СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ДНКАЗЫ (ВАРИАНТЫ), ОЧИЩЕННАЯ ДЕЗАМИДИРОВАННАЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКАЯ ДНКАЗА, ОЧИЩЕННАЯ НЕДЕЗАМИДИРОВАННАЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКАЯ ДНКА-ЗА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОУПРУГОСТИ ГНОЯ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТА, СТРАДАЮЩЕГО СКОПЛЕНИЕМ ГНОЯ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТА, СТРАДАЮЩЕГО МУКОВИСЦИДОЗОМ, БРОНХИТОМ, ПНЕВМОНИЕЙ

Изобретение относится к биотехнологии, касается идентификации и характеристики двух компонентов рекомбинантного препарата ДНКазы. Эти компоненты представляют собой очищенную дезамидированную и очищенную недезамидированную человеческую ДНКазу. Способы разделения этих ДНКаз осуществляют с помощью полидентатной катионо-обменной смолы или с помощью смолы с иммобилизованным на ней гепа-рином или с помощью смолы с иммобилизованным на ней негидролизуемым аналогом ДНК. Использование недезамидированной ДНКазы в составе фармацевтической композиции эффективно для введения пациентам, страдающим от нарушений легочного характера. 13 н.з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 1 пр.

Настоящая заявка связана по существу излагаемого материала с материалом, содержащимся в между-народной Публикации WО 90/07572. Содержание указанной предыдущей заявки специально приводится по этой причине в настоящем изобретении в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к результатам, полученным при исследовании дезоксирибонукле-азы (ДНКазы)-фосфодиэстеразы, способной проводить гидролиз полидезоксирибонуклеиновои кислоты. Оно относится в основном к разделению нескольких форм упомянутой ДНКазы, к таким ее формам, на ос-нове которых могут быть составлены полезные лекарственные композиции, а также к способам исполь-зования ДНКаз и созданных на их основе композиций.
Предпосылки создания изобретения
ДНКаза представляет собой фосфодиэстеразу, способную гидролизовать полидезоксирибонуклеино-вую кислоту. ДНКаза была выделена из различных источников с различной степенью чистоты. Впервые полная аминокислотная последовательность для ДНКазы из млекопитающих была определена в 1973 г. См., Liao, et al., J. Biol. Chem. 248:1489 (1973).
ДНКаза характеризуется множеством уже известных полезных свойств и применялась, в связи с этим для лечебных целей. Основное терапевтическое применение ДНКазы связывалось со способностью снижать вязкоупругость легочных выделений при таких заболеваниях, как пневмония и муковисцидоз, что способствовало очищению дыхательных путей. См. Lourenco, et al., Arch. Intern. Med. 142:2299 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188 (1990); Hubbard, et al., New Engl. J. Med. 326:812 (1992).
ДНК, кодирующая ДНКазу человека, была выделена и секвенирована, при этом была достиг-нута экспрессия ДНК в рекомбинантных клетках, что открывало возможности получения человеческой ДНКазы в коммерчески значимых количествах. См., Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990). Рекомбинантные ДНКазы человека оказались полезными в терапевтическом отношении, осо-бенно при использовании в очищенном виде, когда ее освобождали от протеаз и других белков, обычно связанных с нею в естественном состояние. См., Hubbard, et al., New Engl. J. Med. 326:812 (1992).
В цитированных выше заявках на патент описаны способы и методики получения человеческой ДНКазы в фармацевтически приемлемой форме. Существующий уровень техники располагает различ-ными специфическими методами очистки ДНКазы. См., Khouw, et al., U.S. Patent No. 4065355 (опубликован 27 декабря (1977); Markey, FEBS Letters 167:155 (1984); Nefsky, et al., Eur. J. Biochem. 179:215 (1989).
Хотя это не было известно на момент подачи вышеуказанной заявки на выдачу патента, как стало теперь ясно, ДНКазу-содержащий продукт, полученный из куль туры рекомбинантных кле-ток-хозяев, как правило, включает в себя смесь дезамидированной и недезамидированнои форм ДНКазы. Существование дезамидированных форм ДНКазы оставалось неизвестным несмотря на то, что было известно, что в некоторых белках имеет место дезамидирование аспарагиновых и глютамино-вых остатков. См. Eipper et al., Ann. Rev. Physiol. 50:333 (1988); Kossiakoff, Science 240:191 (1988); Brad-bury et al., Trends in Biochem, Sci. 16:112 (1991); и Wright, Protein Engineering 4:283 (1991).
В настоящем изобретении утверждается на основании неотмечавшегося ранее факта, что ре-комбинантная человеческая ДНКаза может существовать в виде смеси дезамидированной и недезамидиро-ваннои форм. С использованием способов настоящего изобретения было показано, что дезамидированная человеческая ДНКаза отличается меньшей ферментативной активностью, чем недезамидированная че-ловеческая ДНКаза. Таким образом, совместное присутствие в смеси дезамидированной и недезамидированнои форм ДНКазы, а также возможность осуществления дальнейшего дезамидиро-вания продукта, которое, как было показано, имеет место при .хранении препаратов человеческой ДНКазы in vitro, может усложнить получение устойчивых однородных препаратов ДНКазы, пригодных для клиническо-го применения. Исходя из этого, поскольку само существование, а тем более характеристики дез-амидированной ДНКазы до настоящего изобретения оставались неизвестными, в даныом изобретении приве-дены методы идентификации дезамидированности ДНКазы, а также способы отделения таких ДНКаз от препаратов ДНКазы, в которых дезамидированная ДНКаза могла быть найдена, однако ее присутствие неочевидно.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способам разделения дезамидированной и недезамидированной форм человеческой ДНКазы из их смеси. В предпочтительном варианте этот процесс включает хроматогра-фирование смеси с использованием смолы или другой поддерживающей среды, способной к связыва-ние с катионным полимером, таким, как гепарин или аналог негидролизованной дезоксирибонуклеиновои кислоты (ДНК), или хроматографирование с использованием так называемой ворсистой катионообменной смолы. Настоящее изобретение относится также к применению таких хроматографических методов, отлич-ных от человеческой ДНКазы, в частности, для бычьей ДНКазы.
Настоящее изобретение относится также к дезамидированной человеческой ДНКазе, как к очищенно-му продукту, по существу не содержащему недезамидированную человеческую ДНКазу.
Настоящее изобретение относится также к недезамидированной человеческой ДНКазе как к очищен-ному продукту, по существу, не содержащему дезамидированную человеческую ДНКазу. С помощью настоящего изобретения было показано, что очищенная недезамидированная человеческая ДНКаза обладает более полной ферментативной активностью в сравнении с дезамидированной ДНКазой.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента либо очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу, либо очищенную недезамидированную человеческую ДНКазу, необязательно в сочетании с фармацевтически при-емлемым наполнителем.
Настоящее изобретение относится также к способу, предусматривающему введение те-рапевтически эффективного количества очищенной дезаминированной ДНКазы или очищенной недез-амидированной ДНКазы для лечения, например, таких больных, у которых отмечается накопление вязкого ДНК-содержащего материала. Предпочтительным способом введения таких очищенных ДНКаз является ингаляция препарата непосредственно в легкие.
Настоящее изобретение относится, в особенности, к способу лечения больных заболеваниями легких, такими, как хронический бронхит, муковисцидоз или эмфизема, предусматривающему введение терапев-тически эффективного количества очищенной недезамидированной ДНКазы, предпочтительно в дыхательные пути.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим недезами-дированную человеческую ДНКазу, помещенную в пластиковый сосуд, необязательно в сочетании с фарма-цевтически приемлемым носителем.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 представлена аминокислотная (SEQ ID No.l) и нуклеотидная последовательность ДНК (SEQ ID No. 2) соответствующие человеческой ДНКазе I. Нативная сигнальная последователь-ность подчеркнута, потенциальные инициирующие кодоны обведены кружками, а зрелая последова-тельность заключена в скобки.
Фигура 2 отражает корреляцию между ферментативной активностью и уровнем дезамидирова-ния образцов человеческой ДНКазы. Удельную активность определяли по нормализации ДНКазной активности от значений, полученных в тесте с метиленовым зеленым (MG) (в единицах концентрации, близ-ких к стандартной кривой) до концентрации ДНКазы, измеряемой на основе иммуносорбентного теста по связыванию фермента (ELISA). Процент дезамидирования определяли по картированию с по-мощью трипсина. Образцы человеческой ДНКазы, соответствующие отметкам "День сбора клеток" ("Day of Harvest"), выделяли с последующей очисткой из культуры рекомбинантных клеток яичника китайского хомячка (СНО), способных к экспрессии ДНК, кодирующей человеческую ДНКазу I. Такие об-разцы отбирались на 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 20 день от начала роста культуры. Образцы, обозначенные как "Высокий рН" ("Higt рН) , представляют собой образцы очищенной ДНКазы 13 дня, которые инкубирова-ли in vitro в течение двух дней при рН 8 и температуре 37°. Образцы, обозначенные как "Стабильность" ("Stability") представляют собой образцы очищенной ДНКазы 13 дня, которые хранили in vitro при температуре 5°, 25° или 37° в течении различных периодов времени.
На фигуре 3 представлен пример триптического картирования ДНКазы, выполненного с целью опре-деления уровня дезамидирования. На показанном примере приведена 65% дезамидированная ДНК. Аббреви-атура "mAU" указывает миллиединицы поглощения при 214 нМ.
На фигуре 4 схематически представлено дезамидирование аспарагинового остатка в 74 положении аминокислотной цепи (Asn-74) в нативной человеческой ДНКазе. Дезамидирование превращает Asn-74 либо в аспарагиновую кислоту (Asp), либо в остаток изо-аспарагиновой кислоты (iso-Asp) . Каждая из этих трех форм ДНКаз дает при расщеплении трипсином пару пептидов, что указывает на идентичность указанных форм ДНКаз.
На фигуре 5 представлена хроматограмма образца человеческой ДНКазы, фракционирован-ной на колонке c ворсистым катионообменником (ТСХ). Показанный образец представляет собой 67% дезамидированную ДНКазу.
На фигуре 6 показаны карты расщепления трипсином фракций двух пиков, взятых в процессе разделе-ния на ТСХ, показанном на фигуре 5. Отсутствие пептида Т6-7 на триптической карте расщеп-ления пика 2 указывает на отсутствие в нем дезамидированной ДНКазы.
На фигуре 7 показаны хроматограммы нескольких образцов человеческой ДНКазы, фракционирован-ной на ТСХ колонке. Образцы, обозначенные как "MI-28 STD" представляют собой препараты человеческой ДНКазы, полученные из культуры клеток яичника китайского хомячка (СНО), трансформированных с помо-щью ДНК, кодирующей нативную человеческую ДНКазу I. Образцы, обозначенные как "Asn-Мутант ДНКа-зы" ("Dnase ASP Mutant"), представляют собой ДНКазу, имевшую в положении 74 аминокислотной цепи остаток аспарагиновой кислоты (а не остаток аспарагина), и которая имеет таким образом ту же аминокис-лотную последовательность, что и Asp-форма дезамидированной ДНКазы, показанной на фигуре 4. Asp-Мутант ДНКазы был получен из культуры клеток, трансформированных ДНК, кодирующей мутантную форму человеческой ДНКазы. ДНК, кодирующая Asp-мутант ДНКазы, . была получена с помощью сайт-направленного мутагенеза ДНК, кодирующей нативную человеческую ДНК. Сравнение хромато-грамм показывает, что одна из форм человеческой ДНКазы представляет собой MI-28 STD, которая элюируется с ТСХ колонки в той же позиции, что и Asp-мутант ДНКазы.
На фигуре 8 представлены хроматограммы нескольких образцов человеческой ДНКазы, фракци-онированных на TSК-гепариновой колонке (Тоso Haas, Montgomeryville, Pennsylvania). Образец, обо-значенный как "12К #8", представляет собой препарат человеческой ДНКазы, полученной из куль-туры клеток яичника китайского хомячка (СНО), трансформированной ДНК, кодирующей нативную челове-ческую ДНКазу I. Образец, обозначенный как "Дезамидированный Стандарт" ("Deamidated Standard") пред-ставляет собой очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу. Образец, обозначенный как "Недез-амидированный Стандарт" ("Non-deamidated Standard"), относится к очищенной недезамидирован-ной человеческой ДНКазе. Очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу и очищенную недез-амидированную человеческую ДНКазу получают с помощью ТСХ хроматографии.
На фигуре 9 представлены хроматограммы нескольких образцов человеческой ДНКазы, фракци-онированных на колонке с иммобилизованным аналогом ДНК. _Образец, обозначенный как "MI-28", представляет собой человеческую ДНКазу, полученную из культуры клеток яичника китайского хо-мячка (СНО), трансформированной ДНК, кодирующей нативную человеческую ДНКазу. Образец, обо-значенный как "Дезамидированный Стандарт" ("Deamidated Standard") представляет собой очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу. Образец,- обозначенный как "Недезамидированный Стандарт" ("Non-deamidated Standard"), относится к очищенной недезамидированной человеческой ДНКазе. Очищенные дезамидированные человеческие ДНКазы и очищенные недезамидированные человеческие ДНКазы получают с помощью ТСХ хроматографии. Образец, обозначенный как "Asp-мутант ДНКазы" ("Dnase ASP Mutant"), представляет собой ДНКазу, несущую остаток аспарагиновой кислоты (а не остаток аспарагина) в позиции 74 аминокислотной последовательности.
Подробное описание
А. Определения
Под термином "человеческая ДНКаза" в настоящем описании подразумевается полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и в приведенной выше на фигуре 1 последовательности аминокислот человеческой зрелой ДНКазы I, то же самое относится к аминокислотной последова-тельности его вариантов (включая аллельные варианты), обладающих ферментативной гидролизующей активностью в отношении ДНК. Таким образом, в данном контексте термин "челове-ческая ДНКаза" обозначает широкий набор материалов, раскрытие или получение которых приведено в обозначенных выше заявках на патент.
Термин "человеческая ДНКаза" обязательно включает в себя нативную зрелую человеческую ДНКазу, имеющую остаток аспарагина (Asn) в 74 положении аминокислотной последовательности полипеп-тида. Как показано в настоящем изобретении, этот остаток аспарагина является чувствительным к дезамиди-рованию, которое может привести к получению смеси дезамидированной и недезамидированной форм человеческой ДНКазы; Вместо остатка (Asn) в положении 74 , аминокислотной последовательности, дезамидированная ДНКаза содержит остаток аспарагиновой кислоты (Asp) или изо-аспарагиновой кислоты (iso-Asp) (См. фигуру 4).
Используемый в данном изобретении термин "дезамидированная человеческая ДНКаза" означает человеческую ДНКазу, дезамидированную по остатку аспарагина, при этом указанное дезамидирование имеет место в 74 положении аминокислотной последовательности нативной зрелой человеческой ДНКазы. Было показано, что дезамидированная ДНКаза может возникать при получении человеческой ДНКазы с применением рекомбинантных методов и может быть обнаружена в препаратах человеческой ДНКазы, полученных из рекомбинантных хозяйских клеток.
Кроме того, дезамидированная человеческая ДНКаза может возникать при хранении in vitro недезами-дированнои человеческой ДНКазы.
Несмотря на то, что остаток аспарагина в положении 7 аминокислотной последовательности, натив-ной зрелой человеческой ДНКазы тоже может быть дезамидирован (в дополнение к остатку аспарагина в 74 положении аминокислотной цепи), показано, что такое двойное дезамидирование приводит к получению ферментативно неактивной ДНКазы.
Используемый здесь термин "смесь" применительно к препаратам человеческой ДНКазы означает присутствие как дезамидированной, так и недезамидированнои форм ДНКаз. Было показано, например, что в препаратах человеческой ДНКазы, полученных при экспрессии в рекомбинантных клетках, дезамидирова-нию подвергается от 50% до 80%, а, возможно, и более высокий процент ДНКазы.
Термин "очищенна.я де.замидированная человеческая ДНКаза", используемый в настоящем изобретении, обозначает дезамидированную человеческую ДНКазу, которая по существу не содер-жит примеси недезамидированнои человеческой ДНКазы. Иными словами, недезамидированная чело-веческая ДНКаза составляет лримерно менее 10%, предпочтительно менее примерно 5%, а в наиболее предпочтительном варианте менее, чем примерно 1% от общей массы ДНКазы в препарате очи-щенной дезамидированной человеческой ДНКазы.
Термин "очищенная недезамидированная человеческая ДНКаза", используемый в настоящем контексте, обозначает недезамидированную человеческую ДНКазу, которая по существу не содер-жит примесей дезамидированной человеческой ДНКазы. Иными словами, дезамидированная человече-ская ДНКаза составляет примерно менее 25%, предпочтительно менее, чем около 5%, а в наиболее пред-почтительном варианте менее примерно 1% от общей массы ДНКазы в препарате очищенной недез-амидированнои человеческой ДНКазы.
Применяемый в настоящем описании термин "наполнитель" означает фармацевтически приемлемый материал, используемый совместно с ДНКазой для приготовления подходящего лекар-ственного средства с целью улучшения действия его при введении ДНКазы пациентам. Подходящие для таких целей наполнители хорошо известны и описаны, например, в Physicians Desk Reference, the Merck Index и Remington's Pharmaceutical Sciences.
Предпочтительной фармацевтической композицией для человеческой ДНКазы является забу-ференный или незабуференный водный раствор, предпочтительно в изотоническом растворе соли, таком, как 150 мМ хлорида натрия, содержащем 1,0 мМ хлорида кальция при рН 7. Такие растворы особенно подходят для использования при коммерчески значимом производстве распылителей, включающих струйные распылители и ультразвуковые распылители, особенно применимые, в частности, при распылении непосредственно в дыхательные, пути или легкие больного. Подробное описа-ние, касающееся способов приготовления фармацевтических композиций, а также их введения для получения эффективного результата, можно найти в цитированных выше патентных заявках.
Под применяемым здесь термином "терапевтически эффективное количество" подразумеваются дози-ровки от 1 мкг до примерно 100 мг человеческой ДНКазы на килограмм веса тела пациента, и вво-димой в составе описываемых здесь фармацевтических композиций. Терапевтически эффективное количество человеческой ДНКазы зависит, например, от терапевтических целей, способа введения и от со-стояния больного. В этой связи, лечащему врачу необходимо проводить титрование нужной дозировки и варьировать способ введения препарата для получения оптимального терапевтического эффекта. В связи с описанными выше различиями в ферментативной активности дезамидированной и недезамидирован-ной форм ДНКаз, может случиться так, что количество очищенной недезамидированной ДНКазы, тре-буемой для достижения терапевтического эффекта, будет меньше, чем количество очищенной дезамиди-рованной человеческой ДНКазы или смеси этих двух форм, необходимых для достижения такого же эффекта при тех же условиях.
Очищенные ДНКазы, особенно недезамидированную ее форму, применяют для изменения вязкоупру-гости слизистых выделений. Такие очищенные препараты человеческой ДНКазы особенно применимы для лечения больных легочныии заболеваниями, для которых характерно наличие аномально вязких гнойных выделений, а также для лечения состояний, таких как острые или хронические бронхолегочные заболевания, включая инфекционную пневмонию, бронхит или трахеобронхит, бронхоэктаз, муковисцидоз, астму, тубер-кулез и микозы. Для такого лечения применяется закапывание в бронхи раствора хорошо размельчен-ного сухого препарата или очищенной дезамидированной человеческой ДНКазы или же очищенной недезамидированнои человеческой ДНКазы с применением традиционных способов, таких, как аэрозольное распыление.
В. Предпочтительные варианты
В результате успешного клонирования и достижения экспрессии человеческой ДНКазы в реком-бинантных клетках-хозяевах было показано в ходе тщательного анализа, что получаемый при такой экспрессии в рекомбинантных клетках ДНКазный продукт представляет собой в типичном случае смесь к тому времени еще не определенных компонентов. В частности, исследование человеческой ДНКазы, выделенной из культуры клеток яичника китайского хомячка (СНО) и далее очищенных, с применением ме-тода изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), выявило сложный набор разных видов ДНКазы. Определяе-мые таким образом различные виды ДНКазы представляют собой результат нескольких пост-трансляционных модификаций ДНКазы, включая, в том числе, и дезамидирование.
Для определения наличия и уровня дезамидированных ДНКаз в таких препаратах применяли два метода анализа. Один из них включал расщепление исходных препаратов ДНКазы с помощью трипсина и дальнейший анализ полученных пептидов с помощью ВЭЖХ с обращением фаз. В этом ме-тоде количество дезамидированной ДНКазы в исходном препарате определяли по количеству шести характерных пептидов, полученных при расщеплении трипсином.
Другой метод включал хроматографирование исходного препарата ДНКазы на ионообменной колонке с ворсистым катионитом (ТСХ). Было показано, что применение ТСХ колонки дает возмож-ность разрешения пиков дезамидированной человеческой ДНКазы и недезамидированной человеческой ДНКазы, так что каждая из имеющихся форм ДНКазы может быть эффективно отделена от другой и получена в чистом виде. В этом методе количества дезамидированной и недезамидирован-ной ДНКаз в исходном препарате определяли за счет измерения зон хроматографических пиков, соответ-ствующих отдельным формам ДНКаз.
Несмотря на то, что оба приведенных метода одинаково эффективны в обнаружении и количественном определение дезамидированной ДНКазы, ТСХ методу отдается предпочтение в связи с тем, что он является менее трудоемким, отнимающим меньше времени, т.е. в этом аспекте бо-лее эффективным, чем второй метод. Кроме того, метод хроматографии на ТСХ обеспечивает разделение дезамидированной и недезамидированной форм ДНК даже в тех случаях, когда традиционно приме-няемые катионообменные смолы, а также другого рода смолы, применяемые в хроматографиче-скои технике, не давали нужного разделения.
Основные принципы хроматографии на ТСХ были описаны, в частности, у Miller, J. Chromatog-raphy 510:133 (1990); Janzen et al., J. Chromatography 522:77 (1990); и Hearn et al. , J. Chromatography 548:117 (1991). He желая ограничить изобретение предложением единственного механизма действия или теоретической основы функционирования, авторы полагают, по аналогии с известной кристалличе-ской структурой бычьей ДНКазы, что остаток Asn-74 в человеческой ДНКазе, чувствительный к дезамидиро-ванию, располагается в ферменте в сайте, удобном для связывания с бороздкой в спирали ДНК. Соответ-ствующая ей бороздка в ферменте содержит основные аминокислотные остатки (для связывания с ДНК) и, по-видимому, именно она является чувствительной к лигандам ворсистой катионообменной смолы, но не к намного более коротким лигандам традиционных катионообменных смол. По-видимому, меха-низм действия основан на том, что лиганды ворсистой катионообменной смолы близки к натураль-ным субстратам на основе нуклеиновых кислот. В этой связи, можно полагать, что ионообменная хроматография на ворсистой смоле будет полезна для очистки также других нуклеаз, таких, как рибонукле-аза (РНКаза) или рестрикционные эндонуклеазы, а также белков, связывающихся с ДНК.
Альтернативно, разделение дезамидированной и недезамидированной форм ДНКаз может быть достигнуто посредством хроматографии на основе смолы или другой несущей матри-цы, ковалентно связанными с катионными полимерами, такими, как гепарин или синтетический негидролизуемый аналог ДНК.
Колонки для хроматографии на основе имобилизованного гепарина коммерчески доступны (например, от Toso Haas Co., Montgomeryville, Pennsylvania).
Негидролизуемые аналоги ДНК были описаны, в частности, у Spitzer et al., Nuc. Acid. Res. 16:11691 (1988). Иммобилизованный негидролизуемый аналог ДНК получают обычно синтезом анало-га ДНК с аминокислотной группировкой на 3'-конце одной или обеих комплементарных нитей. Ами-ногруппа затем становится доступной для связывания с эпоксиактивированнои колонкой, как это описано, в материалах, опубликованных Рэйнин Байокемикел ЭлСи Продактс (Rainin Biochemical LC Products, Woburn, Massachusetts).
После успешного разделения дезамидированной и недезамидированнои форм ДНКаз по мето-ду данного изобретения было обнаружено с помощью исследования с метиленовым зеленым (MG) , что дез-амидированная человеческая ДНК имеет сниженную в сравнении с недезамидированнои чело-веческой ДНКазой ферментативную активность. Kurnick, Arch. Biochem. 29:41 (1950). Было показано, что дезамидированная человеческая ДНКаза обладает половинной ферментативной активностью в срав-нении с недезамидированнои человеческой ДНКазой. Таким образом, сочетая очищенные дезамидирован-ные ДНКазы и очищенные недезамидированные ДНКазы настоящего изобретения в различных пропорциях, можно создавать фармацевтические композиции на основе человеческой ДНКазы, имеющие нужную удель-ную активность в широком диапазоне удельных активностей индивидуальных компонентов, с возможностью выбора оптимальных вариантов для лечения определенных заболеваний.
Приведенные ниже примеры даны только для иллюстрации и никоим образом не
претендуют на ограничение каким-либо образом настоящего изобретения.
С. Примеры
1. Картирование с помощью трипсина
Процедура, применяемая для триптического картирования человеческой ДНКазы может быть сумми-рована следующим образом:
Стадия 1. Образец ДНК весов 1 мг доводится до концентрации 4 мг/мл посредством концентрации на устройстве Амикон Центрикон-10 (Amicon Centricon-10) или путем разбавления носителем. Конечный объем: 250 мкл.
Стадия 2. К образцу добавляют 250 мкл предварительно обработанного буфера (40 мМ Бис-Трис, 10 мМ ЭГТА, рН 6,0). Инкубацию проводят в течение 1 часа при 37°С.
Стадия 3. Меняют буфер, в котором находится образец, на расщепляющий буфер (100 мМ Трис, рН 8) с помощью колонки Фармация NAP-5. Конечный объем: 1 мл.

Стадия 4. К образцу добавляют 10 мкл трипсина (1 мг/мл трипсина, 1 мМ НС1) и инкубируют в тече-ние 2 часов при 37°С.
Стадия 5. К образцу добавляют вторую аликвоту трипсинового раствора, равную 10 мкл, и инкубиру-ют еще в течение 2 часов при 37°С.
Стадия 6. Останавливают процесс расщепления с помощью добавления 6 мкл трихлоруксуснои кисло-ты (ТХУ). Вплоть до хроматографирования хранят образцы при температуре ниже 5°С.
Стадия 7. Разделяют смесь пептидов с применением метода БЭЖХ при следующих условиях:
Колонка: Нуклеозил (Nu.cleosil) C18, 5 мкм, 100 А, 2,0 х 150 мм (Аллтек, Ко. , Дирфилд, Иллинойс - All-tech, Co. , Deerfield, Illinois).
Температура колонки: 4 0 °С.
Элюент А: 0,12% ТХУ в воде
Элюент В: 0,10% ТХУ в ацетонитриле.
Градиентный профиль:

Время (мин) %А %В
0 100 0
5 100 0
65 40 60
69 5 95
70 5 95

Скорость течения: 0,25 мл/мин. Объем наносимого образца: 250 мкл .
Время уравновешивания колонки после проведения разделения при 100% А: 20 мин.
Температура автоматического отборника проб: 5°,
Обнаружение: На основе поглощения при 214 и 280 нм.
Стадия 8. Определяют Т7, (D)T7, T7-8, (D)T7-8, Т6-7-8 и Т6-7 триптических пептидов сравнением вре-мени их удерживания со стандартом.
Стадия 9. Интегрируют пики хроматограммы, полученные при 280 нм. Проверяют качество хромато-граммы по положению базовой линии и разделению рядом элюирующихся пиков. Особое внимание при этом стоит уделить рано элюируемым пептидам Т7 и (D)T7, которые могут не очень хорошо разойтись при элю-ции.
Стадия 10. Соотносят зоны пиков шести указанных вышепептидов с содержанием тирозина. Каждый из пептидов Т7 , (D)T7, Т7-8 и (D)T7-8 содержат единственный остаток тирозина, тогда как Т6-7-8 и Т6-7 со-держат три остатка тирозина. Вычисляют пропорцию дезамидированных видов на основе нормали-зованных, т.е. соотнесенных с содержанием тирозина зон пиков (D)T7, (D)T7-8, Т6-7-8 и Т6-7, относительно общей суммы нормализованных зон пиков всех шести пептидов.
Для тщательного исполнения метода триптического картирования с целью определения дезамидиро-ванной ДНКазы в соответствии с описанной выше процедурой требуется 1 миллиграмм ДНКазы в объеме 250 мкл. В этой связи начальная подготовка к проведению этой процедуры включает либо концентри-рование, либо разбавление образца для получения нужного результата. ДНКаза в высшей степени устойчива к действию протеаз, включая трипсин, в присутствии кальция. По этой причине следующая стадия процедуры заключается в частичном удалении ионов кальция посредством обработки [этилен бис (оксиэтиленнитрило)] тетрауксусной кислотой (ЭГТА). Передозировка при обработке ЭГТА мо-жет привести к денатурации и аггрегации ДНКазы, так что эта стадия должна выполняться особенно тща-тельно. Для ЭГТА-обработанного образца в объеме 0,5 мл заменяют далее среду на расщепляющий буфер (1 мл) , добавляют трипсин и инкубируют образец при температуре 37°С в течение двух часов. Затем добавля-ют вторую аликвоту трипсина и инкубируют образец еще в течение двух часов. Расщепление останавливают подкислением смеси, а образец либо оставляется для дальнейшего анализа, либо загружается для исследова-ния непосредственно на колонку для ВЗЖХ.
250 мкл (250 мкг) смеси пептидов, полученных после расщепления трипсином, разделя-ют на колонке ВЭЖХ с обращением фаз с соблюдением описанных выше условий. Типичная карта триптического расщепления человеческой ДНКазы представлена на фигуре 3. ВЭЖХ проводили на модели Хьюдетт-Паккард (Hewlett Packard) 10 90M ВЭЖХ. Элюируемый с колонки материал сразу же иссле-довался на наличие поглощения при 214 и 280 нм с помощью имеющегося в приборе диодного детектора. Поскольку пептидная карта, получаемая на основе ранней порции элюируемого материала, не дает воз-можности оценить количественно уровень дезамидированной ДНКазы, ниже описываются дру-гие колонки для получения больших порций материала, элюируемого в более позднее время, а также для использования в исследованиях больших, необходимых для анализа объемов. Каждый анализ в соответствии с такой процедурой требует 7 0 минут для градиентного разделения и 2 0 минут для уравновешивания колон-ки для общего цикла ВЭЖХ, составляющего 90 минут. Теоретические основы и практические подходы для интегрирования пика с целью определения дезамидированной ДНКазы в образце представлены ниже.
Дезамидирование человеческой ДНКазы имеет место, по крайней мере, по аспарагиновому остатку в 74 положении аминокислотной цепи (Asn-74) нативной зрелой человеческой ДНК. Как видно из перечня ожидаемых пептидов при расщеплении трипсином человеческой ДНКазы, приведенного в Таблице I, Asn-74 находится на С-концевом участке сайта расщепления трипсином рядом с аргининовым остатком в 73 позиции аминокислотной цепи (Arg-73).


Таблица I
Пептиды, ожидаемые при расщеплении нативной зрелой человеческой
ДНКазы трипсином
ID Остатки Аминокислотная последовательность пептида
Т1 1-2 LK
Т2 3-15 IAAFNIQTFGETK (SEQ.ID.NO. 3)
ТЗ 16-31 MSNATLVSYIVQILSR (SEQ.ID.NO. 4)
Т4 32-41 YDIALVQEVR {SEQ.ID.NO. 5)
ТБ 42-50 DSHLTAVGKISEQ.ID.NO. 6}
Т6 51-73 LLDNLNaDAPDTYHYWSEPLGR (SEQ.ID.NO. 7)
Т7 74-77 NSYK (SEQ.lD.NO. 8)
Т8 78-79 ER
ТЭ 80-1 11 YLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFNR (SEQ.ID.NO. 9)
Т10 112-117 EPAIVR (SEQ.ID.NO. 10)
Т11 118-121 FFSR (SEQ.ID.NO. 11)
T12 122-126 FTEVR (SEQ.ID.NO. 12)
T13 127-157 EFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEK (SEQ.ID.NO. 13)
T14 158-185 WGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIR (SEQ.tD.NO. 14]
T15 186-213 LWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDR {SEQ.ID.NO. 15)
TT6 214-222 IVVAGMLLR (SEQ.ID.NO. 16)
T17 223-260 GAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK (SEQ.ID.NO. 17)


Вместо Asn (единственная обозначающая буква "N") остатка в положении 74 нативной недезамидиро-ванной человеческой ДНКазы, дезамидирование человеческой ДНКазы может иметь место или по Asp или по iso-Asp остатку, как это показано на фигуре 4 . Isо-Asp представляет собой изомерную, бета-аминокислотную форму аспарагиновой кислоты. Пептидная связь между Arg-73 и iso-Asp устойчива к расщеплению трипсином, так что дезамидированная человеческая ДНКаза дает при расщеплении трипсином характерный пептид, содержащий остатки 51-77 и называемый Т6-7, поскольку представляет собой пептид, объединенный на основе пептидов Т6 и Т7. В условиях, используемых для триптического расщепления, пеп-тидная связь Arg-7 3-Asn-74 в недезамидированной человеческой ДНКазе и пептидная связь Arg-73 -Asn-74 в Asp-форме дезамидированной человеческой ДНКазы расщепляются трипсином. Отсюда, на наличие недезамидированной ДНКазы указывает присутствие на триптической карте Т7 пептида, показанного в таблице I, тогда как на наличие Asp-74 формы человеческой дезамидированной ДНКазы ука-зывает присутствие на триптической карте дезамидированного Т7 пептида, называемого (D)T7. Эти три опи-санных пептида обозначены на фигуре 3. К сожалению, трипсин лишь частично расщепляет пептидную связь на С-концевом участке Т7, между остатками 77 и 78, так что каждый из описываемых пептидов Т7, (D)T7 и Т6-7 имеют Т7-коньюгат, Т7-8 и Т6-7-8 соответственно. Эти уже шесть репортерных пепти-дов должны приниматься во внимание для количественного определения дезамидированной человече-ской ДНКазы с помощью метода триптического картирования.

В принципе, (D)T7, (D)T7-8, Т6-7 и Т-6-7-8 пептиды указывают на наличие дезамидированной челове-ческой ДНКазы, а Т7 и Т7-8 пептиды указывают на наличие недезамидированнои человеческой ДНКазы, и зная количественное соотношение этих пептидов, можно прямо вычислить уровень дезамидирования, харак-терный для данного препарата ДНКазы. Для вычисления количества фракции дезамидированной ДНКазы необходимо располагать знанием молярных коэффициентов дезамидированной и недезамидирован-ной видов ДНКаз. Однако, в процедуре триптического картирования возникают две дополнительные пробле-мы, которые необходимо преодолеть: одна из них-хроматографическая проблема и вторая - пробле-ма обнаружения. Хроматографическая проблема заключается в том, что Т2 пептид элюируется вместе с Т6-7, и это затрудняет интеграцию четких зон пиков этого характерного для дезамидированного мате-риала пептида. Указанная проблема может быть преодолена за счет интегрирования хроматограмм, полу-ченных при 280 нм, поскольку все шесть релевантных пептидов имеют как минимум один тирозиновый оста-ток (Туг), и поэтому достаточно сильно поглощают при 280 нм, тогда как Т2 содержит Tyr или триптофано-вый (Тrр) остаток, и поэтому его поглощение при этой длине волны пренебрежительно мало. Проблема обна-ружения заключается в том, что Т6-7 и Т6-7-8 пептиды содержат каждый по три (Tyr) остатка, тогда как каж-дый из оставшихся четырех пептидов содержат только по одному остатку Тyr. Таким образом, Т6-содержащие пептиды имеют больший коэффициент полярной абсорбции, чем пептиды, содержащие только Т7, так что простое сравнение зон пиков приведет к завышению значения уровня дезамидированно-го вида в образце. Эта проблема может быть решена за счет нормализации, т.е. пересчета значе-ний зон пиков шести пептидов с учетом числа Тyr остатков в пептиде. Нормализация таким образом значений зон пиков подразумевает, что все тирозиновые остатки в каждом пептиде находятся в равном химическом окружении, которое, как можно предположить, достаточно хорошо подходит для относительно малых пеп-тидов, в частности, таких, какие рассматриваются здесь. При проведении нормализации, скорректированные таким образом зоны пиков дезамидированных и недезамидированных пептидов можно сравнивать для оцен-ки содержания дезамидированной ДНКазы в образце.
2. Ионообменная хроматография на ворсистом катионите
Ворсистая ' катионитная смола (ТСХ) для ионообменной хроматографии, в отличие от традиционных смол-катионитов, имеет полиионные лиганды, связывающиеся с кремневой поверхностью. Используемая в приводимом примере колонка с лигандами ЛиКросфер®
1000 SO3 (LiChrospher®, EM Separations, Gibbstown, New Jersey) содержит, как представлено в ре-кламе, от 25 до 50 сульфопропильных групп вдоль полиэтиленового стержня, которые присоединяются со стороны кремневой поверхности.
ТСХ хроматограмма образца рекомбинантной человеческой ДНКаза проводится на ЛиКросфе-ре® 1000 SO3 колонке, как показано на фигуре 5. Рекомбинантную человеческую ДНКазу вы-деляли с последующим очищением из культуры клеток яичника китайского хомячка (СНО), трансформированных ДНК, кодирующей человеческую ДНКазу, Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Shak, et al.. International Patent Application Publication No. WO 90/07572 (опубликована 12 июля 1990).
Оба полученных пика собирают и подвергают нескольким анализам для идентификации форм ДНКаз, отличающихся только остатком в 74 позиции аминокислотной последовательности. На фигуре 6 показаны карты триптического расщепления двух пиков, выделенных с помощью ТСХ колонки, которые подтверждают, что они являются, соответственно, дезамидированной и недезамидированной фор-мами человеческой ДНКазы. Карта триптического расщепления также показывает, что обе формы дезамидированной ДНКазы (имеющие Asp и isо-Asp в позиции 74 аминокислотной последовательности) по-являются уже в первом пике при разделении на ТСХ. В таблице II показано, что измеряемая для этих двух пиков удельная активность, подтверждающая связь между дезамидированием и удельной активностью, выведена на основе показанной на фигуре 2 корреляции, служащая, кроме того, для до-полнительной идентификации ТСХ фракций. Активность фракции ДНКазы определялась с помо-щью метода исследования с метиловым зеленым <MG) .
Таблица 2
Активности фракций, собранных с ТСХ колонки
Концентрации, определяемые по методу MG и методу ELISA, представляют собой средние зна-чения из определений двух образцов.

Образец MG EL1SA Удельная
(мкг/мл). (мкг/мл) Активность
Исходный препарат 8315 7828 1,06
Рекомбинантной человеческой
ДНКазы
(загружаемый)
Пик 1 с ТСХ 85,3 119, 7 0, 71
(дезамидированный)
Пик 2 с ТСХ 149,2 99, 4 1,50
(недезамидированныи)

Мутантную форму человеческой ДНКазы, имеющей в позиции 74 аминокислотной по-следовательности Asp остаток, получают путем сайт-направленного мутагенеза ДНК, коди-рующей нативную зрелую человеческую ДНК. Эта мутантная форма элюируется вместе с первым пиком, •получаемым по описанной выше процедуре хроматографирова-ния (см. фигуру 7)•
Ниже приведена методика наполнения колонки ворсистой
катионообменной смолой ЛиКросфер® (LiChrospher®) 1000 SO3. Другим близким к ней видом ворсистой катионобменной смолы, пригодной для разделения дезамидированной и недезамиди-рованнои форм ДНКазы, является ворсистая-катионообменная смола Фрактогель (Fractogel®) (EM Separa-tions, Gibbstown, New Jersey). Смолы ЛиКросфер и Фрактогель являются зарегистрированными торговыми марками ЕМ Индастриз, Инк., Хауторн Н.Й. ЕМ (ЕМ Industries, Inc. , Hawthorne, N.Y., или Е.Мерк, Дармштадт, Германия (Е. Merck, Darmstadt, West Germany). В настоящее время авторы полагают, что "сильные" формы ворсистой катионообменной смолы, имеющей ЭОз функциональные группы (независимо от того, ЛиКросфер это или Фрактогель), способны дать наилучшие результаты разделения.
3. Методика Наполнения Колонки для ВЭЖХ Смолой ЛиКросфер® 1000 SO3
a…Материалы и оборудование:
1.. Стеклянный картридж с наилучшими для разрешения параметрами и размерами 1,0 см х 5,0 см.
2. Буфер для наполнения: 100 мМ ацетата натрия, 1 мМ СаС12, рН до 4, 5, с уксусной кисло-той.Фильтруют чрез фильтр с порами0,2 мкм.
3. Емкость для наполнения колонки в 20 мл. (Alltech part # 9501 или эквивалентный вариант).
4. Пустая колонка из нержавеющей стали размером 4,6 мм х 50 мм с фриттой предельного размера 0,5 мкм.
5. Насос для проведения ВЭЖХ, способный поддерживать противодавление, равное 2000 фунт/дюйм2 (Модель Вотерс 510 (Watters) или эквивалентный вариант).
b. Процедура наполнения колонки
1. Подготовка смолы к наполнению:
а) Распаковать стеклянную колонку для высокоэффективного разделения размером 1,0 см х 5,0 см (чистый объем - 3,93 мл смолы). Ресуспендировать смолу в 20 мл чистом стакане, влить в сосуд буфер для наполнения (упаковочный буфер). Полученную суспензию взбалтывают до однородности к разделяют на две аликвоты: 2 х 10 мл. К каждой аликвоте добавляют по 10 мл упаковочного буфера до получения суспензий приблизительного состава - 1,95 мл смолы в 20 мл упаковочного буфера.
b) Смолу взбалтывают с целью достижения однородной суспензии. Затем позволяют пройти про-цессу осаждения до тех пор, пока частицы на дне сосуда не образуют твердый слой (2-4 часа) . Осторожно сливают супернатант, содержащий мелкие частицы.
c) Добавляют к смоле 20 мл упаковочного буфера и повторяют стадию b) . Эту процедуру повторя-ют не менее четырех раз для уверенности в том, что все мелкие частицы смолы удалены.
2. Наполнение колонки
a) Соединяют пустую ВЭЖХ колонку размером 4,6 мм х 50 мм с упаковочной емкостью. Снова взбалты-вают смолу в упаковочном буфере.
b) Вливают перемешанную смолу в упаковочную емкость и быстро закрывают ее. Накачивают упако-вочный буфер в таком режиме, чтобы давление не превышало 2000 фунтов/дюйм2. Устанавливают скорость течения такой, чтобы давление наполнения оставалось на уровне 2000 фунтов/дюйм2, а поток продолжался в течение 15 минут после того, как давление стабилизируется. Далее отсоединяют колонку и закрывают верх-ний конец. Колонка может быть использована сразу же или может храниться в 0,02% азиде натрия.
Для большинства образцов, включая ДНКазу, приготовленную на 150 мМ NaCl, не требуется никакой подготовки образца перед нанесением на колонку. Колонку уравновешивают ацетатным буфером, рН 4,5, содержащим ионы кальция, вносят образец и затем проводят элюцию колонки с помощью солевого градиен-та. В случае небольших по масштабу процессов разделения дезамидированной и недезамидирован-нои форм ДНКазы может быть использована следующая процедура. Соотношения зон пиков, вышедших на хроматограмме, соответствует соотношению дезамидированной и недезамидированнои форм ДНКазы в об-разце.
Стадия 1. Загружают образец, содержащий до 150 мМ NaCl при рН 9 в автоматический пробоот-борник. Образцы, содержащие жидкость с собранными клетками культуры, подвергают подведению рН до 4,5 и центрифугированию для удаления таких белков, которые нерастворимы в используемом по этой ме-тодике буфере.
Стадия 2. Разделяют две формы ДНКазы методом ВЭЖХ при слеующих условиях:
Колонка: ТСХ ЛиКросфер® 1000 SO3, загруженный в колонку из нержавеющей стали. Размеры колон-ки 4,6 в мм х 50 мм и 4,60 мм х 150 мм - уже наполненных и готовых в применению.
Температура колонки: соответствует температуре окружающей среды.
Элюент А: 10 мМ ацетата натрия, 1 мМ СаС12/ рН 4,5.
Элюент В: 1М NaCl в буфере А.

Градиентный профиль

Время (мин) %А % B
0 100 0
4 100 0
30 30 70
30,1 5 95
37 5 95

Скорость течения: 0,8 мл/мин (50 мм колонка), 0,5 мл/мин (150 мм колонка).
Объем наносимого образца: до 250 мкл.
Время уравновешивания колонки после отработки при 100% А: 20 минут.
Температура внутри автоматического пробоотборника: 5°.
Обнаружение: Поглощение при 280 нм.
Стадия 3. Интегрируют хроматограмму. Вычисляют пропорцию дезамидированного вида на основе зоны пика элюированной раньше дезамидированной ДНКазы относительно общей зоны пиков обе-их форм.
Хроматография на ворсистом катионообменнике дает также способ разделения в больших масштабах дезамидированной и недезамидированной форм человеческой ДНКазы. Широкомасштабные разделения наиболее удобно осуществлять с использованием более упрощенной схемы элюции, чем это опи-сано для небольших по объему партий аналитического разделения двух форм ДНКаза. В этой связи, крупно-масштабное разделение производят с применением ворсистого катионита Фрактогеля на основе следующей процедуры рН - элюции.
Стадия 1. Заполняют 31,6 колонку (1/6 см. внутр. диам. х 15,7 см высоты) Фрактогелем EMD SO3 650-М ворсистой катионообменной смолы (ЕМ Separations, Gibbstown, New Jersey).
Стадия 2. ДНКазу после диафильтрации загружают уравновешивающим буфером (30 мМ ацетата натрия (NaAc). 1 мМ хлорида кальция (СаС12) , 50 мМ хлорида натрия (NaCl), рН 5) . Кон-центрируют с помощью ультрафильтрации до объема 355 мл и концентрации 2,5 мг/мл.
Стадия 3. Промывают колонку 2,5 объемами колонки (CV) 2% раствором гидроксида натрия (NaOH).
Стадия 4. Промывают колонку 2,5 CV предварительно уравновешенного буфера (300 мМ NaAc, 1M NaCl, рН 5) .
Стадия 5. Промывают колонну 2,5 CV уравновешивающего буфера.
Стадия 6. Загружают колонку 1-1,3 г диафильтрованной/ультрафильтрованной ДНКазы (от стадии 2).
Начинают сбор фракций вытекающего из колонки эффлюента с момента нанесения ДНКазы.
Стадия 7. Промывают колонку 5 CV уравновешивающего буфера.
Стадия 8, Промывают колонку 5 CV промывочного буфера, рН 5,3 (25 мМ сукцината, 1 мМ СаС12, рН 5,3) .
Стадия 9. Промывают колонку 10 CV промывочного буфера, рН 5,4 (25 мМ сукцината, 1 мМ СаС12, рН 5,4) .
Стадия 10. Промывают колонку 10 CV промывочного буфера, рН б (25 мМ MES, 1 мМ СаС12, рН 6,0)..
Стадия 11. Для получения пула, состоящего главным образом из дезамидированной ДНКазы, объединяют фракции, собранные на Стадиях 6-8. Для получения пула, состоящего из недезамидированнои ДНКазы, объединяют фракции, собранные в течение Стадии 10. Фрак-ции, собранные на Стадии 9, содержат смесь двух форм ДНКазы и могут быть вновь подверг-нуты разделению.
Описанная выше процедура представляет собой всего один пример использования ворсистой ионообменной смолы-катионита для разделения двух форм рекомбинантной человеческой ДНКазы в условиях, пригодных для крупномасштабного выделения очищенной дезамидированной и очищенной недезамидированной ДНКаз.
4. Хроматография с применением гепарина и иммобилизованного аналога ДНК
На фигуре 8 приведены данные по хроматографии на TSK-гепариновых колонках (Toso Haas, Mont-gomeryville, Pennsylvania) образцов, содержащих либо смесь дезамидированной и недезамидиро-ванной форм, либо очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу, либо очищенную недезамидированную человеческую ДНКазу. Хроматография на TSK-гепариновой колонке проводилась при тех же самых условиях, что были описаны для аналитического варианта на ТСХ колонке. Выровненные на фиг. 8 хроматограммы демонстрируют, что колонка с иммобилизованным гепарином хорошо разрешает дезамидированную и недезамидированную формы ДНКазы.
Как было отмечено выше, другим способом разделения дезамидированной и недезамидирован-ной форм ДНКаз является применение колонки, содержащей иммобилизованный аналог ДНК, устойчи-вый к гидролизу ДНКазой. Один из примеров такого подхода к использованию колонки с иммобилизованным аналогом ДНК включает синтез фосфоротиоатного олигонуклеотида: 5-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-NH3-3. - Эта самокомплементарная последовательность может быть пре-вращена в двухцепочечную форму и далее введена в ,Рейнин-Гидропор-ЕР Колонку (Rainin Co., Woburn, Mas-sachussetts). На фигуре 9 представлены данные по хроматографированию на этой колонке образцов, содер-жащих либо смесь дезамидированной и недезамидированнои форм человеческой ДНКазы, очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу, очищенную недезамидированную человеческую ДНКазу или очищенную мутантную человеческую ДНКаэу, имеющую остаток аспарагиновой кислоты (а не остаток аспарагина) в позиции 74 аминокислотной последовательности. Колонка работала с целью такого анализа в буфере, содержащем 1 мМ хлорида кальция, 5 мМ/MES при рН 6, элюировали градиентом с концентрацией соли до 1 М хлорида натрия свыше 20 минут при скорости течения 1 мл/мин. Как показано на фигуре 9, при этих условиях дезамидированная и недезамидированная формы ДНКазы частично отделялись друг от друга. Кроме того, 2 изомерных формы дезамидированной ДНКазы, которые от-личаются по позиции 74 аминокислотной последовательности тем, что имеют либо аспарагино-вую кислоту, либо изо-аспарагиновую кислоту, также разрешаются этой колонкой. Таким образом, дополни-тельным плюсом данного хроматографического метода является то, что он позволяет проводить разделение двух изомеров, возникающих при дезамидировании человеческой ДНКазы.
5. Ферментативная активность дезамидированной человеческой ДНКазы и недезамидированной чело-веческой ДНКазы.
Использовали несколько методов для выявления и изучения влияния дезамидирования на фер-ментативную активность человеческой ДНКазы.
Очищенную дезамидированную человеческую ДНКазу и очищенную недезамидированную человече-скую ДНКазу для использования в приведенных далее тестах получали с помощью хроматографии на ТСХ по описанному выше методу.
В одном из методов для определения ферментативной активности ДНКазы использовали синтезиро-ванную двухцепочечную ДНК-25 пар оснований в длину, которую метили на одном конце динитрофенолом (ДНФ), а на другом конце - биотином. Гидролиз субстрата ДНКазой определяли по связыванию реакционных продуктов на лунках микротитрационного плато, покрытых антителом к ДНФ, а также количественно - с помощью реакции интактной пробы со стрептавидин-пероксидазой хрена. Удельная активность обладающих стабильностью образцов коррелировала (r2 = 0,613: n=5) с уровнем дезамидированности ДНКазы (в пределах от 27% до 93%). Экстраполяция линейного уравнения дает оценку удельной активно-сти дезамидированной человеческой ДНКазы примерно на 77% ниже, чем соответствующий показатель для недезамидированнои человеческой ДНКазы.
Другой метод определения ферментативной активности ДНКазы включает гидролиз хромогенного субстрата п-нитрофенилфенил-фосфоната (ПНФФ) по методу Лиао с соавт. (Liao, et al., Biochem. J. 255:781-787 (1988)). Кинетика гидролиза ПНФФ человеческой ДНКазой представлена сигмоидной кривой и описыва-ется уравнением нелинейной регрессии Хилла. С применением этого метода было показано, что Vmax полно-стью дезамидированной человеческой ДНКазы на 77% ниже, чем у недезамидированнои человеческой ДНКазы. Концентрация субстрата для. активности, равной половине максимальной, (So,5) суще-ственно не отличалась для дезаминированного и недезаминированного образцов ДНКазы.
Следующий метод определения энзиматический активности представляет собой тест, описанный Ку-нитцем (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349 (1950)) , в значительной степени модифицированный так, что энзимати-ческая реакция проводится при рН примерно 7,0 – 7,5. Этот метод также показал, что энзиматическая актив-ность дезаминированной человеческой ДНКазы ниже, чем таковая у недезаминированной человеческой ДНКазы.
Хранение человеческой ДНКазы In Vitro.
Очищенную человеческую ДНКазу из рекомбинантных СНО клеток растворяют до коцентрации 4 мг/мл в незабуференном водном растворе 150 мМ NaCL и CaCI2. Затем образцы полученного раствора ДНКазы помещают в стеклянные и пластиковые ампулы.
При этом используют два типа пластиковых ампул: один из них приготовлен на основе пластиковой смолы Дюпон 20 (Dupont 20) (производство E.I. du Pont de Nemours Co., Inc. Wilmington, Delaware USA), а другой сделан на основе пластиковой смолы Эскорен (Escorene) (производство Exxon Corp.).
Оба вида пластиковых материалов представляют собой полиэтилен низкой плотности, однако, могут также использоваться контейнеры, приготовленные на основе других пластиковых, таких как полипропилен, полистирол или другие полиолефины. Ампулы содержащие раствор ДНКазы, хранятся при температурах: -700С, 2-80С . Первоначально растворы содержат до 60-65% ДНКазыинированной форме.
Растворы в ампулах исследовались неоднократно после начала хранения с целью определения уровня дезаминированности ДНКазы.


Результаты исследований представлены в Таблице III.
Таблица III
% Дезамидирования рекомбинантной человеческой ДНКазы/ хранящейся в стеклянных и пластиковых ампулах

Образец День 70°С 2-8°С 25°С
Стекло 83
174 66
63 66
66 78
81
Дюпон 2 0 83
174 65
63 66
63 71
70
Эскорен 83
174 65
64 66
62 71
70


После 83 и 174 дней хранения при -70°С или 2-8°С не было обнаружено различий в количестве дезамидированнои ДНКазы как в пластиковых, так и в стеклянных ампулах. В каждом таком случае примерно 64% (+/-2%) ДНКазы в ампулах было представле-но дезамидированнои ДНКазой.
Однако, неожиданно, было отмечено различие при хранении препарата в течение 83 или 174 дней при 25°С в количестве дезамидированнои ДНКазы в пластиковых и в стеклянных ампулах. В пластиковых ампулах присутствовало значительно меньшее количество дезамидированнои ДНКазы. В частности, через 83 дня хранения при 25°С 78% ДНКазы в стеклянных ампулах было представлено дезамидированнои ДНКазой, тогда как в пластиковых ампулах - только около 70% ДНКазы состав-ляла дезамидированная ДНКаза. Через 174 дня хранения при 25°С 81% ДНКазы в стеклянных ампулах было представлено дезами-дированнои ДНКазой, тогда как только около 71% ДНКазы в пластиковых ампулах было представлено дезамидированнои ДНКа-зой.
Не ограничивая изобретение определенным механизмом или определенной теоретической основой действия, мы тем не менее предположили, что различия в величине дезамидированнои ДНКазы в пластиковых и стеклян-ных ампулах может быть следствием различий рН растворов в разных ампулах. Изначально, рН раствора ДНКазы в стеклянной ампуле был несколько выше, чем в пластиковой (около рН 6,7 и около рН 6,5 соответ-ственно), рН раствора ДНКазы в стеклянных ампулах продолжал с течением времени незначительно возрас-тать (примерно до рН 6,9 через 83 дня хранения при 25°С и примерно до 7,0 через 174 дня хранения при 25°С) , возможно, как следствие растворения силикатов или ионов с поверхности стекла. При более высо-ком рН скорость дезамидирования человеческой ДНКазы увеличивается. Поскольку ранее не был оценен тот факт, что при повышении рН имеет место дезамидирование ДНКазы, одним из вариантов настоя-щего изобретения является разработка способа приготовления и/или хранения человеческой ДНКазы в рас-творах, имеющих кислый рН, в типичном случае при рН 4,5-6,8 и в наиболее предпочтительных случаях - при рН около 5,0-6,8 .
Таким образом, было достигнуто значительно улучшение свойств стабильности раствора человече-ской ДНКазы при помещении такого раствора в пластиковые, а не стеклянные ампулы, поскольку при такой замене происходит значительно меньшее дезамидирование ДНКазы с течением времени. Это от-крытие существенно для выбора упаковки для препарата человеческой ДНКазы, используемой в терапевти-ческих целях, особенно когда желательно, чтобы препарат человеческой ДНКазы был способен к хранению в течение длительного времени без значительного снижения ферментативной активности. Разу-меется, стеклянные ампулы с нестеклянным выстилающим слоем будут одинаково полезны для такой цели. Важно, однако, избегать при хранении ДНКазы контакта со стеклом, особенно при хранении в течение срока свыше 15-30 дней.
Широко известно, что ДНКаза I является белком, применяемым для снижения вязкости гноя путем гид-ролитического расщепления ДНК в указанном гное. Под торговым наименованием Pulmozyme® ДНКаза I одобрена для такого применения при муковисцидозе.
ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Ниже приведено описание специфических деталей, имеющих отношение к применению настоящего изобретения. Имея подробные специфические методы для идентификации, характеристики разделе-ния и использования очищенных дезамидированнои и недезамидированной человеческих ДНКаз, равно, как и знание специфических модельных систем их поддержания в активном состоянии, каждый, имеющий средний уровень знаний в данной области, может самостоятельно разработать соб-ственные альтернативные способы использования плодов настоящего изобретения на основе имеющейся в нем информации. Несмотря на то, что ниже в тексте может встретиться излишняя детализация, приводимые примеры не следует истолковывать в плане какого-либо ограничения области настоящего изоб-ретения: границы настоящего изобретения будут закономерно определены в формуле изобретения.

1. WO 9007572 A, 12.07.1990
2. US 4065355, 27.12.1977
3. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, ч.2. М.Медицина, 1965, с.54.
4. John FRENZ et.al. Characterization of human growth hormone by capillary electrophoresis. Journal of Chroma-tography. 1989, v.480, p.379-391.