СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА S541, ШТАММЫ СТРЕПТОМИЦЕТОВ-ПРОДУЦЕНТЫ АНТИБИОТИКА S541

Изобретение относится к новым соединениям – антибиотикам и к способам их полу-чения, более конкретно изобретение относится к соединениям - антибиотикам, кото-рые могут быть получены посредством ферментации актиномицетов Streotomyces thermoarchaensis штамм NC1B12015, или NC1B12111, или NC1B12114 на среде, со-держащей источник углерода, азота и минеральные соли, при 28-34о С, pII 5,4-7,2 в течение 5-10 сут. с последующим выделением целевого продукта антибиотика S541 формулы



где R1 – метил, этил или изопропил;
R2 –водород или метил. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к новым соединениям – антибиотикам и способам их получе-ния, более конкретно изобретение относится к соединениям-антибиотикам, которые могут быть получены посредством ферментации организмов Streptomyces.
Антибиотики S541 представляют собой группу родственных соединений формулы


более конкретно формулы II



Изобретение распространяется на соединения, имеющие указанные выше форму-лы, как индивидуальные, так и их сочетания. Для определенных областей использова-ния, например в земледелии, в садоводстве или в ветеринарной медицине, более удобным может быть применение Антибиотиков S541 без разделения на индивидуаль-ные компоненты, однако для других областей использования, например в гуманитар-ной медицине, может быть предпочтительным использование индивидуальных соеди-нений.
Первоначально выделенные антибиотики S541 легко разделяются посредством хроматографии на силикагеле на два компонента, которые обладают например, про-тивогельминтной активностью и тушат ультрафиолетовую флуоресценцию при 254 нм. Компонент I характеризуется значением Rf 0,7-0,75, а компонент II – 0,39-0,46, что было определено методом тонкослойной хроматографии на пластинах фирмы Мерк 5735 из силикагеля 60, элюируемых смесью 3:1 хлороформа и этилацетата. Компо-ненты I и II, где R2 является соответственно группой – СН 3 и –Н, антибиотиков S541 мо-гут быть, дополнительно очищены с образованием шести веществ формулы I, облада-ющих активностью антибиотика, например противогельминтной, имеющих общую формулу III.



где R1 – метильная , этильная или изопропильная группа;
R2 – водород или мептильная группа.
Эти шесть веществ формул III обозначим как фактор А (R1 – изопропил, R2 – водо-род), фактор В (R1 – метил, R2 – метил), фактор С (R1 – метил, R2 – водород), фактор D (R1 – этил, R2 – водород), фактор Е (R1 – этил, R2 – метил), фактор F (R1 – изопропил, R2 – метил). Факторы А и С являются особенно предпочтительными.
Факторы В, Е и F получают из компонента I, а факторы А, С и D – из компонента II.
Вещества по изобретению обладают активностью антибиотиков, например проти-вогельминтной, в частности, против нематод, и в особенности активностью против внутренних и внешних паразитов.
В частности обнаружено, что такие вещества являются активными против парази-тирующих нематод, например Haemonchus contortus, Ostertagia circumcineta, Trichostrongylus colubiformis. Dictyocaulus viviparis, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagi, Nippostrongulas loraziliensis, и паразирующих клещиков, таких как Sarcoptes sp., Psoroptes sp. Следовательно, эти вещества могут быть использованы при лечении животных и людей, пораженных внутренними и/или внешними паразитами.
Кроме того, было обнаружено, что такие вещества обладают противофунгицидной активностью, например против штаммов Candida sp., таких как Candida glabrata, и про-тив дрожжей, таких как Saccharomyces carlsbergensis.
Эти вещества также активны против свободно живущих нематод Caenorhabditis elegans.
Кроме того, было найдено, что вещества, полученные по предлагаемому способу являются эффективными при борьбе с насекомыми, клещевидными и не6матодными вредителями в продуктах земледелия, садоводства, лесоводства, в хранящихся про-дуктах и для общего здравоохранения. Вредители почвы и растительных плодов, включая злаки (например, пшеница, ячмень, кукуруза и рис), овощи (например, соя), фрукты (например, яблоки, виноград и цитрусовые), а также корнеплоды (например, сахарная свекла, картофель) могут быть эфеективно уничтожены.
В частности, обнаружено, что предлагаемые вещества являются активными, например, против фруктовых клещиков и тлей, таких как Aphis fabae, Aulacorthum curumflexum, Myzus persicae, at all, и представителей рода Trialeuroides, нематод та-ких как представителя рода Aphelencoides, Globodera Heterodera et al., чешуекрылых, таких как Heliothis, Plutella, Spodoptera, каландрин, таких как Anthonomus grandis, Sitophilus granaries, мучных хрущаков, таких как Tribolium castaneum, мух, таких как Musea domestica, муравьев Рихтера, узкокрылых молей-минерорв Pear psylla, Thrips tabaci, тараканов, таких как Blatella germanica, Periplaneta Americana, и комаров, таких как Aedes aegupti.
Вообще эти вещества могут применяться как в отношении хозяина (животного или человека, или растения, или другой растительности), так и в отношении самих вреди-телей или их очага. Особенно предпочтительными являются факторы A, D, C, D, E, и F, которые указаны выше. Вещества, полученные по предлагаемому способу, могут быть использованы в виде различных лекарственных форм для введения любым удобным способом в ветеринарии или медицине.
Композиции в состав которых входят предлагаемые вещества, могут быть исполь-зованы для парэнтерального (включая внутригрудное, орального, ректального, мест-ного или имплантантного) введения. При составлении композиции, которая должна быть стерильной, например инъекция, глазные капли и мази, активный компонент мо-жет быть приготовлен антисептическим или стерильным, например, после обработки гамма-излучением или окисью этилена.
При использовании в садоводстве или земледелии, вещества, полученные по предлагаемому способу, могут быть включены в рецептуры сухого или жидкого ти-пов, включающие основы дуста, или концентраты, порошки, включающие раствори-мые или увлажненные порошки, грянуляты, включающие микрогранулы или гранулы, способные диспергироваться, таблетки, текучие жидкости, эмульсии, такие как раз-бавленные эмульсии или концентраты, способные эмульгироваться, жидкости для по-гружения, такие как погружные жидкости для корней или для семян, оболочки семян, семенные таблетки, масляные концентраты, масляные растворы, инъекции, например инъекции и стебель, аэрозоли, дымы и туманы.
Обычно такие рецептуры включают соединение в сочетании с подходящим носи-телем или разбавителем. Такие носители могут быть жидкими или твердыми и предна-значаются для облегчения применения вещества или посредством диспергирования там, где оно должно быть нанесено, или для обеспечения рецептуры, которая может быть составлена потребителем в виде препарата, способного к диспергированию. Та-кие рецептуры хорошо известны и могут быть получены традиционными методами, такими как например, смешивание и/или размалывание активного компонента(тов) вместе с носителем или разбавителем, например твердым носителем, растворителем или поверхностно-активным веществом.
Твердые носители, подходящие для использования в рецептурах, таких как дусты, гранулаты и порошки, могут быть выбраны, например, из природных минеральных наполнителей, таких как диатомит, тальк, каолин, монтморилнонит, пирофиллит или аттанульгит. Сильно диспергированная кремневая кислота или сильно диспергиро-ванные поглощающие полимеры могут быть включены в композицию. Используемые гранулированные адсорбирующие носители могут быть пористыми (такими как пем-за,Ю размолотый кирпич, сениолит или бентонит) или непористыми (такими как каль-цит или песок). Могут быть использованы подходящие предварительно гранулиро-ванные материалы, которые могут быть органическими или неорганическими и вклю-чают доломит и размолотые растительные остатки.
Используемые в качестве носителей или разбавителей растворители представляют собой ароматические углеволороды, алифатические углуводороды, спирты и гликоли или их простые эфиры, сложные эфиры, кетоны, амиды кислот, сильно полярные рас-творители, необязательно эпокдиксированные растительные масла и воду.
Также могут быть использованы традиционные неионогенные, катионогенные или анионные поверхностно-активные вещества, например этоксилированные алкилфено-лы и спирты, соли щелочных или щелочно-земельных металлов алкилбензолсульфо-кислот, лигносульфокислоты или сульфонаты полимерных фенолов, которые облада-ют хорошими эмульгирующими, диспергирующими и/или увлажняющими свойства-ми, или индивидуально или в сочетании в композициях.
Кроме того, в композициях могут быть использованы стабилизаторы, противосле-живающиеся добавки, регуляторы вязкости, связующие и липкие добавки, фотостаби-лизаторы, а также удобрения, стимуляторы питания или другие активные вещества, вещества полученные по предлагаемому способу, могут быть использованы в смеси с другими инсектицидами, акарицидами и нематоцидами.
В этих рецептурах концентрация активного материала обычно составляет 0,01-99% и более, предпочтительно 0,01-40 вес.%.
Промышленные продукты обычно поставляются в виде концентрированных ком-позиций, которые для использования могут быть разбавлены до соответствующей концентрации активного материала, например от 0,001 до 0,0001 вес.%.
В земледелии, садоводстве и ветеринарии может быть желательным использова-ние цельного ферментационного бульона (без разделения его на компоненты или фак-торы) в качестве источника активных веществ. Может быть удобынм использование высушенного бульона, содержащего мицелий, или лизированного мицелия, живого или неживого мицелия, выделенного из бульона с использованием методик разделе-ния жидкость – твердое тело или методик выпаривания, или с использованием фер-ментационного бульона, остающегося после выделения мицелия. По желанию мице-лий моет быть пастеризирован или, ибо более предпочтительно, высушен, например методами распылительной сушки или сушки на роликах. Мицелий или бульон могут входить в состав композиций, включающих традиционные инертные носители, среды для лекарств или разбавители, которые описаны выше.
На основе таксономических исследований, конкретным микроорганизмом, спо-собным продуцировать указанные выше вещества, является новый вид рода Strepto-myces , который был назван Streptomyces thermoarchaensis . Образец этого микроорга-низма, выделенного из почвы, депонирован в постоянную коллекцию культур Нацио-нальных Коллекций промышленных и морских бактерий (Исследовательская станция Торри, г. Абердин Великобритания) ему присвоен номер NC1B 12015.
Изобретение также распространяется на любые вещества, которые способны про-дуцироваться посредством ферментации S. Thermoarchaensis NC1B 12015 и которые являются оптическими изомерами веществ формулы 1.
Организм рода Streptomyces предпочтительно представляет собой Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015 или его мутант.
Мутанты S. thermoarchaensis NC1B 12015 могут возникать самопроизвольно или продуцироваться множеством способов. Такие способы включают ионизирующее из-лучение, химические методы, например обработку N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (НТГ), термообработку, генетические методики, такие как реком-бинация, трансдукция, трансформация, лизогенизация и лизогенное превращение, и селективные методики для самопроизвольных мутантов.
Так, например, получены четыре мутантных штамма S. thermoarchaensis NC1B 12015, причем каждый штамм депонирован в коллекции культур Национальных Кол-лекций промышленных и морских бактерий (Исследовательская станция Торри, г. Абердин Великобритания) ему присвоен номер NC1B 12111, NC1B 12112, NC1B 12113 и NC1B 12114: S. thermoarchaensis NC1B 12011, 12112, 12113 и 12114.
Мутантные штаммы NC1B 12011, 12112 и 12113 выведены путем обработки спор S. thermoarchaensis NC1B 12015N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином и затем оха-рактеризованы одностадийным способом Холлидэя.
Мутантный штамм NC1B 12014 возник при самопроизвольной мутации S. thermo-archaensis NC1B 12015 и был идентифицирован как стойкий к стрептомицину, так как оставался жизнеспособным после воздействия сульфата стрептомицина (100 мгк/мл) при 28оС в теч. 5 сут.
Таксономические исследования показывают, что S. thermoarchaensis NC1B 12015 представляет собой микроорганизм нового вида, характеристики которого описаны ниже.
На предпочтительных сноруляционных средах – агаре овсяной муки, солодово-дрожжевом агаре и крахмальном агаре с неорганическими солями – S. thermoarchaen-sis NC1B 12015 обильно растет, продуцируя стабильный субстратный мицелий и воз-душный мицелий, порождающий споры в открытых спиральных цепочках в виде бо-ковых ответвлений на основных гиф. На этих средах обратная пигментация желто-коричневая, а спорофоры серые. При стократном увеличении видно, что спорофоры содержат 2-5 витков в цепочке с 5-10 спорами внутри каждого витка спирали. В сред-нем спорофоры содержат 20-50 спор. При увеличении в 12000 в сканирующем элек-тронном микроскопе видно, что споры имеют гладкие стенки и эллипсоидную форму 0,7х1,4 мкм в наиболее широкой части эллипсоида.
S. thermoarchaensis NC1B 12015 является грамположительным организмом и спо-собен расти и образовывать споры при 20-50оС.
Сравнение приведенных выше данных с опубликованными описаниями в Бергеев-ском справочнике определительной бактериологии показывает, что организм S. ther-moarchaensis NC1B 12015 принадлежит к роду Streptomyces.
Идентификацию S. thermoarchaensis NC1B 12015 на уровне вида-группы проводят, используя компьютеризованную матрицу идентификации.
Ниже приведены результаты 41 таксономического испытания для S. thermoar-chaensis NC1B 12015:
Признак Результат
Цепочка спор мутовчатая -
Цепочка спор жестко связанная -
Цепочка спор прямоизвитая -
Цепочка спор спиральная +
Фрагментация мицелия -
Поверхность спор гладкая +
Поверхность спор морщинистая -
Цвет спор серый +
Цвет спор красный -
Цвет спор зеленый -
Обратный желто-коричневый +
Обратный красно оранжевый -
Использование адонитола -
Использование целлобиозы +
Использование D-фруктозы +
Использование мезо-инозитола -
Использование инулина +
Использование манитола -
Использование раффинозы +
Использование рамнозы +
Использование D-ксилозы +
Использование DL-альфа-аминомасляной
кислоты -
Использование L-гистидина +
Использование L-гидроксипролина -
Расщепление аллантонна +
Расщепление арбутина +
Расщепление пектина + Расщепление лецитина +
Восстановление нитрата +
Производство сероводорода +
Устойчивость к азиду натрия (0,01 вес/об) -
Устойчивость к хлориду натрия (7 вес/об) -
Устойчивость к фенолу (0,1 вес/об) +
Рост при 45оС +
Стойкость к неомицину (50 мкг/мл) -
Стойкость к рафампицину (50 мкг/мл) +
Антибиоз к Aspergillus niger LIV 131 +
Антибиоз к Bacillus subtilis NC1B 3610 -
Антибиоз к Streptomyces murinus ISP 5091 +

Мутантные штаммы NC1B 12111, 12112, 12113 и 12114 все имеют практически аналогичные S.thermoarchaensis существенные признаки. Однако NC1B 12111 для ро-ста требуется аденин, NC1B 12113 – гистидин, а NC1B 12114 стоек к стрентомицину.
Микроорганизмы, способные продуцировать антибиотики S541, легко могут быть обнаружены с помощью удобного мелкомасштабного теста с применением нематод Caenorhabditis elegans, например путем добавления испытуемого образца к суспензии нематод и определения последующего воздействия на жизнеспособность последних.
Получение антибиотиков S541 путем ферментации подходящего организма Strep-tomuces может быть осуществлено традиционными способами, например путем куль-тивирования организма Streptomyces в присутствии источника усваиваемого углерода и минеральных солей.
Источники усваиваемого углерода, азота и минеральных солей могут быть предо-ставлены простыми либо сложными питательными веществами. Источники углерода обычно могут включать глюкозу, мальтозу, крахмал, глицерин, кормовую патоку, лактозу, сахарозу, фруктозу, карбоновые кислоты, аминокислоты, глицериды, спирты, алканы и растительные масла. Вообще источники углерода могут составлять 0,5-10 от веса ферментационной среды.
Источники азота могут включать муку соевых бобов, жидкости замочки зерна, растворимые продукты перегонки, экстракты дрожжей, муку семян хлопчатника, пен-тоны, размолотую ореховую муку, солодовый экстракт, кормовую патоку, казеин, смеси аминокислот, аммиак (газ или раствор), аммонийные соли или нитраты. Также могут применяться мочевина и другие амиды. Источники азота могут составлять 0,1 – 10% от веса ферментационной среды.
Питательные минеральные соли, которые могут быть введены в культуральную среду, включают соли, способные выделять ионы натрия, калия, аммония, железа, магния, цинка, никеля, кобальта, марганца, ванадия, хрома, кальция, меди молибдена, бора, фосфора, сульфата, хлора и карбоната.
Для регулирования избыточного вспенивания может присутствовать противопен-ная добавка, которую добавляют периодически по мере надобности.
Культивирование организма Streptomyces обычно осуществляют при 20-500С, предпочтительно 25-400С, особенно около 340 С, причем желательно, чтобы культи-вирование протекало при аэрировании и перемешивании, например, посредством встряхивания и перемешивания. Среда может быть первоначально инокулирована не-большим количеством суспензии микроорганизма, производящего споры. Причем, чтобы избежать задержки роста можно приготовить вегетативный инокулят организма путем инокулирования небольшого количества культуральной среды спорообразую-щим организмом, полученный вегетативный инокулят может быть перенесен в фер-ментационную среду или, что более предпочтительно, на одну или несколько затра-вочных стадий, где происходит дальнейший рост до переноса в основную фермента-ционную среду. В основном ферментация осуществляется при рН 5,5 – 8,5, предпо-чтительно 5,5 – 7,5.
Ферментация может проводится в течение 2 – 10 сут, например около 5 сут.
Разделение материала, содержащего антибиотики S541 и любые их компоненты или факторы, или введение любых их компонентов или факторов осуществляют с помо-щью традиционных методик выделения и разделения. Антибиотики S541 преимуще-ственно содержатся в мицелии клеток, но также могут быть найдены в ферментацион-ном бульоне. Выделение может быть проведено до или после осветления фермента-ционного бульона, выбор методики выделения может широко варьироваться.
Антибиотики S541 могут быть выделены и разделены с помощью множества мето-дик фракционирования, например с помощью адсорбции - элюирования, осаждения, дробной кристаллизации и экстракции растворителем, которые могут сочетаться раз-личным образом.
Найдено, что экстракция растворителем, хроматография и дробная кристаллиза-ция являются наиболее пригодными для выделения и разделения веществ, получаемо-го по предлагаемому способу.
После ферментации мицелий может быть собран с использованием традиционных методик, например фильтрации или центрифугирования. После этого материал может быть экстрагирован из мицелия подходящим органическим растворителем, таким как кетон, ацетон, метилэтилкетон или метилизобутилкатон, углеводород, например, гек-сан, галоидированный углеводород, например хлороформ, четыреххлористый угле-род или хлористый метилен, спирт, например метанол или этанол, или диол, например пропандиол – 1,2, или сложный эфир, например метилацетат или этилацетат. Если ми-целии содержат значительное количество воды, то предпочтительно использование водорастворимого растворителя.
Для достижения оптимального выделения необходима более чем одна экстракция. Предпочтительно первую экстракцию проводят с использованием смешивающегося с водой растворителя, такого как метанол или ацетон. Антибиотики могут быть выделе-ны в виде сырого экстракта посредством удаления растворителя. Экстракты раствори-теля могут быть сами экстрагированы после уменьшения объема растворителя, например, посредством выпаривания. На этой стадии предпочтительно использовать не смешивающийся с водой растворитель, такой как гексан, хлороформ, хлористый метилен или этилацетат или их смесь, причем для достижения удовлетворительного распределения соединений – антибиотиков добавляют достаточно количество воды. При удалении не смешивающейся с водой фазы получают материал, содержащий ан-тибиотики S541 . Фактор В может бть выделен посредством кристаллизации из подхо-дящего растворителя, например изопропанола.
Очистка и/или разделение активных компонентов и/или факторов могут быть осуществлены традиционными способами, такими как, например, хроматография (включая жидкостную хроматографию высокого разрешения) на подходящем носите-ле, таком как силикагель, нефункциональная макросетчатая адсорбционная смола, например, сшитые полистирольные смолы, такие как амберлит XAD 2, XAD-4 или XAD-1180 (фирма «Роом и Хаас, Лтд.»), или смола S112 (фирма «Кассталл. Лтд.»), или совместно с органическим растворителем сшитый декстран, такой как сефадекс LH20 (фирма «Фармация Ю-Кей.Лтд.»), или в случае жидкостной хроматографии вы-сокого разрешения – обратимофазные носители, такие как привитой углеводородный силикагель, например С18 –привитой силикагель. Этот носитель может находится в виде слоя или, что боле предпочтительно, набит в колонку. В случае нефункциональ-ных макросетчатых смол, таких как XAD-1180 или S112, для элюирования могут быть, использованы смеси органических растворителей, например ацетопирил с во-дой.
Обычно раствор веществ в подходящем растворителе запускается в колонки с си-ликагелем или сефадексом после первого уменьшения объема растворителя. Колонка необязательно может быть промыта и затем элюирована растворителем подходящей полярности. В случае сефадекса и силикагеля в качестве растворителей могут быть использованы спирты, такие как метанол, углеводороды, такие как хлороформ или хлористый метилен, или сложные эфиры, такие как этилацетат. Кроме того, могут применяться сочетания таки растворителей или без воды, или с водой.
Заходом элюирования и разделения/очистки веществ можно следить, используя традиционные методики, такие как хроматография, например тонкослойная хромато-графия, и жидкостная хроматография высокого разрешения.
При хроматографировании на силикагеле, предпочтительно с использованием элюента, такого как смесь хлороформ: этилацетат, антибиотики S541 легко разделяют-ся на компоненты І и І І, причем компонент І элюируется первым. Затем легко могт быть получен из компонента І факторы В, Е и F с использованием, например, жидкост-ной хроматографии высокого разрешения. Аналогично, факторы А, С и D легко могут быть выделены из компонента І І. Альтернативно фактор В может быть разделен с фак-торами E и F путем кристаллизации из спирта, такого как метанол или изопропанол. По желанию, маточные растворы, содержащие факторы E и F, могут быть подвергнуты дальнейшей очистке,анапример хроматографической на силикагеле, причем факторы E и F выделяют с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения.
После того как эти факторы получены, они могут быть очищены дополнительно посредством кристаллизации, например, из метанола, изопропанола или смеси мета-нол/вода, и это распространяется на вещества, находящиеся в кристаллическом состо-янии.
С помощью подходящего сочетания указанных выше методик вещества, получен-ные согласно предлагаемому способу, выделяют в твердом состоянии. Причем поря-док, в котором проводятся указанные выше стадии очистки, и выбор этих стадий для применения могут широко варьироваться.
Так, фактор В получен как кристаллическое твердое вещество, имеющее степень чистоты выше 90%. Аналогично факторы А, C, D, E и F имеют степень чистоты выше 90%. Однако эти факторы используются со степенью чистоты, соответствующей их предполагаемому использованию: для применения в медицине желательна степень чистоты по меньшей мере 90%, предпочтительно выше чем 90% для использования в ветеринарии, земледелии или садоводстве достаточны степени чистоты, например, 50% или ниже.
Изобретение иллюстрируется примерами, где приняты следующие сокращения: ТСХ – тонкослойная хроматография ( с использованием пластинок фирмы Мерк 5735 с силикагелем 60, проявленных смесью (3:1) хлороформ: этилацетат); ХК – хромато-графия на колонке фирмы Мерк 7734 с силикагелем 60 (колонка длинной 200 и диа-метром 4 см), элюируемой смесью (3:1) хлороформ: этилацетат; ЖХВР – жидкостная хроматография высокого разрешения; ПЭ – петролейный эфир (т. Кип. 60 - 800С).
Среды А, В и С, которые упоминаются в примерах, имеют следующий состав.
Среда А, г/л:
D – Глюкоза 15,0
Глицерин 15,0
Соевый пентон 15,0
Хлористый натрий 3,0
Углекислый кальций 1,0
Дистиллированная вода до 1 л
рН доводят до значения 7,0 водным раствором едкого натра до выдерживания в автоклаве.
Среда В, г/л:
D – Глюкоза 2,5
Солодовый декстрин М ЗОЕ (фирма
«Рокуетт, Лтд.» Великобритания) 25,0
Арказой 50 (фирма «Бритиш Аркадии Ко., Лтд.») 12,5
Кормовая патока 1,5
К2НРО4 0,125
Карбонат кальция 1,25
МОР S[3-(N-морфолино)-пропанфульфокислота] 21,0
Дистиллированная вода до 1 л
рН доводят до значения 6,5 водным 5 н. раствором едкого натра до выдерживания в автоклаве.
Среда С, г/л:
D – Глюкоза 2,5
Солодовый декстрин МД ЗОЕ (фирма
«Рокуетт, Лтд.» Великобритания) 25,0
Арказой 50 12,5
Свекольная патока 1,5
К2НРО4 0,125
Углекислый кальций 1,25
Силикон 1520 (фирма «Доу Корнинг») 0,625
Дистиллированная вода до 1 л
рН доводят до 6,5 до стерилизации.
Пример 1. Споры Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015 инокулируют на скошенный агар, состоящий из следующих компонентов, г/л:
Дрожжевой экстракт (фирма «Оксоид L21») 0,5
Солодовый экстракт (фирма «Оксоид L39») 30,0
Микологический пептон (фирма «Оксоид L40») 5,0
Агар № 3 (фирма «Оксоид L13») 15,0
значение рН около 5,4, и культивируют при 280С в течение 10 сут. Затем созревший скошенный агар покрывают 10% - ным раствором глицерина (6 мл) и соскабливают стерильным инструментом, для того чтобы, разрыхлить споры и мицелий. Аликвоты (0,4мл) полученной суспензии спор переносят в стерильные полипропиленовые со-ломки, которые затем термически запаивают и хранят в парах жидкого азота до упо-требления.
Содержимое отдельной соломки используют для инокулирования 10 мл. среды А, которую затем культивируют при 280С в течение 3 сут на качалке, вращающейся со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального движения 50 мм. Эта культивируе-мая среда используется для иноклирования (в количестве 2%) 15 пробирок и двух колб Эрленмейера (емкостью 250 мл), содержащих соответственно 10 мл и 50 мл среды В.
Пробирки и колбы культивируют при 280С в течение 5 сут, а затем культуры раз-дельно фильтруют под вакуумом и клетки встряхивают в течение 30 мин с метанолом, взятым в количестве, равном объему фильтрата культуры.
Активность против Caenorhabditis elegans определяют в экстрактах клеток, выра-щенных в пробирках и колбах. Мицелиальные экстракты объединяют, выпаривают досуха и повторно экстрагируют метанолом до концентрата (6 мл), который подают в колонку, заполненную сефадексом Н20 (110х2,5 см) и элюированную метанолом. Со-бирают фракции по 10 мл.
Фракции 21-28 сгруппировывают и выпаривают с образованием маслянисого остатка (156 кг), который экстрагируют смесью (3:1) хлороформ: этилацетат. Полу-чают 3 мл экстракта, который подвергают ХК (колонка 55 х 2,5 см), собирают фракции по 10 мл и анализируют методом ТСХ, используя пластины, содержащие флуорес-центный индикатор. Фракции 20-23 и 36-44 вызывают две главные области, которые тушат флуоресценцию, их идентифицируют как компонент І (Rf 0,70) и компонент І І (Rf 0,43).
При выпаривании фракций 20-23 получают компонент І в твердом виде (9 мг). В максимумах поглощения при 238, 245 и 254 им величины Е1 равны соответственно 340, 350 и 200.
При выпаривании фракций 36-44 получают компонент І І в твердом виде (11 мг). В максимумах при 238, 245 и 254 им величины Е составляют соответственно 440, 460 и 280.
Пример 2. Каждую из двух колб Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащую по 50 мл среды А, инокулируют 0,2 мл суспензии спор Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015, взятой из соломки, приготовленной как описано в примере 1. Колбы культивируют при 280С в течение 3 сут на качалке, вращающейся со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального движения 50 мм. Затем содержимое обеих колб используют для инокулирования сосуда-ферментера емкостью 20 мл, содержащего 12 л среды В. Через 5 сут роста производит сбор клеток культуры, которые обрабаты-вают, как описано в примере 3.
Пример 3. Через 5 сут культивирования при 280 С ферментационного бульона (12 л), полученного, как описано в примере 2, производят сбор клеток, которые центрифу-гируют со скоростью 4200 об/мин при 100 С в течение 15 мин. Лепешку из клеток смешивают с 5 л метанола и выдерживают при 40 С в течение 20 ч. Мицелиальный экстракт фильтруют, выпаривают при 400 С и подвергают азиотропной перегонке по-сле добавления 100 мл бутанола -1. Затем экстракт обрабатывают метанолом (5 раз по 200 мл), объединенные экстракты выпаривают до объема 100 мл и подают на колонку с сефадексом LH20 (112x5 см). Колонку элюируют метанолом и после пробного про-хождения 200 мл собирают фракции по 50 мл. Фракции 40-90 группируют и выпари-вают, получая 3,85 г маслянистого остатка. Этот остаток экстрагируют 77 мл смеси (3:1) хлороформ: этилацетат, фильтруют и затем подвергают разделению на ХК, при-чем после пробного прохождения 200 мл собирают фракции объемом около 15 мл.
Фракции 124-142, содержащие компонент І, группируют и выпаривают, получая 253 мг твердого вещества, из которых 216 мг очищают методом ЖХВР (колнка с фа-зой Зорбакс ODS, 25 х 2,1 см, элюент 80% ацетонитрила /вода). Фракции 250–320, со-держащие компонент І І, группируют и выпаривают, получая 602 мг твердого веще-ства, из которых 540 мг очищают методом ЖХВР (как для фракций 124 – 142 ) и соби-рают фракции из нескольких опытов.
Элюируемый из колонки ЖХВР материал просматривают методом УФ-спектроскопии при 243 им. Вещества, имеющие пики поглощения при этой длине вол-ны, высушивают и испытывают на активность против Carnorhabditis elegans, а также анализируют методом ТСХ. Четыре вещества, которые активностью против Caeno-rhabditis elegans, также имеют значение Rf 0,3 9 - 0,46 или 0,70 – 0,75.
Компонент І даст один пик со значением Rf 0,70 до 0,75, этот пик был приписан фактору В. Компонент І І дает три пика со значениями Rf 0,3 9 - 0,46, эти три пика бы-ли приписаны факторам A, C и D.
Фактор А, элюированный из колонки ЖХВР между 260 и 340 мл после введения образца, имеет значение Rf 0,44, найденное методом ТСХ. Фактор В элюируют из ко-лонки ЖХВР между 270 и 310 мл после введения образца, причем он имеет значение Rf 0,62, найденное методом ТСХ. Фактор С элюируют из колонки ЖХВР между 160 и 180 мл после введения образца, причем он имеет значение Rf 0,4, найденное методом ТСХ. Дополнительные характеристики факторов A, B, C и D описаны ниже.
Пример 4. Используют 0,4 мл суспензии спор организма Streptomyces thermoar-chaensis NC1B 12015, взятой из соломки, приготовленной как описано в примере 1, для инокулирования 50 мл среды А, содержащейся в колбе Эрленмейера емкостью 250 мл. Колбу культивируют при 280С в течение 4 сут на качалке, вращающейся со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального движения 50 мм. Затем используют порции по 8 мл для того, чтобы инокулировать каждую из двух плоскодонных колб, содержащих 400 мл той же среды, и затем культивируют в тех же самых условиях в течение 3 сут.
Содержимое обеих колб затем используют для инокулирования сосуда ферменте-ра емкостью 70 л, содержащего 40 л среды В, дополненной силиконом 525 (фирма «Доу Корнинг», 0,0625 об/об. %). Ферментаию проводят с перемешиванием и аэриро-ванием, которое обеспечивает поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более20% от насыщения, причем при необходимости добавляют силиконо-вый антивсиениватель. Через 10 сут проводят сбор ферментационных клеток, причем бульон (40 л) осветляют центрифугированием (1500 об/мин). Жидкость над осадком заменяют на воду (5 л) и выделенные клетки (1,4 кг) замораживают при -200 С.
Через неделю замороженные клетки оттаивают, суспендируют в 15 л метанола и осторожно перемешивают 15 ч. Затем суспензию фильтруют и твердый остаток по-вторно экстрагируют метанолом (10 л). Объединенные фильтры (25 л) разбавляют водой (12 л) и экстрагируют петролейным эфиром 925 л). Через 30 мин фазы разде-ляют центрифугированием.
Нижнюю метанольную фазу снова экстрагируют петролейным эфиром (3 раза: 25, 15 и 15 л). Объединенные фазы петролейного эфира (80 л) концентрируют, пропуская три раза через тонкопленочный испаритель ифаудлер 8,8 – 12V – 27 (давление паров 0,1 бар, температура паров 200 С, температура водяного пара 1270 С), и концентрат (8 л) сушат сульфатом натрия (1 кг) и дополнительно концентрируют при пониженном давлении и 400 С в роторном пленочном испарителе. Маслянистый остаток (15 мл) растворяют в смеси хлороформа и этилацетата (70 мл, 3:1 об/об.) и подвергают разде-лению на ХК, собирая фракции объемом около 40 мл после пробного прохождения 1400 мл.

Фракции 45 -65 объединяют и выпаривают, получая фактор В (940 мг, как указано в примере 3), который дважды перекристаллизовывают из метанола и окончательно из нитрометана. Кристаллы подвергают рентгеновскому дифракционному анализу монокристаллов, из которого следует, что кристаллы представляют собой орторомби-ческие прозрачные призмы с параметрами: а = 10,171/3/, b = 13,317/5/, с = 25,032-7/, λ, объем ячейки 3391 А3, Z = 4, пространственная группа Р2L 2L 2L, Dc = 1,18 г/см3, R = 0,053 для 2169независимо наблюдаемых отражений (Ǿ меньше 580), измеренных ди-фрактором с Cu-K - излучением (длина волны 1,54178 А).
Пример 5. Инокулят Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015 готовят, как опи-сана в примере 4, причем период роста составлял 2 сут, и используют его для иноку-лирования сосуда ферментера (70 л), содержащего 40 л среды В, дополненной поло-пропиленом 2000 (0,065 об/об.%) вместо силикона 525. Полипропилен 2000 добав-ляют по мере необходимости на протяжении ферментации для того, чтобы уменьшить вспенивание. Ферментацию проводят при 280 С с перемешиванием и аэрированием, которое обеспечивает поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 30% от насыщения. Через 24 ч ферментации порцию бульона (1 л) пере-носят в ферментер (700 л), содержащий 450 л среды, имеющий следующий состав, г/л:
D – Глюкоза 2,8
Солодовый декстрин (МД ЗОЕ) 27,8
Арказой 50 13,0
Кормовая патока 1,7
К2НРО4 0,14
СаСО3 1,39
Силикон 1520 (Доу Корнинг) 0,06%
(об/об.)
До стерилизации доводят рН до 6,5.
Ферментацию проводят при 280 С с перемешиванием и аэрированием, обеспечи-вающим поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 20% от насыщения. Через 2 сут доводят рН до 7,2 добавлением серной кислоты. Через 5 сут ферментации проводят сбор клеток культуры.
Бульон (450 л) осветляют путем центрифугирования и жидкость над осадком за-меняют водой (20 л). Выделенные клетки (25,5 кг) перемешивают в течении 1 ч в та-ком количестве метанола, чтобы общий объем смеси состалял 75 л. Суспензию филь-труют, твердый остаток повторно экстрагируют 35 л метанола и фильтруют. Объеди-ненный фильтрат (87 л) разбавляют водой (40 л) и экстрагируют петролейным эфи-ром. Через 30 мин фазы разделяют центрифугированием, и нижнюю метанольную фа-зу повторно экстрагируют петролейным эфиром (30 л) после добавления 40 л воды. После разделения нижнюю фазу снова экстрагируют 30 л ПЭ. Объединенные фазы петролейного эфира (85 л) концентрируют, пропуская через тонкопленочный испари-тель ифаудлер 8,8 – 12V – 27 (давление паров 0,1 бар, температура паров 200 С, тем-пература водяного пара 1270 С). Концентрат (9 л) сушат сульфатом натрия (2 кг) и до-полнительно концентрируют при пониженном давлении при 400 С в роторном пле-ночном испарителе. Маслянистый остаток (130 мл) растворяют в хлороформе, полу-чая 190 мл смеси, которую подвергают разделению на ХК (набивая колонка, промы-тая 500 мл хлороформа), собирают фракции объемом около 40 мл после пробного прохождения 1400 мл.
Фракции 32 -46 объединяют и выпаривают, получая 21,2 г масла. Фракции 47 -93 объединяют и выпаривают, получая 20,1 г масла, которое растворяют в смеси (3:1) хлороформ: ЭА до объема 50 мл. Раствор разделяют на ХК, собирая фракции объе-мом около 40 мл после пробного прохождения 1400 мл. Фракции 22 -23 объединяют и выпаривают, получая 3,1 г масла, которое добавляют к маслу, полученному из фракций 32 -46 на первой колонке. Объединенные масла растворяют в кипящем мета-ноле (4 мл) и затем этот раствор добавляют к 20 мл горячего пропанола – 2, получая при выдерживании кристаллический фактор В (2,57 г).
Маточный раствор после кристаллизации фактора В выпаривают, получая масло, которое растворяют в равном объеме хлористого метилена , и раствор подают на ко-лонку (30 х 2,2 см) с фазой мерк кизельгель 60 (70 – 230 меш, ASTMx № 7734), запол-ненной в хлористом метилене. Слой промывают СН2Сl2 (вдвое больше объема слоя) и элюируют смесью (3:1) хлороформ: этилацетат (2 объема слоя). При выпаривании элюата получают масло, которое растворяют в метаноле и подвергают препаративно-му разделению методом ЖХВР на сферисорбе S 50DS – 2 (250 x 20 мм, фирма «Фэцз Сеп. Лтд.»). Образец объемом 5 мл прокачивают через колонку в течение 1 мин и ко-лонку элюируют смесью (7:3) ацетонитрил : вода при следующих условиях:

Время, мин Поток, мл/мин
0,00
1,00
1,10
39,90
40,00
75,00 0,00 (Время
0,00 ввода
30,00 пробы)
30,00
35,00
35,00

Элюируемый из колонки ЖХВР материал анализируют методом УФ - спектроско-пии при 238 нм. При выпаривании объединенных фракций, имеющих пик, элюируе-мый на 26,3 минуте, получают фактор Е в твердом виде. При выпаривании объединен-ных фракций, имеющих пик, элюируемый на 36,4 минуте, получают фактор F в твер-дом виде.
Пример 6. Ферментационный бульон (аналогичны примеру 2) с урожаем клеток культуры через 117 ч обрабатывают в автоклаве (1210С, 1 ч), охлаждают до комнат-ной температуры и перемешивают на магнитной мешалке, получая гомогенную сус-пензию клеток. Две порции суспензии (2мл) центрифугируют (ускорение 12 000 g , 2 мин, комнатная температура), декантируют жидкость над осадком и осажденные клет-ки суспендируют в 2 мл воды, тщательно смешивают и снова подвергают центрифуги-рованию (ускорение 12 000 g , 2 мин, комнатная температура). После декантации жид-кости над осадком клетки дважды промывают дистиллированной водой (порции по 2 мл). Затем промытые клетки тщательно смешивают с водой (2 мл) или с метанолом (2 мл) и выдерживают при комнатной температуре при периодическом встряхивании в течении 1,5 ч. Суспензию снова центрифугируют (12 000 g , 2 мин, комнатная темпе-ратура) и надосадочные жидкости последовательно разбавляют в воде. Клетки из водных суспензий повторно суспендируют в воде и немедленно последовательно разбавляют водой. Порции (10 мкл) каждого из разбавлений добавляют к суспензии (20 мкл) нематод Caenorhabditis elegans в буферном растворе, содержащим, г/л: гид-рофосфат натрия 6; гидрофосфат калия 3; хлорид натрия 5; семиводный сульфат маг-ния 0,25 – и имеющем рН 7,0. Через 4 ч суспензию нематод исследуют, чтобы устано-вить, какие азбавление испытуемой смеси вызывают полное ингибирование подвиж-ности более чем 98% нематод в анализируемой суспензии. Было найдено, что разбав-ления метанольного экстракта 1:5, 1:25, 1:250 и 1:500, разбавления клеточной суспен-зии 1:5, 1:25, 1:250, 1:500 и 1:1 000 и разбавления водного экстракта 1:2, 1:4 и 1:8 вы-зывают такое ингибирование нематод, когда 10 мкл добавляют к 200 мкл суспензии нематод.
Пример 7. 50 мл среды А или среды В Эрленмейера емкостью 250 мл инокулиру-ют 0,4 мл суспензии спор S. thermoarchaensis NC1B 12015, взятой из соломки, приго-товленной как описано в примере 1. Колбы, содержащие среду А или В, культивируют при 280С в течение 2 сут на роторной качалке, работающей в режиме250 об/мин с диаметром хода 50 мм. Затем из каждой среды берут пори (8 мл) для инокулирования плоскодонных колб емкостью 2 л, содержащих 400 мл той же самой среды (А или В соответственно). Эти колбы культивируют в течение 2 сут при тех же условиях.
Два ферментера емкостью 70 л каждый инокулируют двумя колбами среды А и один 70-литровый ферментер инокулируют двумя колбами среды В. Каждый фермен-тер содержит 40 л среды С.
Ферментацию проводят при 340С перемешиванием и аэрированием, достаточным для поддержания концентрации растворенного кислорода свыше 30% от насыщения. Приблизительно через 24 ч ферментации значение рН смеси доводят до 7,2 добавле-нием водного раствора серной кислоты. При необходимости добавляют антивспени-ватель – полипропиленгликоль 2000. Через 5 сут проводят сбор клеток, которые объ-единяют.
70 –литровый ферментер, который также инокулируют двумя колбами, содержа-щими среду В, содержит среду В с добавлением 0,06% силикона 1520. Ферментацию проводят при 280С с перемешиванием и аэрированием, достаточными для поддержа-ния концентрации растворенного кислорода на уровне свыше 30% от насыщения. При необходимости для уменьшения вспенивания добавляют полипропиленгликоль 2000. Через 24 ч порцию 9 л переносят в ферментеремкостью 700 л содержащей 450 л сре-ды С.
Ферментацию проводят при 340С перемешиванием и аэрированием, достаточными для поддержания концентрации растворенного кислорода на уровне - свыше 30% от насыщения. Вспенивания регулируют добавлением полипропиленгликоля 2000 и приблизительно через 24 ч рН среды доводят до 7,2 добавлением водного раствора серной кислоты. Через 4 сут ферментации собирают клетки культуры, которые объ-единяют с тремя описанными выше продуктами ферментации.
Объединенные бульоны с клетками центрифугируют на центрифуге «Шарплес AS16PУ» со скоростью около 120 л/ч. Остаточную жидкость над осадком в центрифу-гируемых сосудах заменяют на воду.
Выделенные клетки (11,65 кг) суспендируют в 33 л метанола с помощью смесите-ля Силверсона. Через 60 мин суспензию фильтруют через киперную ткань и остаток еще раз суспендируют в 34 л метанола. Через 40 мин суспензию снова фильтруют. Фильтраты от двух метанольных экстракций объединяют.
Объединенные экстракты (53,5л) смешивают с 27 л воды и 27 л петролейного эфи-ра. После перемешивания в течение 20 мин две фазы разделяют на центрифуге «Вест-фалия МЕМ 1256». Нижнюю водно-метанольную фазу (70л) смешивают с водой (37 л) и петролейным эфиром (27л), перемешивают и разделяют, как и раньше. Межфаз-ную эмульсию в фазе петролейного эфира разбивают ацетоном (4 л). Нижнюю водно–метанольную фазу (108 л) затем смешивают с водой (40 л) и петролейным эфиром (27л) в третий раз, перемешивают и разделяют, как и раньше, причем для разбиения межфазной эмульсии используют 4 л ацетона. Затем три гексановых экстракта объ-единяют.
Объединенные экстракты петролейного эфира (85 л) концентрируют на тонкопле-ночном испарителе (давление паров 0,15 бар, температура паров 260 С). Концентрат (3 л) сушат сульфатом натрия (2 кг) и затем дополнительно выпаривают при пони-женном давлении и 400 С. Полученное масло (639 г) растворяют в смеси хлороформа и этилацетата (3:1, об/об.) и фильтруют и промывные жидкости (1060 мл) разделяют на ХК (1500 мм, диаметр 100 мм), элюируя со скоростью потока 6 л/ч.
Фракции, элюируемые между 8,8 и 13,1 л, объединяют и выпаривают при низком давлении, получая 56,3 г масла; фракции элюируемые между 13,1 и 24,6 л, упаривают, аналогично, получая светло –желтое твердое вещество (153,4 г).Первые фракции в основном содержат фактор В, тогда как последние фракции содержать смесь факто-ров A, B, C и D. Фактор В в этой последней фракции последовательно удаляют при повторении разделения на ХК, как описано выше, дважды (последний раз на свежем силикагеле) при аналогичных условия за исключением того, что скорость потока была снижена до 3 л/час.
Пики веществ, содержащих факторы A, C и D, из второй из указанных колонок элюируют между 8,8 и 17,6 л, достаточный фактор В, который она содержит, разде-ляют на третьей колонке, из которой факторы A, C и D элюируются между 14 и 28 л. Этот окончательный объединенный элюат упаривают при пониженном давлении, по-лучая 114 г твердого вещества. Пики веществ, содержащих фактор В, из двух колонок (7,5 - 8,8 л и 10,3 – 13,4 л соответственно) выпаривают до масла (соответственно 10,7 и 10 г) и объединяют с маслом, полученным на первой из этих трех колонок.
Масла, содержащие фактор В, растворяют в кипящем метаноле (25 мл) и смеши-вают с кипящим пропанолом – 2 (100 мл). При охлаждении до 40Сфактор В кристал-лизуется. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (200 мл), охлаждают до -250С и сушат в вакууме, получая 25,3 г фактора В.
Твердое вещество из третьей силикагеловой колонки, в котором содержатся фак-торы A, C и D, сушат в вакууме до постоянного веса (87 г). Образцы (20 г) этого твер-дого вещества растворяют в 190 мл метанола и доводят до объема 230 мл смесью (7:3 по объему) ацетонитрила и воды. Затем порции (5 мл) этого раствора разделяют на хроматографической колонке (250 мм, диаметр 21,2 мм) со сферисорбом ODS – 2 (ча-стицы диаметром 5 мкм), используя в качестве элюирующего растворителя смесь (7:3) ацетонитрила и воды. Скорость потока элюента поддерживают равной 20 мл/мин приблизительно в течение 10 с, затем ее постоянно увеличивают до 34 мл/мин в тече-ние 22-минутного периода и эту скорость поддерживают еще в течение 3 мин. Элюи-руемые факторы детектируют при длине волны 238 нм. Фактор С элюируют между 11,0 – и 13,4-й минутами. Фактор D между 13,4- и 17,4-й минутами и фактор А между 17,4- и 23,0-й минутами.
Содержащие фактор С фракции из каждого хроматографического разделения объ-единяют и выпаривают при низком давлении до твердого вещества. Фракции, содер-жащие фактор А, аналогично выпаривают до твердого вещества. Фракции содержа-щие фактор D, также объединяют и выпаривают, получая неочищенное твердое веще-ство (7 г). Последнее вещество снова растворяют в метаноле (65 мл), смешивают с водным ацетонитрилом (30 об.% воды) и повторно хроматографически на колонке со сферисорбом ODS – 2, как описано выше, с тем исключением, что при разделении поддерживают постоянным поток элюента 20 мл/мин. Теперь фактор D элюируют между 16- и 20-й минутой, и эти фракции из каждого хроматического разделения объ-единяют. Объединенные элюаты выпаривают до твердого вещества. Три твердых ве-щества, содержание факторы A, C и D, высушивают над Р2О5 в вакууме до постоянно-го веса (55; 7,0 и 1,21 г соответственно).
Показано, что каждое из четырех твердых веществ, выделенных в этом способе, аналогично образцам факторов A, В, C и D.
Пример 8. 50 мл среды В, содержащейся в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, инокулируют суспензией спор организмов Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12111, 12112, 12113 и 12114 (по 0,5 мл), взятой из соломок, приготовленных, как опи-сано в примере 1.
Колбы, содержащие S. thermoarchaensis NC1B 12111, NC1B 13112, NC1B 12113, культивируют при 310С на роторной качалке. Колбу, содержащую S. thermoarchaensis NC1B 12114, культивируют при 280С в течение 2 сут и затем 1 мл бульона переносят в другую колбу Эрленмейера, содержащую 50 мл среды В. Эту колбу культивируют при 310С на роторной качалке. Все колбы встряхивают со скоростью 250 об/мин при диаметре хода 50 мм.
Через 4 сут культивирования центрифугируют 10 мл образца каждого бульона при ускорении 1250 g в течение 45 мин и обрабатывают, как указано ниже. Жидкость над осадком сливают и таблетку осадка повторно суспендируют в 10 мл метанола. Сус-пензию тщательно встряхивают и выдерживают 1 ч при периодическом перемешива-нии. Затем суспензию центрифугируют при 10 000 ε в течение 5 мин и жидкость над осадком анализируют методом ЖХВР (колонка S5 ODS -2, 10 см, диаметр 4,6 мм, элюент 70% - ный ацетонитрил / 0,1 М раствор дигидрофосфата аммония). Пики ве-ществ анализировали при 246 нм.
В каждом случае анализ ЖХВР показал наличие факторов A, В, C и D.
Пример 9. Установлено, что факторы A, В, C, D, E и F содержать только углерод, водород и кислород.
Методом масс-спектроскопии электронного удара (МСЭУ) были получены ре-зультаты для факторов A, В, C, D, E и F (приведенные в табл. 1).



Таблица 1

Фактор
Молекулярный
ион Соответствующая молекулярная фор-мула

A
B
C
D
E
F

612,37
598,35
584,34
598,35
612,3638
626,3807
С36Н52О8
С35Н50О8
С34Н48О8
С35Н50О8
С36Н52О8
С37Н54О8





Методом масс – спектроскопии с бомбардировкой быстрыми атомами (МС-ББА) были получены результаты, приведенные в табл. 2.



Таблица 2

Фактор +е ББА -е ББА Мол. вес
А


B




С

D M / Z 635 (M+Na)+
M / Z 613 (M+H)+

M / Z 691 (M+H+глицерин)+
M / Z 599 (M+Н)+
M / Z 581 (MН-Н2О)+
M / Z 563 (MН-2Н2О)+

M / Z 607 (M+Na)+

M / Z 621 (M+Na)+
M / Z611 (M-H)-







M / Z 583 (M+Н)-

M / Z 597 (M+Н)-
612


598




584

598

Методом масс-спектроскопии полевой десорбции для фактора Е были получены следующие результаты: M / Z 612 M+, а для фактора F - M / Z 626 M+ .
В спектре МСЭУ фактора А при точном измерении масс отмечены ионы: при 612,37 – С36Н52О8; 466,31 – С30Н42О4; 448,30 – С30Н40О3; 425,23 – С26Н33О5; 354,22 – С23Н30О3; 297,22 – С21Н29О ; 278,11 – С15Н18О5; 247,17 – С16Н23О2; 219,18 – С15Н23О ; 95,05 – С6Н7О.
В спектре МСЭУ фактора В при точном определении масс отмечены ионы: при 598,35 – С35Н50О8; 438,28 – С28Н38О4; 420,26 – 314,19 – С20Н26О3; 248,14 – С15Н20О3; 151,08 – С9Н11О2.
В спектре МСЭУ фактора С при точном определении масс отмечены ионы: при 584,34 – С34Н48О8; 566,33 – С34Н46О7; 438,28 – С28Н38О4.
В спектре МСЭУ фактора D при точном определении масс отмечены ионы: при 598,35 – С35Н50О8; 452,29 – С29Н40О4; 434,28 – С29Н38О3.
В спектре МСЭУ фактора Е при точном определении масс отмечены ионы: при 452,2908 – С29Н40О4, и для фактора F ионы при 466,3067 – С30Н24О4.
Факторы A, B, C, D, E и F имеют следующие характерные пики в ИК-спектре (в бромоформе).
Для фактора А – около 3510 (ОН); 1712 (сложный эфир) и 998 см -1 (С-О).
Для фактора В – около 3510 (ОН); 1710 (сложный эфир) и 996 см -1 (С-О).
Для фактора С – около 3510 (ОН); 1712 (сложный эфир) и 996 см -1 (С-О).
Для фактора D – около 3508 (ОН); 1711 (сложный эфир) и 996 см -1 (С-О).
Для фактора E – около 3500 (ОН); 1708 (сложный эфир) и 994 см -1 (С-О).
Для фактора F – около 3100 (ОН); 1708 (сложный эфир) и 997 см -1 (С-О).
Факторы A, B, C, D, E и F имеют УФ-спектре в растворе метанола (0,002%), где П – перегиб и М – максимум (см. табл. 3).



Таблица 3

Фактор
Длина волны, нм Е¦


A


B


C


D


E*


F*

252 П
244,5 М
239 П
252 П
244,5 М
239 П
252 П
244,5 М
239 П
252 П
244,5 М
239 П
252 П
244 М
238 П
252 П
244,5 М
239 М

318
468
430
302
426
394
316
470
432
263
393
362
266
402
373
285
421
389
*Концентрация в метаноле С=0,001%

Приведенные выше значения макс представляют собой характеристику каждого фактора, значения Е¦ отражают чистоту материала в полученном виде (отношения ве-личины Е¦ являются характеристичными для вещества).
Спектры протонного магнитного резонанса (ПМР) при 200 МГ каждого фактора в растворе дейтерохлороформа включают следующие сигналы (значения с мульти-плектностью, константами сочетания (Гц) и интегральными величинами в скобках).
Фактор А: 4,1 – 4,4 (м, 2Н); 4,61 (шир. С, 1Н); 4,6 – 4,75 (м, 2Н); 4,81 (д, 9, 1Н); 5,05 – 4,4 (м, 1Н); 5,34 (с, 2Н); 5,69 (д, 5, 1Н); 6,06 (д, 5, 1Н); 6,17 (м, 1Н); 6,26 (д, 11, 1Н); 6,37 (м, 1Н); 6,46 (д, 10, 1Н); 6,74 (к, 2, 1Н); 7,42 (м, 1Н); 7,7 – 7,9 (м, 5Н); 8,14 (с, 3Н); 8,40 (с, 3Н); 8,47 (с, 3Н); 8,61 (т, 11, 1Н); 8,96 (д, 7, 3Н); 9,06 (д, 7, 3Н); 9,02 (д, 7, Н); 9,13 (к, 11, 1Н); 9,21 (д, 7, 3Н).
Фактор В: 4,2 – 4,4 (м, 2Н); 4,55 (к, 7, 1Н); 4,65 (шир. с, 1Н); 4,6 – 4,8 (м, 2Н); 5,06 (м, 1Н); 5,3 – 5,5 (м, 2Н); 6,01 (д, 5, 1Н); 6,07 (д, 5, 1Н); 6,12 (с, 1Н); 6,24 (д, 11, 1Н); 6,24 (м, 1Н); 6,3 – 6,5 (м, 2Н); 6,53 (с, 3Н); 6,73 (к, 2, 1Н); 7,62 (м, 1Н); 7,6 – 8,0 (м, 4Н); 8,22 (с, 3Н); 8,35 (д, 7, 3Н); 8,41 (с, 3Н); 8,49 (с, 3Н); 8,62 (т, 11, 1Н); 9,03 (д, 6, 3Н); 9,12 (к, 11, 1Н); 9,22 (д, 3Н).
Фактор С: 4,29 (д, 11, т, 2, 1Н); 4,4 – 4,6 (м, 3Н); 4,56 (шир. с, 1Н); 5,14 (дд, 15, 10, 1Н); 5,23 (м, 1Н); 5,65 (шир. с, 2Н); 5,72 (д, 6, 1Н); 5,95 (д, 10, 1Н); 5,99 (д, 6, 1Н); 6,08 (шир. с, 1Н); 6,1 – 6,4 (м, 3Н); 6,62 (к, 3, 1Н); 7,7 – 8,1 (м, около 1Н); 7,18 (с, 3Н); 8,33 (с, 3Н); 8,48 (д, 7, 3Н); 8,64 (с, 3Н); 8,68 (т, 11, 1Н); 9,00 (д, 7); 9,08 (д, 7, 3Н); 9,12 (к, 12, 1Н).
Фактор D: 4,18 – 414 (м, 2Н); 4,47 – 4,82 (м, 4Н); 5,04 (м, 1Н); 5,35 (с, 2Н); 5,72 (д, 7, 1Н); 6,07 (д, 7, 1Н); 6,15 – 6,45 (м, 4Н); 6,74 (к, 4, 1Н); 7,45 – 8,1 (м, 8Н); 8,16 (с, 3Н); 8,41 (с, 3Н); 8,49 (с, 3Н); 8,62 (т, 11, 1Н); 8,92 – 9,05 (м, 6Н); 9,21 (д, 7, 3Н).
Фактор E: 4,1 – 4,3 (м, 2Н); 4,5 – 4,8 (м, 4Н всего); 5,04 (м, 1Н); 5,2 – 5,5 (м, 2Н); 6,01 (д, 5, 1Н); 6,05 (д, 5, 1Н); 6,11 (с, 1Н); 6,1 – 6,4 (м, 3Н); 6,45 (д, 1Н); 6,51 (с, 3Н); 6,70 (к, 2, 1Н); 7,60 (м, 1Н); 8,20 (с, 3Н); 8,41 (с, 3Н); 8,47 (с, 3Н); 8,60 (т, 11, 1Н); 9,00 (т, 7, 3Н); 9,02 (д, 6, 3Н); 9,11 (к, 11, 1Н); 9,20 (д, 7, 3Н).
Фактор F: 4,2 – 4,4 (м, 2Н); 4,62 (с, 1Н); около 4,70 (м, 2Н); 4,80 (д, 9, 1Н); 5,04 (м, 1Н); 5,2 – 5,5 (м, 2Н); 5,99 (д, 5, 1Н); 6,05 (д, 5, 1Н); 6,11 (с, 1Н); 6,1 – 6,3 (м, 2Н); око-ло 6,36 (м, 1Н); 6,45 (д, 10, 1Н); 6,51 (с, 3Н); 6,70 (к, 2, 1Н); 7,42 (м, 1Н); 7,58 (м, 1Н); 8,19 (с, 3Н); 8,40 (с, 3Н); 8,47 (с, 3Н); 8,60 (т, 11, 1Н); 8,95 (д, 3Н); 9,05 (д, 7, 3Н); 9,01 (д, 7, 3Н); 9,10 (к, 11, 1Н); 9,21 (д, 6, 3Н).
Отфильтрованный от шума спектр ЯМР – С13 при 25,05 МГц раствора каждого фактора в дейтерохлороформе включает пики (в скобках даны величины с мульти-плетностью сигналов внерезонансного спектра).
Фактор А при 173,2 (с); 142,6 (д); 139,2 (с); 137,6 (с); 137,1 (с); 137,0 (д); 130,4 (с); 123,1 (д); 120,1 (д); 171,8 (д); 99,5 (с); 80,0 (с); 79,0 (д); 76,5 (д); 69,0 (д); 68,3х; 67,4 (д); 48,2 (т); 45,4 (д); 40,9 (т); 40,5 (т); 35,8х; 34,5 (т); 22,1 (к); 34,5 (т); 26,6 (д); 22,6 (к); 22,0 (к); 19,7 (к); 15,3 (к); 13,7 (к); 10,8 (к).
Фактор В при 173,4 (с); 142,1 (д); 139,5 (с); 137,1 (с); 136,7 (с); 133,7 (с); 123,6 (д); 123,3 (д); 120,0 (д); 119,3 (д); 118,2 (д); 99,5 (с); 80,1 (с); 77,3 (д); 76,6 (д); 76,4 (д); 69,0 (д); 68,3 (д); 67,9*; 67,6*; 57,5 (к); 48,2 (т); 45,4 (д); 40,7 (т); 40,5 (т); 35,8*; 34,5 (т); 22,1 (к); 19,6 (к); 15,3 (к); 13,6 (к); 12,9 (к); 10,5 (к).
Фактор С при 173,3 (с); 142,2 (д); 140,3 (с); 138,5 (с); 137 (с); 134,9 (с); 123,9 (д); 121,1 (д); 120,6 (д); 118,1 (д); 100,2 (с); 80,6 (с); 80,1 (д); 77,4 (д); 69,2 (д); 69,0 (д); 68,3*; 68,0 (д); 67,9 (д); 48,6 (т); 46,3 (д); 41,4 (т); 36,5*; 36,3*; 36,1 (д); 35,0 (т); 22,6 (к); 20,0 (к); 15,4 (к); 14,3 (к); 13,1 (к); 10,8 (к).
Фактор D при 173,2 (с); 142,5 (д); 139,1 (с); 137,5 (с); 137,1 (с); 132,1 (с); 131,4 (д); 123,1 (д); 120,1 (д); 117,8 (д); 99,5 (с); 79,9 (с); 79,2 (д); 76,5 (д); 69,0 (д); 68,3*; 68,1*; 67,6*; 67,4*; 48,2 (т); 45,5 (д); 40,8 (т); 40,5 (т); 35,7*; 34,5 (т); 22,0 (к); 20,6 (т); 19,6 (к); 15,3 (к); 13,7 (к); 13,6 (к); 10,7 (к).
Кривые кругового дихронизма для факторов А, В, С и D (концентрация растворов в метаноле около 0,1%) плохо разрешены в области 230-260 нм, связанной поглоще-нием диенового хромофора. Это указывает на то, что во всех четырех факторах абсо-лютные конфигурации при атомах углерода С2, С7, С17, и С19, являются одинаковыми.
Ниже следуют примеры рецептур согласно изобретению (активный компонент – вещество, полученное по предлагаемому способу, которое может представлять собой один из факторов А, В, С, D, E или F.
Парэнтеральная многодозная инъекция (интервал 1 – 5 вес./об%):
Активный компонент 4,0
Бензиловый спирт 2,0
Триацетат глицерина 30,0
Пропиленгликоль до 100,0
Активный компонент растворяют в бензиловом спирте и триацетате глицерина. Добавляют пропиленгликоль и доводят до объема. Раствор фильтруют, чтобы удалить любые твердые примеси. Продукт асентично заполняют в ампулы для инъекций и за-крывают резиновыми уплотнениями или поршнями, удерживаемыми на месте алюми-ниевыми колпачками. Окончательно стерилизуют продукт путем нагревания в авто-клаве.
Аэрозольный распылитель (интервал 0,01-0,50 вес.%), вес./вес.%:
Активный компонент 0,1
Трихлорэтан 29,9
Трихлофторметан 35,0
Дихлорфторметан 35,0
Смешивают активный компонент с трихлорэтаном и заполняют в аэрозольный контейнер. Продувают пространство головки газообразным распылителем и обжима-ют клапан на месте. Под давлением вводят необходимое количество жидкого распы-лителя через клапан. Устанавливают пускатель и внутреннюю крышку.
Таблетки. Способ получения – влажная грануляция: Вес.% мг
Актавный компонент 250,0
Стеарат магния 1 4,5
Кукурузный крахмал 5 22,5
Натрий - гликолят крахмала 2 9,0
Лаурилсульфат натрия 1 4,5

Микрокристаллическая целлюлоза для оболочки таблетки весом 450 мг.
К активному компоненту добавляют достаточное количество 10% - ной крахмаль-ной пасты для получения удобной для гранулирования влажной массы. Формуют гра-нулы и сушат, используя сушильный поднос или сушилку в ожиженном слое. Просеи-вают через сито, добавляют оставшиеся компоненты и прессуют в таблетки.
В случае необходимости поверхность таблетки покрывают пленкой, используя ок-симетилцеллюлозу или другой подобный пленкообразующий материал, применяя водную или неводную систему растворителей. В состав покрывающей пленки могут быть включены пластификатор и подходящая краска.
Ветеринарная таблетка для мелких домашних животных. Способ получения сухая грануляция. Состав, мг:
Активный компонент 50,0
Стеарат магния 7,5
Микрокристаллическая целлюлоза для оболочки таблетки 75,0
Смешивают активный компонент со стеаратом магния и микрокристаллической целлюлозой. Формуют из смеси червячки. Разбивают червячки, пропуская их через роторный гранулятор, получают свободнотекучие таблетки. Прессуют в таблетки. Оболочки таблеток затем могут быть покрыты пленкой.
Ветеринарная внутригрудная инъекция:
Активный компонент, мг 150
Полисорбат 60, вес.% до 3,0
Белый пчелиный воск, вес.% 6,0
Арахисовое масло, вес.% 91
Нагревают арахисовое масло, белый пчелиный воск и полисорбат 60 до 160°С при перемешивании. Выдерживают 2 ч при этой температуре и затем охлаждают до ком-натной температуры при перемешивании.
Асептично добавляют активный компонент в носитель и диспергируют, используя высокоскоростной смеситель. Очищают путем пропускания через колоидную мель-ницу. Асептично заполняют продукт в стерильные пластиковые шприцы.
Ветеринарный пероральный мягчитель, весь / об.%:
Активный компонент 0,35
«Полисирбат 85» 5,0
Бензиловый спирт 3,0
Пропиленгликоль 30,0
Фосфатный буфер до рН 6,0 – 6,5
Вода до 100,0
Растворяют активный компонент в полисорбате 85, бензиловом спирте и пропи-ленгликоле. Добавляют часть воды и доводят рН до 6,0 – 6,5 фосфатным буфером (в случае необходимости). Добавляют остальное количество воды. Заполняют продукт в емкость мягчителя.
Ветеринарная пероральная паста, вес.%:
Активный компонент 7,5
Сахарин 25,0
Полисорбат 85 3,0
Дистеарат алюминия 5,0
Фракционированное масло кокосового ореха до 100,0
Диспергируют дистеарат алюминия во фракционированном кокосовом масле и полисорбате 85 путем нагревания. Охлаждают до комнатной температуры и диспер-гируют сахарин в масляном носителе. Распределяют активный компонент в основе. Заполняют в пластиковые шприцы.
Гранулы для ветеринарного назначения в пищу, вес.%:
Активный компонент 2,5
Известковая мука до 100,0
Смешивают активный компонент с известковой мукой. Формуют гранулы исполь-зуя способ влажной грануляции. Сушат, применяя сушильный поднос или сушилку в ожиженном слое. Заполняют в подходящие контейнеры.
Эмульгируемый концентрат
Активный компонент, г 50
Анионный эмульгатор (например, фенилсульфонат CALX), г 40
Неионогенный эмульгатор (например, «Сипероник NP 13»), г 60
Ароматический растворитель (например, «Сольвессо 100»), л до 1
Смешивают все компоненты и перемешивают до растворения.
Гранулы, г:
а) Активный компонент 50
Древесная смола 40
Гипсовые гранулы, 20-60 меш
например, «Агсорб 100 А») до 1000
б) Активный компонент 50
Сипероник NP 13 40
Гипсовые гранулы (20-60 меш) до 1000
Растворяют все компоненты в летучем растворителе, например хлористом мети-лене, добавляют к гранулам, обрабатывают в барабане-смесителе. Сушат, чтобы уда-лить растворитель.
Активность факторов А, В, С, D, E или F определяют, используя множество вреди-телей и их хозяев, включая следующие:Tetranyc husurticae (обыкновенная фасоль и мирабель В), Myzus persicae (капуска китайская и редька), Heliotlus virescens (хло-пок), Chiloportellus (фасол Рейна), Meloidogyne incognita (золотистая фасол), Panon-chus ulmi (мирабель В), Phorodon humuli (хмель), Aulacorthus cirsumflexua (цикла-мен).
Продукт используют в виде жидкого препарата (например, раствора в аетоне). За-тем эти растворы разбавляют водой, содержащей 0,1 или 0,01 вес.% увлажняющего агента, до тех пор пока жидкие препараты не будут содержать требуемую концентра-цию продукта.
Методика испытания, принятая с учетом каждого вредителя, включает помещение нескольких вредителей в среду, которой обычно является растение-хозяин, и эту сре-ду обрабатывают препаратом (остаточное испытание). В случае Tetranyc urticae пре-паратом обрабатывают как вредителей, так и среду (контактное испытание).
Используя эту методику, находят, что факторы A-F являются эффективными при конентрациях (по весу продукта) до 500 ч. на млн или менее.