ФРАКЦИЯ СОПОЛИМЕРА–1 И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯНОГО СКЛЕРОЗА
(51) МПК: 7 C08G 69/10, A61K 31/758
Сведения о документе ▾
- (11) Номер документа
- 392
- (13) Код типа документа
- P
- (51) МПК
- 7 C08G 69/10, A61K 31/758
- (45) Дата публикации
- 13.10.2004
- Статус
- Прекратил действие
Заявка ▾
- (21) Рег. номер заявки
- 96000421
- (22) Дата подачи заявки
- 23.05.1995
- (31) Конвенционный приоритет
- 1.08/248,037
- (32) Дата подачи конв. заявки
- 24.05.1994
- (33) Страна приоритета
- US
Лица ▾
- (71) Заявитель(и)
- Еда Рисерч энд Дивелопмент Ко, Лтд., IL
- (72) Автор(ы)
- Конфайно Элизер (IL), Села Майкл (IL), Тайтельбаум Двора (IL), Арнон Рут (IL)
- (73) Патентообладатель(и)
- Еда Рисерч энд Дивелопмент Ко, Лтд., IL
Реферат
Фракция сополимера-1, который является синтетическим полипептидным аналогом основного белка миелина, по существу свободная от видов сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа и потенциально пригодная как терапевтическое средство против рассеянного склероза; способ ее получения и композиции на ее основе.
Формула изобретения
1.Фракция сополимера-1. представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, которая содержит более 75% молекул с молекулярной массой от 2 до 20 кДа и менее 5% молекул с молекулярной массой более 40 кДа.
2. Фракция сополимера-1, по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит менее 2,5% молекул с молекулярной массой более 40 кДа.
3. Фракция сополимера-1 по п. 1. отличающаяся тем, что указанная фракция сополимера-1 получена способом, включающим:
осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции, обработку указанного трифторацетилсополимера-1, бо-лее 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, водным раствором пиперидина с образованием сополимера –1, у которого более 75% молярной доли имеет молекулярную мас-су в интервале от 2 до 2 до 20 кДа.
4. Фракция сополимера-1 по п.3. отличающаяся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с броми-стоводородной кислотой осуществляют в течение 10-50 ч при температуре 20-28°С.
5. Фракция сополимера-1 по п.3. отличающаяся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с броми-стоводородной кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 260С.
6. Фракция сополимера-1, представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глута-миновой кислоты, лизина и тирозина, имеющая среднюю молекулярную массу от 4 до 8,6 кДа.
7. Фракция сополимера-1, представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глута-миновой кислоты, лизина и тирозина, имеющая среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа.
8. Композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество фракции сополимера-1, представляющего собой смесь поли-пептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, содержащей более 75% молекул с молекулярной массой от 2 до 20 кДа и менее 5% молекул с молекулярной массой более 40 кДа.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что она содержит фракцию сополимера-1, имеющую менее 2,5% молекул сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа.
10. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанная фракция сополимера-1 получена способом, включающим осуществление реакции защищенного сополимера-1, с бромистоводородной кислотой с обра-зованием трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температуре, кото-рые предварительно определены посредством пробной реакции, и обработку указанного трифторацетилсо-полимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале примерно от 2 до 20 кДа, водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1, более 75% молярной доли которого име-ет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
11. Композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество фракции сополимера-1, представляющего собой смесь полипеп-тидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, имеющей среднюю молекулярную массу от 4 до 8,6 кДа.
12. Композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество фракции сополимера-1, представляющего собой смесь полипеп-тидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, имеющей среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа.
13. Сополимер-1 с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа, полученный способом, включающим осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием три-фторацетилсополимсра-1, обработку указанного трифторацетилсополимера-1 водным раствором пипериди-на с образованием сополимера-1 и очистку указанного сополимера-1 с получением сополимера-1 с молеку-лярной массой от 5 до 9 кДа.
14. Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в данном лечении, фармацевтически эффективного количества фракции сополимера-1, причем указанная фракция содержит менее 5% видов сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа, и более 75% сополимера-1 в указанной фракции имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, а указанная фракция сополимера-1 получена способом, включающим осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводо-родной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температурах, которые предварительно определены посредством пробной реакции, и обработку указан-ного трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интер-вале от 2 до 20 кДа, водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
15. Способ получения сополимера-1, включающий осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, обработку указанного три-фторацетилсополимера-1 водным раствором пиперидина с образованием сополимера–1, и очистку указан-ного сополимера-1 с получением сополимера–1 с молекулярной массой от 5 до 9 кДа.
16. Трифторацетилсополимер-1, у которого более 75% молярной доли имеет молекулярную массу в ин-тервале от 2 до 20 кДа, полученный способом, включающим осуществление реакции защищенного сополи-мера-1 с бромистоводородной кислотой в течение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции.
17. Трифторацетилсополимер-1 по п.16, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение 10-50 ч при температуре примерно 20-28°С.
18. Трифторацетилсополимер-1 по п.16, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 26°С.
19. Способ получения сополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы, вклю-чающий выбор заданного профиля распределения молекулярной массы, осуществление реакции защищен-ного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1 с задан-ным профилем распределения молекулярной массы, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции, и обработку ука-занного трифторацетилсополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводород-ной кислотой осуществляют в течение 10-50 ч при температуре 20-28°С.
21. Способ по п.19, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводород-ной кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 26°С.
22. Способ получения трифторацетилсополимера-1 с заданным профилем распределения молекуляр-ной массы, включающий выбор заданного профиля распределения молекулярных масс, осуществление реак-ции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополиме-ра-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы, причем указанную реакцию проводят в те-чение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции, с образованием трифторацетилсополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводород-ной кислотой осуществляют в течение примерно 10-50 ч при температуре 20-28°С.
24. Способ по п.22, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводорад-нои кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 26°С.
25. Композиция, содержащая полидисперсную смесь полипептидов состоящих из глутаминовой кисло-ты, лизина. аланина и тирозина, в которой смесь имеет среднюю молекулярною массу от 4 до 9 кДа.
26. Композиция по п. 25, в которой более 75% полипептидов в смеси, в расчете на молярные доли, имеют молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
27. Композиция по п. 25, в которой менее 5% полипептидов в смеси имеют молекулярную массу более 40 кДа.
28. Композиция по п. 27, в которой более 75% полипептидов в смеси, в расчете на молярные доли имеют молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
29. Композиция по п. 28, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа
30. Композиция по п. 25, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 4 до 8,6 кДа.
31. Композиция по п. 25, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 5 до 9 кДа.
32. Композиция по п. 25, в которой менее 2,5% полипептидов в смеси имеют молекулярную массу более 40 кДа.
33. Композиция по п. 32, в которой более 75% полипептидов в смеси, в расчете на молярные доли, имеют молекулярную массу в интервале примерно от 2 до 20 кДа.
34. Композиция по п. 33, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа.
35. Композиция по п. 25, в которой смесь имеет такое молекулярно-массовое распределение, где средняя молекулярная масса составляет 7,7 кДа.
36. Фармацевтическая композиция, содержащая дозу композиции по любому из п.п. 25-35, эффективную для лечения рассеянного склероза.
37. Способ лечения пациента, страдающего рассеянным склерозом, путем введения пациенту, нуждаю-щемуся в лечении, композиции по п. 36.
2. Фракция сополимера-1, по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит менее 2,5% молекул с молекулярной массой более 40 кДа.
3. Фракция сополимера-1 по п. 1. отличающаяся тем, что указанная фракция сополимера-1 получена способом, включающим:
осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции, обработку указанного трифторацетилсополимера-1, бо-лее 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, водным раствором пиперидина с образованием сополимера –1, у которого более 75% молярной доли имеет молекулярную мас-су в интервале от 2 до 2 до 20 кДа.
4. Фракция сополимера-1 по п.3. отличающаяся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с броми-стоводородной кислотой осуществляют в течение 10-50 ч при температуре 20-28°С.
5. Фракция сополимера-1 по п.3. отличающаяся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с броми-стоводородной кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 260С.
6. Фракция сополимера-1, представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глута-миновой кислоты, лизина и тирозина, имеющая среднюю молекулярную массу от 4 до 8,6 кДа.
7. Фракция сополимера-1, представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глута-миновой кислоты, лизина и тирозина, имеющая среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа.
8. Композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество фракции сополимера-1, представляющего собой смесь поли-пептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, содержащей более 75% молекул с молекулярной массой от 2 до 20 кДа и менее 5% молекул с молекулярной массой более 40 кДа.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что она содержит фракцию сополимера-1, имеющую менее 2,5% молекул сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа.
10. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанная фракция сополимера-1 получена способом, включающим осуществление реакции защищенного сополимера-1, с бромистоводородной кислотой с обра-зованием трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температуре, кото-рые предварительно определены посредством пробной реакции, и обработку указанного трифторацетилсо-полимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале примерно от 2 до 20 кДа, водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1, более 75% молярной доли которого име-ет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
11. Композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество фракции сополимера-1, представляющего собой смесь полипеп-тидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, имеющей среднюю молекулярную массу от 4 до 8,6 кДа.
12. Композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество фракции сополимера-1, представляющего собой смесь полипеп-тидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина, имеющей среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа.
13. Сополимер-1 с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа, полученный способом, включающим осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием три-фторацетилсополимсра-1, обработку указанного трифторацетилсополимера-1 водным раствором пипериди-на с образованием сополимера-1 и очистку указанного сополимера-1 с получением сополимера-1 с молеку-лярной массой от 5 до 9 кДа.
14. Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в данном лечении, фармацевтически эффективного количества фракции сополимера-1, причем указанная фракция содержит менее 5% видов сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа, и более 75% сополимера-1 в указанной фракции имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, а указанная фракция сополимера-1 получена способом, включающим осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводо-родной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температурах, которые предварительно определены посредством пробной реакции, и обработку указан-ного трифторацетилсополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интер-вале от 2 до 20 кДа, водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1, более 75% молярной доли которого имеет молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
15. Способ получения сополимера-1, включающий осуществление реакции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, обработку указанного три-фторацетилсополимера-1 водным раствором пиперидина с образованием сополимера–1, и очистку указан-ного сополимера-1 с получением сополимера–1 с молекулярной массой от 5 до 9 кДа.
16. Трифторацетилсополимер-1, у которого более 75% молярной доли имеет молекулярную массу в ин-тервале от 2 до 20 кДа, полученный способом, включающим осуществление реакции защищенного сополи-мера-1 с бромистоводородной кислотой в течение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции.
17. Трифторацетилсополимер-1 по п.16, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение 10-50 ч при температуре примерно 20-28°С.
18. Трифторацетилсополимер-1 по п.16, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 26°С.
19. Способ получения сополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы, вклю-чающий выбор заданного профиля распределения молекулярной массы, осуществление реакции защищен-ного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1 с задан-ным профилем распределения молекулярной массы, причем указанную реакцию проводят в течение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции, и обработку ука-занного трифторацетилсополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводород-ной кислотой осуществляют в течение 10-50 ч при температуре 20-28°С.
21. Способ по п.19, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводород-ной кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 26°С.
22. Способ получения трифторацетилсополимера-1 с заданным профилем распределения молекуляр-ной массы, включающий выбор заданного профиля распределения молекулярных масс, осуществление реак-ции защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополиме-ра-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы, причем указанную реакцию проводят в те-чение времени и при температуре, которые предварительно определены посредством пробной реакции, с образованием трифторацетилсополимера-1 с заданным профилем распределения молекулярной массы.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводород-ной кислотой осуществляют в течение примерно 10-50 ч при температуре 20-28°С.
24. Способ по п.22, отличающийся тем, что реакцию защищенного сополимера-1 с бромистоводорад-нои кислотой осуществляют в течение 17 ч при температуре 26°С.
25. Композиция, содержащая полидисперсную смесь полипептидов состоящих из глутаминовой кисло-ты, лизина. аланина и тирозина, в которой смесь имеет среднюю молекулярною массу от 4 до 9 кДа.
26. Композиция по п. 25, в которой более 75% полипептидов в смеси, в расчете на молярные доли, имеют молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
27. Композиция по п. 25, в которой менее 5% полипептидов в смеси имеют молекулярную массу более 40 кДа.
28. Композиция по п. 27, в которой более 75% полипептидов в смеси, в расчете на молярные доли имеют молекулярную массу в интервале от 2 до 20 кДа.
29. Композиция по п. 28, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа
30. Композиция по п. 25, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 4 до 8,6 кДа.
31. Композиция по п. 25, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 5 до 9 кДа.
32. Композиция по п. 25, в которой менее 2,5% полипептидов в смеси имеют молекулярную массу более 40 кДа.
33. Композиция по п. 32, в которой более 75% полипептидов в смеси, в расчете на молярные доли, имеют молекулярную массу в интервале примерно от 2 до 20 кДа.
34. Композиция по п. 33, в которой смесь имеет среднюю молекулярную массу от 6,25 до 8,4 кДа.
35. Композиция по п. 25, в которой смесь имеет такое молекулярно-массовое распределение, где средняя молекулярная масса составляет 7,7 кДа.
36. Фармацевтическая композиция, содержащая дозу композиции по любому из п.п. 25-35, эффективную для лечения рассеянного склероза.
37. Способ лечения пациента, страдающего рассеянным склерозом, путем введения пациенту, нуждаю-щемуся в лечении, композиции по п. 36.
Описание
Эта заявка частичное продолжение заявки США № 08/344 248 от 23.11.94, поданной в продолжение за-явки США № 08/248 037 от 24.05.94.
Уровень техники
Сополимер-1 - это синтетический полипептидный аналог основного белка миелина (ОБМ) природного компонента миелиновой оболочки. Его предлагали применять в качестве потенциального терапевтического средства против рассеянного склероза (Еur. J.Immunol. [1971] 1:242; и J.Neurol.. Sci. [1977] 31:433). Все при-веденные здесь ссылки полностью включены в эту заявку. Интерес к сополимеру- 1 как иммунотерапевтиче-скому средству от рассеянного склероза возник в 1950-х годах, когда обнаружили, что такие компоненты миелина, как ОБМ, предотвращают или задерживают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАИ). ЭАИ болезнь, сходная с рассеянным склерозом, который может быть вызван у подверженных этому заболеванию животных.
Сополимер-1 был исследован в институте Вейсмана (Реховот, Израиль) докторами Села, Арноном с со-трудниками, которые выявили, что он подавляет ЭАИ (Еur. J.Immunol. [1971] 1:242; патент США 3849550). В последнее время стало известно, что сополимер-1 оказывает благоприятное действие на пациентов с обост-ряющейся и ослабевающей формой рассеянного склероза (N. Еngl. J.Med. [1987] 317:408). У пациентов, кото-рым ежедневно вводили сополимер-1, отмечено меньше случаев обострения и небольшое развитие нетрудо-способности в сравнении с контрольными пациентами.
Сополимер-1 - это смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирози-на в молярном соотношении соответственно около 6:2:5:2. Его синтезируют, полимеризуя эти четыре амино-кислоты с образованием продуктов со средней молекулярной массой 23 000 Да (Патент США 3849550).
Цель изобретения - получение усовершенствованной композиции сополимера-1.
Сущность изобретения
Изобретение относится к составу сополимера-1, по существу свободному от сополимера- 1 с молекуляр-ной массой более 40 кДа.
Кроме того, изобретение относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.
Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции и к способу лечения рассеянного склеро-за с применением описанного сополимера-1.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны распределение молекулярной массы трех доз сополимера-1 и пропорция видов с мо-лекулярной массой выше 40 кДа. На фиг.2 показаны те же данные, относящиеся к молярной доле.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к составу сополимера- 1, по существу свободному от видов сополи-мера–1 с молекулярной массой более 40 кДа. Этот состав предпочтительно содержит менее 5%, а более предпочтительно менее 2,5% видов сополимера-1 с молекулярной массой 40 кДа или более.
Изобретение также относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой при-мерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.
Дополнительно, изобретение относится к сополимеру- 1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа. В частности, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа и к сополимеру- 1 со средней молекулярной массой примерно от 6,25 до примерно 8,4 кДа.
Сополимер- 1 согласно изобретению может быть получен известными способами, например, способом по патенту США № 3849550, согласно которому N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, Y-бензилглутамата и E-N-трифторацетиллизина полимеризуют при температуре окружающей среды в безвод-ном диоксане с диэтиламином как инициатором. Далее Y-карбоксильную группу глутаминовой кислоты де-блокируют бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте с последующим удалением трифторацетиль-ных групп из остатков лизина 1М пиперидином. В заявке термины "температура окружающей среды" и "ком-натная температура" следует понимать как температуру примерно от 20 до примерно 260С.
Сополимер- 1 с требуемым профилем молекулярной массы может быть получен по существу любым из-вестным способом. Такие способы включают хроматографию сополимера-1, содержащего высокомолеку-лярные виды, и сбор фракций без нежелательных видов или частичный кислотный или ферментативный гидролиз для удаления высокомолекулярных видов с последующей очисткой диализом или ультрафильтрацией. Другой способ получения сополимера-1 с желаемым профилем молекулярной массы заключается в получе-нии желаемого вида с защищенными аминокислотами и последующем получении необходимого вида непо-средственно после снятия защиты. Рецептуры композиций согласно изобретению можно составить общеиз-вестными способами. Предпочтительно состав лиофилизируют или превращают в водный раствор, пригод-ный для подкожных инъекций. Сополимеру-1 можно также придать любую из известных форм, удобную для приготовления пептидных лекарств для перорального, носового, защечного или ректального введения.
Обычно пациентам, страдающим рассеянным склерозом, сополимер- 1 вводят ежедневно в дозах 20 мг.
Изобретение описано в примерах, не ограничивающих его объем.
Пример 1
Хроматографический способ получения низкотоксичного сополимера- 1
Две дозы сополимера-1 получили известным способом, например по патенту США № 3849550.
Затем ону дозу подвергли хроматографическому разделению, как описано ниже.
Колонку для гельфильтрации FRACTOGEL TSK HWSS (600 х 26 мм) собрали в патроне Superbormance 26 Мегсk согласно инструкции изготовителя.
Колонку эквилибрировали водой и впрыснули раствор ацетона для определения общего объема. Колон-ку эквилибрировали 0,2 М буфером ацетата аммония с рН 5,0, загрузили в нее 30 мл проб сополимера- 1 (20 мг/мл в 0,2 М буфере ацетата аммония с рН 5,0) и каждые 10 мин отбирали фракции. Фракцию со средней молекулярной массой 7-8 кДа, выделяли между 120-130 минутами (Доза А).
Анализ молекулярной массы
Поглощение ультрафиолетового света (ПУС) при 275 нм определяли спектрофотометром UVIKON 810. Пробы разбавляли для достижения уровня ПУС ниже 1 единицы поглощения. Молекулярное распределение двух доз определяли на калиброванной гельфильтрационной колонке (Superose 12). Было обнаружено, что доза А сополимера- 1 имела среднюю молекулярную массу 7-8 кДа. В этой дозе из всех видов сополимера- 1 2,5 % имели молекулярную массу выше 42 кДа, а 5 % - более 40 кДа.
Средняя молекулярная масса другой, не подвергнутой хроматографическому разделению, дозы сополи-мера-1 составила 12 кДа. В этой дозе из всех видов сополимера- 1 2,5 % также имели молекулярную массу выше 42 кДа, а 5 % - более 40 кДа.
Пример 2
Анализ на токсичность
А: In Vivo
Три дозы сополимера- 1 со средней молекулярной массой 7,3 кДа, 8,4 кДа (менее 2,5 % сополимера- 1 имеет молекулярную массу более 40 кДа) и 22 кДа (более 5 % сополимера- 1 имеет молекулярную массу более 40 кДа) испытали на токсичность, как описано ниже. В каждом случае в каждой экспериментальной группе использовали по 5 мышей.
Методика
Результаты обобщены в следующей таблице:
Средняя молекулярная мас-са, Да Доля видов с молекулярной мас-сой более 40 кДф, Выделенный серотонин %
6250
7300
13000
14500 2,5
2,5
5
5 12,4
21,0
66,9
67,8
Сополимер- 1 растворили в дистиллированной воде для получения раствора с концентрацией активного ингредиента 2 мг/мл. Каждой мыши ввели 0,5 мл испытуемого раствора в вену хвоста. Для определения смертности и соответствующих клинических признаков мышей наблюдали более 48 часов. Результаты наблюдений записывали через 10 мин, 24 часа и 48 часов после инъекции. Если к исходу 48 часов все живот-ные были живы и никаких неблагоприятных признаков не было обнаружено, то такая доза считалась "неток-сичной".
Если же одна или более мышей погибли или проявляли неблагоприятные признаки, то такая доза счи-талось «токсичной». Дозы со средней молекулярной массой 7,3 и 8,4 кДа были отнесены к "нетоксичным", а в опытах с дозой со средней молекулярной массой 22 кДа 3 из 5 мышей погибли к исходу 48 часов и поэтому ее признали "токсичной".
В: In Vitro
Тест на БЛК-дегрануляцию
I. Введение. Выделенный из базофильных клеток гистамин (или серотонин) служит in vitro моделью ал-лергической реакции немедленного типа.
Была получена линия базофильных лейкозных клеток крыс (БЛК-2Нз), которая представляла собой вос-производимую однородную легко сохраняемую систему с высокой чувствительностью (E.L.Basumian, C.Isersky M.G.Petrino and R.P.Siraganian. Eur.J.Immunol. 11 , 317, 1981). Физиологический стимул для выделе-ния гитамина предполагает связывание антигена с мембранно-связан-ными молекулами IgЕ, в результате чего происходит сшивка молекул и последующий запуск сложного биохимического каскада. Кроме этих физиологических иммуноглобулин-опосредованных механизмов запуска, дегрануляция может быть вызвана различными Не-IgE-опосредованными стимулами. Среди них - различные пептиды и синтетические полиме-ры, например, полилизин (R.P.Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432, 1983). Поэтому ис-пытание на БЛК-дегрануляцию используют для отбора тех доз сополимера-1, которые вызывают существен-ную дегрануляцию и таким образом могут выявить нежелательные локальные и/или системные побочные эффекты.
II. Основы методики испытаний. К базофильным лейкозным клеткам крыс (БЛК-2Нз) добавляли [3Н]-се-ротонин и смесь инкубировали со 100 мкг сополимера- 1. Дозы сополимера- 1, вызывающие неспецифиче-скую дегрануляцию, высвобождали [3Н]-серотонин в среду. Ее радиоактивность определяли сцинтилляцион-ным счетчиком, а общее количество проникшего в клетки серотонина определяли в центрифугированных клетках. Степень деградации вычисляли в процентах выделенного из клеток серотонина от его общего коли-чества.
III. Результаты. Четыре дозы сополимера- 1 со средней молекулярной массой в интервале 6250-14500 исследовали для определения в процентах доли видов с молекулярной массой более 40 кДа и на БЛК-дегрануляцию.
Как видно из таблицы, при малой (2,5%) доле сополимера-1 с высокой молекулярной массой низкий (2,5), процент выделенного как индикатор токсичности серотонина низок и наоборот
Пример 3. Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер- 1 получали, как описано Тайтельбаумом и др. (Eur.J.Immun.Vol. 1 p.242, 1971), из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N-карбоксиангидридов тирозина, 50 г аланина, 35 г Y- бензилглутама-та и 83 г трифторацетиллизина.
Полимеризацию инициировали добавлением 0,01-0,02 % диэтиламина. Реакционную смесь перемеши-вали при комнатной температуре в течение 24 часов, затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сопо-лимер- 1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали. Блокирующие Y-бензильные группы удаляли из остатков глутамата, обрабатывая 33% бромистоводородной кислотой при комнатной температуре в тече-ние 6-12 часов при перемешивании. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, про-мывали и высушивали, получая на выходе трифторацетилсополимер-1.
Пример 4. Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер- 1 получали, как описано Тайтельбаумом и др. (Eur.J.Immun.Vol.1 р.242, 1971), из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N -карбоксиангидридов тирозина, 50 г аланина, 35 г -с-бензилглутамата и 83 г трифторацетиллизина.
Полимеризацию инициировали добавлением 0,01-0,02 % диэтиламина. Реакционную смесь перемеши-вали при комнатной температуре в течение 24 часов, затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сопо-лимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали.
Защищенный сополимер-1 обрабатывали 33 % НВг в уксусной кислоте, удаляя защищающую омега-бензилгруппу из 5-карбоксилатного остатка глутамата, и расщепляли полимер на более короткие полипеп-тиды. Время, необходимое для получения сополимера- 1 с молекулярной массой 7000 + 2000 Да, зависит от температуры реакции и размера защищенного сополимера-1. Каждую дозу вводили в тест-реакцию при тем-пературе 20-28С и в течение разного времени, например от 10 до 50 часов.
Результаты относительно молекулярных масс в этих маломасштабных реакциях подсчитывали и строи-ли график зависимости молекулярной массы от времени. Время, необходимое для получения молекулярной массы 7000+ 2000 Да, рассчитывали по графику и этот показатель использовали при крупномасштабных реакциях. В среднем, при 26 С время составляет 17 часов. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали получая на выходе трифторацетилсополимер-1.
Получение низкотоксичного сополимера-1
20 г трифторацетилсополимера-1 диспергировали в 1 л воды и добавляли 100 г пиперидина. Смесь пе-ремешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и фильтровали. Раствор сырого сополимера- 1 распределяют по камерам для диализа и диализировали при 10-20 С против воды до достижения рН=8. За-тем проводили диализ против 0,3 % уксусной кислоты и снова против воды до рН=5,5-6,0. Затем раствор концентрировали и подвергли лиофильной сушке.
Уровень техники
Сополимер-1 - это синтетический полипептидный аналог основного белка миелина (ОБМ) природного компонента миелиновой оболочки. Его предлагали применять в качестве потенциального терапевтического средства против рассеянного склероза (Еur. J.Immunol. [1971] 1:242; и J.Neurol.. Sci. [1977] 31:433). Все при-веденные здесь ссылки полностью включены в эту заявку. Интерес к сополимеру- 1 как иммунотерапевтиче-скому средству от рассеянного склероза возник в 1950-х годах, когда обнаружили, что такие компоненты миелина, как ОБМ, предотвращают или задерживают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАИ). ЭАИ болезнь, сходная с рассеянным склерозом, который может быть вызван у подверженных этому заболеванию животных.
Сополимер-1 был исследован в институте Вейсмана (Реховот, Израиль) докторами Села, Арноном с со-трудниками, которые выявили, что он подавляет ЭАИ (Еur. J.Immunol. [1971] 1:242; патент США 3849550). В последнее время стало известно, что сополимер-1 оказывает благоприятное действие на пациентов с обост-ряющейся и ослабевающей формой рассеянного склероза (N. Еngl. J.Med. [1987] 317:408). У пациентов, кото-рым ежедневно вводили сополимер-1, отмечено меньше случаев обострения и небольшое развитие нетрудо-способности в сравнении с контрольными пациентами.
Сополимер-1 - это смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирози-на в молярном соотношении соответственно около 6:2:5:2. Его синтезируют, полимеризуя эти четыре амино-кислоты с образованием продуктов со средней молекулярной массой 23 000 Да (Патент США 3849550).
Цель изобретения - получение усовершенствованной композиции сополимера-1.
Сущность изобретения
Изобретение относится к составу сополимера-1, по существу свободному от сополимера- 1 с молекуляр-ной массой более 40 кДа.
Кроме того, изобретение относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.
Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции и к способу лечения рассеянного склеро-за с применением описанного сополимера-1.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны распределение молекулярной массы трех доз сополимера-1 и пропорция видов с мо-лекулярной массой выше 40 кДа. На фиг.2 показаны те же данные, относящиеся к молярной доле.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к составу сополимера- 1, по существу свободному от видов сополи-мера–1 с молекулярной массой более 40 кДа. Этот состав предпочтительно содержит менее 5%, а более предпочтительно менее 2,5% видов сополимера-1 с молекулярной массой 40 кДа или более.
Изобретение также относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой при-мерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.
Дополнительно, изобретение относится к сополимеру- 1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа. В частности, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа и к сополимеру- 1 со средней молекулярной массой примерно от 6,25 до примерно 8,4 кДа.
Сополимер- 1 согласно изобретению может быть получен известными способами, например, способом по патенту США № 3849550, согласно которому N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, Y-бензилглутамата и E-N-трифторацетиллизина полимеризуют при температуре окружающей среды в безвод-ном диоксане с диэтиламином как инициатором. Далее Y-карбоксильную группу глутаминовой кислоты де-блокируют бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте с последующим удалением трифторацетиль-ных групп из остатков лизина 1М пиперидином. В заявке термины "температура окружающей среды" и "ком-натная температура" следует понимать как температуру примерно от 20 до примерно 260С.
Сополимер- 1 с требуемым профилем молекулярной массы может быть получен по существу любым из-вестным способом. Такие способы включают хроматографию сополимера-1, содержащего высокомолеку-лярные виды, и сбор фракций без нежелательных видов или частичный кислотный или ферментативный гидролиз для удаления высокомолекулярных видов с последующей очисткой диализом или ультрафильтрацией. Другой способ получения сополимера-1 с желаемым профилем молекулярной массы заключается в получе-нии желаемого вида с защищенными аминокислотами и последующем получении необходимого вида непо-средственно после снятия защиты. Рецептуры композиций согласно изобретению можно составить общеиз-вестными способами. Предпочтительно состав лиофилизируют или превращают в водный раствор, пригод-ный для подкожных инъекций. Сополимеру-1 можно также придать любую из известных форм, удобную для приготовления пептидных лекарств для перорального, носового, защечного или ректального введения.
Обычно пациентам, страдающим рассеянным склерозом, сополимер- 1 вводят ежедневно в дозах 20 мг.
Изобретение описано в примерах, не ограничивающих его объем.
Пример 1
Хроматографический способ получения низкотоксичного сополимера- 1
Две дозы сополимера-1 получили известным способом, например по патенту США № 3849550.
Затем ону дозу подвергли хроматографическому разделению, как описано ниже.
Колонку для гельфильтрации FRACTOGEL TSK HWSS (600 х 26 мм) собрали в патроне Superbormance 26 Мегсk согласно инструкции изготовителя.
Колонку эквилибрировали водой и впрыснули раствор ацетона для определения общего объема. Колон-ку эквилибрировали 0,2 М буфером ацетата аммония с рН 5,0, загрузили в нее 30 мл проб сополимера- 1 (20 мг/мл в 0,2 М буфере ацетата аммония с рН 5,0) и каждые 10 мин отбирали фракции. Фракцию со средней молекулярной массой 7-8 кДа, выделяли между 120-130 минутами (Доза А).
Анализ молекулярной массы
Поглощение ультрафиолетового света (ПУС) при 275 нм определяли спектрофотометром UVIKON 810. Пробы разбавляли для достижения уровня ПУС ниже 1 единицы поглощения. Молекулярное распределение двух доз определяли на калиброванной гельфильтрационной колонке (Superose 12). Было обнаружено, что доза А сополимера- 1 имела среднюю молекулярную массу 7-8 кДа. В этой дозе из всех видов сополимера- 1 2,5 % имели молекулярную массу выше 42 кДа, а 5 % - более 40 кДа.
Средняя молекулярная масса другой, не подвергнутой хроматографическому разделению, дозы сополи-мера-1 составила 12 кДа. В этой дозе из всех видов сополимера- 1 2,5 % также имели молекулярную массу выше 42 кДа, а 5 % - более 40 кДа.
Пример 2
Анализ на токсичность
А: In Vivo
Три дозы сополимера- 1 со средней молекулярной массой 7,3 кДа, 8,4 кДа (менее 2,5 % сополимера- 1 имеет молекулярную массу более 40 кДа) и 22 кДа (более 5 % сополимера- 1 имеет молекулярную массу более 40 кДа) испытали на токсичность, как описано ниже. В каждом случае в каждой экспериментальной группе использовали по 5 мышей.
Методика
Результаты обобщены в следующей таблице:
Средняя молекулярная мас-са, Да Доля видов с молекулярной мас-сой более 40 кДф, Выделенный серотонин %
6250
7300
13000
14500 2,5
2,5
5
5 12,4
21,0
66,9
67,8
Сополимер- 1 растворили в дистиллированной воде для получения раствора с концентрацией активного ингредиента 2 мг/мл. Каждой мыши ввели 0,5 мл испытуемого раствора в вену хвоста. Для определения смертности и соответствующих клинических признаков мышей наблюдали более 48 часов. Результаты наблюдений записывали через 10 мин, 24 часа и 48 часов после инъекции. Если к исходу 48 часов все живот-ные были живы и никаких неблагоприятных признаков не было обнаружено, то такая доза считалась "неток-сичной".
Если же одна или более мышей погибли или проявляли неблагоприятные признаки, то такая доза счи-талось «токсичной». Дозы со средней молекулярной массой 7,3 и 8,4 кДа были отнесены к "нетоксичным", а в опытах с дозой со средней молекулярной массой 22 кДа 3 из 5 мышей погибли к исходу 48 часов и поэтому ее признали "токсичной".
В: In Vitro
Тест на БЛК-дегрануляцию
I. Введение. Выделенный из базофильных клеток гистамин (или серотонин) служит in vitro моделью ал-лергической реакции немедленного типа.
Была получена линия базофильных лейкозных клеток крыс (БЛК-2Нз), которая представляла собой вос-производимую однородную легко сохраняемую систему с высокой чувствительностью (E.L.Basumian, C.Isersky M.G.Petrino and R.P.Siraganian. Eur.J.Immunol. 11 , 317, 1981). Физиологический стимул для выделе-ния гитамина предполагает связывание антигена с мембранно-связан-ными молекулами IgЕ, в результате чего происходит сшивка молекул и последующий запуск сложного биохимического каскада. Кроме этих физиологических иммуноглобулин-опосредованных механизмов запуска, дегрануляция может быть вызвана различными Не-IgE-опосредованными стимулами. Среди них - различные пептиды и синтетические полиме-ры, например, полилизин (R.P.Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432, 1983). Поэтому ис-пытание на БЛК-дегрануляцию используют для отбора тех доз сополимера-1, которые вызывают существен-ную дегрануляцию и таким образом могут выявить нежелательные локальные и/или системные побочные эффекты.
II. Основы методики испытаний. К базофильным лейкозным клеткам крыс (БЛК-2Нз) добавляли [3Н]-се-ротонин и смесь инкубировали со 100 мкг сополимера- 1. Дозы сополимера- 1, вызывающие неспецифиче-скую дегрануляцию, высвобождали [3Н]-серотонин в среду. Ее радиоактивность определяли сцинтилляцион-ным счетчиком, а общее количество проникшего в клетки серотонина определяли в центрифугированных клетках. Степень деградации вычисляли в процентах выделенного из клеток серотонина от его общего коли-чества.
III. Результаты. Четыре дозы сополимера- 1 со средней молекулярной массой в интервале 6250-14500 исследовали для определения в процентах доли видов с молекулярной массой более 40 кДа и на БЛК-дегрануляцию.
Как видно из таблицы, при малой (2,5%) доле сополимера-1 с высокой молекулярной массой низкий (2,5), процент выделенного как индикатор токсичности серотонина низок и наоборот
Пример 3. Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер- 1 получали, как описано Тайтельбаумом и др. (Eur.J.Immun.Vol. 1 p.242, 1971), из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N-карбоксиангидридов тирозина, 50 г аланина, 35 г Y- бензилглутама-та и 83 г трифторацетиллизина.
Полимеризацию инициировали добавлением 0,01-0,02 % диэтиламина. Реакционную смесь перемеши-вали при комнатной температуре в течение 24 часов, затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сопо-лимер- 1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали. Блокирующие Y-бензильные группы удаляли из остатков глутамата, обрабатывая 33% бромистоводородной кислотой при комнатной температуре в тече-ние 6-12 часов при перемешивании. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, про-мывали и высушивали, получая на выходе трифторацетилсополимер-1.
Пример 4. Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер- 1 получали, как описано Тайтельбаумом и др. (Eur.J.Immun.Vol.1 р.242, 1971), из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N -карбоксиангидридов тирозина, 50 г аланина, 35 г -с-бензилглутамата и 83 г трифторацетиллизина.
Полимеризацию инициировали добавлением 0,01-0,02 % диэтиламина. Реакционную смесь перемеши-вали при комнатной температуре в течение 24 часов, затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сопо-лимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали.
Защищенный сополимер-1 обрабатывали 33 % НВг в уксусной кислоте, удаляя защищающую омега-бензилгруппу из 5-карбоксилатного остатка глутамата, и расщепляли полимер на более короткие полипеп-тиды. Время, необходимое для получения сополимера- 1 с молекулярной массой 7000 + 2000 Да, зависит от температуры реакции и размера защищенного сополимера-1. Каждую дозу вводили в тест-реакцию при тем-пературе 20-28С и в течение разного времени, например от 10 до 50 часов.
Результаты относительно молекулярных масс в этих маломасштабных реакциях подсчитывали и строи-ли график зависимости молекулярной массы от времени. Время, необходимое для получения молекулярной массы 7000+ 2000 Да, рассчитывали по графику и этот показатель использовали при крупномасштабных реакциях. В среднем, при 26 С время составляет 17 часов. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали получая на выходе трифторацетилсополимер-1.
Получение низкотоксичного сополимера-1
20 г трифторацетилсополимера-1 диспергировали в 1 л воды и добавляли 100 г пиперидина. Смесь пе-ремешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и фильтровали. Раствор сырого сополимера- 1 распределяют по камерам для диализа и диализировали при 10-20 С против воды до достижения рН=8. За-тем проводили диализ против 0,3 % уксусной кислоты и снова против воды до рН=5,5-6,0. Затем раствор концентрировали и подвергли лиофильной сушке.
(56) Документы, цитированные в отчёте
US 3 849 550 A, 19.11.1974
EP 0383620 A2, 22.08.1990
US 4594409 A, 10.06.1986
DE 3930733 A1, 28.03.1991
EP 0378246 A1, 18.07.1990
EP 0383620 A2, 22.08.1990
US 4594409 A, 10.06.1986
DE 3930733 A1, 28.03.1991
EP 0378246 A1, 18.07.1990
📎 Прикреплённые файлы
-
392.pdf⬇ Скачать