ПРОБИОТИК СУБТИЛГИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ МАСТИТОВ И ЭНДОМЕТРИТОВ У КОРОВ

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к производству микробиологических препаратов на основе Bacillus subtilis, ис-пользуемый в качестве пробиотического препа-рата для профилактики и лечения маститов и эндометритов у коров.
Биопрепарат содержит биомассу штаммов Bac. subtilis BS TJ 09 и BS TJ Д 26 (10 - 20 млрд м.к./г) - 0,001 % и наполнитель в составе бентонитопектиновой смеси – 30%, сухого молока – 20%, сахарозы – 20%, картофельного крахмала – 20% и стеарата кальция – 9,999%.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к производству микробиологических препаратов на основе Bacillus subtilis, используемый в качестве пробиотического препарата для профилактики и лечения маститов и эндометритов у коров.
Известен препарат на основе штамм Bacillus subtilis 534, ВКМ B-1666D, позволяющий успешно профилактировать и лечить эндометриты у коров [1]. Однако указанный штамм, полученный из негнойной раны человека, не является характерным для микробиоценоза матки и влагалища коров. Он не обладает хорошей приживаемостью на слизистых оболочках половых путей и чувствителен к большинству антибиотиков. Антагонистические свойства этого препарата по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре при эндометритах также недостаточно сильны. Биотехнологические свойства штамма Bacillus subtilis 534, ВКМ B-1666D не позволяют достигать высокой концентрации микробных тел при культивиро-вании в питательном бульоне, что делает технологию изготовления из него пробиотического препарата сложной и дорогостоящей.
Известен препарата Биосан, включающий выращивание чистых культур Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri, внесение их в колбу на подготовленную соево-печеночную питательную среду и культивирование в термостате 48 ч при t=36-38оC. В 1 мл биосана должно быть 2,5 - 3,5 млрд микробных тел. В ветеринарной практике биосан используют для лечения эндометрита и санации матки при искусственном осеменении коров [2].
Недостатком препарата является применение штаммов микроорганизмов имеющие слабые противомикробные активности и низкая концентрация микробных клеток в мл препарата.
Наиболее близким аналогом является известный препарат, Бактоцеллолактин – пробиотик, представляющий собой смесь трёх видов микроорганизмов-симбионтов: Laktobacillus (L) plantarum, Ruminococcus (R) albus, Bacillus (B) subtilus [3].
Недостатками этого препарата является: отсутствие в его состав минеральных и растительных адсорбентов, способствующих сохранению жизнедеятельности бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды и усиливающих их анти-микробную активность, слабая бактерицидная активность препарата при смешанных инфекциях мастита и эндометрита у животных.
Цель изобретения – является получение пробиотического препарата при профилактике и лечении маститов и эндометритов коров.
Технический результат изобретения заключается в получения пробиотического препарата с высоким терапевтическом эффективности препарата за счет включения в состав препарата микроорганизмов с высокой
адгезивностью и активными биологическими свойствами. Состав препарата состоит из следующих компонентов: Бактериальная масса штаммов Bac. subtilis BS TJ 09 и BS TJ Д 26 (10 - 20 млрд м.к./г) - 0,001 %; бентонито-пектиновую смесь – 30%; сухой молоко – 20%; сахароза – 20%; картофельный крахмал – 20; и стеарать кальция – 9,999%.
Поставленная цель достигается тем, что с полужидкого агара культуры производственных штаммов Bac. subtilis BS TJ 09 и BS TJ Д 26 засевают в пробирку с модифицированным картофельным питательным бульоном и выращивают в течение 24 ч при температуре (37±0,5)оС.
Первичные культуры проверяют на чистоту, засевают в колбы Эрленмейера (объемом 1,5л), наполненные модифицированным картофельным питательным бульоном не более 2/3 объема, и инкубируют при температуре (37±0,5)оС в течение 24 ч.
Чистые культуры производственных штаммов (BS TJ 09 и BS TJ Д 26) 24-часового роста в количестве 10% объема (1л) засеваемого модифицированного картофельного питательного бульона (рН 7,4 – 7,6) инокулируют в 10-литровые бутыли и выращивают при температуре (37±0,5)оС в течение 48 ч.
Пектин перемешивают с бентонитом в со-отношении 37:60 до получения однородной смеси. Бентонито-пектиновую смесь добавляют в бактериальную массу производственных штаммов Bac. subtilis BS TJ 09 и BS TJ Д 26 и перемешивают. В течение 24 ч при температуре (37±0,5)оС минеральные и растительные адсорбенты стимулируют рост микроорганизмов. Добавляют сухой молоко, сахароза, картофельный крахмал и стеарать кальция, соответственно (20:20:20:10). Контактносорбционным методом обезвоживания биомассу в течение 48 ч сушат при температуре (50±0,5)оС. Производственную серию биомассы после сушки измельчают в шаровых мельницах, порошок просеивают через сито.
Полученный препарат проверяли на без-вредность для животных, бактерицидную актив-ность в отношении тест-культур возбудители болезней животных (Escherichia coli, Salmonella dublin, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris) и лечебно-профилактическую эффективность при маститах и эндометритах коров.
Пример 1. Безвредность Cубтилгина проверяли на лабораторных животных по «Методические указания по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве. – М.,1988».
Изучение острой токсичности нового пробиотика на лабораторных животных проводили в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве». Опыты провели на 40 белых мышах двухмесячного возраста, массой 18-21 г. Перед началом исследований их содержали в обычных условиях и наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали накануне опыта вечером, прием воды не ограничивали.
Из белых мышей по принципу парных аналогов сформировали 5 групп (n=8). Из них 4 опытных и одна – контрольная.
Исходя из результатов предыдущего опыта о нетоксичности препарата «Субтилгин» на лабораторных животных, в этой серии наблюдений сразу применили высшие дозы исследуемого препарата. Для этого, мышам 4-х опытных групп, пробиотик в виде суспензии вводили однократно перорально в дозе – 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я группа), 0,3 мл (3-я группа) и 0,5 мл (4-я группа), что в пересчете на 1 кг массы тела составляло соответственно: 5 мл; 10мл; 15 мл и 25 мл.
Контрольным животным (5-я группа) в та-ком же объеме ввели только физиологический раствор.
Результаты опытов показали, что все ва-рианты Субтилгин безвредны. Все животные остались живыми в течение всего периода наблюдения, ни у одного из них не выявлены признаки заболеваний и других нарушений функций организма. Опыты на белых мышах свидетельствуют о том, что биомасса пробиотика лаксубтил при энтеральном введении в максимальных дозах до 25000 мг/кг не вызвала гибели экспериментальных животных. Результаты испытаний представлены в таблице 1. [Результат изучения острой токсично-сти пробиотика Субтилгин на белых мышах].
Следовательно, экспериментальный пробиотик Субтилгин в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 можно отнести к VI классу токсичности, т.е. к веществу относительно безопасному.
Пример 2. Антибактериальную активность препарата Субтилгин изучали по отношению к тест культурам, в жидкой питательной среде методом серийных разведений.
По минимальному количеству препарата, соответствовавшему наименьшей его концентрации, дающему полную задержку роста тест-культуры, определяли чувствительность тест-микробов к препарату, результаты опытов оцени-вали микроскопически, путем исследования мазков культуральной жидкости, окрашенных по Граму.
Опыты проводили в трех повторах. Результаты представлены в таблице 2 [Бактерицид-ная активность Субтилгина к тест-микробам].
Установлено, что препарат обладает высокой бактерицидной активностью по отношению к тест-микробам. Результаты бактериологического исследования показали, что МПК Субтилгин составляет 0,06 – 0,12 мкг/мл. Препарат проявил высокую бактерицидную активность, которая составила 0,12 – 0,24 мкг/мл.
Пример 3. Эффективность Субтилгина в различных дозах при профилактике эндометрита испытали на 30 коров (после трудного рода и задержания последа) в животноводческих хозяйствах. Схема проведения опытов и результаты применения Субтилгина представлены в таблице 3 [Эффективность Субтилгина при профилактике эндометрита коров].
Результаты исследований свидетельствуют, что препарат Субтилгин в дозах 3; 5 и 10 г, в виде 10% -ного раствора в стерильном физиологическом растворе внутриматочное при содержании биомассы (100 - 200x107 м.к./мл), имеет высокий эффект в профилактике эндометрита коров.
Пример 4. Исходя из полученных результатов, препарат Субтилгин испытан в сравнительном аспекте с препаратом Витагин и Ветомгин на 60 голов ново отеливших коров.
Животных по принципу аналогов, разделили на 3 группы по 20 голов в каждой. Коровам первой группы после удаление последа вводили внутриматочное препарата Субтилгин, содержащий биомассу В. subtilis (100-200x107 м.к./мл) в дозе 5 г в виде 10-ный суспензии один раз в день, в течение 3 дней.
Коровам второй и третей группы соответственно вводили Витагин и Ветомгин в соответ-ствии с наставлением по их применению.
Результаты опытов представлены в таблице 4 [Профилактическая эффективность Субтилги-на].
Из данных таблицы видно, что препарата Субтилгин не уступает по профилактическая эф-фективность известными препаратом Витагин и Ветомгин.
Пример 5. Лечебную эффективность преарата Субтилгин изучали на 3 группах больных эндометритом коров. При бактериологическом исследовании у больных коров были выявлены ассоциации бактериальных агентов (эшерихии коли, протей и сальмонелл).
Коровам первой группы (10 гол.) препарат Субтилгин в дозе 5 г вводили внутриматочно дважды в сутки. Коровам второй и третьей группы соответственно вводили препарат Ветомгин и Витагин в соответствии с наставлением по их применению.
Всем группам животным дополнительно лечили с утеротоном, который вводили в дозе 5,0 мл три дня подряд и проводили ректальный массаж матку.
На 2-е сутки после введения Субтилгина в комплексе с утеротоном количество выделяемого экссудата увеличивалось, а в последующие дни терапии постепенно уменьшалось. Через 4 дня после начала лечения наблюдали выделение прозрачной слизи, а на 6- – 7-е сут – прекращение выделений из матки у большинства животных 2-ой группы.
Освобождение от экссудата было тесно связано с восстановлением моторной функции и положительными изменениями со стороны стенок и в шейке матки.
Выделение прозрачной слизи у коров 1-й (Субтилгин) и контрольной (Витагин) группы от-мечали через 5, а прекращение выделений из матки у животных третьей групп (Ветомгин) – 8 – 10 сут после начала лечения.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что Субтилгин обладает высоким терапевтическим эффектом, внутриматочное введение его подавляло в полости матку развитие патогенных возбудителей и лечебная эффективность не уступала известному препарату Витагин.
Результаты опытов представлены в табли-це 5 [Эффективность применения Субтилгина для лечения эндометрита коров].
Пример 6. Лечебную эффективность препарата Субтилгина при мастите коров изучали на 2 группах больных животных. При бактериологическом исследовании у больных маститам коров были выявлены ассоциации бактериальных агентов (Эшерихии коли, Стафилококк и Стрептококк).
Коровам первой группы (15 гол.) препарат Субтилгин в дозе 3 г в виде 10-ной суспензии, который вводили внутрицистериально после дойки дважды в сутки. Коровам второй группы соответственно вводили препарат Лактовит в соответствии с наставлением по их применению.
Всем группам животным дополнительно лечили новокаиновым блокадам по мосину, который вводили в дозе 2,0 мл/кг массы тела три дня подряд применяли ихтиоловую мазь и проводили массаж вымени.
Показатели температуры, пульса, частоты дыхания и количество сокращений рубца здоровых и больных маститом коров до, во время и после проведенного лечения животных обеих групп находились в пределах физиологической нормы (Р=0,05).
Данные по изучению терапевтической эф-фективности препаратов приведены в таблице 6 [Эффективность применения Субтилгина для лечения мастита коров].
Как видно из таблицы, Субтилгин высоко-эффективен при всех формах мастита, при которых провели испытание. Эффективность его прак-тически аналогична Лактовитам (чуть менее результативен при субклиническом и серозном мастите — продолжительность лечения и выздоровление на 0,2—0,4 дня дольше, и наоборот, более эффективен при тяжелых формах мастита: ката-ральном, гнойном и геморрагическом — продолжительность лечения и выздоровление на 0,3—0,6 дня короче).
Новый противомаститный пробиотик Субтилгин не уступает по эффективность известному препарату Лактовиту при всех формах мастита. Так, число введений уменьшается в 1,3— 1,8 раза при субклиническом, серозном и серознокатаральном маститах, в 1,9—2,6 — при катаральном, гнойно-катаральном и гнойном маститах и в 2,4—2,5 раза — при геморрагическом и фибринозном маститах. Сроки выздоровления животных при тех же формах воспаления вымени сокращаются соответственно на 1,9—2,3 дня, 2,8—3,1 и 3,0—3,4 дня при меньшей продолжительности лечения.
При изучении влияния кратности введения на эффективность терапии установили, что его применение дважды в день более результативно, чем однократное ежедневное, при этом сроки выздоровления животных в зависимости от формы мастита сокращаются на 1,2— 4,5 дня.
На основании вышеприведенных данных Субтилгин необходимо применять 2 раза в день с интервалом 12 ч после сдаивания 2— 6 раз вплоть до клинического выздоровления животного.
Пробиотик Субтилгин обладает антагонистическим действием, способен повысить восстановлением моторной функции матки у животных, восстановить их нормальную микрофлору, а также используется для лечения и профилактики эндометритов и маститов.
Препарат вводят внутриматочно или внутрицистериально в дозах 3; 5 г в виде 10%-ный суспензии для лечения и профилактики эндометритов и маститов у коров. Лечебно-профилактическая эффективность составляет 82,5 - 87,5%.

1. Никитенко В.И. Вместо лекарств - бактерии //Наука в СССР, 1991, 4, с. 116-121.
2. Подберезный В.В., Париков В.А., Полянцев Н.И. Превентивная тарапия при послеродовой болезнях и маститов коров // Ветаринария, 1996, 4. С.116-121.
3. Ивановский А.А. Новый пробиотик - бактоцеллолактин при различных патологиях у животных // Ветеринария, 1996, 11, с.34- 35.