СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ .

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и может быть применено для профилактики сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных.
Способ включает засев и раздельное управляемое культивирование вакцинных штаммов сальмонелл и пастерелл. Далее осуществляют инактивацию культур формалином и с добавлением гидроокиси алюминия адсорбируют их на адъюванте. В качестве вакцинных штаммов используют патогенные бактерии сальмонеллеза-Salmonella dublin-Г№12 и ЛМ№10 и пастереллеза-Pasteurella multocida-В№2 и Д№5, полученных путем отбора патогенных возбудителей из пораженных органов от больных и павших сельскохозяйственных животных из местных эпизоотических очагов.

Изобретение относится к области ветеринар-ной медицины и может быть применено для про-филактики сальмонеллеза и пастереллеза сель-скохозяйственных животных из местных штаммов.
Известен способ изготовления ассоциирован-ной инактивированной вакцины против стрептококкоза и пастереллеза [1], включающий раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus epi-demicus ВГНКИ NК- ДЕП, Pаsterellа multocidа ВГНКИ и Pаsterellа multocidа ВГНКИ № l0l5 в течение l8-24 часов, замораживание – оттаивание полученных культур, отделение жидких фракций, инактивацию культур возбудителей 0,3-0,4% раствором формалина, объединение полученных антигенов в равных соотношениях по объему и последующее внесение адъювантов-гидроокиси алюминия и сапонина.
Недостатком данного способа является более сложный и дорогостоющий способ приготовления.
В качестве прототипа принят способ изготовления ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза и стрептококков поросят [2], включающий засев и раздельное управляемое культивирование вакцинных штаммов сальмонелл, пастерелл и стрептококков с последующей инактивацией культур формальдегидом, адсорбцией их на адъюванте и смешиванием адсорбированных культур. В качестве вакцинного штамма сальмонелл используют штамм S.cholerae-suis №370, инактивацию которого проводят формальдегидом.
Указанный способ имеет ряд недостатков, к числу которых относятся избыточная концентрация формальдегида в инактивированных культурах Salmonella cholerae-suis, что отрицательно влияет на иммуногенность препаратов и продолжительное время инактивации.
Целью заявляемого изобретения является раз-работка способа изготовления универсальной высокоиммуногенной специфичной ассоциированной вакцины из местных штаммов, обеспечивающей надежную защиту животных от сальмонеллеза и пастереллеза, вызываемых патогенными бактериями Pasteurella multocida и Salmonella dub-lin.
Поставленная цель достигается тем, что для приготовления ассоциированной вакцины осуществляют предварительное выделение из местных эпизоотических очагов штаммов патогенных возбудителей болезней- Pasteurella multocida-В№2 и Д№5, Salmonella Dublin-Г№12 и ЛМ№10, их идентификация, наработка биомассы культуры возбудителя раздельным культивированием и инактивация биомассы культуры возбудителя химическим реагентом.
Для достижения технического результата осуществляют следующие действия:
- проведение эпизоотологического анализа распространения инфекционных болезней сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных;
- получение местных бактериальных штаммов путем отбора от пораженных органов от больных и павших сельскохозяйственных животных из местных эпизоотических очагов;
- проверка морфологии микробных клеток патогенных возбудителей;
- изучение биологических свойств патогенных бактерий местных штаммов Pasteurella multocida-В№2 и Д№5 и Salmonella dublin-Г№12 и ЛМ№10;
- купажирование, засев и раздельное управляемое культивирование вакцинных штаммов пастерелл, сальмонелл;
- приготовление образцов антигенов пастерелл, сальмонелл и обезвреживание действием химических факторов (инактивирование формалином);
- проверка на стерильность (проведение посевов на специальные питательные среды);
- изучение безвредности и реактогенности вакцины;
- проверка активности вакцины;
- определение оптимальной иммунизирующей дозы, напряженности и продолжительности иммунитета после применения вакцины на крупном рогатом скоте и овцах;
- изготовление экспериментальных образцов ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза из местных штаммов;
- проведение количественной характеристики на лабораторных и подопытных сельскохозяйственных животных в зависимости между дозой антигена в составе вакцины и защитой от летальной дозы возбудителя;
- повышение качества препарата и стандартности биологических свойств вакцины.
Способ приготовления осуществляется следующим образом.
Проведена оптимизация условий культивирования сальмонеллеза и пастереллеза, посев на дифференциально-диагностические среды. Суспензию культур бактериальных инфекций подвергают купажированию 32-36 часов, выращивают раздельно в мясопептонном бульоне с глюкозой до концентрации микробных клеток 8 млрд. в l см3и выделяют чистые культуры вирулентных штаммов возбудителей сальмонеллеза Salmonella dublin и пастереллеза Pasteurella multocida. Концентрацию выращенных культур определяли по стандарту мутности ГОСУДАРСТВЕННОГО ИН-СТИТУТА СТАНДАРТИЗАЦИИ И КОНТРОЛЯ ИМ. ТАРАСЕВИЧА (ГИСК). Затем добавляли инактивирующие вещества формалин и выдерживали двое суток при t0-36-370Св термостате. После смешивания культуры микроорганизмов сальмонелл и пастерелл добавляли адъювант-гидроокись алюминия. Формалин вносят в культуру возбудителей до концентрации 0,4-0,5%, гидроокись алюминия до концентрации 4 – 5 %.
Соотношение компонентов для приготовления суспензии клеток чистой культуры вирулентных штаммов возбудителей сальмонеллеза Salmonella dublin и пастереллеза Pasteurella multocida приведено в Табл. 1 (масс. %):
Таблица 1 Суспензия клеток чистой культуры возбудителя сальмонеллеза, выделенного из местных эпизоотическых очагов в питательной среде с титром 8 млрд. микробных клеток в l см3 47,0-48,0
Суспензия клеток чистой культуры возбудителя пастереллеза выделенного из местных эпизоотического очагов в питательной среде с титром, 8 млрд. микробных клеток в l см3 47,0-48,0
Формалин 0,4-0,5
Гидроокись алюминия 4 - 5
В антиген добавляют гидроокись алюминия 4-5%, при этом для получения вакцинного препарата антиген используют в количестве, достаточном для стимуляции активной иммунной реакции в организме животных при введении им целевого препарата.
Для проверки морфологии микробных клеток вирулентных штаммов возбудителей сальмонеллеза Salmonella dublin и пастереллеза Pasteurella multocida (из местного эпизоотического очага), делают мазки на предметном стекле, мазки окрашивают и просматривают под микро-скопом. Возбудители сальмонеллеза Salmonella dublin - в мазках должны быть мелкие, прямые, с закругленными концами грамотрицательные палочки, а также частицы гидроокиси алюминия.
Возбудители пастереллеза Pasteurella multocida - небольшые, грамотрицательные, неподвижные и не образующые спор бактерии, располагающаяся изолированно, парами и иногда - в виде цепочек.
Для проверки на стерильность делают посевы на специальные питательные среды в пробирках (МПА - мясо-пептонный агар, МПБ - мясо-пептонный бульон с глюкозой, МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом и агар Сабуро или среду Чапека, чтобы исключить контаминацию грибковой микрофлорой). При выдерживании в течение 10 дней в термостате при 36-37оС посевы должны оставаться стерильными.
В лабораторных и производственных условиях проведено изучение безвредности, реактогенных свойств и иммуногенной активности разработанной ассоциированной вакцины.
Для проверки безвредности в лабораторных условиях отбирают десять клинически здоровых белых мышей массой 18-20 г. и вводят им подкожно вакцину в дозе 0,5 мл и 5-ти кроликам, массой 1,5-2,0 кг, которым вакцину вводили подкожно по 3,0 мл. За лабораторными животными вели наблюдение в течение 10 дней, регистрируя при этом заболеваемость, гибель и местную реакцию на введение ассоциированной вакцины. Животные должны оставаться здоровыми, без заметной местной и общей реакции в течение всего периода наблюдения. В случае падежа мышей или кроликов при повторной проверке вакцину бракуют. Экспериментальные серии ассоциированной вакцины против сальмонеллёза и патереллёза с/х животных оказались безвредными, авирулентными и ареактогенными.
В процессе проведения основного опыта были сформированы 2 опытные группы по 5 кроликов в каждой. Кроликам первой группы вводили ассоциированную вакцину (соотношение сальмонеллезного и пастереллезного компонентов 1:1) в дозе 3 мл, двухкратно с интервалом 14 дней, животным второй группы вводили ассоциированную вакцину (соотношение сальмонеллезного и пастереллезного компонентов – 1:2) – в дозе 3 мл., также двукратно с интервалом 14 дней. Кроликам контрольной группы (5 голов) подобранным по принципу аналогов, вводили физиологический раствор. Через 14 дней после повторной вакцинации проводили исследование сыворотки крови опытных и контрольных животных с целью определения титров специфических антител в реакция агглютинации.
Наиболее иммунногенной считали ассоциированную вакцину (с определенным соотношением сальмонеллезного и пастереллезного компонентов), обеспечивающую максимальный титр соответствующих антител.
При определении оптимального соотношения сальмонеллезного и пастереллезного компонентов в ассоциированной вакцине на лабораторных животных установлено, что титр специфических антител (отношение пастерелл к сальмонеллам) в сыворотке крови у кроликов первой группы при соотношении сальмонеллез-ного и пастереллезного антигена 1:1 составил в среднем 1:640 и 1:800 соответственно.
При соотношении компонентов 1:2 в ассоциированной вакцине титр специфических антител в сыворотке крови у кроликов второй группы в среднем составил 1:320 и 1:1120 соответственно. Результаты опытов показали, что соотношение 1:1 сальмонеллезного и пастереллезного компонентов в ассоциированной вакцине против сальмонеллеза и пастереллеза является наиболее оптимальным, так как способствует наибольшей выработке специфических антител. Таким образом, приготовленный препарат представляет собой ассоциировании вакцину на основе местных бактериальных штаммов для животноводческых хозяйств.
Общее время, связанное с приготовлением конечной формы ассоциированной вакцины составляло 1,5 месяца.
Перед применением препарата в хозяйстве показатели реактогенности и безвредности оценивают на группе изолированных телят, используя при этом от 5 до 10 животных, которым вводят подкожно по 3 мл вакцины. Наблюдение за животными проводилось в течение 14 - 20 дней.. После получения хороших результатов на изолированных телятах, вакцинации подвергают двукратно стельных сухостойных коров и суягных овцематок за 40 и 20 дней до отела, а также телят и ягнят с 2-ух месячного возраста. Для этого проводят подкожную иммунизацию животных ассоциированной вакциной в области шеи. При этом 1 доза препарата составляет 3 мл при первичной вакцинации и 5 мл при повторной вакцинации для взрослых животных, для телят и ягнят 2 и 3 мл соответственно. В результате про-веденной работы гибель КРС в хозяйстве снизилась в 3 раза по сравнению с предыдущими годами, когда данная работа не проводилась.
Пример 1. Способ получения препарата с оптимальными значениями параметров на основе бактериальных штаммов сальмонелл и пастерелл из местных эпизоотических очагов для приготовления ассоциированной вакцины против заболеваний крупного и мелкого рогато-го скота, включающий предварительное выделение из местных эпизоотических очагов штаммов возбудителей сальмонеллеза и пастереллеза, полученных путем отбора сальмонелл и пастерелл из пораженных органов от больных и павших сельскохозяйственных животных из местных эпизоотических очагов, их идентификацию, раздельное культивирование, наработку биомассы культур возбудителей микробиологическим способом. В ассоциированной вакцине против сальмонеллеза и пастереллеза сельско-хозяйственных животных, содержащей суспензию инактивированных антигенов Pasteurella multocida и Salmonella Dublin местных штаммов, адъювант, согласно изобретению в качестве антигенов, содержит суспензию клеток чистых культур возбудителей Pasteurella multocida и Salmonella dublin из местных штаммов (соотношение сальмонеллезного и пастереллезного компонентов 1:1), а также формалин и гидроокись алюминия, при следующем соотношении компонентов, масс. % (таблица 2):
Таблица 2
Суспензия клеток чистой культуры возбудителя сальмонеллеза, выделенного из местных эпизоотических очагов в питательной среде с титром 8 млрд. микробных клеток в l см3 47,0-48,0
Суспензия клеток чистой культуры возбудителя пастереллеза, выделенного из местных эпизоотических очагов в питательной среде с титром 8 млрд. микробных клеток в l см3 47,0-48,0
Формалин 0,4- 0,5
Гидроокись алюминия 4 - 5
Пример 2. Способ получения препарата с максимальными получениями параметров на основе бактериальных штаммов сальмонелл и пастерелл из местных эпизоотических очагов для приготовления ассоциированной вакцины против заболеваний крупного и мелкого рогатого скота, включающий предварительное выделение из местных эпизоотических очагов штаммов возбудителей сальмонеллеза и пастереллеза, полученных путем отбора сальмонелл и пастерелл из пораженных органов от больных и павших сельскохозяйственных животных из местных эпизоотическых очагов, их идентификацию, раздельное культивирование, наработку биомассы культур возбудителей микробиологическим способом.
В ассоциированной вакцине против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных, содержащей суспензию инактивированных антигенов Pasteurella multocida-В№2 и Д№5 и Salmonella dublin-Г№12 и ЛМ№10 местных штаммов, адъювант. Согласно изобретению в качестве антигенов, содержит суспензию клеток чистых культур возбудителей Pasteurella multocida и Salmonella dublin из местных штаммов (соотношение сальмонеллезного и пастереллезного компонентов 1:2), а также фор-малин и гидроокись алюминия, при следующем соотношении компонентов, мас.% (таблица 3):
Таблица 3
Суспензия клеток чистой культуры возбудителя сальмонеллеза, выделенного из местных эпизоотических очагов в питательной среде с титром 8 млрд. микробных клеток в l см3 23,5-24,0
Суспензия клеток чистой культуры возбудителя пастереллеза выделенного из местных эпизоотических очагов в питательной среде с титром 8 млрд. микробных клеток в l см3 70,5-70,1
Формалин 0,4- 0,5
Гидроокись алюминия 4 - 5
При определении оптимального соотношения сальмонеллезного и пастереллезного компонентов в ассоциированной вакцине установлено, что титр специфических антител (соотношение сальмонеллезного и пастереллезного компонентов 1:1) Пример 1 является наиболее оптимальным, так как способствует наибольшей выработке специфических антител у привитых животных.
Изготовленная ассоциированная вакцина против сальмонеллеза и пастереллеза оказалась стерильной, безвредной и ареактогенной для лабораторных животных.
Заявляемый способ позволяет повысить иммуногенную активность и специфическую безопасность препарата.

. Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, № 2394.
2. Патент Российской Федерации (RU) № 2220743.