (звену) нестабильности AUUUA, описанному G. Shaw и др., 1986, Cell, 46, 659-667. Комплементарная ДНК большинства известных цитокинов имеет последовательность, соответствующую этому консенсусному элементу нестабильности.
4)
Последовательность ДНК включает открытую рамку считывания для трансляции протеина из ATG в положении 15-17 вплоть до TGA в положении 453 - 455, которое соответствует терминирующему трансляцию кодону. В этой рамке считывания имеются два кодона ATG в положениях 15 - 17 и 57 - 59, способные инициировать трансляцию, соответствующие преобразованным протеинам из 146 и 132 аминокислот. Из них нуклеотидное окружение ATG в положениях 57-59 представляет собой такое, которое более всего приближается к обобщающей типичной последовательности, описанной Kozak М.. 1978, Cell, 15, 1109-1123, для инициирования трансляции в эукариогных клетках.
5)
Программное обеспечение поиска сигнального пептида, называемое ниже программное обеспечение PS. разработано заявителем по методу и сведениям, описанным Von Heijne, 1986, Nucl. Ле. Kes., 14, 483-490. Эго программное обеспечение (пакет программ) в этой рамке считывания предусматривает гидрофобную область, подобную сигнальному пептиду, и четыре вероятные сайта протеинового расщепления (гидролиза), в положениях 74-75 (между Thr и Thr), 86-87 (между Ala и Leu ), 110-111 (между Ala и Ser) и 116-117 (между Pro и Gly). Предусмафиваемый сигнальный пептид находится между одним из двух Met, способных инициировать трансляцию, и одним из этих четырех сайтов расщепления. Предусматриваемый зрелый протеин (преобразованный протеин, рещеи.тениый по месту своею сигнального пептида) включает, следовательно, последовательность из 126, 122, 114 пли 112 аминокислот.
Те же самые прогнозирования получают с помощью пакета tipotpaMM (программного обеспече
ния) UW GCG университета в Висконсине: Devereux и др. 1984, Nuel, Ac, Res. 12, 8711-8721- Версия: Поиск сигнального пептида по методу G. Неупе (ссылкаприведена выше).
Сравнение с другими известными последовательностями
Уже известная пептидная последовательность, наиболее близкая к таковой последовательности из 112 аминокислот зрелого протеина, представляет собой последовательность протеина из 132 аминокислот, выведенную из кДНК протеина Р 600 мыши, описанную К. D. Brown и др., 1989, 7, J, 1mm., 142, 679-687. Этот протеин экспрессируется (эксприми- руется) в подклассе Т-лимфонитоз мыши: клетки Т112, активированные с помощью конканавалина А.
Сравнение этих пептидных последовательностей с помощью метода Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48, 443-453, используемого в программном обеспечении UWGCG университета в Висконсине: Devereux и др., 1984, Nuel. Ac. Res., 12 8711-8721, версия GAP, показывает, что 63 аминокислоты из 112 идентичны, или гомология идентичности составляет около 56%. Этот алгоритмический метод учитывает все возможные согласования и позволяет создать согласованный ряд, представленный на рисунке 3, в котором как можно больше идентичных аминокислот подбирают под пары и число пропусков в согласованных последовательностях является минимальным.
Сравнение нуклеотидных последовательностей по этому методу показывает гомологию идентичности 70% между кодирующей последовательностью кДНК-1МС30 и кДНК протеина Р 600 мыши (см. рисунок 4).
3)
Секвенирование кДНК клона КСЗО-бнс
Секвенирование, осуществляемое как описано выше в 1), позволяет обнаружить для кДНК клона NC'30-бис такую же протеиновую последовательность, как и для клона NC30, за исключением 75-той преобразованной аминокислоты, которая представляет собой Asp, кодируемую GAC, для клона NC30 и Gly. кодируемую GGC, для клона NC'30-бис.
РАЗДЕЛ 6:
Анализ секреции в клетках COS протеина, кодируемого кДМК-ХСЗО
Клетки COS представляют собой клетки обезьяньих почек, экспримпруюшпе антиген Т вируса SV40 ( Gluzman Y. Cell, 23, 1981, 175-182). Эти клетки. которые допускают репликацию векторов, содержащих источник репликации ДНК вируса SV 40 (случай вектора pSEI), представляют собой выбранных хозяев для исследования экспрессии генов в клетках животных.
1)
Трансфехция клеток COS и транзисторная экспрессия протеина, кодируемою кДНК-НС 30:
5 х 10’’ клеток COS высевают в чашку Петри диаметром 6 см (Corning) в 5 мл модифицированной по способу Дульбекко в среде Hina, ниже называемой ДМЕМ (Гибко: стандартное обозначение: 04101965), которая содержи! 0,6 г/л 1лутамипа, 3.7 г.л
гидро карбоната натрия и дополнена плодной телячьей сывороткой (I ибко) в количестве 5%. После культивирования в течение примерно 16 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода, культуральную среду удаляют путем отсасывания и клетки промывают 3 мл буфера ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор; Гибко). После этого к ним добавляют следующую смесь: 1000 мкл из (ДМЕМ + 10% плодной телячьей сыворотки (Гибко)), 110 мкл диэтиламиноэтилдекстрана со средней молекулярной массой 500 000 (Фармация) при концентрации 2 mi/мл, 1,1 мкл 100 мМ Хлороквина (Сигма) и б мкг плазмиднои ДНК клона NC30, полученной по способу щелочного лизиса с последующей очисткой плазмиднои ДНК при использовании градиента хлорида цезия (Sambrook и др., цитировано выше). После инкубации в течение 5 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода, смесь удаляют от клеток. После этого к ним добавляют 2 мл буфера ЗФР. содержащего 10% диметилсульфоксида (качества "для спектроскопии"; Мерк). После инкубации в течение 1 минуты при комнатной температуре, смесь удаляют и клетки промывают два раза с помощью ЗФР и инкубируют в среде ДМЕМ, содержащей 2% плодной телячьей сыворотки. Инкубацию продолжают в течение 40 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода.
С другой стороны, подготавливают контрольные клетки COS , осуществляя вышеописанные операции с ДНК плазмиды pSEI.
2)
Маркировка протеинов
Совокупность вышеописанных операций осуществляют с клетками COS, трансфектированными плазмиднои ДНК клона NC30, и с клетками COS, которые являются контрольными.
Культуральную среду удаляют путем отсасывания и клетки промывают два раза по 3 мл буфера ЗФР. Добавляют 5 мл среды МЕМ (минимальная поддерживающая среда Игла) без метионина (Гибко; стандартное обозначение: 041-0190011), дополненной 3 г/мл глюкозы и 4 ммоль глутамина. Инкубируют в течение 2 часов при 37°С. Культуральную среду удаляют и добавляют 2 мл такой же среды с добавкой 200 микрокюри митнонина с ’"S (стандартное обозначение: SJ 1015. Амерсхам). Инкубируют в течение 6 часов при 37°С. Культуральную среду извлекают, центрифугируют ее в течение 5 минут дтя удаления остатков клеток и суспендированных клеток, и супернатант сохраняют.
3)
Анализ ралномаркированных протеинов трансфектированных клеток COS путем электрофореза на поликриламидном геле:
Осаждают I мл супернатанта грансфекшрован- ных клеток COS 9 мл ацетона при -20°С. Центрифугируют н рекуперируют осадки протеинов.Их обрабатывают в буфере состава: 0,125 М Трнс-НС1, рН=б,8; 4% додецилсульфата натрия, 20% глицерина; и нагревают при 100°С в течение 10 минут. Аликвотную часть полученной суспензии, соответствующую радиоактивности 200 000 импульсов в минуту, анализируют нулем электрофореза на 15%-ном полиакриламидном геле в ирисутствии додецилсульфата натрия, согласно метолу, описанному U.K. Zaenimti, Anal., Bicchein., 1977, 78, 459. Гель высушивают в вакууме. Радиомаркированные протеины обнаруживают с помощью ауторентгенографии. На ауторентгенограмме устанавливаю! наличие двух лишних полос для клеток, трансфектированных с помощью плазмпдной ДНК клона NC30, по сравнению с контрольными клетками: отчетливая полоса высокой интенсивное i n, соответствующая молекулярной массе около 9,0±kDa, и диффузная полоса слабой интенсивности, соответствующая кажущейся молекулярной массе 16,0±2 килодалыонов. Следовательно, клон NC30 кодирует секретированный протеин, называемый в дальнейшем протеином NC30. Молекулярная масса для формы протеина согласно изобретению, соответствующая около 9±2 kDa, меньше молекулярной массы, рассчитанной для зрелого протеина из 112 аминокислот и равной 12366 Da. Это различие вероятно вызвано электрофоретической мобильностью, неожиданной для этой формы протеина согласно изобре гению.
Полоса молекулярной массы около 16,0±2 kDa может соответствовать N-гликозилированной форме протеина согласно изобретению. В самом деле, она имеет четыре возможных сайта Ы-гликозилирования, подчеркнутых пунктирной линией на фиг. 2 и соответствующих обобщающей типичной последовательности, описанной Donner и др., 1987, J. Cell. Biol., 105,2665.
4)
Выявление возможного П- глмхозилировапия протеина с молекулярной массой около 16±2 kDa
Маркировку протеинов осуществляют как описано выше в 2), но в присутствии 10 мкг/мл туника- мицина (Сигма; стандартное обозначение: Т 7765), агента, ингибирующего М-гликозилирование протеинов.
Анализ протеинов на полиакриламидном геле осуществляю! как описано в 3).
На ауторентгенограмме устанавливаю! наличие одной лишней полосы 9±2 килодальтонов для клеток, трансфектированных плазмиднои ДПК клона NC30, по сравнению с кон [ рольными клетками. Эти результаты показывают, что форма рекомбинантного протеина, рассматриваемого в и. 3), которая соответствует молекулярной массе 16±2 kDa, является N- гликозилированной.
РАЗДЕЛ 7:
Продуцирование протеина NC30 в клетках COS
4,3 х 10' Клеток COS высевают в цилиндрическую качалочную колбу, называемый обычно "роллер", с поверхностью 850 см2, в 150 мл среды DMEM, которая содержит 0,6 г л глутамина, 3,7 г. л гидрокарбоната натрия и дополнена плодной телячьей сывороткой (Гибко) в количестве 5%, затем буфе- рируют диоксидом углерода.
Спустя примерно 16 часов культивирования при 37°С на качалке (скорость вращения около 0.2 оборотов в минуту), культуральную среду удаляют путем отсасывания и клетки промываю! буфером ЗФР
(забуференный фосфатом физиологический раствор). К ним затем добавляют смесь следующего состава: 35 мл среды DM ЕМ + 10% плодной телячьей сыворотки (Сигма), 4 мл диэтиламиноэтилдекстрапа (Фармация, средняя молекулярная масса 500 000) в концентрации 2 мг/мл, 40 мкл, 100 мМ Хлороксина (Сигма) и 128 мкг плазмиднои ДНК клона NC30, полученной по методу щелочного лизиса с последующей очисткой плазмиднои ДНК на градиенте хлорида цезия (Sambrook и др., цитировано выше).
После инкубации в течение 5 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода, смесь удаляют с клеток. 11осле этого к ним добавляют 35 мл буфера ЗФР. содержащего 7% диметилсульфоксида (качества "для спектроскопии", Мерк), при 4°С. После перемешивания путем вращения в течение 1 минуты 30 секунд при комнатной температуре, смесь удаляют и клетки промывают два раза с помощью ЗФР. Добавляют 150 мл среды £МЕМ (Сигма), содержащей 1% плодной телячьей сыворотки ( SVF). на роллер, и клетки инкубируют при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода (вращение со скоростью 0,2 оборота в минуту). Спустя один день после трансфекции, среду удаляют путем отсасывания, клетки промывают 2 раза с помощью ЗФР. После этого добавляют 150 мл на роллер среды DMEM (Сигма) без сыворотки и роллеры выдерживают при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода (при вращении со скоростью 0,2 оборота в минуту) в течение 5 дней.
Сбор осуществляют на 6-й день после трансфекции. Культуральную среду центрифугируют со скоростью 7000 оборотов в минуту в течние 10 минут; супернатант отфильтровывают через фильтр 0,2 мкм Nalgene.
РАЗДЕЛ 8:
Очистка протеина НС-ЗО, продуцированного в клетках COS, и определение его аминоконцевой последовательности
1)
Очистка протеина НС-ЗО
Рекомбинантный протеин с молекулярной массой около 9±2 kDa, из 500 мл полученного в разделе 7 супернатанта, очищают с помощью следующих стадий:
-
ионообменная хроматография на колонке Sfasl Пом (Фармация) (15 х 100 мм), предварительно уравновешенной с 50 мМ раствором ацетата натрия, pH = 4,0, при использовании в качестве элюирующего средства 1М раст вора NaCl в 50 мМ раствора ацетата натрия в качестве буфера, рН=4,0, с расходом 2 мл/мин;
-
элюат копиейтрируют на мембране Centriprep 10 (Амикон) вплоть до объема около 1 мл. затем подвергают хроматографии ВЭЖХ (с обратимой фазой, на колонке С4 (Bownlee) (100 х 2,1мм), предварительно уравновешенной с раствором, содержащим 30% ацетонитрила и 0.1 % ТФК. с линейным градиентом от 30 до 70% ацетонитрила в растворе, содержащем 0,1% ТФК. Фракции, содержащие рекомбинантный протеин (определяю! по электрофоретическому анализу на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), объединяют.
2)
Определение амин о концевой последовательности протеина NC30 с кажущейся молекулярной массой 9±2 kDa
Полученный в п. 1) протеин подвер1ают электрофоретическому анализу на 16%-ном акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Протеины в течение 1 часа при силе тока 0.8 мА/см2 в буфере состава: 25 мМ Трис-бората, pH = 9.0 и 10% метанола, переносят на мембрану Иммобилон (ми.т-
Gly
Pro Vai
Pro Pro Ser Thr
1
5
Glu
Leu
15
липор), затем проявляются с помощью Кумасси- синего.
Полосу с молекулярной массой около 9±2 kDa вырезают и помещают в секвенатор Applied Bicsys- tems модель 470 А, соединенный с анализатором фенилтиогидантоиновых производных Applied Bic- systems модель 120 А.
Полученная аминоконцсвая последовательность представляет собой следующую последовательность (tr0),
Ala Leu Arg Glu Leu He Glu
10~
которая соответствует четвертому сайту расщепления, предусматриваемому программным обеспечением PS (см. раздел 5 - 2).
РАЗДЕЛ 9:
Конструирование вектора экспрессии кДНК NC30 в дрожжах, плазмида pEMR 673, и трансформация штамма дрожжей с ночошью этой плазмиды:
1) Конструирование плазмиды pEMR 673
Плазмиду рЕМК 583 (описывается в европейской заявке на патент 435776) подвергают ферментативному расщеплению с помощью ферментов Hind III и Bam HI. Очистке подвергают большой фрагмент (называемый далее фрагментом А), включающий источник репликации и локус STB в 2 микрона, геи LEU 2d, ген резистентности к ампициллину, источник pBR 322, терминатор гена РОК, ген UR АЗ, искусственный промотор и начало ргёрго - области альфа-феромона.
Фрагмент Hind III и Bam Hl (называемый ниже как фрагмент В), включающий конец ргёрго-области альфа-феромона и кДНК. кодирующую зрелый протеин. фланкированный сайтом рестрикции Bam HI у З’-конца, получают путем амплификации по методу полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) из плазмиды pSt'l - NC30. Последовательность этого фрагмента представлена на фиг. 5. Фрагменты А и В лигируют для получения плазмиды pEMR 673.
а) Описание метода полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР)
Метод полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) представляет собой хорошо известный специалисту метод, который позволяет копировать одновременно две нити последовательности предварительно денатурированной ДНК, используя два олигонуклеотида в качестве праймеров (см. особенно работу Н.А. Erlich “PCR. Technology Principles and Applications for DNA amplication” опубликованную в 1989 г. издателями Macmillan Publishers Ltd., Royaume-Uni, и
CAGTGAATTC A AGC TTG GAT AAA AGA
Ser Leu Asp Lys Arg Область 1
имеет две различные области: область I, коюрая содержит конец ргерго - области альфа-феромона.
работу M.A. Innis и др. “PCR Protocols”,. Опубликованную в 1990 r.Academic Press Inc., Сан-Диего, Калифорния, 92101, США). Принцип этого метода вкратце излагается ниже.
Метод 11ЦР основан на повторении в три этапа, позволяющем получить, после 10-30 циклов, сотни тысяч копий первоначальной матрицы, с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, обычно называемой Taq - полимеразой. Эти три этапа представляют собой следующие:
-
Денатурация матрицы
Двунитевую ДНК денатурируют до одноните- вой ДНК путем инкубирования при высокой температуре (92-96°С) в течение примерно двух минут.
-
Гибридизация праймеров
Эти праймеры представляют собой пару синтетических олигонуклеотидов, которые гибридизируются с концами амплифицируемой области. Два праймера гибридизируются с противоположными нитями. Праймеры добавляют в избытке, так, чтобы благоприятствовать образованию комплекса праймер-матрица.
-Удлинение(инсерция)праймеров
Этап, в процессе которого Taq, - полимераза обеспечивает удлинение комплекса праймер-матрица от З’-конца к З’-концу, осуществляют при 72°С.
В методе ПЦР, целевой продукт появляется в третьем цикле и тоща он в значительной степени амплифицирован. В процессе раскрытия циклов, продукт амплификации быстро становится матрицей, с которой гибридизируются праймеры.
б) Описание используемых праймеров
11олучают два синтетических олигонуклеотида. Первый олигонуклео! ид, называемый праймером 1, последовательность которого следующая:
ТСС’ СС/\ GGC ССТ GTG ССТ СС
Ser Pro Gly Pro Vai Pro
Облает ь 2
модифицированной по сравнению с природной последовательностью, описанной Kurjan и др., 1082,
Cell, 30, 933-943, путем молчащей мутации, которая позволяет вводить сайт расщепления Hiod щ точно перед кодирующей частью области 1 (одиннадцатый нуклеотид области 1); и область 2, которая является областью, предназначенной для гибридизации с кодирующей областью, соответствующей началу зрелого протеина из 114 аминокислот (см. раздел 5), некодирующей нити кДНК NC30.
Второй олигонуклеотид, называемый праймером -2, последовательность которого является следующей:
CGACGGATCC CAAATAATGA TGCTTTCGAA G область I область 2
также состоит из двух различных областей: область 1, которая в четвертом нуклеотиде содержит сайт BamHI, и область 2, которая включает нуклеотидную последовательность, соответствующую непреобразо- ванной 3' -области кДНК NC30. Эта область предназначена для гибридизации с кодирующей нитью кДНК NC30.
в) Получение амплифицированного фрагмента Hind III - Bam Hi, представляющего собой конец ргёрго-област и о( -феромона и кДНК, кодирующую зрелый протеин NC30
В качестве матрицы используют плазмиду pSEI
-
NC30, которая включает кДНК, кодирующую протеин NC30.
В пробирку вносят 100 нг плазмиды pSEI - NC30, 100 нг праймера 1, 100 нг праймера 2,5 мкл концентрированной в 10 раз реакционной смеси (конечная концентрация: 67 ммоль Трис-1 ICI, р] 1=8,8; 1,6 ммоль сульфата аммония; 1 ммоль А- меркапто этанола; 6,7 ммоль ЭДТК; 0,15% Тритон х 100; 2 ммоль хлорида магния; 0,2 ммоль dNTP; 200 нг желатины); объем смеси затем доводят до 50 мкл пу гем добавления воды.
Добавляют 0,5 мкл, или 2,5 единицы, полимеразы Taq (Boehringer Mannheim, стандартное обозначение: 1146-173). После этого смесь покрывают парафином, чтобы избежать испарения водного раствора.
Амплификацию проводят в течение 15 реакционных циклов, со следующими стадиями одного цикла:
-
1 минута при 94°С - денатурация
-
1 минута при 55°С - гибридизация
-
I минула при 72°С - полимеризация.
После 15 циклов ферментативную реакцию прекращают пуз ем доба.тения 20 ммоль ЭДТК.
Таким образом амплифицированный фрагмент ДНК. который имеет ожидаемую величину примерно из 380 пар оснований, затем очищают на 1%-ном агарозном геле, подвергаю! диализу с хроматографированием на колонке из полиакриламидного толя Р 10 (Фармация), затем полностью и одновременно гидролизуют с помощью ферментов Hind III и Bam 111, согласно обычным, хороню известным специалисту способам ( Sombrcck. 1983). чтобы получить когезивные концы Hind 111 и Bam 111. После inipo.in- за фрагмент очищают па колонке 1’ 10.
Последовательность полученного фрагмента В представлена на рисунке 5, Она включает в своей, кодирующей протеин NC30. части молчащую по отношению к кДНК NC30 мутацию, указанную с помощью звездочки на рисунке 5. Фрагменты А и В лигируют с целью получения плазмиды pEMR 673.
2)
Трансформация штамма дрожжей ЕМУ 761 с помощью плазмиды pEMR 673 и экспрессия протеина NC30 трансформированным штаммом
Штамм ЕМУ a-Mal, Leu 2, ura 3, his 2), описанный в европейском патенте 0408461 и который может быть получен путем удаления плазмиды из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов 27 декабря 1989 г. под номером 1 - 1021, содержит мутации (leu 2 и ига 3), которые могут быть комплементированы маркером дефективной (неполной) селекции LEU2d и маркером селекции UR АЗ, присутствующими в плазмиде pEMR 673. Штамм трансформируют с помощью плазмиды pEMS 673 при селекции для прототрофии лейцина согласно варианту способа трансформации, описанного Beggs и др. (Beggs и др., 1978, Nature, 275, 104-109), который заключается в том, что дрожжи подвергают протопластизирующей обработке в присутствии осмотического стабилизатора, сорбитола, в концентрации 1 моль.
Краткое изложение протокола трансформации приводится ниже:
a)
200 мл жидкой среды YPG (см. таблицу 1 ниже) инокулируют с помощью примерно 5 х 10h клеток культуры в стационарной фазе и таким образом инокулированную культуру оставляют на ночь при перемешивании при 30°С;
b)
когда культура достигает примерно 10 клеток на мл, то клетки центрифугируют в течение 5 минут со скоростью 4000 оборотов в минуту и осадок после центрифугирования промывают IМ раствором сорбитола;
c)
клетки суспендируют в 5 мл 1М раствора сорбитола, содержащего 25 ммоль ЭДТК и 50 ммоль дитиотреитола, и инкубируют в течение К) минут при 30°С;
d)
клетки промывают один раз с помощью К) мл 1М раствора сорбитола и суспендируют в 20 мл раствора сорбитола. Добавляют зимолазу-100Т (препарат, выпускаемый в продажу фирмой Seykagaku Kogya со. Ltd., который получают путем частичной очистки на аффинной колонке супернатанта культуры Atlirobacter luteus и который содержит |3-1,3- г люканаза-ламинарипентагидролазу) в конечной концентрации 20 мкл/мл и суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение примерно 15 минут;
с) клетки снова суспендируют в 20 мл среды, содержащей сорбитол и называемой YI’G-сорбитол (см. таблицу I ниже), и инкубируют в течение 20 минут при ЗО°С н при умеренной перемешивании;
f)
центрифугируют в течение 3 минут со скоростью 2500 оборотов в минуту;
g)
клетки снова суспендируют в 9 мл буфера для трансформации следующего состава: I М сорбитола'10 мМ Трис-HCl, рН=7,5; и 10 мМ хлорида кальция;
И) берут 0,1 мл клеток и 5 мкл раствора ДИК (около 5 мкг) и полученную суспензию оставляют стоять в течение 10-15 минут при комнатной температуре;
i)
добавляют 1 мл раствора следующего состава: 20% ПЭГ (полиэтиленгликоля) 4000, 10 мМ Трис-HCl, pl 1=7,5; и 10 мМ хлорида кальция;
j) 0,1 мл полученной в п. i) суспензии вносят в пробирку, содержащую твердую регенерационную среду без лейцина (см. таблицу 1 ниже), предварительно расплавленную и поддерживаемую в жидком состоянии примерно при 45°С. Суспензию выливают в чашку Петри, содержащую затвердевший слой из 15 мл твердой регенерационной среды без лейцина.
Трансформанты начинают появляться по истечении трех дней. Таким образом получают трансформант, называемый штамм ЕМУ761 pEMR 673.
Таблица 1
Состав и приготовление основных сред, используемых
в протоколе трансформация штамма дрожжей ЕМУ 761
-
жидкая среда YPQ:
10 г дрожжевого экстракта (Bacto- Yeast- экстракт, Дифко)
20 г пептона (бакто-пептон, Дифко)
20 г глюкозы;
смешать ингредиенты в дистиллированной воде; дополнить до конечного объема 1 л с помощью дистиллированной воды; автоклавировать в течение 15 минут при 120°С.
-
среда УРСсорбитол:
использовать состав жидкой среды yPG: к которой, после автоклавирования, добавляют сорбитол в концентрации 1 моль.
-твердая регенерационная среда без лейцина:
6,7 г азотистого основания дрожжей без аминокислот (Дифко);
20 мг аденина
20 мг урацила
20 мг L-трипгофаиа
20 мг L-гист идина
20 мг L-api инина
20 мг L-mci нонина
30 мг L-тирозина
30 мг L-изолейцина
30 мг L-лизина
50 мг L-фенилаланина
100 мг L-глутаминовой кислоты
150 мг L-валина
20 г глюкозы
30 г агара
182 г сорбитола;
смешать все ингредиенты в дистиллированной воде; дополнпгель объем до 1л с помощью дистиллированной воды; автоклавировать в |счение 15 mhhvi
при 120°С; после автоклавирования добавить 200 мг L-треонила и 100 мг L-аспарагиповой кислоты.
РАЗДЕЛ 10:
Экспрессия в эрленмейере протеина NC30 трансформированным штаммом дрожжей и обнаружение протеина в культуральной среде на полиакриламидном геле в присутствии додепилсульфата натрия
1)
Культивирование штамма EMY761 pEMR 673
Колонию штамма EMY761 pEMR 673 (получен в Разделе 9) культивируют в 50 мл жидкой среды без урацила. Эта среда содержит на литр:
6,7 г азотистого основания дрожжей без аминокислот (Дифко)
-
5,0 г казеинового гидролизата (казаминокис- лоты, Дифко)
-
10 г глюкозы.
После перемешивания в течение ночи при 30°С, культуру центрифугируют в течение 10 минут, осадок после центрифугирования обрабатывают с помощью 10 мл стерильной воды и снова центрифугируют в течение 10 минут. Экспрессию протеина NC30 индуктируют, активизируя клетки в 50 мл среды следующего состава:
-
6,7 г/л азотистого основания дрожжей без аминокислот (Дифко)
-
5. 0 г/л казеинового гидролизата (казаминокисло- ты, Дифко)
-
30,0 г/л глицерина
-
30,0 г/л галактозы
-
10 мл/л этанола.
Культивируют в течение 24 часов при перемешивании и при 30°С.
2)
Анализ экспрессированного протеина:
а) полиакриламидный гель в присутствии додепилсульфата натрия Подготовка образцов:
Часть клеток, культивированных в течение 1 ночи в среде, называемой жидкой средой без урацила, с глюкозой, состав которой конкретно приводится ниже в таблице 2, центрифугируют: неиндуктпро- ванный образец. Клетки, культивированные в течение 1 ночи в среде, называемой жидкой средой без урацила, с этанолом, глицерином и галактозой (таблица 2 ниже), центрифугируют: индуктированный образец. Супернатат собирают. К К) мл супернатанта добавляют 5 мл 50%-ной трих.торуксусной кислоты, содержащей 2 мг. мл дезоксихолята.
Смесь выдерживают в течение 30 минут при температуре +4°С, затем центрифугируют в течение 30 минут. Осадок после центрифугирования обрабатывают примерно 1 мл охлажденного ацетона (+4°С) и снова цетрифугпруюг в течение 30 минут. Осадок. после высушивания, обрабатывают примерно 20 мкл буфера, называемого заполняющим буфером (tampon de chage), который состоит из 0,125 М Трис- HCl, рН=б,8; 4% додепилсульфата натрия. 0.002% бромфенолового синего, 20% глицерина. 10% |3- меркапionанола, согласно протоколу, описанному Лэммли в 1970 г, что хорошо известно специалисту. Осадок растворяют путем кипячения в течение 15 минут, затем нейтрализую!.
Образцы помешают на акриламидный гель в присут ствии додецилсульфа га натрия и подвергают электрофорезу.
Результаты:
Анализ геля (обнаружение по Кумасси-синсму) для индуктированного образца показывает присутствие нескольких дополнительных полос (зон) по сравнению с неиндуктпровапным образом, из которых два основных соответствуют молекулярной массе 9±2 и 16±2 kDa. Другие наблюдаемые дополнительные полосы, которые довольно многочисленнны и диффузны, вероятно соответствуют изменяемой степени гликозилирования.
Известно, что N-гликозилирование протеина дрожжами включает простое N-гликозилирование ("сердцевинное гликозилирование") в эндоплазматической сети и N-гипергликозилирование ("виецепо- чечное гликозилирование'1) в аппарате Гольджи R.A. Hitzenian и др., 1990, “Metods in Enzimology № 185, Academic Press c. 421-440). Вообще, простое N- гликозилирование приводит к гликопротеину с однородной кажущейся массой (одна полоса), a N- гипергликозилирование приводит к гликопротеину с неоднородной кажущейся молекулярной массой (множество диффузных полос).
б) Иммуноимприитинт (вестерн- блотирование) с возможной обработкой эндогликозидазой Н
Приготовление образцов
Часть клеток, культивированных в течение ночи в жидкой среде без урацила, с глюкозой (таблица 2), центрифугируют: пеиндуктированный образец.
Клетки, культивированные в течение ночи в жидкой среде без урацила, с этанолом, глицерином и галактозой (таблица 2). центрифугируют, индуктированный образец. Супернатант собирают. К 10 мл супернатанта добавляют' 5 мл 50%-ной грихлоруксуспой кислоты, содержащей 2 мт/мл дезоксихолята.
Смесь выдерживаю! при темпера гуре +4°С в течение 30 минут, затем центрифугируют в течение 30 минут. Осадок после центрифугирования обрабатывают примерно 1 мл охлажденного ацетона (э 4°С) и снова центрифугируют в течение 30 минут. Осадок после центрифугирования обрабатывают 20 мкл растворяющего буфера (состава: Трис-HCI с рН=6,8, 10 ммоль; 2% & -рмеркаптоэтанола; 1% додсцплсульфата натрия). Осадок выдерживают при Ю0°С в течение 5 минут.
Образец затем делят на две част и:
-
к первой части, равной 10 мкл, добавляют 10 мкл 50 мМ натрийцш ратного буфера с рН= 5,5, содержащего эндоглпкозидазу II (5mUI : Bcehringcr стандартноеобозпачение: 1088726). Образец выдерживают при 37°С в течение примерно ночи. 3aie\i добавляют 20 мкл заполняющего буфера;
-
ко второй части, равной 10 мкл, добавляют 10 мкл заполняющего буфера. Образцы кипятят в течение 10 минут. Образцы помешают на полиакриламидный
гель в присутствии додецилсульфата натрия и осуществляют электрофорез согласно протоколу Лэммли (ссылка приведена выше). Содержащиеся в геле протеины затем переносят на нитроцеллюлозную мембрану (согласно способу 11. Towbin и др., 1979,Proc. Natl. Acad. Sei., США. 76, 4350-4354). Иммунодетектировпие, осуществляемое согласно протоколу, описанному в наборе для анализа путем иммуно-блотирования фирмы Био-Рад (стандартное обозначение: 170-6450), включает следующие стадии:
-
насыщение нитроцеллюлозной мембраны буфером ЗТР ("трис-забуференный физиологический раствор"), который содержит 3 г/100 мл желатины, в течение 30 минут;
-
промывка мембраны с помощью буфера, называемого ЗТТР (буфер ЗТР, который содержит 0,05% Твина 20), два раза в течение 5 минут;
-
введение в контакт мембраны с иммуносывороткой. приготовленной в разделе 13, в течение 1 часа при комнатной температуре;
-
промывка мембраны с помощью буфера ЗТТР,
два раза
в течение 5 минут;
-
введение в контакт мембраны с конъюгируемым антителом из набора;
-
промывка мембраны с помощью буфера ЗТТР два раза в течение 5 минут и один раз в течение 5 минут с помощью буфера ЗТР;
-
комплекс антиген-антитело обнаруживают путем введения в контакт мембраны с проявляющим буфером, содержим 5-бром-4-хлор-3-индолил- фосфаг (ВС 1Р) и нигротетразолиевый синий (NBT);
-
промывка мембраны водой.
Результаты:
Анализ путем вестерн-блотирования для индуцированного, необработанного эндогликозидазой Н, образца показывает наличие нескольких дополнительных полос (зон) по сравнению с неиндуктиро- ванным образцом две основные полосы которого соответс 1 вуют молекулярной массе около 9±2 и 16±2 K,Da. Также обнаруживают другие многочисленные и диффузные полосы с более высокой молекулярной массой. Все эти полосы распознают с помощью иммуносыворотки, приготовленной в разделе 13.
В индуктированном образце полоса, соответствующая молекулярной массе около 16±2 kDa имеет тенденцию к исчезновению после обработки эндогликозидазой И, тогда как полоса с массой 9±2 кнлодалыонов увеличивается гю интенсивности в тех же условиях. Эти результаты показывают, что протеин с молекулярной массой около 16 ±2 к а является N-гликозилировапным.
Диффузные полосы с более высокой молекулярной массой также исчезают и замечают появление двух полос, соответствующих молекулярным массам около 18 ± 2 и 20 ± 2 kDa. Формы протеина NC30, устойчивые к обработке эндогликозидазой Н, могут соответствовать предшественнику, сохраняющему pro-последовательность феромона. или 0I ликозилировапным формам протеина NC30.
Таблица 2
Состав и приготовление некоторых сред, используемых для получения образцов
-
жидкая среда без уранила, с глюкозой
-6,7 г азотистого основания дрожжей без аминокислот (Дифко)
-
5,0 г казеинового гидролизата (казаминокис- лоты, Дифко)
-
10.0 г глюкозы;
смешать все ингредиенты в дистиллированной воде и дополнить среду до конечного объема 1 л с помощью дистиллированной воды; автоклавировать в течение 10 минут при 120°С;
-
жидкая среда безурацила, с этанолом, глицерином и галактозой:
использовать состав жидкой среды без урацила, описанный выше, но без глюкозы. После автоклавирования добавить 10 мл 100%-ного этанола. 30 г глицерина и 30 г галактозы.
РАЗДЕЛ II:
Продуцирование протеина NC30 в ферментере с помошью штамма Е1МУ761 pEMR 673
Культивирование штамма ЕМУ761 pEMR 673 осуществляют в ферментере следующим образом:
а) Фаза предкультивирования в конической колбе с перегородками
Исходя из 1 мл культуральной суспензии, содержащей 20% глицерина, вышеуказанного штамма с числом клеток, соответствующим оптической плотности 3 для X = 600 нм (на спектрографе Коп- трон), засевает коническую колбу с перегородками емкостью 500 мл, содержащую 90 мл полусинтети- ческой среды для выращивания автоклавируемом фазы (МСНРА), дополненные 1,28 г буфера МЭС - на основе 2-(1Ч-морфолино) этансульфокислоты- (М 8250, Сигма), и 10 мл полусинтегической среды для выращивания отфильтровываемой фазы (MCHPF). Химические составы и способ приготовления сред МСНРА и МСПРҒ приводятся конкретно ниже. После
инкубации с течение 24 часов при перемешивании при 30°С оптическая плотность культуры при >,= 600 нм составляет около 7.
б) Фаза рос ia в фермен тере
Вышеуказанную культуру используют для засевания ферментера емкостью 2,5 л, предварительно заполненного 800 мл среды МСНРА и 100 мл среды MCHPF.
рИ-Значение культуры в ферментере устанавливают 5.5. Точно также давление кислорода поддерживают выше 4 000 На (30 мм. рт.ст.) путем регулирования перемешивания. Первоначально расход воздуха устанавливают равным 1 л/мин., или около 1 объема на один объем в минуту, затем, в зависимости от потребностей, ступенчато увеличивают.
После культивирования в течение 6-7 часов при 30°С, добавляют, равномерно и в течение 9 часов, 72 мл раствора глюкозы с концентрацией 500 г/л. или в целом 36 г глюкозы.
в) Фаза экспрессии в ферментере
К вьшеописанной смеси добавляют 100 мл по- лусинтетической среды для экспрессии автоклавируемой фазы (МЕНРА) и 100 мл полусинтетической среды для экспрессии отфильтровываемой фазы (MEHPF), химические составы и способ приготовления которых указываются конкретно ниже. Культивирование затем продолжают в течение примерно 5 часов без всякой добавки. За концентрациями грех источников углерода (глицерин, галактоза, этанол) следят с помощью ВЭЖХ и дополняют путем стерильных инъекций, чтобы соблюдать следующие значения:
15 г/л глицерина, 15 г/л этанола. 7,5 г/л галактозы.
Спустя 23-24 часа и при индукции, достигают оптической плотности при 7. = 600 нм, близкой к 90. и культивирование ^прекращают.
Культуральную суспензию затем центрифугируют с ускорением 11 500 g в точение 30 минут. Осадок клеток дрожжей удаляют, сохраняемый супернатант замораживают при -80°С.
Химический состав сред для выращивания и экспрессии
- Полусинтетичсская среда для выращивания автоклавируемой фазы ’’МСНРА"
В расчёте на конечный объём 800 мл (со сверхчистой водой)
НТК (нитрилуксусная кислота)
1г
K2SO4
I г
хлорид нагрия
0.5 г
MgS04- 711 ?0
1.0
СаС1:-7Н:()
700 mi
глутаминовая кислота
3.7 г
HY-CASE SF(Shef'field Product )
25 г
лейцин
1.8 1
гистидин 500 мг
метионин I г
микроэлементы типа 1-5 (см. ниже) 5 мл
п, „и с с Автоклавировать в течение 20 минут при
Довести до pH = 5.Э с помощью концентри- ро°С Н
рованной серной кислоты или концентрированного
раствора гидроксида калия.
-Перечень микроэлементов типа I-_5
В расчете на конечный объем 1 литр
(со сверхчистой водой)
сульфат меди
CuSOj- 5Н2О
780 s
борная кислот а
Н,ВО,
5 г
сульфат цинка
ZnSO4- 7Н2О
3 г
иод ид калия
К1
1 г
сульфат марганца
MnSO4- 2Н:О
3,5 г
молибдат натрия
Na2MoO4-2H2O
2 г
хлорид железа
FeCly 6110
4,8 г
Добавить к раствору 100 мл концентрированной соляной кислоты. Долить до 1 000 мл.
- Полусин гетическая среда для выращивания отфильтровываемой фазы "MCHPF"
В расчете на конечный объем
100 мл (со сверхчистой водой)
К112РО4
4 г
триптофан
350 мг
витамины типа 1-S (см. ниже)
1 мл
глюкоза
15 г
Нагревать для растворения, разбавлять, добавлять витамины типа 1 - S и стерилизовать путем фильтрации через мембрану 0,2 мкм.
- Перечень витаминов типа 1 -_S
В расчете на конечный объем 100 мл
(со сверхчистой водой)
биотин
5 мг
фолиевая кислота
4 мг
ниацин
б мг
(пиридоксин-никотиновая кислота ПС 1)
250 мг
тиамин. НО
1 г
пантотенат кальция
5 г
М-111 юситол
10 т
После рас творения дополни ть до объема 100 мл.
С|срилыю фильтровать на холоду через мембрану
0,2 мкм. Хранить при температуре +Ч°С.
О1олусинтетическая среда для экспрессии автоклавируемой фазы "МЕНРА"
| В расчете па 400 мл (со сверхчистой водой)
НТК 1 г
K2SO4 1.74 г
глутаминовая кислота 1,8 г
HY-C’ASE SF (Sheffield Products ) 500 мт
лейцин I т
гистидин метионин триптофан' 350 мт
MgSO3-2H2O 6()0 мг
микроэлементы типа I -S (см. выше)________________5 мл___________________________________
раствора гидроксида калия. Автоклавировать в гече- Довести pH до 5,5 с помощью коицеигриро- ние 20 минут при темпера type 120°( .
ванной серной кислоты или концентрированного
-Полусинтетическая среда для экспрессии отфильтровываемой фазы "MEHPF"
В расчете на конечный объем 100 мл (со сверхчистой водой)
КН2РО4
2 г
триптофан
350 мг
витамины типа 1-S (см. выше)
1 мл
глицерин
15 г
этанол
15 г
галактоза
7,5 г
Нагревать для растворения, разбавлять, добавлять витамины и стерилизовать путем фильтрации через мембрану 0,2 мкм.
г) Анализ продуцированного протеина Образцы готовят способом, аналогичным таковому, описанному в Разделе 10, и подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Наблюдают распределение полос (зон) на геле, идентичное таковому, наблюдаемому в Разделе 10 для индуктированного образца.
РАЗДЕЛ 12:
Очистка продуцированного в дрожжах протеина NC30 и определение его аминоконцевой последовательности и его пептидной карты
Очистка двух мажоритарных форм протеина NC30
Выделяют две мажоритарные формы рекомбинантного протеина дрожжей, полосы которых соответствуют молекулярным массам, после электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, составляют около 9±2 и 16±2 kDa и очищают, исходя из 500 мл супернатанта, полученного в Разделе 11 .согласно следующему методу: Осуществляют последовательно несколько стадий:
-
ионообменная хроматография на колонке Q last flow, (Фармация) (5x5 см), предварительно уравновешенной с 50 мМ раствором ацетата натрия, рН=4,0. Расход: 1 мл/мин. pl 1-значение супернатанта предварительно доводят до 4,0. В этих условиях работы протеин не фиксируется на геле;
-
ионообменная хроматография на колонке Q fast llow (Фармация) (5x4 см), предварительно уравновешенной с 50 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,0, при использовании в качестве элюирующего средства 1М раствора хлорида натрия в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН=4,0. Расход: I мл/мпн.: - элюат концентрируют на мембране УМ5 (Ампкон) вплоть до объема около 2 мл. зшем вносят в колонку для ie.'ib-фи.тьтрации АСА 54 (IBP) (100 х 1,5 см),
уравновешенную в 0.1 М фосфатном буфере, содержащем 0,14 М ИаС1; расход: 0,2 мл/мин. Фракции, содержащие рекомбинантный протеин (определяют путем электрофоретического анализа на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) объединяют.
Таким образом полученный раствор подвергают электрофоретическому анализу на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и проявляют ни гратом серебра. Наблюдают две мажоритарные формы протеина NC30, соответствующие молекулярным массам около 9±2 и 16±2 KDa, со степенью чистоты выше 70%. Этот раствор используют в нижеописанных тестах на биологическую активность.
В другом эксперимен ге, в этот протокол (методику) очистки вводят стадию ВЭЖХ с обратимой фазой на колонке С4 ( Brownlee. ) при использовании в качестве элюирующего средства линейного градиента от 30 до 70% ацетонитрила в 0,1%-ном растворе ТФК (трифгоруксусная кислота), что позволят получать продукт, имеющий степень чистоты выше 90% (оценивают путем электрофоретического анализа на полиакриламидном геле в присутствии доле- цплсульфата натрия и проявляют нитратом серебра).
2) Определение аминоконцевой последовательности двух мажоритарных форм iipoTenna_NC30:
Очищенный протеин подвергают электрофорезу на 16%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфаза натрия. Протеины геля переносят на мембрану Иммобилон (миллипор), при 0,8 мА/см2, в течение 1 часа в буфере состава: 25 мМ грис-бората, pl 1=9,0, и 10% метанола.
Две полосы, соответствующие молекулярным массам около 9±2kDa. и 16±2 kDa, вырезают и помешают в секвенатор Applied Biosyslenis модель 470 А, соединенный с анализатором фснилтиогидаптои- новых производных Applied Biosystems модель 120 А.
Эти две полосы имеют одну и ту же аминоконцевую последовательноеiь (tri):
Ser Pro Glv Pro Va! Pro I ’ 5
которая является ожидаемой аминоконцевой последовательностью: последовательность зрелого протеина из 114 аминокислот (см. фиг. 2), описанная в Разделе 5, кодирующую последовательность которого вводят в вектор pEMR 673, описанный в Разделе 9.
3)
Определение пептидной карты формы протеина NC30 с молекулярной массой около 9±2 kDa
1 [рогеин с молекулярной массой около 9±2 kDa расщепляют в геле с помощью свиного трипсина и пептиды разделяют с помощью ВЭЖХ с обратимой фазо('1 в следующих условиях:
Полученный в Разделе 11 супернатант дрожжей осаждают с помощью трихлоруксусной кислоты и преципитат, после растворения при 100°С в буфере, содержащем додецилсульфат натрия, подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле. Протеины геля проявляют с помощью Кумасси-синего. Из геля вырезают полосу с молекулярной массой около 9±2 kDa и гидролизуют с помощью свиного трипсина в геле согласно методу, описанному в статье .1. Rosenfeld и др., находится в процессе публикации "In gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one or two dimensional gel electrphoresis”.
Затем трипсиновые пептиды разделяют путем ВЭЖХ обратимой фазой на колонке Altex С 18 (0,21 х 25 см) Бекмана с градиентом от I до 70% ацетонитрила в 0,1%-ном растворе ТФК в течение 60 минут. Пики определяют путем измерения оптической плотности при 218 нм.
Две фракции, соответствующие, каждая, одному пику, называемые ниже первая фракция и вторая фракция, анализируют с помощью секвенатора модель 470 А. как указано выше.
Полученные аминокислотные последовательности представляют собой следующие:
-
для первой фракции:. Vai Ser Ala Gly Gin Phe Ser Ser Leu His Vai, которая соответствует аминокислотам 108 - 118 преобразованного (traduite) протеина RC'30 (см. рисунок 2);
-
для второй фракции: Ser Pro Glv Pro Vai Pro Pro Ser Thr Ala Leu и LyS Leu Phe, которые соответствуют. соответственно, аминокислотам 33-43 и 138140 преобразованного протеина NC’30 (см. рисунок 2).
РАЗДЕЛ 13: Цитоплазматическая экспрессия протеина А/С 30 в E.colt и приготовление им.му носы воротки
1) I (итоилазматическая экспрессия протеина NC30 в Ec.coli:
Экспрессирующий вектор зрелого протеина NC30 из 112 аминокислот, метиопилированпого в E.coli. называемый pSE714.12, конщрупруют путем вставки в открытый в сайтах Ndei и Bamlii вектор рЕТЗа фрагмент ДПК, содержащего часть кДНК
Pro Ser Thr Ala Leu
10
NC30. Этот экспрессирующий вектор включает от 5'- конца к З’-концу:
-
промотор РНК-полимеразы фага Т7, содержащийся в плазмиде рЕТЗа, описанной Rosenberg и. др.. Gene, 56. 125-135;
-часть кДНК NC30, которая кодирует зрелый протеин из 112 аминокислот (см.Раздел 5), предшествующий ATG- инициатору трансляции;
-
герминатор гена 10 фага Т7 (Studier и др., 1986, J. Mol, Biol, 189, 113-130).
Эта кассета экспрессии функционирует только в присутствии специфической РНК-пол и меразы фага Т7. Следовательно, нужно синтезировать эту РНК- полимеразу в штамме - хозяине E.coli. Кассету экспрессии этой РНК-полимеразы конструируют, ставя кодирующую этот фермент последовательность (клонированную в ДНК лямбда-фага СЕ6, согласно Studier и др., 1986, Y.Mol. Biol, 189, 113-130) в зависимость от промотора PR лямбда-фага. Эта кассета экспрессии также включает аллель Cl (С 1857), кодирующий термочувствительную форму репрессора этого промотора PR, (Р. Leplatois и др., 1983, Bio- chimie. 65, 317-324). Следовательно, при низкой температуре, кассета экспрессии ДНК-полимеразы подавляется, при высокой температуре экспрессия не подавляется. Эту кассету экспрессии клонируют в векторе интеграции pEJL407, происходящем от пли- замид N. Kjeckner (1984, Gene, 32, 369-379). Полученный вектор представляет собой плазмиду pEMR 648. Этот вектор поддерживается в эписомическом состоянии в клетке, но он вызывает интеграцию одной или нескольких копий кассеты экспрессии полимеразы (включая туда репрессор CI), когда индуктируют транспозицию с помощью II’TG (изопропил-р- тио-галактозид). Транспозаза, ответственная за эту интеграцию, находится под контролем гена lac I, но сама она не преобразуется, что позволяет получать стабильные интегранты после удаления плазмиды. Трансформируя штамм E.coli К12НВ101 (Гибко BRL, стандартное обозначение: 8260 SA) с помощью pF.MR. 648, затем вызывая процессы (события) интеграции на трансформантах, получают производное НВ101. называемое VG112, которое включает 2 кассеты экспрессии полимеразы фага Т7 под контролем термочувствительной системы PL-CI, iihtciрирован- ные в хромосому. Штамм VG-112 E.colt очищают от плазмиды pEMR 64 8 и трансформирую!, при низкой температуре (30°С), с помощью плазмиды pl MR 714.
Полученный трансформант, называемый штаммом VG-112 pSE.714.l2. и депонированный в Национальной коллекции микроорганизмов 20 декабря 1991 г. под номером 1-1162, культивируют в среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкт /мл, при ЗО°С вплоть до оптической плотности при 600 нм, равной 1. Затем экспрессию гена полимеразы индуктируют с помощью IPTG при 41°С в
течение 2 часов. Анализ всего клеточного экстракта на денатурирующем полиакриламидном геле позволяет выявить протеин в 9 килодальтонов, соответствующий лишней полосе, по сравнению с выделенным и не трансформированным штаммом VG112 (контрольный штамм). Лизис клеток путем обработки ультразвуком с последующим центрифугированием позволяет разделить клеточный экстракт на 2 фракции: растворимую фракцию (супернатант) и нерастворимую фракцию (осадок). Протеин NC30 находится с протеинами нерастворимой фракции и составляет около 90% масс, протеинов этой фракции.
2) Приготовление иммуиосыворотки, распознающей протеин NC30
Эту нерастворимую фракцию используют для иммунизации кролика (самец весом около 2 кг, Новая Зеландия). Иммунизации осуществляют все 15 дней согласно протоколу, описанному Vaitukaitis, 1981, Methods in Eiizymology, 73, 46. Для первой инъекции, один объем раствора антигена эмульгируют в одном объеме полного стимулятора Freund (Сигма; стандартное обозначение: 4258). Шесть повторений осуществляют путем введения неполного стимулятора Freund (Сигма, стандартное обозначение: 5506).
Полученная иммуносыворотка способна распознавать протеин NC30, продуцируемый дрожжами и клетками COS путем иммунодетектирования после электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
а) Характеризация протеина NC30 с помощью пептидной карты
Полученную в п. 1) нерастворимую фракцию подвергают электрофорезу на полиакриламидное геле в присутствии додецилсульфата натрия. Протеины геля обнаруживают путем окрашивания Ку- масси-синим. Полосы, соответствующую кажущейся молекулярной массе 9±2 килодальтон, вырезают из геля и гидролизуют с помощью свиного трипсина в геле и трипсиновые пептиды разделяют как описано в Разделе 12-3).
Соответствующую пику фракцию анализируют с помощью секвенатора Applied Biosystems, модель 470А.
Полученная аминоконцевая последовательность является следующей:
Vai Ser Ala Glv Cln Phc Ser Ser Leu N Vai Arg,
в которых N обозначает не определенную аминокислоту.
Эта последовательность соответствует аминокислотам 108-119 преобразованного проз сипа NC30 (см. фиг. 2) и пептиду первой фракции, проанализированному в Разделе 12.
РАЗДЕЛ 14:
Выявление для протеина \'СЗ() ши и- бнруюшей активноеги в отношении продуцирования информационных РНК IL-1 р и IL-6 моноцитами периферической
крови,стимулированными ДПС
1) Используемый метод
а) Подготовка клеток
Из аликвоты (une poche ) периферической крови (предварительно отобранной у здоровых доноров в центре переливания крови) удаляют большую часть эритроцитов путем седиментации при 37°С в течение 30 мин в среде, содержащей 0,6% декстрана и 0,09% хлорида натрия. Затем клетки помещают поверх слоя Ficoll-Paque (Фармация) и центрифугируют при 400 g в течение 30 минут. Монону к. парные клетки периферической крови (RBMNC), которые находятся на поверхности раздела между Ficoll и супернатантом, отбирают. PBMNC помещают в среду RPM1 (среда RPMI 1640, Гибко BRL), содержащую 10% плодной телячьей сыворотки (SVF), находящуюся в чашках Х1я культивирования диаметром 15 см, по 1-5 х 10 клеток на чашку. Спустя 30 минут среду отсасывают и приросшие к чашке клетки (в основном образованные моноцитами) инкубируют как описано ниже.
б) Инкубация клеток с ЛИС и протеином NC30
Приросшие RBMNC инкубируют в 20 мл RPMI / 10% плодной телячьей сыворотки в течение 4 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода, в присутствии 5 мкг на мл липополисахарида (ЛПС) (стандартное обозначение: 1.4391, Сигма) и возрастающих концентраций NC30, происходящего от очищенных дрожжей (0,1-10 нг/мл), или супернатантов клеток COS, либо трансфектированных плазмидой pSEI NC30 и культивированных как описано в Разделе 7, либо трансфектированных плазмидой pSEI и культивированных в тех же условиях (контроль).
в) Получение и анализ РНК
Клетки промывают с помощью ЗФР, затем соскабливают прямо в 1 мл буфера D (следующего состава: 4 М тиоцианата гуанидиния; 25 мМ цитрата натрия; 0,5% саркозила; 0,1 М р-меркапгоэтанола (Chomczynski Р. и Sacchi N.. (1987), Anal. Biochem.. 162, 156-159). РНК получают методом экстракции фенолом при кислом значении pH, описанным л ими авторами. Наносят 1-5 мкт РНК на 1%-ный агарозный гель в присутствии формальдегида ( Sambrook и др., нитровано выше). После миграции, РНК переносят на усиленную нитроцеллюлозную мембрану ( Schleicher и Schuell) и гибридизируют с радимаркп- рованными кДНК-зондами, как в Разделе 4. Интенсивности гибридизации каждой РНК с различными зоилами определяю! (количественно) пузем фосфо- ресцентного анализа на приборе Phosphorimager (Molecular Dinamics, 800Е, авеню Argues Sunnvxale, Ca, 94086- Cl 11 A).
2) Pen .штаты
Средние значения и стандартные отклонения результатов, полученных с очищенным протеином NC30 в четырех экспериментах, представлены в нижеприводимой таблице 3, в которой количества информационных РНК, определенные путем фосфоресцен зного анализа, выражены в виде процент по о|ношению к количеству информационной РНК.
определенному для образца, происходящего от клеток. обработанных одним Л1IC.
ТАБЛИЦА 3
Количества информационных РНК 1L- 10 и 1L-6, определенные для различных кониентарции протеина NC30
Условие стимуляции клеток
количество информационных РНК
1L- 10
1L - 6
ЛПС (липополисахарид)
100
100
ЛПС + протеин NC30 в концентрации 0,1 нг/мл
97±36
77±18
ЛПС' + протеин NC30 в концентрации 1 нг/мл
54±39
24±11
ЛПС + протеин ЫСЗО в концентрации 10 hi/мл
30±5
13±4
Из таблицы, приводимой выше, следуец что аккумуляция информационных РНК 1L-10 и IL-6 в моноцитах, обработанных с помощью липополисахарида, инкубируется протеином NC30. Наиболее значительное ингибирование обнаруживают для концентрации 10 нг/мл протеина NC30. и доза для достижения ингибирования на 50% (ИК?о) составляет величину порядка 1 нг/мл.
Точно также устанавливают ингибирование продуцирования информационных РНК 1L-10 и 1L-6 в присутствии супернатантов клеток COS, трансфектированных плазмидой pSEl-NC30, и не обнаруживают никакого ингибирования в присутствии супернатантов контрольных клеток COS.
Также во время других экспериментов устанавливают ингибирование продуцирования протеинов 1L-10 и 1L-6 в культуральных средах моноцитов, обработанных ЛПС, в присутствии протеина NC30. IL-6 анализируют количественно по его воздействию па пролиферацию линии гибридомы В9 по методу, описанному Z.A. Aarden, 1987, Eur. J. Immunol, 71, 1411-1416. (Количество протеина NC30, присутствующее в образцах, не интерферирует с определением по линии В9 количеств 1L-6, продуцируемых моноцитами). Определение IL-10 осуществляют на клетках ЕЕ 4 по методу, описанному E.W. Palaszyn- ski, 1987. Biochem. And Biopliys, Res. Comm. 147, c. 204-211, который состоит в определении (количественно) конкуренции связывания с ралиомаркирован- ным IE-10 ».
РАЗДЕЛ 15:
Выявление для протеина N€’30 модуляции количества поверхпост ного антигена €1)23 В - клетками миндалин
1) Используемый метод
а) Подготовка клеток
Человеческие миндалины извлекают путем хирургического вмешательства у девочки в возрасте б лет. Миндалины разрывают скальпелем в среде RPM1, охлажденной до 4°С. Увеличившиеся в объеме в среде после этой операции клетки отфильтровывают через марлю, чтобы получип. гомогенную суспензию клеток. После двух промывок клетки полечи навают и обрабатываю! в плодной 1слячьей
сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида (Мерк). По 7,5.10° клеток в объеме 1 мл распределяют на каждую пробирку для замораживания. Клетки помещают в термостат с температурой -80°С на 24 часа, затем хранят в жидком азоте.
б) Инкубация клеток с протеином NC30
В день эксперимента, аликвоту клеток размораживают при 37°С, затем медленно разбавляют с помощью 50 мл среды RPM1, содержащей 10% плодной телячьей сыворотки. Клетки центрифугируют для удаления диметилсульфоксида. После подсчета клеток, 100 мкл суспензии клеток, доведенной до концентрации 4.10° клегок/мл, наносят на микротит- рационные планшеты с 96 лунками (NUNC).
Очищенный протеин NC30 в различных концентрациях добавляют в среду RPM1, содержащую 10% плодной телячьей сыворотки. 100 мкл среды с различными концентрациями протеина добавляют к клеткам в лунках для микрокультуры. Инкубацию осуществляют в течение 48 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода.
в) Маркировка клеток для иммунофлуоресценции
После инкубации, клетки переносят в микропробирки (Labsystem), Для обычного иммунофлуо- ресценгного анализа, к суспензии клеток добавляют 10 мкл анги-С'П23-ант итела в сочетании с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (Immunotech). Для анализа по методу двойных флуоресцирующих антител, к суспензии клеток одновременно добавляют 10 мкл анти-СО23-ант|1тела в сочетании с фикоэритрином и 10 мкл апти-€Т)20-антитела в сочетании с ФИТЦ (Becton Dickinson)
Инкубацию осуществляют в течение 30 минут при 4°С’, затем клетки центрифугируют и осадок после центрифугирования обрабатывают с помощью 250 мкл охлажденного буфера ЗФР. С целью выявления клеток, погибших во время анализа, добавляют 50 мкл раствора пропидиумподила (Сигма) с концентрацией 20 мкг/мл.
г) Анализ_с помощью проточной цитометрии
Образцы анализируют путем определения флуоресценции па триере (селекторе) клеток FacStar Plus (Becton Dickinson) с лазерной длиной волны возбуждения флуоресценции 488 нм. Во время анации, эмиссии ФИТЦ и пропидиумиодпда определяют при использовании, соответственно, интерференционных фильтров 530 нм и 630 нм. Во время анализа по методу двойных флуоресцирующих антител, дополнительную эмиссию, возникающую вследствие наличия фикоэритрина, улавливают через интерференционный фильтр 575 нм. В случае этого, указанного последним анализа используют электронную компенсационную систему для тога, чтобы избежать контаминирования флуоресценции ФИТЦ в канале фитоэритрина, флуоресценции фикоэритрина в канале пропидиумиодпда, и флуоресценции пропи-
диумиодида в канале фикоэритрина. Результаты собирают и обрабашвают, используя программное обеспечение LyS IS II ( Becton Dickinson).
2) Результаты
а)_Мрду.тяция количества антигена Ci)23 в клетках миндалин за сче! протеина N(’30
Средние значения и стандартные отклонения полученных результатов представлены в нижеприводимой таблице 4 для инкубации клеток миндалин в течение 48 часов и диапазона концентраций протеина NC30 от НГ’ до I О2 нг/мл.
ТАБЛИЦА 4
Изменение процента клеток миндалин, экспримируютнх антиген С/523, в присутствии различных концентраций протеина NC30
Концентрация NC30 (нг/мл)
% клеток, экспрессирующих CD23
0
4.8±1.2
КГ
4.8±0.8
1О’?
4.9±0.4
10'
12±2.4
1
17.0±2.5
10
27.3±1.6
ю2
20.4±2.5
Устанавливают, что процент клеток миндалин, экспрессирующих антиген CD23 (рецептор слабого сродства к IgE), является более значительным для концентрации протеина НС30 выше 101 нг/мл, чем процент, достигаемый в отсутствие протеина NC30. Самое значительное воздействие этого протеина установлено при концентрации 10 нг/мл.
б) Характеризация клеток, в которых протеин NC30 модулирует экспрессию антигена CD23
Характеризацию клеток, которые экспримируют антиген GL23, осуществляют с помощью иммунофлуоресценции по методу двойных флуоресцирующих антител, используя антитело анти-СО23 в сочетании с фикоэритрином и антитело анти-СО20 в сочетании с ФИТЦ. Это, указанное последним, антитело направлено против рецептора, присутствующего только в клетках В. Анализ путем проточной цитометрии показывает', что фракция клеток В экспримирует ант иген CD23 под действием протеина NC30.
РАЗДЕЛ 16:
Выявление воздействия протеина NC30 на пролиферацию линии гибридомы В9
Активность в отношении стимуляции пролиферации линии гибридомы В9 выявляют при использовании супернатантов культуры клеток COS. трансфектированных плазмидой pSEI-NC30 (см. Раздел 7), и очищенного протеина NC30, происходящего от дрожжей (см. Раздел 12). Эту линию обычно используют для осуществления биологического определения 1 1-6 (Z.A. Aarden. 1987, Bur. J.linmun., 17. 14111416).
1) - Используемый метод.
а) Принцип определения
I [ринцип этого определения описывается Т. Mosman, 1983, J.linmun. Methods, 65, 55-63, и кратко излагается ниже:
Митохондрии включают множественные дегидрогеназы, способные восстанавливать тетразолиевый цикл в формазан. Таким образом восстановленная соль этого типа, МТТ (3-4, 5-диметил-тиазол-2,5- дифснил-тегразолийбромид) дает синее окрашивание с сильным поглощением при 565 нм. Описанное здесь колориметрическое определение позволяет количественно измерять число митохондрий, следовательно, число клеток.
б) Ку..ыут,1 клеток
Используемые клетки относятся к линии В9, представляющей собой линию гибридомы мышь/мышь, описанную Z.A. Aarden, 1987, Bur, J.lmmun.,17, 1411-1416. Это неадгезпвные клетки, которые пролиферируют в прису1ствии мышиного 1L-6 или человеческого IL-6.
Культуральная среда
500 мл среды R РМ1 1640 без глутамина (стандартное обозначение: 041 -01870 М. Гибко) + 50 мл плодной телячьей сыворотки (декомпле-
ментироваиная, то есть нагретая в течение 30 минут при 55°С для пнактизаиии фрагментов сывороточного комплемента) (Сигма, стандартное обозначение: F4135)
+ 12,5 мл 100 мМ пирувата натрия (етандар1ное
обозначение: 043 - 0136011; Гибко)
+ 2,5 мл IM Геиес. pH = 7,3 (стандартное обозначение:
043 - О563ОГ); I ибко)
+ 10 мл 200 мМ глутамина (стандартное обозначение:
043-05030Л; Гибко)
Перед самым употреблением добавляют:
-
р - меркаптоэтанол (С'нгма; стандарт ное обозначение: М-6250), конечная концентрация 5x10 моль;
-
IL -6 в конечной концентрации 500 пкг.'мл
в) Подготовка образцов:
Используют два типа образцов: один, получаемый из супернатанта клеток COS, либо трансфектированных плазмидой pSElNC30 и культивированных как описано в Разделе 7, либо трансфектированных плазмидой pSEl и культивированных в тех же условиях (контроль); другой, получаемый из раствора протеина NC30, происходящего от дрожжей, очищенный согласно Разделу 12, в концентрации 50 и г/мл.
11 Протокол определения
Определение осуществляют в культуральных планшетах с 96 лунками с плоским дном, причем каждый образец анализируют в ряду из 12 лунок в изменяемых концентрациях.
Клетки линии В9 культивируют, промывают 2 раза культуральной средой без IL-6, снова суспендируют в культуральной среде (без IL-6) и инкубируют в течение 2 часов при 37°С. Эта инкубация позволяет лучше удалить IL-6, ответственный за фон при определении. Наконец, клетки снова центрифугируют и суспендируют в вышеуказанной культуральной среде (без IL-6) в концентрации 2.10’ клеток/мл.
В 9б-луночные планшеты последовательно вносят:
-
50 мкл культуральной среды (без IL-б) в каждую лунку (за исключением первых лунок каждого ряда);
-
100 мкл испытуемого образца в первую лунку каждого ряда (с разбавлением в 2 раза от лупки к лунке);
-
50 мкл суспензии клеток в каждую лунку (10 000 клеток на лунку).
Планшеты затем помешают в термостат с температурой 37°С и содеражщей 5% диоксида углерода атмосферой.
После инкубации в течение 3 дней, в каждую лунку в стерильных условиях добавляют 10 мкл раствора МТТ (С’нгма, стандартное обозначение: 2128) с концентрацией 5 мг/мл в буфере ЗФР. Планшет снова помещают в термостат. С помощью микроскопа можно следить за появлением формазапа. который пролуцируеюя в виде синеватых кристаллов живыми клетками. 11о истечении четырех часов, клетки погибают, супернатант из каждой лунки осторожно отсасывают и кристаллы растворяют в 100 мл 66 %-ного раствора н-пропанола. содержащего 10% додецилсульфта натрия и 0,04н НО. 11ланше1ы на несколько минут помещают на встряхпваге.чь для планшетов, чюбы сделать однородным окрашивание. Затем считывание осуществляют с помощью
аппарата для прочтения планшета при длине волны 565 нм.
Вместо вышеописанного определения с помощью МТТ также можно осуществлять подсчет клеток при использовании микроскопа.
2) Результаты
а) Супернатант клеток COS, содержащий протеин NC30
Проводят 6 серий измерений: 3 е различными супернатантами клеток COS, содержащими протеин NC30, и 3 е различными контрольными супернатантами клеток COS, с различными, для каждой серии, факторами разбавления раствора супернатанта COS.
11олученные результаты представлены на рисунке б, на котором отражено изменение оптической плотности (каждая точка представляет собой среднюю величину оптической плотности, измеренную для одного и того же фактора разбавления в 3 сериях экспериментов) в зависимости от фактора разбавления раствора супернатанта COS.
При считывании данных этого рисунка устанавливают, что раствор супернатанта COS, содержащий протеин NC30, в 4-6 раз более активен в пролиферации линии В9, чем раствор контрольного супернатанта С0£.
Активность в отношении стимулирования пролиферации линии В9, установленная при использовании раствора контрольного супернатанта COS г возникает вследствие эндогенного продуцирования 1L-6 клетками COS, которое может быть количественно определено путем радиоиммунного анализа (РИА), особенно с помощью набора фирмы Амерс- хам (стандартное обозначение: Р-ч РА 537). Этот радиоиммунный анализ позволяет подтвердить, что увеличение активности в отношении стимулирования пролиферации линии В9 (за счет супернатанта COS, содержащего протеин NC30) не связано со сверхпродуцированием IL-б клетками COS •
б) Очищенный протеин NC30, происходящий от дрожжей:
Нроводяз две серии измерений: одну - в отношении оптической плотности после окрашивания с помощью МТТ; другую - в отношении плотности клеток путем подсчета клеток на микроскопе, с различными, для каждой серии, концентрациями протеина NC30.
Полученные результаты представлены на рисунке 7, на котором отражено изменение оптической плотности и плотности клеток в зависимости от концентрации протеина RC30, выраженной в нг, мл.
Устанавливают, что очищенный протеин NC30 стимулирует пролиферацию липин В9. ЭД50 (кончен трация. при которой констатируют активность, равную половине полученной максимальной активности) составляет величину порядка 100 иг,'мл.
Следует заметить, что клетки В9 являются мышиными клетками, что может объяснить необходимость использования повышенных концентраций протеина RC30 по сравнению с концентрациями, используемыми для воздействия па человеческие клетки (см. Разделы 14, 15 и 17).
РАЗДЕЛ 17:
Выявление воздействия протеина NC30 на пролиферацию мегакариобластической человеческой линии М07е
в присутствии GMCSF
Повышение пролиферативной активности GMGSF в отношении мегакариобластической человеческой линии М()7е выявляют с помощью продуцированного в дрожжах протеина NC30 (Раздел
12). Эта линия клеток, описанная M.F. Brizzi и др.. 1990, British. J с urnal of'Haematology, 76, 203-209, строго зависит в своем роете от цитокинов 1L3 или GMCSF.
1) Используемый метод
а) Цель
Речь идет о сравнении пролиферации клеток линии М07е, культивированных либо в присутствии количества GMCSF, необходимого для половины максимальной пролиферации, либо в присутствии такого же количества GMCSF, к которой добавляют протеин NC30 в изменяемой концентрации.
б) Принцип определения
Пролиферацию клеток определяют путем измерения радиоактивности за счет включения содержащего тритий тимидина клетками культуры.
Пролиферирующие клетки используют тимидин для синтеза ДНК. Содержащий тритий тимидин, вводимый в культуру, вступает в конкуренцию с нерадиоактивным лймидином среды и включается в клетки.
Спустя определенное время, клетки рекуперируют на фильтре и, для удаления избытка содержащего тритий тимидина, не внедренного в клетки, промывают. Каждый фильтр затем анализируют с помощью гамма-счетчика. Пролиферативную активность выражают в виде числа импульсов в минуту внедренною, содержащею фитий тимидина.
в) Культура клеток
Используемые клетки относятся к линии М()7е, которая представляет собой мегакариобластическую человеческую линию, установленную M.F Brizzi и др. (цитировано выше). Это неадгезивные клетки, которые пролиферирую! в присутствии человеческого IL-3 или человеческих GMC 5F. Половина полученной максимальной активности (ЭД^) составляет:
35 пг/мл для GMCSF ( Genzyme; стандартное обозначение: RM - CSF - С);
0,7 пг/мл для IL3 (Genzyme; стандартное обозначение 111 L3 С).
Кульгуралыга среда
-
500 мл среды Дульбекко, модифицированной по способу Исков (среда IM DM ' Гибко; стандартное обозначение: 04101980);
-
50 мл плодной телячьей сыворотки (деком- плсментировапная, то есть нагретая при 55°С в течение 30 минут для инактивации фрагментов сывороточною комплемснia) (Сигма; стандартное обозначение: F 4135);
- 10 мг/мл Гентамицина (I мл раствора Гибко с стандартным обозначением: 043. 05710 D).
Перед самым употреблением добавляют человеческий рекомбинантный 1L3 (Genzyme; стандартное обозначение: H1L3.C) в конечной концентрации 4 нг/мл.
г) 11одготовка образцов
Испытуемые образцы готовят (путем разбавления в культуральной среде без 1L3) из раствора протеина NC30, происходящего из дрожжей и очищенного согласно Разделу 12, в концентрации 500 нг/мл.
д) Протокол определения
Определение осуществляют в культуральных планшетах с 96 лунками с плоским дном, причем каждый образец анализируют в ряду из 12 лунок при использовании изменяемых концентраций. Культивируемые клетки линии М07е должны находиться в экспоненциальной фазе роста.
Для определения, клетки промывают 2 раза культуральной средой без IL3- и инкубируют в течение 3 часов при 37°С. Эта инкубация позволяет лучше удалить IL3, ответственный за фон при определении. Наконец, клетки снова центрифугируют и снова суспендируют в вышеуказанной культуральной среде (без IL3) в концен фации 2.1 (Г клеток/мл.
В планшеты с 96 лунками последовательно вносят:
-
либо 50 мкл культуральной среды (без 11L3) в каждую лунку;
-
либо 50 мкл культуральной среды (без IL3) и 10 мкл раствора GMCSF с концентрацией 200 пг/мл;
-
либо 50 мкл испытуемого образца в различных концентрациях и К) мкл раствора GMCSF с концентрацией 200 пг/мл;
-
затем 50 мкг суспензии клеток, в каждую .лунку (10 000 клеток/лунка).
Планшеты затем помещают в термостат с температурой 37°С и атмосферой, содержащей 5% диоксида углерода.
После инкубации в течение 3 дней, в каждю лунку, в стерильных условиях, добавляют 50 мкл раствора содержащего тритий тимидина (10 микро- кюри/мл) (А.мерсхам; стандартное обозначение: TRA6 = 1 милликюри/мл - 10 микрокюри/мл) в культуральной среде без 1L3. Планшет помещают в термостат. По истечении 4 часов содержимое каждой лунки наносят на фильтр путем отсасывания из лунок и промывки дистиллированной водой и измеряют радиоактивность фильтра.
2) Результат ы
Основные полученные результаты представлены в нижеприводимой таблице 5, в которой указываются значение радиоактивности, выраженное числом импульсов в минуту, для среды без GMCSF и без протеина NC30 к величина радиоактивности для среды, содержащей 18 ш/мл GMCSF, в зависимое!и от концентрации протеина NC30.
Представленные здесь величины радиоактивности являются средними значениями из 11 опытов для среды без GMCSF, также, как для среды, содержащей только GMCSF, и из 7 опытов для сред, содержащих GMGSF и iipoieini NC30. Значения этих средних величин сравнивают, используя критерий
Стыодента, со степенью достоверности выше 99,95%.
ТАБЛИЦА 5
Радиоактивность в зависимости от концентрации протеина NC30
Концентрация протеина NC 30 (нг/мл)
0
0.49
1,95
7,8
31,2
125
500
радиоактивность (число импульсов в минуту)для среды без GMCSF
550
/
/
/
/
/
/
Радиоактивность
(число импульсов в минуту для среды, содержащей 18 11 г/мл GMCSF
14462
16852
18840
20264
20549
20685
21784
Значительное отклонение с вероятностью > 99,95%
/
нет
да
да
да
да
да
Из вышеприведенной таблицы следует, что протеин NC30 значительно увеличивает пролиферацию линии М07е в присутствии GMCSF.
РАЗДЕЛ 18:
Выявление для протеина НСЗО хемотаксис- ной активности
1) Используемый метод
а) Выделение нейтрофилов
Из периферической крови удаляют большую часть эритроцитов путем осаждения при 37°С в течение 30 минут в растворе, содержащем 0,6% декстрана Т500 (Фармация; стандартное обозначение: 170320-01) и 0,09% хлорида натрия. Затем клетки помешают поверх слоя Ficoll-Paque (Фармация) и центрифугируют в течение 30 минут при 400 g. Монон- кулеарные клетки периферической крови (RBMNC) находятся на границе раздела между Ficoll и супернатантом, тогда как остаточные эритроциты и многоядерные элементы (в основном нейтрофилы) находятся в осадке клеток. Этот осадок снова суспендируют в 0,8% растворе хлорида аммония в 10 мМ Гепес и инкубируют в течение 7 минуг при 37°С для деструкции эритроцитов. Остаточные клетки (в основном нейтрофилы) центрифугируют и промывают в буфере HBSS: сбалансированный солевой раствор Хенкса (Гибко B2L; стандартное обозначение: 04104025 11), называемый ниже раствор HBS5.
б) Выделение моноцитов
Принцип выделения моноцитов описывается A.Boyuin, 1983, Scan.J.Imnninci., 17. 429-436. Ниже приводится его краткое изложение: Метод заключается в выделении моноцитов из крови при использовании среды с содержащим иод градиентом,Nycodenz (Х'\'-бис(2,3-дигироксипропи.|)-5- ,'N-(2,3-днгидроксипропил) аистамидо/-2,4.6-трииод- изофталамид). Для усиления различия в плотности между моноцитами и лимфоцитами, повышают осмолярность раствора, следовательно, лимфоциты теряют воду и становятся более плотными. Можно использован, среду "NycoPrcp 068", которая содержит
Nycodenz,хлорид натрия и трицин/NaOH в оптимальных концентрациях, для выделения моноцитов (Nycomed Pharma AS, Норвегия; стандартное обозначение: 223510).
Используемым протоколом (методикой) является следующий:
И:з периферической крови удаляют большую часть эритроцитов путем осаждения при 37°С в течение 30 минут в растворе, содержащем 0,6% декстрана и 0,09% хлорида натрия. Отбирают верхнюю фазу плазмы, содержащей моноциты, лимфоциты и нейтрофилы. Для отделения моноцитов от других клеток подготавливают пробирки следующим образом:
б мл плазмы помещают на слой из 3 мл Nycc.Prcp.
1.068 (Nycomed Pharma AS, Норвегия; стандартное обозначение: 223510) в пробирке диаметром 13 - 14 мм. После ценгрифу:ировапия при 600 g в течение 15 минут, отбирают осветленную плазму на 3 - 4 мм выше промежуточной фазы и собирают остаток плазмы и весь раствор NycoPrep вплоть до примерно на 1 см выше осадка клеток, что позволяет не отбирать лимфоциты. Собранную суспензию моноцитов дополняют до объема 6-7 .мл с помощью раствора следующего состава: 0,9% хлорида натрия, 0,13 % ЭДТК, 1% бычьего сывороточного альбумина. затем центрифугируют в течение 7 минут при 600 g.
Моноциты загрязнены тромбоцитами. Для удаления тромбоцитов цетрпфугируюг, за:ем отбирают суперна 1ант и снова суспендируют в том же растворе, повторяя эти операции 3 раза.
Клетки суспендируют снова в среде SPM1 1640 (Гибко), содержащей бычий сывороточный альбумин (В5А) в количестве 0,5%.
в) Протокол выявления хемотаксиса
Используемым тестом является таковой, описанный W.Falk и лр.. 1980.
J.Iniin.Melh,33, 230-247. Ниже приводится конкретно используемый протокол (методика):
Для определения хемотаксиса используют модифицированную камеру Бойдена, выпускаемую в продажу фирмой Neuroprobe (стандартное обозначение: АР48).
Испытуемые образцы, разбавленные в растворе НВ55 для тестов на нейтрофилы, и в среде BPMI, содержащей 0,5% бычьего сывороточного альбумина для тестов на моноциты, помещают в лунки нижнего планшета. На него помещают поликарбонатную мембрану (размер пор: 5 мм; Nuiclepore: стандартное обозначение: 155845) глянцевой стороной вниз. На мембрану помещают верхний планшет. Клетки (50 ООО на 50 мкл буфера) вносят в лунки верхнего планшета. Камеру инкубируют при 37°С в термостате, содержащем влагу, или в содержащем смоченную вату кожухе ( une boite. в течение 1 часа для теста па нейтрофилы и в течение 3 часов для теста на моноциты. Мембрану вынимают и удаляют клетки, которые находятся на матовой стороне (клетки, которые не мигрировали), путем осушения мембраны и скобления ее с помощью скребка из каучука, причем эти две последние операции повторяют 1 раз. Мигрировавшие клетки окрашивают и фиксируют, используя набор "Diff-quick” (Dade; стандартное обозначение: 130832). Путем наблюдения в микроскоп подсчитыТаблица
6
Протеин NC30
(нг/мл)
Индекс хемотаксиса по отношению к моноидам
Индекс хемотаксиса по отношению к нейтронлам
0.1
2.2
0.6
1
4.1
1.0
10
6.1
1.2
100
5.1
1.1
fMLP(l кмоль)
3.0
3.8
б) Бактериальные штаммы
Устанавливают, что в испытуемых концентрациях, протеин NC30 не оказывает значительного воздействия на нейтрофилы, но в концентрации 1,10 и 100 нм/мл он имеет индекс хемотаксиса по отношению к моноцитам отчетливо выше такового I' MLP.
Протеин NC30, следовательно, является сильным и специфичным хемоаттрактантом для моноцитов.
РАЗДЕЛ 19:
Иммунпмоду.чя горная активность ин bubo в случае мыши
Происходящий от дрожжей, очищенный протеин NC30 пспытвают на его пммуномоду.тяторную активность в двух системных инфекционных моделях в случае мыши.
1) Материал и метод
а) Животные
Для этого исследования используют самок мышей CD1, поставляемых С. River (Франция), со средней массой 25 г. Используемые группы включают 8 или К) мышей.
вают число клеток с глянцевой стороны мембраны (мигрировавшие клетки).
Затем рассчитывают индекс хемотаксиса образца но отношению к рассматриваемым клеткам (моноциты или нейтрофилы), который определяю! как соотношение числа мигрировавших в образец клеток к числу клеток, которые в контрольном эксперименте мигрировали в среду или буфер для разбавления.
3)
Подготовка образцов
а) Образцы рекомбинантного протеина NC30: протеин NC30, происходящий от дрожжей,
очищенный, как описано в Разделе 12, в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл.
б) Контроль
пептид формил-Met-Leu-Phe, обычно называемый 1' MLP (Сигма; стандартное обозначение: F 3506), в концентрации 1 мкмоль (концентрация, обычно используемая для применения в качестве положительного контроля хемотаксиса).
4)
Результаты:
Основные полученные результаты представлены в нижеприводимой таблице 6, в которой указывается индекс хемотаксиса по отношению к моноцитам и индекс хемотаксиса по отношениюе к нейтрофилам для протеина NC30 в различных концентрациях и контроля -I’ MLP. Этот индекс рассчитывают из среднего из четырех независимых экспериментов.
Инфекционными штаммами являются штамм Zisteria monocytogenes, депонированный в Коллекции Института Пастера под номером CIP 5734, и штамм. E.coli, клинический изолят, хранящиеся при -70°С.
в) Образцы
Протеин NC30, происходящий от дрожжей, очищенный, как описано в Разделе 12, используют разбавленным в 0,15 М раствора хлорида натрия, содержащем 1 объемн.% мышиной плазмы. Этот раствор служит контролем.
г) Обработка мышей
После распределения мышей на несколько групп, вводят протеин NC30 интраперитонеально в дозах 2 и 20 мкг/кг, в интервалы времени за 24 пли 4 часа до инфекции. Контрольную группу обрабатывают разбавителем.
д) Инфекционные моде ш
Использую! две инфекционные сенТИцсмичс- ские модели, применяя штаммы E.Coli и L.monocytogenes.Эти модели описываются Kong- Tck-Chang. 1987. Infection and Immunity. 55. c. 668-
673; и M.Haak-Frendscho и др. Infection and Immunity, 1989, 57, e. 3014-3021.
Штаммы E.colL и L.vjnjcytogenes культивируют в питательном бульоне (Nutrient Broth. Oxoid) в течение 18 часов при 37°С. Объем 0,5 мл соответствующего разбавления культурального бульона, соответс гвующего 5 х 10r' UFC (образующая колонию единица) вводят мышам интраперитонеально. Ежедневно вплоть до десятого дня регистрируют гибель мышей в различных груп- нах.
е) Статистика
Число выживших мышей, обнаруживаемое в обработанных группах, сравниваю! с лаковым контрольной группы с помощью теста khi 2. Различие считают значительным, когда вероятность выше 95%.
2) Результаты
а) Инфскция_с помощью L.Monocvtoeeneses.
Группы мышей, обработанные шпраперитоне- ально в интервалы времени Т за 24 или 4 часа до инфекции с помощью 2 или 20 мкг/кг протеина NC30, ведут себя как контрольные i руины. Не установлено никакого улучшения степени выживания.
б) _Инфекция с помощью E.Coli.
Результаты представлены в нижеприводимой таблице 7, в которой указывается доля выживших мышей в подвергающихся испытанию группах:
Число выживших мышей / число мышей, инфицированных с помощью E.C’oli в зависимости от дозы протеина NC30 и интервала времени Т, отделяющего обработку от инфекции
Т ХЬ-ШЦА 7
т
24 часа
4 часа
Доза (мкг/кг)
Пример 1
Пример 1
Пример 2
11ример 3
0 (контроль)
3/8
1/10
1/8
2/8
2
3/8
5/8*
3/8
2/8
20
7/8*
не опред.
5/Г
3/8
*значительное различие по сравнению с контролем с вероятностью выше 95%.
Устанавливают:
Мыши, обработанные интраперитонеально за 24 часа до инфекции с помощью 20 мкг/кг протеина NC30, значительно лучше устойчивы к микробной инфекции, чем мыши контрольной группы.
Профилактическая обработка, осуществляемая за 4 часа до инфекции интраперитонеально, эффективна в двух из трех реализуемых экспериментов и позволяет значительно повысить степень выживания обработанных животных по сравнению с таковой контрольных животных. В первом эксперименте эффективна только одна испытваемая доза 2 мкг/кг. Во втором эксперименте одна доза 20 мкг/кг защищает мышей от инфекции с помощью E.coli.
В другой серии экспериментов, осуществляемых на 1 руппах из 20 мышей, устанавливают, что доза 32 мкг/кг протеина NC30, происходящего от дрожжей, очищенного как описано в Разделе 12, вводимая за 24 часа до инфекции с помощью E.coli, позволяет достигать отчетливо более значительной степени выживания мышей: 11 из 20 по сравнению с
2 из 20 в случае контроля. Установленное различие является значительным с вероятностью выше 99%, согласно критерию Стьюдента.
Протеин NC30, следовательно, также ин виво обладает иммуномодуляторным эффектом.
Протеин NC30, следовательно, является новым лимфокином, обладающим иммуномодуляторными активностями цитокинового типа ин витро (пролиферация клеток, клеточная активация, хемотаксис и регуляция синтеза других цитокинов) и ин виво. Он оказывает воздействие, по крайней мере, на два типа ключевых клеток относящихся к иммунитету системы: моноциты и В-лимфоциты. Следовательно, речь идет о новом интерлейкине. Некоторые из его свойств являются общими с интерлейкином-4: ингибирование синтеза интерлейкина-1 А и интерлейкина- б человеческими моноцитами периферической крови. активированными с помощью ЛИС, и модуляция экспрессии антигена CD23 в В-лимфоцигах миндалин. (W.Paul, 1991. Blood, 77 1959; и Waal Malelyt и др.. 1991, .1, Exp., Med., 174.. 1199-1220).

1. K.D. BROWN et al., A famili of inducible protein secreted by leucocytes are members of a new superfamily that includes leucocyte and fibroblast- derived inflammatory agents, growt factors, and indicators of various processer
THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, 1989, v. 142, No2, 679-687
2. WO 90/07009 Al (THE SECRETARY UNITED STATES DEPARTMENT OF COMMERCE), 28.06.90, c. 5-7, формула
3. Л.А. Остерман, Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование,