CПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА СУБТИЛБЕН

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов на основе Bacillus Subtilis применяющихся в сельском хозяйстве – растениеводстве и ветеринарной медицине.
Целью изобретения является повышение эффективности способа.
Разработанный способ получения препарата субтилбен из бактерий рода Bacillus, включающий культивирование на питательной среде, состоящей из минеральных солей, пептона, углеводов, и отде-ление биомассы, отличающийся тем, что биомассу Bacillus subtilis смешивают с наполнителем – бенто-нито-пектоновой смесью в соотношении 9:1 – в количестве 20-30% и высушивают нелиофильным спо-собом при температуре 60 –650 С в течение 48 ч.
Разработанный способ дает возможность избежать дорогостоящего этапа по лиофильному высуши-ванию бактериальной массы, увеличить выход биомассы и повысить ее активность.

Изобретениее относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов на ос-нове Bacillus Subtilis, применяющихся в сельском хозяйстве – растениеводстве и ветеринарной медицине
Известен способ получения биопрепарата из бактерий рода Bacillus Subtilis (1), включающий засев пита-тельной среды маточной культурой, жидкостное культивирование в среде, содержащей минеральные соли, пептон, углеводы и отделение целевого продукта; состоящего из культуральной жидкости со споровой био-массой, на 14 сутки инкубации. Препарат используется в жидкой форме.
Недостатками указанного способа являются:
-длительность культивирования 14 суток;
-низкий выход биомассы -1,6 - 3 млрд. живых клеток в форме спор в 1 мл;
-недостаточно длительный срок хране ния - 4 месяца.
-непригодность жидкой формы препарата для заблаговременной (за 2-3 месяца до посева) обработки семян хлопчатника и других культур.
Известен способ получения биопрепарата из бактерий рода Bacillus Subtilis (2,) включающий засев пита-тельной среды маточной культурой, жидкостное культивирование (12-16ч.) в среде, содержащей минераль-ные соли, пептон, углеводы и отделения целевого продукта, содержащего культуральную жидкость со споро-вой биомассой. Полученная культуральная жидкость содержит 24 –26 млрд. микробных клеток (м.к.) в мл (70-100% спор). К полученной биомассе добавляют стабилизатор биомассы ( гуми 0,5-2 % или сульфит натрия 2-6%), что обеспечивает сохранение количества живых колониеобразующих клеток в течение 6-8 месяцев. Культуральная жидкость, содержащую споровую биомассу штамма acillus Subtilis 26Д и стабилизатор био-массы и используют в качестве бактерийного препарата фитоспорин в жидкой форме (3).
Недостатками указанного способа являются:
- низкий выход биомассы - 24-26 млрд. живых клеток в форме спор 1 мл;
- недостаточно длительный срок хранения: в течение 6-8 месяцев;
- непригодность жидкой формы препарата для заблаговременной (за 2-3 месяца до посева) обработки семян хлопчатника и других культур.
Применяется способ получения препарата из штамма Bacillus Subtilis 26Д (4), включающий засев пита-тельной среды маточной культурой, жидкостное культивирование в среде, содержащей минеральные соли, пептон, улеводы и отделение целевого продукта, содержащего культуральную жидкость со споровой био-массой (24 – 26 млрд м.к./мл). Препарат содержит лиофильно высушенные живые клетки и споры Bacillus Subtilis и наполнитель (белково-сахароза-желатиновую смесь).
Препарат выпускают во флаконах и ампулах.
Недостатками способа, принятого за прототип, являются:
- необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих и энергоемких аппаратов для сушки биомассы лиофильным способом;
- неудобства использования флаконов и ампул с препаратом при приготовлении больших его объе-мов для обработки семена хлопчатника и других культур, а также массовых обработок животных;
- препарат не содержит минеральных и растительных адсорбентов в качестве наполнителя, способ-ствующих сохранению жизнедеятельности бактерий в неблагоприятных условиях среды и усиливающих его антимикробную активность.
Цель изобретения – разработать способ получения препарата из бактерий рода Bacillus с высоким вы-ходом биомассы в форме порошка без использования лиофильной сушки, менее дорогостоящего, технологи-чески удобного для применения.
Поставленная цель достигается получением биомассы Bacillus subtilis (штамм 26Д ТаджНИВИ 09) путем культивирования на питательной среде, следующего состава, %: пептон ферментативный - 9,0 –10,0; пита-тельный бульон – 9,0 – 10,0; картофельный крахмал – 10,0 – 12,0; глюкоза - 8,0 - 9,0; хлорид натрия –0,1 - 0,15; агар-агар – 8,0-9,0; вода - остальное. Засев производят маточной экспонсиальной культурой в количе-стве 2-3х109 м.к/ мл. Культивирование осуществляют в течение 48 ч при температуре 370 С. К полученной биомассе добавляют наполнитель-бентонито - пектиновую смесь в соотношение 9:1 - в количестве 20-30% и высушивают нелиофильным способом при температуре 60-650С в течение 48 ч. Полученный порошок, состо-ящий из живых микробных клеток Bacillus subtilis и наполнителя, содержащий 60 – 70 млрд м.к./г (90 – 100% спор), используется в качесте препарата субтилбен.
Пример 1. Биомассу Bacillus subtilis (штамм 26Д Тадж НИВИ 09) получали путем культивирования в пи-тательной среде следующего состава %: пептон ферментативный – 9,0 – 10,0; питательный бульон –9,0 - 10.0; картофельный крахмал – 10,0 – 12,0; глюкоза 8,0-9,0; хлорид натрия –0,1-0,15; агар-агар 8.0-9,0; вода - остальное. Засев производят маточной экспонсиальной культурой в количестве 2-3х109 м.к./мл. Культивиро-вание осуществляли в течение 48 ч при температуре 37 С. К полученной биомассе добавляли наполнитель - бентонито -пектиновую смесь в соотношение 9:1 - в количестве 20% и высушивали нелиофильным способом при температуре 60 С в течение 48 часов. Контроль за ростом культуры проводили путем отбора проб через каждые 2 часа и определением концентра ции микробных клеток в камере Горяева; количе ство колониеоб-разующих клеток (КОК) определяли высевом на плотные питательные среды, наличие спор - в мазках куль-туры, окрашенных по Граму. Готовый препарат измельчали в порошок и расфасовывали в бумажные пакеты.
Результаты исследования показали, что количество КОК составило 70 млрд. м.к./г, количество живых клеток в 1 г препарата достигло 96 - 97% (85-100%спор).
Пример 2. Культивирование проводили как в примере 1, при этом в биомассу добавляли бентонито-пектиновый наполнитель (9:1) в количестве 30% и высушивали препарат в сушильном шкафу при температу-ре 600 С в течение 48 ч.
Результаты исследования показали, что количество КОК составило 68 млрд. м.к./г, количество живых клеток в 1г препарата достигло 94 - 96% (95-100% спор).
Пример 3. Культивирование проводили как в примере 1, при этом в биомассу добавляли бентонито-пектиновый наполнитель (9:1) в количестве 20% и высушивали препарат в сушильном шкафу при температу-ре 650 С в течение 48 ч.
Результаты исследования показали, что количество КОК составило 63 млрд. м.к./г, количество живых клеток в 1 г препарата достигло 94-96% (94-100% спор).
Пример 4. Культивирование проводили как в примере 1, при этом в биомассу добавляли бентонито-пектиновый наполнитель (9:1) в количестве 30% и высушивали препарат в сушильном шкафу при температу-ре 650 С в течение 48 ч.
Результаты исследования показали, что количество КОК составило 60 млрд. м.к./г, количество живых клеток в 1 г препарата достигло 92-94% (95-100% спор).
Пример 5. Культивирование проводили как в
примере 1, при этом в биомассу добавляли бентонито-пектиновый наполнитель (9:1) в количестве 30% и высушивали препарат в сушильном шкафу при температуре 700 С в течение 48 ч.
Результаты исследования показали, что количества КОК составило 28 млрд м.к./г, количество живых клеток в 1 г препарата достигло 45% ( 100% спор).
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что добавление бентонито-пектинового наполнителя (9:1) в количестве 20 - 30% к биомассе и сушка смеси в сушильном шкафу при тем-пературе 60 - 650 С в течение 48 ч является наиболее эффективным.
Антибактериальную активность препарата субтилбен, приготовленного, как в примере 1, изучали по от-ношению к тест-культурам в жидкой питательной среде методом серийных разведений (5).
Минимальное количество препарата, дающее полную задержку роста тесткультуры, соответствовало наименьшей его концентрации, по нему определялась чувствительность тест-микробов к препарату. Резуль-таты опытов оценивали микроскопически путем исследований мазков культуральной жидкости, окрашенных по Граму.
Опыты проводили в трех повторениях. Результаты представлены в таблице.
Установлено, что препарат обладает высокой бактерицидной активностью по отношению к тест-микробам. Минимальное количество препарата, дающее полную задержку роста и развития тест-микробов, составило 15,1 – 31,2 млн м.к. в мл.

1. RU 2099947, C1, 27.12.1997
2. RU 2129375, C1, 27.04.1999
3. GB 1501563, 15.02.1978
4. KR 9603924, 23.03.1996