НОВАЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА 6-ГИДРОКСИ-3-(4-[2-(ПИПЕРИДИН-1-ИЛ)ЭТОКСИ]-ФЕНОКСИ)-2-(4-МЕТОКСИФЕНИЛ) БЕНЗ[b]ТИОФЕНА ГИДРОХЛОРИДА

Данное изобретение относится к новому кристаллическому гидрату 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида и к применениям этого соединения, включающим в себя ингибирование заболеваний, связанных с недостаточностью эстрогена, включая сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемию и остеопороз; и ингибирование патологических состояний, таких как эндометриоз, фиброз матки, эстроген-зависимый рак (включая рак молочной железы и матки), рак простаты, доброкачественная гиперплазия эндометрия, расстройства ЦНС, включающие в себя болезнь Альцгеймера, предупреждение рака молочной железы и активацию ChAT

Данное изобретение относится к новому кристаллическому гидрату 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]тиофена гидрохлорида и к применениям этого соединения, включающим в себя ингибирование заболеваний, связанных с недостаточностью эстрогена, включая сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемию и остеопороз; и ингибирование патологических состояний, таких как эндометриоз, фиброз матки, эстроген-зависимый рак (включая рак молочной железы и матки), рак простаты, доброкачественная гиперплазия эндометрия, расстройства ЦНС, включающие в себя болезнь Альцгеймера, предупреждение рака молочной железы и активацию ChAT



6-Гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси) -2-(4-метоксифенил)-бенз[b]тиофен гидрохлорид (арзоксифен) в самом общем виде был впервые описан в Патенте США №5510357 и подробно рас-смотрен в Патенте США №5723474 ('474) и в Заявке на Европейский Патент 0729956. Арзоксифен представ-ляет собой нестероидный смешанный антагонист/агонист эстрогена, между прочим, используется для сниже-ния холестерина сыворотки, ингибирования гиперлипидемии, остеопороза, эстроген-зависимых раков, вклю-чая рак молочной железы и матки, эндометриоза, расстройств ЦНС, включая болезнь Алыдгеймера, проли-ферации клеток гладких мышц аорты и рестеноза.
Точнее, арзоксифен является полезным и в настоящее время применяется в клиниках для лечения рецеп-тор-позитивного метастатического рака молочной железы; адъювантного лечения рецептор-позитивных пациентов после соответствующей системной и местной терапии; снижения распространения инвазивного и неинвазивного рака молочной железы и протоковой карциномы in situ (DCIS). Арзоксифен также использует-ся в комбинации с лучевой терапией, ингибиторами ароматазы, аналогами LHRH (лютеинизирующий гор-мон-рилизинг гормон) и ингибиторами ацетилхолинэстеразы (AchE).
Исследования с помощью методов рентгеновской порошковой дифракции (XRD), термогравиметрическо-го анализа (TGA), метода протонного ядерного магнитного резонанса (1Н ЯМР) и метода Карла Фишера (Karl Fischer; KF) основной массы арзоксифена, выделенного согласно способам, изложенным в “474”, указывают, что названный материал является гидратированным, слабо кристаллизующимся и содержит в своей кристал-лической решетке различные количества органического летучего компонента (этилацетата).
Обычно для приготовления лекарственных средств слабо кристаллизующиеся вещества менее жела-тельны, чем высоко кристаллизующиеся вещества. Кроме того, вообще нежелательно получение фармацев-тических средств, содержащих значительные количества органического растворителя (например, этилацета-та), вследствие возможной токсичности растворителя для реципиента и изменения эффективности фар-мацевтического средства в результате действия растворителя.
Хотя арзоксифен, полученный согласно способам, предложен¬ным в “474”, можно использовать как фар-мацевтическое средство, крайне желательны и полезны поиски еще и кристаллической формы арзоксифена, которая не содержала бы органический растворитель в кристаллической решетке и которую можно воспро-изводить и эффективно получать в коммерческом масштабе.
Данное изобретение относится к новой нестехиометрической гидратированной кристаллической форме 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]-фенокси)-2-(4-метоксифенил)бенз[b]-тиофена гидрохлорида (F-I), имеющей рентгеновскую дифрактограмму, которая включает в себя следующие пики: 7, 90,2; 10,70,2; 14,90,2; 15,90,2; 18,30,2 и 20,6+0,2° при 2; получаемые из медного источника излучения.
Кроме того, данное изобретение относится к фармацевти¬ческой композиции, содержащей F-I; один или больше фармацевтических носителей, разбавителей или наполнителей; и необязательно эстро-ген, необязательно прогестин, необязательно ингибитор ароматазы, необязательно аналог LHRH и необяза-тельно ингибитор ацетилхолинэстеразы (AChE).
К тому же данное изобретение относится к способам применения F-I для ингибирования патологиче-ских состояний, таких как фиброз матки, эндометриоз, пролиферация клеток гладких мышц аорты, рестеноз, рак молочной железы, рак матки, рак простаты, доброкачественная гиперплазия простаты, разрежение ко-сти, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемия, расстройства ЦНС и болезнь Альцгей-мера, а также применения F-I для производства лекарственных средств для ингибирования таких заболеваний.
Данное изобретение также относится к способам применения F-I для активации холин-ацетилтрансферазы (ChAT) и применения F-I для производства лекарственного средства для активации этого фермента.
Краткое описание фигур
Фигура 1 является типичным изображением дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)/TGA S-II.
Фигура 2 является типичным изображением DSC/TGA F-I.
Фигура 3 является типичным изображением DSC/TGA F-III.
Фигура 4 изображает изотермы сорбции влаги для F-I и F-III.
Фигура 5 изображает десольватацию S-II как функцию времени и температуры высушивания.
Основная масса арзоксифена, полученного по методу, изложенному в “474” (пример 41, кристаллизация из смеси этанола и этилацетата, фильтрование и высушивание фильтровального осадка под ва-куумом до постоянного веса при комнатной температуре), была охарактеризована методом XRD и, как было обнаружено, является слабо кристаллизующимся веществом. Методом 1Н ЯМР под-твердили, что основная масса вещества содержит 6% этилацетата.
Предложенный в “474” способ кристаллизации впоследствии модифицировали с тем, чтобы добавлять этанол в суспензию неочищенного арзоксифена в кипящем этилацетате. После охлаждения и фильтрования под вакуумом твердое вещество, полученное с помощью этого модифицированного способа, представляет собой высоко кристаллизующийся смешанный сольват арзоксифена в этилацетате/воде (в дальнейшем упо-минаемый как S-II), который, как было обнаружено позднее, является исходным материалом для F-I.
F-I может быть получен удалением этилацетата из кристаллической решетки S-II с помо-щью вакуумной сушки/ отжигания S-II при повышенных температурах. Время и температура, необхо-димые для отжига S-II, чтобы получить F-I, меняются от партии к партии, но обычно составляют по-рядка 5 дней приблизительно при 100°С. Для осуществления превращения S-II в F-I с помощью этого метода требуются высокие температуры, поскольку при суспендировании S-II в воде при температуре окружающей среды или хранении образца при 98% RH в течение 3 недель не происходит никакого превра-щения в F-I. Кроме того, высушивание S-II в конвекционной печи при высоких температурах не десольвати-рует никакой материал, что позволяет предположить, что вакуум также необходим для вытягивания этилаце-тата из решетки S-II.
Предпочтительно, F-I быстро получают и выделяют путем кристаллизации арзоксифена (или его любой полиморфной модификации/сольвата) из тетрагидрофурана при температуре окружающей среды. Эта кри-сталлизация предпочтительно проводится с помощью первоначального растворения арзоксифена во влаж-ном тетрагидрофуране (1-10% воды по объему, предпочтительно 2,5-7,5% и наиболее предпочтительно от 4,5 до 5,5%) с последующим удалением упомянутой воды посредством перегонки при атмосферном давлении. Пример этой кристаллизации подробно описан ниже в примере 2. При получении F-I с помощью этого улуч-шенного способа кристаллизации можно ожидать, что общий относительный уровень вещества (TRS) соста-вит <0,5%.
Подходящий исходный материал арзоксифена для этой кристаллизации включает в себя S-II, F-III, ар-зоксифен, полученный посредством способов, предложенных в “474”, или любую их смесь, но не ограничивается перечисленным. Неважно, какая форма арзоксифена окажется исходным материалом, так как кристаллизация из тетрагидрофурана в соответствии со способами, описанными в заявке, приводит к образованию кристаллов F-I. Для синтеза F-I в коммерческом масштабе может быть полезным добавление затравки кристаллизации F-I.
F-III, другой нестехиометрический гидрат арзоксифена, легко получают и выделяют кристаллизацией арзоксифена (или любой его полиморфной модификации/сольвата) из смеси изопропилового спирта (IPA) и воды при температуре окружающей среды. Соотношение воды и IPA (объем:объем) обычно составля-ет от 1:1 до 9:1. Более предпочтительно, соотношение составляет от 2,5 до 5,6:1. Наиболее предпочтительно, соотношение оказывается между 3 и 5,6:1. Соотношение IPA не является существенным для осу-ществления кристаллизации F-III, но влияет на выход. Для синтеза F-III в коммерческом масштабе может быть полезным добавление затравки кристаллизации F-III. Подходящий исходный материал арзоксифена для вышеупомянутой кристаллизации включает в себя S-II, F-I, арзоксифен, полученный по способам, опи-санным в “474”, или любые их смеси, но не ограничивается перечисленным.
Характеристика и дифференциация S-IX, F-I и F-III.
Для характеристики S-II, F-I и F-III были использованы методы DSC/TGA и XRD. TGA часто использует-ся для выявления различий между разными твердыми формами вещества, так как температура(ы), при кото-рой происходят физические изменения в веществе; обычно является характеристикой полиморфа или сольвата. DSC представляет собой способ, который часто используют для скрининга со-единений для образования полиморфной модификации и сольвата. Наконец, XRD является способом определения дальнего порядка в кристаллическом веществе.
Арзоксифен, полученный по способам, изложенным в '474, дает рентгенограмму с низким отношением сигнала к фону и повышенной базовой линией, что указывает на слабо кристаллизующееся вещество. Поэто-му проводятся сравнения F-I и F-III с веществом (S-II), полученным с помощью вышеописанного модифици-рованного способа кристаллизации арзоксифена (добавление этанола в суспензию арзоксифена в кипящем этилацетате).
Типичные изображения DSC/TGA для S-II, F-I и F-III представлены на фигурах 1, 2 и 3, соответственно. Изображение DSC для S-II показывает интенсивную эндотермическую реакцию, начинающуюся приблизи-тельно при 62°С, соответствующую потере этилацетата и воды из решетки. Эндотермия, начинающаяся при-близительно при 152°С, представляет собой расплав. Потеря массы, по данным TGA, приблизительно 2,5% происходит одновременно с первым превращением, тогда как оставшиеся 0,5% потери массы проис-ходят вплоть до начала плавления, это позволяет предположить, что некоторое количество молекул раство-рителя более прочно удерживается в решетке.
Изображение DSC для F-I демонстрирует интенсивную эндотермическую реакцию, начинающуюся при-близительно при 75°С, за которой следует вторая эндотермическая реакция, начинающаяся при приблизи-тельно 155°С, соответствующая расплаву. Изображение TGA F-I показывает постепенную потерю 0,3% мас-сы с последующей резкой потерей 1,5%, что вместе представляет собой дегидратацию решетки. Начало пер-вого DSC превращения и соответствующая TGA потеря массы незначительно смещаются вследствие разли-чий в скоростях нагревания. Первоначальная потеря массы представляет собой слабо удерживаемую воду гидратации, тогда как вторая потеря массы соответствует приблизительно 0,5 моля воды, присутствующей в решетке при очень низкой относительной влажности (ниже 5% - см. данные сорбции влаги).
Изображение DSC F-III представляет собой интенсивную низкотемпературную эндотермическую реак-цию приблизительно при 30°С с последующей второй полной, относительно слабой эндотермической реакцией, начинающейся приблизительно при 70°С, и конечное превращение, начинающееся прибли-зительно при 146°С, соответствующее расплаву. Резкая 1,5% потеря массы (~0,5 моля) в TGA, совпадающая с первой эндотермической реакцией, соответствует потере слабо удерживаемых молекул воды, тогда как до-полнительная ~1,6% потеря массы при температуре выше 60°С, представляет собой потерю более прочно удерживаемых молекул воды, то есть молекул, которые присутствуют при очень низкой относительной влажности. Потеря массы, наблюдаемая после 170°, соответствует разложению F-III.
Схемы XRD для F-I и F-III изображают острые пики и плоскую базовую линию, указывающие на высоко кристаллизующиеся вещества. Угловые положения пиков при 2 и соответствующие данные 1/10 для типичных образцов F-I, F-III и S-II представлены в таблице 1. Хотя многие отражения интен-сивности обычно находятся при одинаковых углах дифракции, каждая из форм дает особую по-рошковую рентгенограмму, указывая на четкие различия между S-II, F-I и F-III.
В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной полиморфной модификации отно-сительные интенсивности дифракционных пиков могут изменяться вследствие предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология кристаллов. Если имеется влияние предпочтительной ориентации, интенсивность пиков меняется, однако характерные положения пиков полиморфной модифика-ции не меняются. См., например. The United States Pharmacopeia # 23, National Formulary #18, pages 1843-1844,- 1995. Таким образом, на основании интенсивности пиков, а также положения пиков, F-I может быть идентифицирован по присутствию пиков при 7,9±0,2; 10,7+0,2; 14,9±0,2; 15,9±0,2; 18,3±0,2; и 20,6±0,2° при 2; когда изображения были получены из медного источника излучения.


Таблица 1

S-II F-I F-III
2 (°) I/Io (%) 2 (°) I/Io (%) 2 (°) I/Io(%)
4.67 1.3 4.92 2.6 4.63 20.8
5.03 6 7.69 34.6 7.82 100
6.83 5.8 7.91 100 9.29 16.9
7.17 16.1 9.89 2.5 10.16 22.7
7.73 100 10.22 2 10.35 5.4
9.03 1.3 10.74 7.4 13.77 10.7
9.31 1.7 14.86 9.1 13.97 15.2
9.66 2.4 15.45 2.3 15.06 6.9
10.27 1.6 15.92 15.9 15.71 22.3
10.47 2.2 16.67 1.7 15.87 7.4
10.91 6.3 16.98 3.1 16.35 34.5
13.63 2.1 18.28 17.8 16.77 12.3
14.09 4.6 18.56 7 17.28 10
15.10 4.1 20.58 13.1 17.62 47.9
15.52 10.5 20.85 8.8 18.09 43.9
16.45 9.1 21.64 3.9 20.43 42
16.67 7.6 22.19 4.8 20.80 33.6
17.21 4.9 22.65 2.9 21.31 42.7
17.53 2.4 23.28 3.4 21.71 13
18.33 28.2 23.97 11.8 21.85 14.5
18.69 11.1 24.31 6.3 22.13 12.8
19.37 3.5 25.52 3.9 22.26 16.3
20.29 8.6 26.20 3.4 23.51 13.2
20.64 17.2 26.47 3.1 23.69 15.9
21.02 12.7 28.84 6.4 23.91 25.6
21.68 5.1 30.13 3.5 24.31 38.7
22.01 8.3 31.12 29 25.22 8
22.29 8 25.67 8.9
23.17 7 ..8 27.05 18.9
23.39 9.1 27..89 13.3
24.30 13.6 28.24 8.6
25.76 3.4 28.71 21.3
28.10 1.8 29.89 8.9
28.73 10.9 30.24 18.7
29.42 3.2 30.88 5.8
30.00 3 .7 31.44 7.6
30.89 2.1 33 .06 4.5
31.34 2.4 34.36 6
31.70 1.1
32.81 1
32.91 0.8
33.48 2
26.05 4
26.63 5.5
27.01 3.1
27.49 2 .8


Дальнейшая характеристика F-I и F-III
Проведены исследования гигроскопичности F-I и F-III. На фигуре 4 представлены изотермы сорбции влаги для F-I и F-III. После исходной экспозиции образцов приблизительно до 5% RH происходит немедлен-ное увеличение массы влаги на 1,5% и 1,7% для F-I и F-III, соответственно, эквивалентное приблизительно 0,5 моля воды. Обе формы демонстрируют непрерывную сорбцию влаги по всей зоне влажности, что является следствием включения молекул воды в решетки.
Различия в поглощении влаги двумя формами, вероятно, отражает количество воды, которое может быть включено в две решетки (то есть величину доступного пространства решетки, которое может вместить моле-кулы воды). Отсутствие гистерезиса в изотермах сорбция-десорбция для F-I и F-III указывает, что кристалли-ческие формы быстро уравновешиваются при любой данной влажности.
Профили сорбции влаги для F-I и F-III показывают, что эти формы по существу являются нестехиомет-рическими гидратами. При относительной влажности окружающей среды (около 50% RH), F-I содержит приблизительно 1,7% воды, соответствующей 0,5 моля воды, тогда как F-III сорбирует около 3,0% воды, что соответствует приблизительно 0,85 моля воды. Основная масса форм F-I и F-III быстро уравновешива-ется с атмосферой так, что содержание воды, определяемое с помощью аналитических методов, являет-ся отражением относительной влажности во время сбора данных. По данным DSC, выявляемые различия от партии к партии, вероятно, обусловлены образцами, гидратированными в различной cтепени вследствие хранения при разных условиях окружающей среды.
Получены рентгенограммы для образцов F-I и F-III, хранившихся при различной относительной влажности (0; 22; 50 и 80%). Когда увеличивается относительная влажность, происходит постепенное сме-щение первоначальных (0% RH) пиков F-III приблизительно при 13,8; 17,6; 18,0; 20,5 и 24,0° при 2, также как и незначальное смещение менее интенсивных пиков. Эти наблюдаемые изменения в рентгенограммах F-III указывают, что меняются размеры элементарной ячейки, чтобы, вероятно, вместить слабо удер-живаемые молекулы воды, когда увеличивается относительная влажность. Непрерывное смещение пиков в зависимости от влажности хорошо коррелирует с данными по сорбции влаги, о чем свиде-тельствует постепенное увеличение массы в пределах этой области RH, доказывающее вариабельность об-разования гидрата.
Аналогичный эксперимент проведен с F-I, чтобы установить, будет ли оказывать изменение относитель-ной влажности подобное действие на его решетку (0; 25; 52; 73 и 95% RH). Наблюдается очень незначитель-ное смещение пиков 0% RH приблизительно при 7,7; 18,3; 18,5; 20,5; 20,8° при 2, когда увеличивается отно-сительная влажность. Также оказалось, что пики приблизительно при 7,7; 20,8 и 24,1 становятся несколько более расширенными и менее разделенными при более высокой относительной влажности, указывая на то, что вода оказывается сорбированной в аморфных компонентах (или пластифицирует твердое вещество), особенно при 73 и 95% RH. Смещение пиков на рентгенограммах F-I менее драматично, чем наблюдаемое смещение пиков в случае экспонирования F-III при различной относитель¬ной влажности. Это позволяет предположить, что решетка F-I не подвергается растяжению и/или уплотнению как решетка F-III.
Обнаружено, что F-I и F-III стабильны в пределах всей области относительной влажности, несмотря на способность F-III сорбировать почти вдвое больше воды. Установлено, что две формы имеют сравнимые размеры кристаллов, морфологию, растворимость в воде и скорости растворения.
Проведено исследование высушивания, чтобы проследить десольватацию S-II как функ-цию времени и температуры высушивания (см.фигуру 5). Во время эксперимента десольватации полу-чены рентгенограммы для различных временных точек. Большинство пиков дифракции, полученных при исследовании десольватации S-II, оказываются с углами, подобными F-I, что подтверждает, что решетки S-II и F-I очень схожи. Исчезновение пиков дифракции приблизительно при 6,8; 7,2 и 14,0° при 2 после толь-ко минимального высушивания позволяет предположить, что эти отражения могут быть отнесены к кристал-лографическим плоскостям, вмещающим частичную плотность электронов молекул этилацетата.
Продолжительный отжиг под вакуумом сольватированного вещества при высоких температурах дает F-I. Полученный таким способом F-I показывает на рентгенограммах высокую степень кристалличности. По-этому вещество, полученное путем кристаллизации из раствора этанола и этилацетата с последующим вы-сушиванием под вакуумом в течение только нескольких часов, как предложено в “474”, проявляет очень низ-кую кристалличность, так как такой способ дает в результате частично десольвати-рованный S-II.
F-I и F-III имеют некоторые преимущества перед вышеописанной формой арзоксифена предыду-щего уровня техники. По сравнению с арзоксифеном, полученным способами, предложенными в “474”, F-I и F-III, более стабильны при температуре окружающей среды и поэтому оказываются более под-дающимися фармацевтической обработке, то есть созданию дозированных композиций. Кроме того, F-I и F-III являются значительно более кристаллическими, чем форма, описанная в “474”. Кристаллические веще-ства обычно менее гигроскопичны и более стабильны (то есть менее склонны к химическому разруше-нию, сохраняют консистентные свойства), чем аморфные вещества, и поэтому являются более желатель-ными для производства композиций. Кроме того, в отличие от формы арзоксифена, полученной способами предложенными в '474, которая содержит в своей решетке этилацетат и воду, F-I и F-III содержат только воду.
Методы исследования
Измерения. DSC проводили на ТА Instruments 2920 Modulated DSC, присоединенном к Thermal Analyst 3100 и снабженном охлаждающей системой. Образцы (3-5 мг) нагревали в извитых алюминиевых резервуа-рах от 10 до 240°С при скорости нагревания 2С/минуту.
TGA исследования проводили на ТА Instruments 2050 термогравиметрическом анализаторе, присоединенном к Thermal Analyst 3100. Образцы (5-10 мг) нагревали в открытых резервуарах от 25°С до 250°С при скорости нагревания 5°С/минуту.
Рентгенограммы получали на Siemens D5000 рентгеновском порошковом дифрактометре, снаб-женном СuКα источником { + 1,54056 α) и Kevex детектором твердого состояния, работающем при 50 кВ и 40 мА. Каждый образец сканировали между 4 ° и 35° в 2. Образцы оставляли для уравновешивания, по крайней мере, в течение 30 минут при требуемой температуре и/или относительной влажности до сбора дан-ных.
Измерения гигроскопичности производили для F-I и F-III, используя метод VTI, следующим обра-зом. Каждый образец высушивали под вакуумом при 60°С до тех пор, пока не прекращалось выявление дальнейшей потери массы, за это время опытная камера была доведена до 0% относительной влажности. Изотермы сорбции влаги получены при 25°С, используя VTI вакуумные рычажные весы со шкалой, проградуированной в процентах влажности, при следующих условиях: величина про-бы 10-15 мг, область адсорбции/десорбции 0-95% относительной влажности, ступень интервала 5%, проме-жуток времени между отборами проб 10 минут.
Следующие примеры иллюстрируют способы получения гидрата данного изобретения. Примеры в лю-бом случае не предназначены для ограничения ими объема защиты этих способов и не должны быть так ис-толкованы.

ПОЛУЧЕНИЕ
Получение'S-II
Неочищенный арзоксифен (1,58 г вещества, полученного с помощью способа примера 41 из Па-тента США №5723474, рекомендации которого приведены в описании цитированием) суспендирован в 28 мл этилацетата и нагрет в колбе с обратным холодильником. Для осуществления растворения добавлен эта-нол (18 мл). Раствор кипятили в течение 20 минут, а затем оставляли для охлаждения до комнатной темпера-туры. Осадок изолировали фильтрованием под вакуумом и промывали 30 мл этилацетата, чтобы получить 1,05 г порошкообразного белого твердого вещества.

ПРИМЕРЫ
Пример 1
F-I из S-II
S-II высушивался в вакуумном сушильном шкафу (-25 in. Hg) при 100°С в течение 118 часов, чтобы по-лучить F-I.
Пример 2
Улучшенный способ получения F-I из арзоксифена.
1-литровая 3-горлая круглодонная колба, снабженная дефлегматором и верхней мешалкой, за-гружалась 25,0 г арзоксифена, 475 мл тетрагидрофурана и 25 мл воды. Реакционный сосуд затем при-спосабливался для простой перегонки. Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником и 250 мл дистиллята удаляли. Нагрев быстро убирали и 250 мл свежего безводного тетрагидрофурана добав-ляли в сосуд. Атмосферная перегонка продолжалась с удалением дополнительных 250 мл дистиллята. Нагрев быстро удаляли, добавляли 250 мл свежего тетрагидрофурана и удаляли дополнительные 250 мл дистиллята. Добавляли дополнительные 250 мл тетрагидрофурана, а реакционную смесь выдерживали при кипячении. При этом добавлении тетрагидрофурана образовывался белый осадок. Перемешиваемую реак-ционную смесь оставляли для медленного охлаждения в течение 3 часов, во время которых допол-нительные твердые вещества выпадали в осадок и шлам достигал температуры окружающей среды. Кристаллический шлам фильтровался и высушивался под вакуумом при 50°С в течение сорока восьми часов с незначительным продуванием N2. Выход 22,50 г (90,0%). XRD анализ показал, что спектры влажного осадка и сухого твердого вещества по существу идентичны и по суще-ству идентичны с спектром ранее полученного F-I. При DSC анализе установлена точка плавления 157°С, тогда как TGA анализ показал 1,5% потери масс в диапазоне между температурой окружающей среды и 100°С. Чистота ВЭЖХ, рассчитанная как свободное основание, составила 88,1% про-тив теоретической эффективности 92,9%. ВЭЖХ анализ показал уровень общего связанного вещества 0,44%,
Пример 3
F-I из [6-бензилокси-3-[4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси)-фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тисфен-(S-оксид)
Тетрагидрофуран (261 мл), воду (45 мл), концентрированную серную кислоту (6,14 г) и [6-бензилокси-3-[4-2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенокси]-2-(4-метоксифенил)]бенз[b]тиофен-(S-оксид) (емкость ВЭЖХ 99%, общий уровень вещества, связанного ВЭЖХ 0,35%) объединяли и перемешивали до гомогенности. Добавляли 10% Pd/C (5,6 г
суспендировали в 22 мл воды) с 5 мл водной промывки. Полученную суспензию отсасывали, и оставляли под водородом при 60 фунтах на кв. дюйм (1 фунт на кв. дюйм = 6,89476 кПа). Температуру реакции приводили к 30°С. Через 2 часа добавляли 10% PD/C (5,6 г) с водой (30 мл). Гидрогенизацию при 60 фунтах на кв.дюйм и 30°С продолжали в течение дополнительных 22 часов. Добавили дополнительные 4,40 г 10% PD/C в 30 мл воды, а гидрогенизацию продолжали при 60 фунтов на кв.дюйм (1 на кв.дюйм - 6,89476 кПа) и 30оС в течение дополнительных 2,5 часов. Катализатор удаляли фильтрованием, и рН фильтрата приводили к 7,24 50% гидроксидом натрия. Добавили хлорид натрия (8,66 г) , растворенный в воде (18 мл), и двухфазный раствор перемешивали в течение 30 минут. Фазы разделяли и водную фазу снова экстрагировали 50 мл тетрагидрофурана. Органические фазы объединяли и концентрировали до объема 50 мл с помощью пере-гонки при атмосферном давлении. К концентрату при 24°С было добавлено 180 мл метанола в течение 1 часового периода. Полученный кристаллический шлам перемешивали в течение 30 минут при 24°С, охлаждали до 0°С и перемешивали в течение 1 часа. Твердые вещества изолировали фильтрованием и промы-вали' последовательно 39 мл воды и 39 мл метанола с последующей вакуумной сушкой в течение ночи при 50°С. Выход 15,52 г (67,8%).
Порцию продукта (10 г) , из полученного выше вещества, перекристаллизовывали из тетрагидрофурана и воды, как описано в примере 2.
Использованная терминология
Используемый термин «эффективное количество» означает количество F-I, которое способно ингибиро-вать заболевания или их пагубные воздействия, описанные в заявке. Когда F-I вводят одновременно с эстро-геном, прогестином, ингибитором ароматазы или ингибитором АСhЕ, термин «эффективное количество» так-же означает количество такого агента, способное осуществить желаемое действие.
Термины «ингибирующий» и «ингибирует» подразумевают их общепринятые значения, то есть преду-преждающий, препятствующий, ограничивающий, купирующий, уменьшающий интенсивность симптомов, замедляющий, останавливающий или реверсирующий прогрессирование или тяжесть патологического со-стояния или его осложнения, описанные в заявке.
Используемые термины «предупреждающий», «предупреждение», «профилактика», «профилактический» и «предотвращать» являются взаимозаменяемыми и подразумевают уменьшение вероятности, что у реципи-ента F-I останутся неизлечимыми или будут проявляться любые патологические состояния или их осложне-ния, описанные в заявке.
Термины «эстроген-дефицитный» и «недостаточность эстрогена» относятся к состоянию, или возника-ющему естественно или клинически индуцированному, когда женщина не может продуцировать достаточное количество эндогенных эстрогенных гормонов для поддержания эстроген-зависимых функций, например, менструальной функции, гомеостаза костной массы, нейронной функции, состояния сердеч-но-сосудистой системы и тому подобного. Такие эстроген-дефицитные состояния возникают во время менопаузы и в результате хирургической или химической овариэктомии, включая ее функциональный экви-валент, например, в результате лекарственной терапии ингибитором ароматазы, агонистами или антагони-стами GnRH, ICI 182780 и тому подобным. Заболевания, связанные с недостаточностью эстрогена включа-ют в себя разрежение кости, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание и гиперлипидемию, но не ограни-чиваются перечисленными.
Используемый термин «эстроген» включает в себя стероидные соединения, характеризующиеся эстро-генной активностью, такие как 17β-эстрадиол, эстрон, конъюгированный эстроген (премарин; Premarin0), конский эстроген 17β-этинилэстрадиол и тому подобное. Предпочтительными соединениями на осно-ве эстрогена являются премарин0 и норэтилнодрел.
Используемый термин «прогестин» включает соединения, проявляющие прогестероноподбную актив-ность, такие, например, как прогестерон, норэтилнодрел, нонгестрел, мегестрол ацетат, норэтиндрон и тому подобные. Норэтиндрон является предпочтительным агентом на основе прогестерона.
Используемый термин «ингибитор ароматазы» включает в себя соединения, которые способны ингиби-ровать ароматазу, например, такие коммерчески доступные ингибиторы, как аминоглутемид (цитандрен0; Cy-tandren0), анастразол (аримидекс0; Arimidex0), летрозол (фемара0; Femara0), форместан (ленатрон0; Lenatron0), эксеме-стан (аромасино; Aromasin0) и тому подобное.
Используемый в описании термин "аналоги LHRH" относится к аналогам лютеинизирующего гормона - рилизинг гормона, которые ингибируют продукцию эстрогена у женщин, находящихся в предклимактери-ческом периоде, и включают в себя, например, госерлин (золодекс0; Zolodex0) , леупролид (лупрон0; Lupron0) и тому подобное.
Используемый термин "ингибитор AChE" включает в себя соединения, которые ингибируют ацетилхо-линэстеразу, например, физостигмин салицилаг, такрин гидрохлорид, донерезил гидрохлорид и тому по-добные.
Термин "активирует ChAT” подразумевает увеличение энзиматической активности ChAT, то есть ускорение превращения холина до ацетилхолина. Эта активация должна включать увеличение эффектив-ности и/или скорости реакции ChAT и холина и/или увеличение количества ChAT, присутствующего в рай-оне действия.
Это увеличение количества присутствующего фермента может быть обусловлено генной регуляцией или другой стадией синтеза при образовании фермента и/или уменьшением инактивации и метаболизма фермента.
Отдельные методы тестирования
Основной способ подготовки крыс: Самок крыс Sprague Dawley (диапазон от 200 до 225 г) в возрасте семидесяти пяти дней (если не указано особо) получали из лабораторий Charles River (Portage, MI). Живот-ным делали двустороннюю овариэктомию (OVX), или подвергали хирургической операции по Шаму (Sham) в лаборатории Charley River, а затем через одну неделю перевозили. По прибытии их раз-мещали в металлические переносные клетки по группам из 3 или 4 животных на клетку и предо-ставляли свободный доступ к пище (содержание кальция приблизительно 0,5%) и воде в течение од-ной недели. Температура помещения поддерживалась при 22,2°С±1,7°С при минимальной относительной влажности 40%. Световой режим в помещении составлял 12-часовое освещение и 12-часовую темноту.
Схема дозирования и сбор ткани: После одной недели акклиматизации (поэтому две недели по-сле OVX) начали ежедневное введение F-1. 17α-этинилэстрадиол или F-I давали перорально, если не ука-зано особо, в виде суспензии в 1% карбоксиметилцеллюлозе или растворенными в 20% циклодекстрине. Жи-вотные получали дозы препарата ежедневно в течение 4 дней. После курса введения лекарственного средства, животных взвешивали и анестезировали смесью кетамин : ксилазин (2:1, объем/объем) и в виде пунктата из сердца брали образцы крови. Животных затем умерщвляли асфиксией СО2, матку удаляли через срединный разрез и определяли влажный вес матки. 17 α-этинилэстрадиол получали от Sigma Chemical CO.,St.,Louis,MO.
Сердечно-сосудистое заболевание/гиперлипидемия.
Образцы крови, взятой у вышеупомянутых животных, оставляли для свертывания при комнатной темпе-ратуре в течение 2 часов и сыворотку получали после центрифугирования в течение 10 минут при 3000 обо-ротов в минуту. Холестерин сыворотки определяли, используя высокоэффективный анализ холестерина Boehringer Mannheim Diagnostics). Вкратце холестерин окисляли до холест-4-ен-3-она и перекиси водорода. Затем перекись водорода взаимодействовала с фенолом и 4-аминофеназоном в присутствии пероксидазы с образованием п-хинониминового красителя, который определяли спектрофотометрически при 500 нм. Концентрацию холестерина затем рассчитывали по стандартной кривой. Все исследования автома-тизировали, используя Biomek Automated Workstation.
Исследование пероксидазы эозинофилов матки
Матки от вышеупомянутых животных хранили при 4°С до момента исследования фермента. Матки гомогенизировали в 50 мМ трис-буфере (рН - 8,0), содержащем 0,005% тритон Х-100. После добавле-ния в трис-буфер 0,01% перекиси водорода и 10 мМ о-фенилендиамина (конечные концентрации) в течение одной минуты следили за увеличением поглощения при 450 нм. Присутствие эозинофилов в матке явля-ется показателем эстрогенной активности соединения. Определяли максимальную скорость 15-секундных интервалов в пределах начального, линейного отрезка реакционной кривой.
Способ исследования ингибирования разрежения кости (остеопороза)
После проведения вышеописанной основной подготовки крыс обрабатывали ежедневно в течение трид-цати пяти дней (6 крыс на группу) и на 36-ой день умерщвляли асфиксией двуокисью углерода. Тридцатипятидневный период времени достаточен для достижения максимального снижения плотности ко-сти, определяемого, как описано в заявке. Во время умерщвления крыс матки удаляли, отслаивали инород-ные ткани и жидкое содержимое выбрасывали перед определением влажного веса для того, чтобы подтвер-дить эстрогенную недостаточность, связанную с полной овариэктомией. Обычно в ответ на овариэктомию вес матки уменьшается приблизительно на 75%. Затем для проведения последующего гистологического ана-лиза, матки помещали в 10% нейтральный забуференный формалин.
Правые бедренные кости иссекали и на периферическом метафизе получали дигитилизиро-ванную рентгенограмму и анализировали с помощью программы анализа изображения (NIH). Проксимальные части большеберцовых костей этих животных также сканировали с помощью количествен-ной компьютерной томографии. В соответствии с вышеописанными способами, опытным животным перо-рально вводили F-I или этинилэстрадиол (ЕЕ2) в 20% гидроксипропил) β-циклодекстрине. F-I также исполь-зуется в комбинации с эстрогеном или прогестином,
Исследование пролиферации MCF-7
Клетки MCF-7 аденокарциномы молочной железы (АТСС НТВ 22) содержали в среде MEM (минималь-ная поддерживающая среда, без фенольного красного, Sigma, St. Louis, МО), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (объем/объем), L-глутамином(2 мМ), пируватом натрия (1 мМ), НEPES { (N-[ 2-гидроксиэтил]-пиперазин-N΄-[2-этансульфокислота] 10 мм}, не незаменимые аминокислоты и бычий инсулин (1 мкг/мл)(поддерживающая среда). За десять дней до исследования клетки MCF-7 переводили в поддержи-вающую среду, дополненную 10% покрытым декстраном древесным углем, захватывающим фетальную бычью сыворотку (DCC-FBS) среда исследования) вместо 10% FBS, чтобы истощить внутренние накопления стероидов. Клетки МСF-7 удаляли из чашек с поддерживающей средой, используя клеточную диссоцииру-ющую среду (Са++/Мд++ без HBSS (без фенолового красного), дополненную 10 мМ HEPES и 2 мМ EDTA). Клетки дважды промывали аналитической средой и доводили до 80000 клеток/мл. Приблизительно 100 мл (8000 клеток) вносили в плоскодонные лунки микрокультуры (Соstar 3596) и инку-бировали при 37°С в 5% СО2 увлаженном инкубаторе в течение 48 часов, чтобы обеспечить клеточное сцеп-ление и уравновешивание после переноса. Готовили серии разведений лекарственных средств и DMSO, в качестве контроля, в аналитической среде, и 50 мл переносили в утроенные микрокультуры, с по-следующим добавлением 50 мл среды исследования до конечного объема 200 мл. После дополнительных 48 часов при 37°С в 5% СО2-инкубаторе, микрокультуры обрабатывали импульсной меткой тритированного тимидина (1 мкКи/лунку) в течение 4 часов. Культивирование завершали замораживанием при -70°С в тече-ние 24 часов с последующим оттаиванием и сбором микрокультур, используя полуавтоматический коллек-тор клеток Skatron. Пробы считали в жидком сцинтилляторе, используя β-счетчик Wallac BetaPlace.
Ингибирование DMBA-индуцированной опухоли молочной железы
Эстроген-зависимые опухоли молочной железы получали у самок крыс Sprague-Dawley, которых покупали в Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. Крысы в возрасте около 55 дней получали с однократ-ным пероральным кормлением 20 мг 7,12- диметилбенз[а]антрацена (DMBA). Приблизительно через 6 недель после введения DMBA молочные железы пальпировали с недельными интервалами с целью обнаруже-ния опухолей. Как только появлялась одна или больше опухолей, метрическим кронциркулем измеряли наибольший и наименьший диаметры каждой опухоли, регистрировали измерения и таких животных отбирали для эксперимента. Предпринята попытка равномерно распределить опухоли различного размера между обрабатываемыми и контрольными группами так, чтобы опухоли среднего размера оказались равномерно распределенными между опытными группами. Контрольные и опытные группы для каждого эксперимента содержали от 5 до 9 животных.
F-I вводили или посредством внутрибрюшинной инъекции в 2% аравийской камеди, или перораль-но. Перорально вводимые соединения либо растворяли, либо суспендировали в 0,2 мл кукурузного мас-ла. Каждую обработку, включая контрольные введения аравийской камеди и кукурузного масла, осуществ-ляли один раз ежедневно каждому опытному животному. После первоначального измерения опухо-ли и отбора опытных животных опухоли измеряли каждую неделю с помощью вышеупомянутого способа. Обработку и измерения животных продолжали в течение 3-5 недель, за время которых устанавли-вали конечные размеры опухолей. Для каждой обработки соединениями и для контрольных введений опре-деляли изменение среднего размера опухоли.
Способы тестирования фиброза матки
Тест 1: Женщинам, в количестве между 3 и 20, страдающим фиброзом матки, вводили F-1. Количество вводимого соединения составляло от 0,1 до 1000 мг/день, а период введения составлял 3 месяца. Для выясне-ния влияния соединения на фиброз матки женщин наблюдали во время периода введения и вплоть до 3 месяцев после прекращения введения.
Тест 2: Использовали тот же способ, что в тесте 1, за исключением того, что период введения составлял 6 месяцев.
Тест 3: Использовали тот же способ, что в тесте 1, за исключением того, что период введения составлял 1 год.
Тест 4 : Для индукции лейомиомы у сексуально зрелых самок морских свинок применяли пролон-гированную эстрогенную стимуляцию. Животным вводили эстрадиол в инъекциях 3-5 раз в неделю в течение 2-4 месяцев или до тех пор, пока не появлялись опухоли. Введения, состоящие из F-I или наполнителя, производили ежедневно в течение 3-16 недель, а затем животных умерщвляли, соби-рали матки и исследовали регрессию опухолей.
Тест 5: Ткань лейомиом человека имплантировали в брюшную полость и/или в миометрий матки поло-возрелой, кастрированной самки бестимусной мыши. Экзогенный эстроген вводили, чтобы вызвать рост тка-ни эксплантата. В некоторых случаях собранные опухолевые клетки культивировали in vitro до импланта-ции. Обработку, состоящую из F-I или наполнителя, осуществляли промыванием желудка ежедневно в течение 3-16 недель и имплантаты удаляли и оценивали рост или регрессию. Во время умерщвления крыс матки собирали, чтобы оценить состояние органа.
Тест 6: Получали ткань фиброзных опухолей и поддерживали in vitro в качестве первичных нетранс-формированных культур. Операционные препараты пропускали через стерильную ячейку или сито, или аль-тернативно, с помощью иглы препарировали ткань от окружающих тканей, чтобы получить одно-родную клеточную суспензию. Клетки поддерживали в среде, содержащей 10% сыворотку и антибиотик. Определяли скорость роста в присутствии и в отсутствие эстрогена. Исследовали спо-собность клеток продуцировать С3-компонент комплемента и их ответ на факторы роста и ростовые гормоны. In vitro оценивали пролиферативный ответ культур после обработок прогестинами, GnRH, F-I и наполнителями. Еженедельно определяли уровни рецепторов стероидных гормонов, чтобы выяснить, со-храняются ли in vitro важные клеточные свойства. Использовали ткань от 5-25 пациентов.
Тест 7: Определяли способность F-I ингибировать стимулируемую эстрогеном пролиферацию линий клеток ELT, полученных из лейомиомы, как описано Fuchs-Young, et al., "Inhibition of Esen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car.,17(3):1510159 (1996), рекоменда-ции которого включены в описание цитированием.
Способ тестирования эндометриоза
Тест 1: В качестве опытных животных использовали от двенадцати до тридцати взрослых самок крыс линии CD. Крыс разделили на три равные группы. У всех животных контролировали эстральный цикл. В день предтечки каждой самке делали операцию. У самок каждой группы удаляли левый рог матки, рог разрезали на небольшие квадратные кусочки и эти квадраты произвольно пришивали в различных участках, прилегающих к мезентериальному кровотоку. Кроме того, самкам группы 2 удаляли яич-ники. Со дня после операции, животным группы 1 и 2, производили внутрибрюшинные инъекции воды в те-чение 14 дней, тогда как животным группы 3 осуществляли внутрибрюшинные инъекции 1,0 мг F-I на кило-грамм веса тела в течение такого же периода времени. После 14 дней обработки, каждую самку умерщвляли и удаляли эндометриальные эксплантаты, надпочечники, оставшуюся часть матки и яичники, что возможно, и подготавливали для гистологического исследования. Яичники и надпочечники взвешивали.
Тест 2: В качестве опытных животных использовали от двенадцати до тридцати взрослых самок крыс линии CD. Крыс делили на две одинаковые группы. У всех животных контролировали эст-ральный цикл. В день предтечки каждой самке делали операцию. У самок каждой группы удаляли левый рог матки, который разрезали на квадратные кусочки, и квадраты произвольно пришивали в различ-ных участках, прилегающих к мезентериальному кровотоку. Приблизительно через 50 дней после операции животным группы 1 делали внутрибрюшинные инъекции воды в течение 21 дня, в то время как животным из группы 2 делали внутрибрюшинные инъекции 1,0 мг F-I на килограмм веса тела в течение такого же пе-риода времени. После 21 дня обработки каждую самку умерщвляли, а эксплантаты эндометрия и надпочечники удаляли и взвешивали. Эксплантаты оценивали как показатель роста. Эстральные циклы кон-тролировались.
Тест 3: Для индукции эндометриоза у крыс и/или кроликов использовали аутотрансплантат ткани эндо-метрия. Репродуктивно зрелых самок животных подвергали двусторонней овариэктомии, а эстроген возме-щали экзогенно, обеспечивая таким образом определенный и постоянный уровень гормона. Аутогенную эн-дометриальную ткань имплантировали в брюшину 5-150 животных и обеспечивали эстрогеном, чтобы вы-звать рост эксплантированной ткани. Обработку, состоящую из соединения согласно изобретению, произ-водили посредством промывания желудка ежедневно в течение 3-16 недель, имплантаты уда-ляли, и оценивали рост или регрессию. Во время умерщвления брали интактный рог матки, чтобы оценить состояние эндометрия.
Тест 4: Ткань из патологических участков эндометрия человека имплантировали в брю-шину половозрелых самок бестимусных мышей. Обеспечивали экзогенным эстрогеном, чтобы вызвать рост эксплантированной ткани. В некоторых случаях собранные клетки эндометрия культивировали in vitro до имплантации. Обработку, состоящую из F-I, производили с помощью промывания же-лудка ежедневно в течение 3-16 недель, имплантаты удаляли, и определяли рост или регрессию. Во время умерщвления удаляли матку, чтобы оценить состояние интактного эндометрия.
Тест 5: Ткань из участков повреждения эндометрия человека собирали и содержали in vitro в ка-честве первичных нетрансформированных культур. Операционные препараты пропускали через сте-рильную ячейку или сито или, альтернативно, препарировали ткань от окружающих тканей, чтобы получить суспензию из клеток одного типа. Клетки поддерживали в среде, содержащей 10% сыворотку и антибиотик. Определяли скорость роста в присутствии и в отсутствие эстрогена. Исследовали способность клеток проду-цировать С3-компонент комплемента, а также ответ клеток на факторы роста и ростовые гормоны. In vitro после обработки прогестинами, GnRH, F-III и наполнителем оценивали пролиферативный ответ культур. Еженедельно определяли уровни рецепторов стероидных гормонов для выяснения того, сохраняются ли in vitro важные свойства клеток. Использовали ткань от 5-25 пациентов.
Расстройства ЦНС, включая болезнь Альцгеймера
Эстрогены, такие как 17β-эстрадиол, регулируют генную транскрипцию посредством связывания с эст-рогенными рецепторами (ER), которые находятся в цитоплазме определенных популяций клеток. Лигандная активация ER является предпосылкой для транспорта комплекса в ядро, где связывание с согласованной по-следовательностью 13 пар оснований палиндромной ДНК (элемент ответа эстрогена, или ERE) запускает процесс сборки транскрипционного аппарата, который достигает своей кульминации при активации соот-ветствующих генов-мишеней. Идентифицировано множество генов, которые регулируются эстроге-нами. Они включают в себя белки цитоскелета, ферменты биосинтеза нейротрансмиттеров и ферменты ме-таболизма и рецепторы, а также другие гормоны и нейропептиды. Элементы ERE идентифицированы во мно-гих эстроген-позитивных генах, включая вителлогенин, с-fos, пролактин и лютеинизирующий гормон.
Имеющие большое значение для центральной нервной системы ERE-подобные последовательности бы-ли идентифицированы в р75ngr и trkA, обе из которых служат сигнальными молекулами для нейротрофинов: фактора роста нервов (NGP), произведенного из головного мозга нейротрофического фактора (BDNGF), и нейротрофина-3.
Показано, что BDNF, также как и NGF повышают жизнеспо¬собность холинэргических нейронов в куль-туре. Полагают, что взаимодействие между нейротрофинами и эстрогенами является важным для разви-тия и выживаемости базальных нейронов переднего мозга (которые дегенерируют при болезни Апьц-геймера) при тех клинических состояниях, при которых недостаточность эстрогена (постклимактериче-ский период) может привести к потере этих нейронов.
Следующий эксперимент проводили на овариэктомированных крысах (подготовленных, как описано выше) для того, чтобы выявить сходство или различие во влиянии F-I и эстрогена на экспрессию гена в раз-личных областях мозга. Крысам в возрасте шести недель ежедневно вводили с помощью подкожных инъек-ций эстрадиол бензоат (0,03 мг/кг), F-I или наполнитель (контроль). После пяти недель обработки животных умерщвляли, удаляли мозг, и микродиссекцией собирали гиппокамп. Гиппокамп быстро замора-живали в жидком азоте и хранили при -70°С. Общую ДНК получали из объединенной ткани живот-ных из групп соответствующих обработок и контрольной группы и обратно транскрибировали, используя 3'-олигонуклеотидный праймер, который выбирали для популяций специфических РНК (поли-A+).
Полимеразные цепьевые реакции (PCR) проводили в коктейле, состоящем из: произвольных 5'-олигонуклеотидов (длиной 10 пар оснований; всего 150), реакционного буфера. Tag полимеразы и 32PdTCP.
После 40 циклов амплификации продукты реакции фракционировали по размеру в 6% ТВЕ-мочевина ге-ле, высушивали и экспонировали на рентгеновской пленке. Полученные картины распределения мРНК срав-нивали между группами.
Применение F-I вместе с эстрогеном
Известно, что женщин в пери- и постклимактерическом периоде часто подвергают гормональ-ной заместительной терапии (HRT), чтобы преодолеть негативные последствия, связанные со снижением в циркуляции эндогенного эстрогена, например, для лечения приступообразного ощущения жара. Однако HRT может быть связана с повышенным риском возникновения определенных раков, включая рак матки и мо-лочной железы. F-I можно применять вместе с HRT для ингибирования этих процессов.
Применение F-I вместе с ингибиторами ароматазы
По определению, у женщин в постклимактерическом периоде, яичники не функционируют. Единствен-ным источником эстрогенов у них является превращение андрогенов надпочечников до эстрогенов с помощью фермента с ароматазы, который обнаружен в периферических тканях (включая жировую ткань, мышцы и саму опухоль молочной железы). Так, лекарственные средства, которые ингибируют ароматазу (ингибиторы ароматазы), истощают циркулирующий эстроген у женщин в постклимактериче-ском периоде. Истощение эстрогена посредством ингибирования ароматазы является важной возможностью при лечении пациентов, страдающих метастатическим раком молочной железы. Во время лечения ингиби-тором ароматазы отсутствие циркулирующего эстрогена может оказывать негативные, не предполагаемые побочные воздействия, например, на уровень липидов в сыворотке, Для пре-дупреждения этих негативных воздействий можно применять F-I.
Применение F-1 вместе с аналогом LHRH
Длительное воздействие аналогом LHRH (лютеинизирующий гормон-рилизинг гормон) способствует ингибированию продукции эстрогена у женщин в предклимактерическом периоде, посредством десенсибили-зации гипофизарной железы, которая потом больше не стимулирует яичники к продукции эстрогена. Клиническим эффектом является «лекарственная овариэктомия», которая является обратимой при отмене аналога LHRH. Во время лечения аналогом LHRH отсутствие циркулирующего эстрогена может быть причиной негативных, не предполагаемых побочных эффектов, например, влияние на уровни липидов сыворотки. F-I может применяться для: ингибирования этих негативных эффектов.
Увеличение уровней ацетилхолина
Известно, что у пациентов с болезнью Альцгеймера значительно ниже уровень холинэр-гических нейронов в гиппокампе, чем у их ровней, не страдающих этим заболеванием. Оказалось, что прогрессивная потеря этих холинэргических нейронов отражает потерю памяти и познавательной функции у таких пациентов. Полагают, что причиной снижения количества этих нейронов является утраченная или сниженная функция нейротрансмиттера ацетилхолина.
Уровень ацетилхолина в нейроне по существу определяют по тому, как изменяется равнове-сие между биосинтезом и биодеградацией. Фермент холин-ацетилтрансфераза (ChAT) главным образом ответственен за синтез ацетилхолина, а ацетилхолинэстераза (АСhЕ) - за его деградацию.
Для изучения влияния F-I на уровни ChAT проведен следующий эксперимент: после описанной выше обычной подготовки крыс 40 крысам ежедневно вводили путем подкожной инъекции и перорально-го кормления через желудочный зонд 3 мг/кг/день F-I в наполнителе, содержащем 10% циклодекстрин, эст-радиол бензоат в количестве 0,03 или 0,3 мг/кг/день, или контроль наполнителя. Животных обраба-тывали в течение 3 или 10 дней. Использовали двенадцать животных на каждую схему приема лекарствен-ного средства. Через соответствующие интервалы времени животных умерщвляли и вскрывали их мозг. Определенные порции мозга гомогенизировали и анализировали. Гомогенаты гиппокампа и лобной части коры мозга обрабатывали и проводили определение активности ChAT путем анализа радиоактивно-сти биосинтеза ацетилхолина. Этот метод может быть обнаружен в J. Neural Transmiss., 78:183-193, 1989, описание которого включено в виде ссылки.
Как предполагали, у OVX-животных уровни ChAT снижены на >50% (р<0,001) по сравнению с фиктивно оперированными контролями.
В другом аспекте данного изобретения, F-I применяли в комбинации с ингибитором AChE. Применение ингибитора AChE приводило к повышению уровней ацетилхолина за счет блокирова-ния его деградации через ингибирование AChE.
Доброкачественная гиперплазия простаты (ВРН)
Предисторию вопроса относительно связи между действием эстрогена и лечением ВРН и карциномы простаты см. в Междуна¬родной заявке
РСТ WО 98/07274, дата международной публикации 15 октября, 1998.
В экспериментах, описанных ниже, на нескольких линиях клеток рака простаты человека оценивали способность F-I связывать рецепторы эстрогена.
Лизаты линий клеток LNCaP, DU-45 и РС-3 рака простаты человека готовили в среде TEG, содержащей 50 нМ трис-HCl, рН 7,4, 1,5 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), 0,4 М КС1, 10% глицерин, 0,5 мМ 2-ME и 10 мМ молибдата натрия, кроме того, содержащей ингибиторы протеаз пепстатин (1 мг/мл), лей-пептин (2 мг/мл) апротинин (5 мг/мл) и фенилметилсульфонилфторид (PMSF, 0,1 мМ) (TEGP).
Клеточные лизаты центрифугировали, и осадок ресуспендировали в холодной TEGP (1 мл TEGP/100 мг осадка) и разрушали ультразвуком в течение 30 секунд (нагрузка цикла 70%, мощность 1/8) на ультразвуко-вой установке Branson, модель 450. Лизаты осаждали центрифугированием при 10000 х g в течение 15 минут при 4оС, после чего супернатант отделяли и либо использовали немедленно, либо хранили при -70°С.
Исследование конкурентного связывания: В качестве связывающего буфера использовали TEG, в кото-ром 0,4 М КС1 заменили 50 мМ NaCI и в который к тому же добавили 1 мг/мл овальбумина (TEGO). F-I разбавляли до 20 нМ в TEGO, из которого готовили 3-кратные серийные разведения. Исследования про-водили в круглодонных полипропиленовых микропланшетах в утроенных микролунках. В каждую лунку помещают 35 мл меченого тритием 17β-эстрадиола (0,5 нМ, удельная активность 60,1 Ки/ммоль, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) и 35 мл охлажденного опытного соединения (0,1 нМ-5 мМ) или TEGO, после инкубации в течение 5 минут при 4°С при встряхивании, добавляли 70 мл лизата линии MCF-7 кле-ток.
Планшеты инкубировали в течение 24 часов при 4°С, после этого в каждую лунку добавляли 70 мл по-крытого декстраном древесного угля (DCC) с последующим энергичным встряхиванием в течение 8 минут при 4°С. Планшеты затем центрифугировали при 1500 х g в течение 10 минут при 4°С. Супернатант отбирали из каждой лунки в гибкий полистироловый микропланшет для сцинтилляционного счета в счетчике Wallac Micobeta Model 1450. Радиоактивность выражали как распад/минуту (DPM) после корректировки на эф-фективность счета (35-40%) и фон. Дополнительными контролями служили общий счет и общий счет + DCC, чтобы определить нижний предел DCC-экстрагируемого счета. Результаты этого конкурентного связы-вания выражали как средний процент связывания (% связывания) ± стандартное отклонение, используя фор-мулу:



DPMопытное соединение - DPMобщий счет + DCC
% связывания = x 100
DPMбез опытного соединения - DPMобщий счет - DCC


Предупреждение рака молочной железы
Данное изобретение также относится к введению F-I реципиенту, который принадлежит к груп-пе риска возникновения de novo рака молочной железы. Термин "de novo" прежде всего означает отсутствие трансформации или перерождения нормальных клеток молочной железы в раковые или злокачественные клетки. Такая трансформация может происходить по стадиям в тех же самых или дочерних клетках через эволюционный процесс, или может происходить как отдельный центральный процесс. Этот процесс de novo отличается от метастазирования, колонизации или распространения уже трансформированных или злокачественных клеток из первичной опухоли в новые участки локализации.
Человек, который не относится к группе повышенного риска появления рака молочной железы, является тем, у кого может возникнуть de novo рак молочной железы, у кого нет никаких симптомов или сомнений от-носительно вероятности заболевания вне обычного риска, и у кого никогда не было диагностировано забо-левание. Наивысшим фактором риска, предполагающим развитие карциномы молочной железы, является анамнез жизни страдающего этим заболеванием или наличие предшествующего проявления заболевания, даже если в настоящее время имеется ремиссия без каких-либо симптомов его наличия. Другим фак-тором риска является наличие заболевания в семейном анамнезе.
Индукция опухолей молочной железы у крыс введением канцерогена N-нитрозо-N-метилмочевины является хорошо известной животной моделью для изучения рака молочной железы и считается подходя-щей моделью для анализа эффективности химиотерапевтических агентов.
В двух отдельных исследованиях, самкам крыс Sprague-Dawley в возрасте 55 дней внутривенно (иссле-дование 1) или внутри брюшинно (исследование 2) вводили дозу 50 мг N-нитрозо-N-метилмочевины на килограмм веса тела за одну неделю до кормления со свободным доступом к пище, в которую приме-шивали варьирующие количества F-I, (Z)-2-[4-(1,2-дифенил-1-бутенил)-фенокси]-N, N-диметилэтанамина, основания (основание тамоксифена), или контроль.
В исследовании 1 пищевые дозы 60 мг/кг еды и 20 мг/кг еды переводили в грубо сравнимые дозы 3 и 1 мг/кг веса тела для каждого животного.
В исследовании 2 пищевые дозы 20, 6, 2 и 0,6 мг/кг еды переводили в грубо сравнимые
дозы 1; 0,3; 0,1 и 0,03 мг/кг веса тела для опытных животных.
Крыс наблюдали на предмет проявлений токсичности, и раз в неделю взвешивали и пальпировали для определения образования опухоли. Через тринадцать недель (исследование 1) или восемнадцать недель (исследование 2) животных умерщвляли, при аутопсии подтверждали наличие опухоли и взвешивали.
Композиции
Термин "фармацевтический", используемый как прилагательное, по существу означает невредный для реципиента млекопитающего. Под термином "фармацевтическая композиция" имеют в виду, что носи-тель, разбавитель, наполнители и активный ингредиент(ы) должны быть совместимыми с другими ин-гредиентами композиции и не быть вредными для реципиента.
Предпочтительно, F-I вносили в композиции до введения. Выбор композиции должен быть сделан наблюдающим врачом с учетом тех же факторов, что включены в определение эффективного количества.
Суммарные активные ингредиенты в такой композиции содержат от 0,1% до 99/9% веса композиции. Предпочтительно не более двух активных ингредиентов включают в названную композицию. Так, предпо-чтительным является включение в состав композиции F-I вместе с другим активным ингредиентом, выбранным из эстрогена, прогестина, ингибитора ароматазы, аналога LHRH и ингибитора AChE. Наиболее предпочтительными композициями являются такие, в которых F-I оказывается единственным активным ингредиентом.
Фармацевтические композиции данного изобретения готовили с помощью способов, известных в данной области, используя хорошо известные и легко доступные ингредиенты. Например, F-I либо сам по себе, либо в комбинации с эстрогеном, прогестином, ингибитором ароматазы, аналогом LHRH или ингибитором AChE, готовили с обычными наполнителями, разбавителями или носителями и формировали в таблетки, капсулы, суспензии, растворы, инъецируемые композиции, аэрозоли, порошки и тому подобное.
Фармацевтические композиции этого изобретения для парентерального введения содержат стерильные водные и неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки, которые реконструируют непосредственно перед применением в стерильных растворах или суспен-зиях. Примеры приемлемых стерильных водных и неводных носителей, разбавителей или наполните-лей включают в себя воду, физиологический солевой раствор, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, поли (этиленгликоль) и тому подобное), и их приемлемые смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть поддерживали, например, применением покрывающих материалов, таких как лецитин, созданием надлежащего размера частиц в случае дисперсий и суспензий и использования поверхностно-активных веществ.
Парентеральные композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергаторы. Предотвращение действия микроорганизмов обеспечивали включением антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парааминобензойной кислоты, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и тому подобного. Также желательно включение изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобного. К пролонгированной абсорбции инъ-ецируемых композиций приводило включение агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеа-рат алюминия и желатин.
В некоторых случаях для пролонгирования действия лекарственного средства желательно замедлить абсорбцию лекарства после подкожной или внутримышечной инъекции. Этого можно достичь использова-нием жидкой суспензии кристаллического вещества с низкой растворимостью или растворением или сус-пендированием лекарственного средства в масляном растворителе. В случае подкожной или внут-римышечной инъекции суспензии, содержащей форму лекарственного средства с низкой растворимостью в воде, скорость абсорбции лекарства зависит от скорости его растворения.
Инъецируемые «депонируемые» композиции F-I получали формированием микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биодеградируемых полимерах, таких как поли(молочная кислота), поли (гликолевая кислота), сополимеры молочной и гликолевой кислот, поли (ортоэфиры) и поли(ангидриды) этих веществ, описанные в данной области. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера и свойств отдельного употребляемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства.
Инъецируемые композиции стерилизуют, например, фильтрованием через антибактериальные фильтры или предварительной стерилизацией соединений смеси перед их смешиванием, или во время производства, или непосредственно перед введением (как в двухкамерном шприце-упаковке).
Твердые дозированные формы для перорального введения включают в себя капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах F-I смешивают, по крайней мере, с одним инерт-ным фармацевтическим носителем, таким как хлорид натрия или вторичный кислый фосфат кальция, и/или (а) сухими разбавителями или наполнителями, такими как крахмалы, сахара, включая лактозу и глюкозу, маннит и кремневую кислоту, (b) связывающими агентами, такими как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин, поли(винилпирролидин), сахароза и аравийская камедь, (с) увлажнителями, такими как глицерин, (d) диспергаторами, такими как агар-агар, углекислый кальций, дву-углекислый натрий, картофельный или крупяной крахмал, альгиновая кислота, силикаты и углекислый натрий, (е) увлажняющими агентами, такими как глицерин; (f) агентами, препятствующими растворению, такими как парафин, (g) усиливающими абсорбцию агентами, такими как соединения четвертичной соли ам-мония, (h) смачивающими веществами, такими как цетиловый спирт и моностеарат глицерина и (j) смазками, такими как тальк, стеарат кальция, твердые поли (этиленгликоли), лаурилсульфат натрия и их сме-си. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированные формы также могут содержать забуферивающие аген-ты.
Твердые композиции подобного типа могут также содержать начинку для мягких и твердых желатино-вых капсул, используя наполнители, такие как лактоза, а также высокомолекулярные поли (этиленгликоли) и тому подобное.
Твердые дозированные формы, такие как таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы также можно производить с покрытиями или оболочками, такими как энтерические покрытия или другие покрытия, хоро-шо известные в области технологии приготовления лекарственных средств. Покрытия могут содер-жать агенты, делающие вещества непрозрачными, или агенты, которые высвобождают активный ингреди-ент(ы) в определенном участке пищеварительного тракта/ как, например, кислоторастворимые покрытия для высвобождения активного ингредиента(ов) в желудке или щелочерастворимые покрытия для высвобождения активного ингредиента(ов) в кишечном тракте.
Активный ингредиент(ы) также может быть микроинкапсулирован в покрытие, затрудняющее высво-бождение, при этом микрокапсулы оказываются частью таблеточного или капсульного образования.
Жидкие дозированные формы F-I для перорального введения включают в себя раствор, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений, жидкие композиции могут включать в себя инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие фармацевтиче-ские растворители, солюбилизирующие вещества и эмульгаторы, такие как этанол, изопропанол, этилкарбо-нат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности хлопковое, арахисовое, кукурузное, масло семян, оливковое, касторовое и сезамовое мас-ло), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, поли(этиленгликоли), эфиры жирных кислот сорбита и их смеси.
Кроме инертных разбавителей, жидкие пероральные композиции также могут включать в себя адъюван-ты, такие как смачивающие вещества, эмульгаторы и суспендирующие агенты и подслащи¬вающие, вкусовые и ароматизирующие вещества.
Жидкие суспензии, кроме активного ингредиента(ов), могут содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и эфиры сорбитана, микрокристал-лическую целлюлозу, метагидроокись алюминия, бентонитную глину, агар-агар и трагакант и их смеси.
Композиции для ректального или интравагинального введения получены смешиванием F-I с под-ходящими не вызывающими раздражение наполнителями, такими как масло какао, полиэтилен-гликоль или любой суппозиторный воск, который оказывается твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре тела и поэтому плавится в прямой кишке или в полости влагалища с высвобождением активного соединения(ий). Соединения были растворены в расплавленном воске, сформированы в требуемую форму и оставлены для затвердевания в окончательную суппозиторную композицию.
F-I также может быть введен в форме липосом. Как известно в данной области, липосомы обычно полу-чают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомные композиции образуются посредством моно и мультислойных гидратированных жидких кристаллов, которые диспергируют в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный, фармацевтический и метаболизирующий липид, способный образовывать липосомы. Данные композиции в липосомной фирме могут содержать, кроме F-I, стабилизаторы, наполнители, консерванты и тому подобнее. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как природные, так и синтетические.
Способы образования липосом известны в данной области и описаны, например, у Prescott, Ed., Vethods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y. (1976), p. 33 и последующие.
Следующие примеры композиций только иллюстрируют данное изобретение и не предназначены для его ограничения.

Композиция 1: Желатиновые капсулы

Твердые желатиновые капсулы приготовлены с использованием следующегот : Ингредиент Количество (мг/капсулу)
F-I
Крахмал, Национальная Фармакопея США
Крахмал, текучий порошок
Кремний жидкий 350 сантистокс 0,1-1000
0-650
0-650
0-15

Вышеупомянутая композиция может быть изменена в соответствии с предлагаемыми обоснованными изменениями.

Таблеточная композиция получена с использованием приведенных ниже ингредиентов:

Композиция 2: Таблетки

Ингредиент Количество (мг/таблетку)
F –I
Целлюлоза, микрокристалическая
Диоксид силикона, дымящий
Стеариновая кислота
2,5-1000
200-650
10-650
5-15

Компоненты смешивают и прессуют с образованием таблеток.
Композиция 3: Таблетки, содержащие приблизительно 10 и 50 мг F-I,
соответственно, могут быть приготовлены следующим образом

Ингредиент Количество (мг/таблетку) Количество (мг/таблетку)
F-I
Лактоза безводная
Лактоза, высушенная распылени-ем
Повидон
Полисорбат 80
Кроссповидон (внутри)
Кроссповидон (снаружи)
Стеарат магния
Целлюлоза, микрокристалличе-ская (снаружи) 11,3
176,8
44,2
11,0
2,5
6,25
6,25
1,5
0,0 56,5
128,2
32,0
13,0
2,6
6,24
6,5
1,7
13,0

Соединения смешивались и прессовались с образованием таблеток.
Альтернативно, таблетки, каждая содержащая 2,5-1000 мг F-I, составлялись следующим образом:

Композиция 4: Таблетки

Ингредиент Количество (мг/таблетку)
F-I
Крахмал
Целлюлоза, микрокристаллическая
Поливинилпирролидон (в виде 10% раствора в воде)
Натрийкарбоксиметилцеллюлоза
Стеарат магния
Тальк 25-1000
45
35

4
4,5
0,5
1

F-I, крахмал и целлюлоза пропускались через сито U.S. №45 меш и энергично смешивались. Раствор по-ливинилпирролидона смешивался с полученными порошками, которые затем пропускались через сито U.S. 14 меш. Полученные таким образом гранулы высушивались при 50°- 60°С и пропускались через сито U.S. №18 меш. Натрийкарбоксиметил крахмал, стеарат магния и тальк, предварительно попущенные через сито U.S. №60 меш, затем добавлялись к гранулам, которые после смешивания прессовались на машине для изго-товления таблеток с образованием таблеток.
Суспензии, каждая содержащая 0,1-1000 мг лекарственного средства на 5 мл дозированной формы, производились следующим образом:

Композиция 5: Суспензии

Ингредиент Количество (мг/5 мл)
F-I
Натрийкарбоксиметилцеллюлоза
Сироп
Раствор бензойной кислоты
Вкусовое вещество
Краска
Очищенная вода до 0,1-1000 мг
50 мг
1,25 мг
0,10 мл
достаточное количество
достаточное количество
5 мл

Лекарственное средство пропускалось через сито U.S. 45 меш и смешивалось с натрийкарбоксиметил-целлюлозой и сиропом с образованием однородной пасты. Раствор бензойной кислоты, вкусовое вещество и краска разбавлялись некоторым количеством воды и добавлялись при перемешивании. Затем добавлялось достаточное количество воды до получения требуемого объема.
Получали аэрозольные растворы, содержащие следующие ингредиенты:

Композиция 6: Аэрозоль

Ингредиент Количество
(% по весу)
F-I
Этанол
Пропеллент 22 (хлордифторметан)
0,25
25, 75

70,0

F-I смешивался с этанолом, и смесь добавлялась к порции пропеллента 22, охлаждалась до 30°С и переносилась в заполняющее устройство. Затем требуемое количество подавалось в нержавеющий стальной контейнер и разбавлялось оставшимся пропеллентом. Вентильное устройство затем монтировалось к контейнеру.
Суппозитории готовились следующим образом:

Композиция 7: Суппозитории


Ингредиент Количество (мг/суппозиторию)
F-I
Глицериды насыщенных жирных кислот 250

2000

F-I пропускался через сито U.S. №60 меш и суспендировался в глицеридах насыщенных жирных кислот, предвари-тельно расплавленных при минимально необходимом нагревании. Смесь затем заливалась в суппозиторную форму с номинальной емкостью 2 г и оставлялась для охлаждения.
Внутривенная композиция была получена следующим образом:

Композиция 8: Внутривенный раствор

Ингредиент Количество
F-I
Изотонческий солевой раствор 25 мг
1000 мл

Раствор вышеупомянутых ингредиентов вводится внутривенно пациенту со скоростью приблизительно 1 мл за минуту.

Композиция 9: Капсула комбинации I

Ингредиент Количество (мг/капсулу)
F-I
Премарин
Авицел РН 101
Крахмал 1500
Силиконовое масло
Твин 80
Cab-O-Sil 50
1
50
117,50
2
0,50
0,25

Композиция 10: Капсула комбинации II

Ингредиент Количество (мг/капсулу)
F-I
Норэтилнодрел
Авицел РН 101
Крахмал 1500
Силиконовое масло
Твин 80 50
5
82,50
90
2
0,50

Композиция 11: Комплексная таблетка

Ингредиент Количество (мг/капсулу)
F-I
Премарин
Кукурузный крахмал, Нацио-нальная Фармакопея США
Полидон, К29-32
Авицел РН 102
Авицел РН 102
Кроссповидон XL10
Стеарат магния
Cab-O-Sil 50
1

50
6
41,50
136,50
2,50
0,50
0,50

Система доз

Определенная доза F-I, вводимая согласно изобретению, устанавливается в соответствии с особыми об-стоятельствами, сопутствующими каждой ситуации. Эти обстоятельства включают в себя способ введения, предшествующую историю болезни, патологическое состояние или симптом, требующие лечения, тяжесть заболевания/симптома, требующего лечение, и возраст и пол реципиента.
Обычно эффективная минимальная ежедневная доза F-I составляет приблизительно 1, 5, 10, 15 или 20 мг. Эффективная максимальная доза составляет приблизительно 800, 100, 60, 50 или 40 мг. Наиболее типично, доза колеблется между 15 мг и 60 мг. Точная доза может быть установлена в соответствии со стан-дартным правилом в медицинской практике «дозового титрования» реципиента; это заключается в первона-чальном введении низкой дозы соединения и в постепенном увеличении ее до тех пор, пока не будет наблю-даться желаемое терапевтическое действие,
Хотя может быть необходимым проведение дозового титрования реципиента в отношении обсуж-даемых выше комбинированных терапий, типичными дозами активных ингредиентов помимо F-III ока-зываются следующие: Этинилэстроген (0,01-0,03 мг/день), местранол (0,05-0,15 мг/день), конъюгированные эстрогенные гормоны (например, премарин0, Premarin0, Wyeth-Ayerst; 0,3-2,5 мг/день), медроксипрогестерон (2,5-10 мг/день), норэтилнодрел (1,0-10,0 мг/день),
нонэтиндрон (0,5-2,0 мг/день), аминоглутемид (250-1250 мг/день, предпочтительно 250 мг четыре раза в день), анастразол (1-5 мг/день, предпочтительно 1 мг один раз в день), летрозол (2,5-10 мг/день, предпочти-тельно 2,5 мг один раз в день), форместан (250-1250 мг в неделю, предпо¬чтительно 250 мг дважды в неделю), эксеместан (25-100 мг/день, предпочтительно 25 мг один раз в день), госерлин (3-15 мг/три месяца, предпо-чтительно 3,6-7,2 мг один раз в три месяца) и леупролид (3-15- мг/месяц, предпочтительно 3,75 - 7,5 мг один раз каждый месяц).
Способ введения
F-I может быть введен с помощью целого ряда способов, включающих в себя пероральный, рек-тальный, чрескожный, подкожный, внутривенный, внутримышечный и интраназальный. Способ введения каждого эстроген- и прогестин-содержащего агента соответствует способу, который известен в данной обла-сти. F-I, один или в комбинации с эстрогеном, прогестином или ингибитором AChE, обычно вводят в подхо-дящей композиции.
Фармацевтические композиции этого изобретения можно вводить человеку и другим млекопи-тающим (например, собакам, кошкам, лошадям, свиньям и тому подобным) перорально, ректально, интравагинально, парентерально, местно, трансбуккально или подъязычно или назально. Термин «паренте-ральное введение» относится к способам введения, которые включают в себя внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрастернальную или внутрисуставную инъекцию или инфузию.
Способ/продолжительность введения
Для большинства из способов данного изобретения F-I вводится постоянно от 1 до 3 раз еже-дневно или так часто, как необходимо, чтобы обеспечить реципиенту эффективное количество. Цик-лическая терапия может быть полезной особенно при лечении эндометриоза или может быть высокоэффек-тивной для лечения болезненных приступов заболевания. В случае рестеноза терапия может быть огра-ничена краткими (1-6 месяцев) интервалами после лечебных манипуляций, таких как ангиопа-стика.

1. WO 98/45287, A1 (ELI LILLY AND COMPANY), 15.10.1998
2. RU 2104278, C1 (Эли Лилли энд Компани),02.10.1998, реферат