МИКРОФЛЮИДИЗИРОВАННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧНОГО ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО Т-ЛИМФОЦИТНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА И ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Изобретение относится к области иммунологии, в частности иммунотерапии. Для решения данной задачи используют антиген папилломавируса, выбранного из группы антигенов HPV16 Е6, HPV16 Е7, HPV18 Е6, HPV18 Е7, HPV6 Е4, HPV6 L1, HPV11 E4 и HPV11 L1. Помимо антигена композиция может включать стабилизирующий детергент, мицеллообразующий агент, биоразлагаемое и биосовместимое масло. Композиция используется для лечения цервикального рака, остроконечной кондиломы. Использование композиции позволяет повысить иммунный ответ на антиген папилломавируса, 3 с, и 5 з.п.ф-лы. 6 табл., 19 ил.

Находящиеся на рассмотрении заявка США 08/919787, поданная 24 июля, 1992, и заявка США 07/735069, поданная 25 июля 1991, озаглавленные "Индукция цитотоксических Т-лимфоцитных им-мунных ответов", Syamal Raychaudhuri и William Н. Rastetter (в настоящее время аннулированные), включаются в качестве ссылки во всей их полноте в данное описание. Это изобретение относится к способам и композициям, полезным для индуциро-вания опосредованных цитотоксическими Т-клетками иммунных ответов у людей и домашних или сельскохозяйственных животных.
Считают, что цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛы) являются основным механизмом защитных сил организма в ответ на разнообразные вирусные инфекции и опухолевый или злокачественный рост. Эти клетки уничтожают инфицированные или трансформированные клетки распознаванием фрагментов антигенов в ассоциации с разнообраз-ными молекулами (названы молекулами МНС класса 1) на инфицированных или трансформиро-ванных клетках. ЦТЛ можно индуцировать экспе-риментально цитоплазматической загрузкой опре-деленных растворимых антигенов в специфические клетки. Иммунизация только растворимым антиге-ном обычно недостаточна для индукции специфич-ных цитотоксических Т-лимфоцитов.
Один способ, которым можно индуцировать иммунный ЦТЛ-ответ, включает использование способов рекомбинантной инженерии для введения критических компонентов рассматриваемого анти-гена в геном мягкого инфекционного агента. Целью такой стратегии является генерирование антиген-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитных иммунных ответов на желаемый эпитоп путем вве-дения хозяину слабой, самоограничивающейся инфекции. Были описаны химерные векторы с ис-пользованием коровьей оспы, вируса полиомиели-та, адено- и ретровирусов. а также бактерий, например Listeria и БСЖ. Например, Takahashi et al., 85 Prog. Natl. Acad. Sci., USA 3105, 1988, описы-вают использование рекомбинантного вируса ко-ровьей оспы, экспрессирующего ген белка в обо-лочке gr160 ВИЧ, в качестве возможного средства для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов.
Второй способ, которым можно индуцировать опосредованный клетками иммунный ответ, вклю-чает использование адъювантов. Хотя в данной области знания продолжаются дискуссии об ис-пользовании адъювантов, до сих пор неясно, был ли индуцирован иммунитет, опосредованный (медиированный) клетками, и включал ли такой медиированный клетками иммунитет цитотоксиче-ский Т-лимфоцитный иммунный ответ. Тем не ме-нее, далее представляются разные публикации в этой области.
Stover et al. 361 Nature 456, 1991 (не допуска-ется, чтобы эта работа была предшествующим уровнем данной заявки) описывает иммунный ЦТЛ-ответ на -галактозидазу с использованием реком-бинантной бактерии БСЖ, содержащей ген -галактозидазы. Такой ответ не был обнаружен при использовании неполного адъюванта Фрейнда и -галактозидазы.
Mitchell et al., 8 J. Clinical Oncology 856,1990 (не допускается, чтобы эта работа рассматрива-лась как предшествующий уровень данной заявки) описывает лечение пациентов с метастатической меланомой адъювантом, названным “DETOKC”, и лизатами аллогенной меланомы, введенными пять раз в течение периода шести недель. У небольшой части пациентов наблюдали повышение цитоток-сических Т-клеток. Авторы описывают потребность в повышении уровня продуцирования цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов и предлагают комбинирован-ную терапию адъювантом с интерлейкином-2, а также в качестве предварительного лечения цик-лофосфамидом для уменьшения уровня специфич-ных для опухоли Т-супрессорных клеток, которые могут иметь место. Детокс включает детоксициро-ванный эндотоксин (монофосфориллипид А) из Salmonella minnesota, каркасы клеточных стенок Mycobacterium phlei, скваленовое масло и эмульга-тор.
Allison и Gregoriadis, 11, Immynology Today 427, 1990 (не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем данного изобретения) указывают, что единственным адъювантом, “раз-решенным для использования” в вакцинах челове-ка, являются алюминиевые соли (квасцы), которые не вызывают стойкого медиированного клетками иммунитета. Allison и Gregoriadis заявляют: “здесь имеется, следовательно, потребность в разработке адъювантов с эффективностью полного адъюванта Фрейнда, но без его различных побочных действий, например гранулем”. Они продолжают заявлять, что существует три возможные стратегии, напри-мер использование липосом; использование адъ-ювантов, названных иммуностимулирующими комплексами (ИСКОМы, которые включают сапо-нин или Квил А (Quil А) (тритерпеноид с двумя уг-леводными цепями), холестерин и фосфатидилхо-лин), которые авторизованы для использования в вакцине против гриппа для лошадей (Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153), и использование эмульсии (SAF) сквале-на или сквалана (с плуроновым средством или без него) и мурамилдипептида (МДП). Говорят, что SAF вызывает медиированный клетками иммунитет у мышей, хотя “считали, что субъединичные анти-гены не могут вызывать цитотоксические Т-клеточные (ЦТЛ) иммунные реакции”.
Takahashi et al., 344 Nature 873, 1990, описы-вают рестриктированный помощник (класса 11) и цитотоксическую Т-лимфоцитную индукцию путем использования ИСКОМов в однократной подкож-ной иммунизации у мышей. Они заявляют, что адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и забуференный фосфатом соляной раствор не инду-цируют цитотоксическую Т-лимфоцитную актив-ность против мишеней, в которых они были заинте-ресованы. Они заявляют, что, в противоположность результатам с другими формами экзогенного рас-творимого белкового антигена, ими показано, что возможно примировать антигенспецифические МНС (класса 1)-рестриктированные CD8 + CD4--ЦТЛ иммунизацией экзогенным интактным белком, используя ИСКОМЫ. Они заявляют также, что описанные эксперименты допускают, что возможно вызывать индукцию ЦТЛ человека использованием ИСКОМов, содержащих белки ВИЧ, и что с исполь-зованием вакцин на основе ИСКОМов можно до-стичь долго достигаемой цели, т.е. индукции как ЦТЛ, так и антител очищенным белком.
Byars и Allison. 5 Vaccines 223, 1987, описыва-ют использование SAF-l, который включает твин 223, плуроник L121 и сквален или сквалан с мура-милдипептидом или без него, и предполагают, что их данные указывают на то, что композиция с му-рамилдипептидом будет полезна для приготовле-ния человеческих и ветеринарных вакцин. Бустер-инъекции адъюванта вводили без мурамилдипеп-тида. Говорят, что мурамилдипептид значительно повышает продуцирование антител по сравнению с использованием адъюванта без мурамилдипепти-да. Медиированный клетками иммунитет измеряли как гиперчувствительность замедленного типа кожными тестами для определения индукции Т-клеток-хелперов. Такая гиперчувствительность была сильнее и более отсроченная, когда мура-милдипептид присутствовал в адъюванте. Анало-гичные адъюванты описываются Allison et al., па-тент США 4770874 (где заявляется, что комбинация мурамилдипептида и плуронового полиола суще-ственна для вызывания сильной медиированной клетками и гуморальной иммунной реакции против яичного альбумина); Allison et al., патент США 4772466; Murphy-Соrb et аl., 246, Science 1293, 1989 (где указано, что использование комбиниро-ванных адъювантов с мурамилдипептидом может повысить индукцию как гуморального, так и кле-точного плеч иммунного ответа); Allison и Byars, 87, Vaccines 56, 1987 (где указано, что медииро-ванный клетками иммунитет вызывается SAF (с мурамилдипептидом), как показано гиперчувстви-тельностью замедленного типа, пролиферативными ответами Т-клеток на антиген, продуцированием интерлейкина-2 и специфическим генетически ре-стриктированным лизисом клеток-мишеней, несу-щих иммунизирующий антиген); Allison и Byars, Immynopharmacology of Infections Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191-201, 1987; Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1989; Kenney et al., 121 J. Immynological Methods 157, 1989; Allison и Byars, 95 J. Immynological Methods, 157, 1986 (где было показано, что эмульсии алюминиевых солей и ми-нерального масла повышают образование антител, но не медиированный клетками иммунитет, и было показано, что композиции мурамилдипептида вы-зывают медиированный клетками иммунитет); Byars et al. 8 Vaccine 49, 1990 (не допускается, что-бы эта работа была предшествующим уровнем заявки), где указано, что их композиция адъюванта заметно повышает гуморальный иммунный ответ и в меньшей степени усиливает медиированные клет-ками иммунные ответы на гемагглютининовый антиген гриппа); Allison and Byars, 28 Molecular Immynology 279, 1991 (не допускается, чтобы эта работа была предшествующим уровнем заявки; которые заявляют, что функцией мурамилдипепти-да является индуцирование экспрессии цитокинов и повышение экспрессии генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), и что получали лучшие клеточные ответы и ответы антител, чем с другими адъювантами; и что они надеются выяснить, эф-фективна ли аналогичная стратегия для людей); Allison and Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401. 1988 (которые описывают меди-ированный клетками иммунитет с использованием SAF); Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (которые дают обзор разных адъюван-тов, используемых для получения вакцин); Allison and Byars, 95 J. Immynologigal Methods 157, 1986 (которые заявляют, что добавление мурамилдипеп-тида к адъюванту заметно повышает медиирован-ные клетками иммунные ответы на различные ан-тигены, включая моноклональные иммуноглобули-ны и вирусные антигены); и Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74,1989 (которые описывают ис-пользование SAF-l для получения вакцины для ви-руса Эпштейн-Барра.
Kwak et al., Idiotype Networks in Biology and Medicine. Elsevier Science Publisher, p. 163, 1990 (не допускается, чтобы эта работа была предшеству-ющим уровнем заявки) описывают использование SAF без мурамилдипептида в качестве адъюванта для идиотина В-клеточной лимфомы у человека. В частности, эмульсию плуроника 1-121, сквалана и 0,4% твина 80 в забуференном фосфатом солевом растворе вводили с идиотипом. Они заявляют, что “добавление адъюванта должно далее повышать... гуморальные иммунные ответы и, кроме того, мо-жет облегчить индукцию клеточных иммунных ответов”.
Другие иммунологические препараты вклю-чают липосомы (Allison et al., патенты США 4053585 и 4117113); Циклические пептиды (Dreesman et al., патент США 4778784); полный адъювант Фрейнда (Asherson et al., 22 Immynology 465, 1972; Berman et al., 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immynopotentiation 73, 1973; and Allison, Non specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ИСКОМы (Letvin et al., 87 Vaccines 209. 1987); адъюванты, содержащие не-ионные блок-сополимерные агенты, образованные с минеральным маслом, поверхностно-активное вещество и твин 80 (Hunter and Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; and Hunter et al., 127 J. Immunology 1244, 1981); адъюванты, составлен-ные из минерального масла и эмульгирующего средства с убитыми микобактериями или без них (Sanchez-Pescador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988) и другие адъюванты, такие как липофильное производное мурамилтрипептида и мурамилдипеп-тида, ковалентно конъюгированный с рекомбинан-тым белком (id.).

Краткое изложение существа изобретения
Заявитель обнаружил безопасный и выгодный способ и композиции, которыми у людей и домаш-них или важных для сельского хозяйства животных можно индуцировать иммунный ЦТЛ-ответ. Способ включает использование антигенной композиции, которая слаботоксична или нетоксична для живот-ных и не содержит иммуностимулирующего пепти-да (например мурамилдипептида), присутствие которого будет понижать желаемый клеточный иммунный ответ. Кроме того, эта методология про-ста в использовании и не требует экстенсивной работы in vivо для изменения существующих кле-ток способами рекомбинантной ДНК, чтобы сде-лать их более антигенными. Это открытие неожи-данное, поскольку не ожидали, что такие иммун-ные ЦТЛ-ответы могут быть индуцированы путем использования такой антигенной композиции, не содержат иммуностимулирующих пептидов или их эквивалентов. Открытие заявителя позволяет ис-пользовать такие антигенные композиции при бо-лезненных состояний широкого спектра или в каче-стве профилактического средства. Введение такой антигенной композиции можно использовать, например, для лечения вирусных болезней, в кото-рых важен иммунный ЦТЛ-ответ, например при лечении инфекции ВИЧ или гриппа; использование ее можно также расширить до использования при лечении бактериальных инфекций, рака, парази-тарных инфекций и тому подобных. В качестве профилактического средства антигенная компози-ция, комбинированная с подходящим антигеном, полезна для предупреждения инфекции вирусами, ответственными за вышеуказанные вирусные бо-лезни, в частности профилактики ВИЧ-инфекции, а также для профилактики пациентов с риском рака, например после резекции первичной опухоли.
Таким образом, первым аспектом изобретения является представление способа индукции иммун-ного ЦТЛ-ответа у человека или домашнего (например кошки или собаки) или важного для сельского хозяйства животного (например козы, коровы или свиньи) к антигену, отличному от анти-гена В-клеточной лимфомы или яичного альбуми-на. Способ включает стадии получения антигена, для которого желателен иммунный ЦТЛ-ответ, и получения нетоксичной антигенной композиции, которая включает стабилизирующий детергент, мицеллообразующий агент и биоразрушаемое и биосовместимое масло или состоит или по суще-ству состоит из этих компонентов. Эта антигенная композиция предпочтительно не содержит иммуно-стимулирующий пептидный компонент или имеет достаточно низкий уровень такого компонента, чтобы не уменьшился требуемый клеточный им-мунный ответ. Эту композицию предпочтительно предоставляют в виде стабильной эмульсии типа масло-в-воде. То есть каждый из различных компо-нентов выбирают так, чтобы эта эмульсия остава-лась в состоянии эмульсии в течение периода по меньшей мере одного месяца, предпочтительно в течение более чем одного года, без разделения фаз. В этом способе антиген и антигенную композицию смешивают для образования смеси (предпочти-тельно микрофлюидизацией) и эту смесь вводят животному в количестве, достаточном для индуци-рования иммунного ЦТЛ-ответа у этого животного. Такое введение требуется проводить только один раз.
Термин “стабилизирующий детергент” озна-чает детергент, который позволяет компонентам эмульсии сохраняться в виде стабильной эмульсии. Такие детергенты включают полисорбат, твин 80 (сорбитам-моно-9-октадеканоат-поли(окси-1,2- этандиил; производимый ICI Americas, Wilmington, DE), твин 40, твин 20, твин 60, цвиттергент 3-12, типол НВ7 и спан 85. Эти детергенты обычно при-меняют в количестве приблизительно 0,05-0,5%, предпочтительно около 0,2%.
Термин “мицеллообразующий агент” обозна-чает агент, который способен стабилизировать эмульсию, образованную с другими компонентами, так чтобы образовывалась мицеллоподобная структура. Такие агенты предпочтительно вызы-вают некоторое раздражение в месте инъекции, чтобы привлечь макрофаги для повышения клеточ-ного иммунного ответа. Примеры таких агентов включают полимерные поверхностно-активные вещества, описанные в публикациях BASF Wyadotte, например Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc., 110, 1977, и Hunter et al. 129 J. Immunol. 1244, 1981, причем обе эти публикации включены в каче-стве ссылок, плуроник L62LF, Lid и L64, ПЭГ1000 и тетроник 1501, 150R1, 701, 901 1301 и 130R1. Хи-мические структуры таких агентов хорошо извест-ны в данной области. Предпочтительно выбирают агент, который имеет гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) между 0 и 2, как определено Hunter and Bennett, 133 Journal of Immunology 3167, 1984. Этот агент предпочтительно применяют в количе-стве от 0,5 до 10%, предпочтительно в количестве от 1,25 до 5%.
Выбирают масло, которое промотирует удер-живание антигена в эмульсии масло-в-воде, то есть обеспечивает носитель для требуемого антигена, и предпочтительно имеет температуру плавления менее чем 65 °С. так что эмульсия образуется либо при комнатной температуре (около от 20 до 25 °С), либо один раз температуру эмульсии снижают до комнатной температуры. Примеры таких масел включают сквален, сквалан, эйкозан, тетратетра-контан, глицерин и арахисовое масло или другие растительные масла. Масло предпочтительно при-меняют в количестве от 1 до 10%, наиболее пред-почтительно от 2,5 до 5%. Важно, чтобы масло было биоразлагаемым и биосовместимым, так что-бы организм мог разрушать масло в течение неко-торого времени и чтобы при использовании такого масла не были очевидными отрицательные дей-ствия, например гранулемы.
В указанной выше композиции важно, чтобы в ней не содержался пептидный компонент, в осо-бенности мурамилдипептид (МДП). Такой пептид будет мешать индукции иммунного ЦТЛ-ответа, если он присутствует в количестве, большем, чем около 20 микрограмм, на одно обычное введение композиции человеку. Предпочтительно, чтобы такие пептиды полностью отсутствовали в анти-генной композиции, несмотря на их очевидную стимуляцию гуморального компартмента иммун-ной системы. То есть заявитель нашел, что, хотя такие пептиды могут усиливать гуморальную им-мунную реакцию, они невыгодны, когда требуется цитотоксический Т-лимфоцитный иммунный ответ.
Другие связанные аспекты изобретения за-ключаются в том, что антигенную композицию образуют только из двух из указанных выше трех компонентов и используют с любым требуемым антигеном (этот термин включает белки, полипеп-тиды и их фрагменты, которые иммуногенные), за исключением яичного альбумина (или других аль-буминов, например человеческого сывороточного альбумина (НSA). бычьего сывороточного альбу-мина (ВSА) и овальбумина (ОBА), для индукции иммунного ЦТЛ-ответа у указанных выше живот-ных или людей.
Заявитель считает, что указанные выше ком-позиции значительно выгоднее, чем предшествую-щие композиции (включая ИС-КОМЫ, детокс и SAF) для использования для людей. В отличие от таких композиций данная композиция как включает мицеллообразующий агент, так и не имеет пепти-дов, каркасов клеточных стенок или компонентов бактериальных клеток. Данная композиция также индуцирует иммунный ЦТЛ-ответ, который либо не имеет место при использовании предшествующих композиций, либо значительно повышается по сравнению с этими композициями.
Термин “нетоксичный” означает, что наблю-дается слабое побочное действие антигенной ком-позиции или не наблюдается такого действия у обработанного такой композицией животного или человека. Обычные специалисты в области меди-цины или ветеринарии должны признать, что этот термин имеет широкое значение. Например, по существу, у здорового животного или человека может допускаться только слабая токсичность, тогда как у человека, страдающего от иммунной болезни, может допускаться значительно более высокая токсичность.
В предпочтительных воплощениях антигенная композиция состоит, по существу, из двух или трех компонентов: детергента, агента и масла, и способ состоит, по существу, в однократном введении смеси (антиген плюс антигенная композициям че-ловеку или животному, человека или животного инфицируют вирусом и он страдает от одного или нескольких симптомов (обычно определяемых вра-чами в соответствующей области) инфекции виру-сом, и антигенная композиция нетоксична для че-ловека или животного.
В других предпочтительных воплощениях ан-тиген выбирают из антигенных частей BИЧ-антигенов: gp160, gag, pol, Nef, Tat и Rev; антигенов малярии: белка спорозоита (CS) и поверхностного белка 2 спорозоита; поверхностных антигенов гепатита В: Pre-S1, Pre-S2, НВс Ag и НВе Ag, анти-генов гриппа: НА, NP и NA; поверхностных антиге-нов гепатита А, антигенов вируса герпеса: gp340 EBV, gp85 EBV, gB HSV, gD HSV, gH HSV, раннего белкового продукта HSV, антигенов вируса папил-ломы человека (например HPV-антигенов, таких как антигены L1, Е4, Е6, Е7, в частности антигенов Е6 и Е7 из HPV16 и 18, двух наиболее обычных типов HPV, связанных с цервикальной карциномой. Е4 и L1, полученных из HPV6 и HPV11, двух наиболее обычных типов HPV, связанных с остро-конечной кондиломой; антигена предстательной железы, gB цитомегаловируса, gH цитомегаловиру-са и белка gP72 1Е; антигенов респираторно-синцитиального вируса: белка F, белка G и белка N; и опухолевых антигенов карциномы СЕА, свя-занной с муцином карциномы, Р21 карциномы, Р53 карциномы, MPG меланомы, р97 меланомы и онко-генного продукта Neu карциномы, продукта гена р53 карциномы, антигена меланомы, названного MAGE и мутированного белка р21 ras, присут-ствующего в различных злокачественных опухо-лях.
В другом аспекте изобретение характеризует-ся композицией, содержащей, состоящей или по существу состоящей из антигена, смешанного с описанной выше композицией, и антиген выбирают из перечисленных антигенных частей.
В другом близком аспекте изобретение харак-теризуется способами лечения пациента, инфици-рованного BИЧ-вирусом, страдающего малярией, страдающего гриппом, страдающего гепатитом, страдающего раком, инфицированного вирусом герпеса, страдающего цервикальным раком, стра-дающего остроконечной кондиломой (остроконеч-ные бородавки) или инфицированного респиратор-но-синцитиальным вирусом, введением компози-ции, включающей подходящий антиген (например, выбранный из перечисленных выше антигенов), смешанный с одной из выше указанных компози-ций антигена. Эти антигены и способы лечения с их использованием являются только примерными ан-тигенами, которые можно использовать в антиген-ных композициях-объектах данного изобретения.
Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего описания предпочтительных воплощений его и из формулы изобретения.

Описание предпочтительных воплощений
Сначала будут кратко описаны чертежи.
Фиг. 1a-1c и 4а-4с являются графическими представлениями данных, сравнивающих индук-цию ЦТЛ различными композициями овальбумина; Е:Т представляет отношение эффектора к мишени на всех чертежах.
Фиг. 2а и 2b являются графическими пред-ставлениями данных, сравнивающих индукцию ЦТЛ разными композициями р-галактозидазы.
Фиг. 3 является графическим представлением данных, сравнивающих индукцию ЦТЛ овальбу-мином в липосоме и в антигенной композиции.
Фиг. 5 и 6 являются графическими представле-ниями данных, показывающих влияние истощения клеток CD4 и СD8 на индукцию ЦТЛ.
Фиг. 7 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ белком gp120.
Фиг. 8 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью плуроника и твина и антигена.
Фиг. 9 является графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью сквалана и плуроника и антигена.
Фиг. 11 является графическим представлением влияния овальбумина (ова) с разными антигенными композициями на иммунный ЦТЛ-ответ.
Фиг. 12 является графическим представлением индукции антител против gp120mb у обезьян раз-личными антигенными композициями.
Фиг. 13 изображает противоопухолевую ак-тивность клеток HОРЕ2 через десять дней после одной иммунизации растворимым белком Е7 в адъюванте.
Фиг. 14 изображает противоопухолевую ак-тивность клеток HОРЕ2 на 10, 19 день после двух иммунизаций растворимым белком Е7 в адъюванте.

Антигенная композиция
Антигенные композиции, полезные в этом изобретении, в общих чертах описываются выше. Специалисты в данной области должны признать, что эквивалентные композиции легко получаются и, как можно ожидать, имеют эквивалентные свой-ства в индукции иммунного ЦТЛ-ответа. Такие композиции легко испытывать на их свойства с использованием методик, эквивалентных методи-кам, описанным в приведенных ниже примерах.
Здесь даются примеры изобретения с исполь-зованием антигенной композиции (АК), состоящей из около 2,5% сквалана, 5% плуроновой кислоты и твина 80 в забуференном фосфатом солевом рас-творе. В частности, эмульсия АК включала: 15 мг сквалана, 37,5 мг полоксамера 401 (плуроник L121), 6 мг полисорбата 80 (твин 80), 0,184 мг хло-рида калия, 0,552 мг первичного кислого фосфата калия, 7,36 мг хлорида натрия, 3,3 мг вторичного кислого фосфата натрия (безводного) на 1 мл воды, рН 7,4, Эту эмульсию микрофлюидизировали, ис-пользуя стандартные способы (модель M110F Microfluidigs) с модулем обратного давления при 0,773-0,984 атм с постепенным возвращением к атмосферному давлению, охлаждение и упаковку в мокрый лед.
В других примерах антиген смешивали с мик-рофлюидизированной смесью сквалана (С), плуро-ника (П) и твина 80 (Т) для достижения конечной концентрации 0,2% твина 80, 1,25% плуроника и 5% сквалана соответственно. Для определения субкомпонентов, необходимых для индукции анти-генспецифичного иммунного ответа, получали смеси сквалан-твин 80, плуроник-твин 80 или сква-лан-плуроник с такой же концентрацией, как и для трехкомпонентной смеси. Плуроник, сквалан или твин 80 готовили также индивидуально для опре-деления влияния индивидуального компонента на индукцию ЦТЛ. Проводили также замену твина 20, твина 40 или цвиттергента на твин 80 для опреде-ления влияния разных производных твина на ин-дукцию ЦТЛ в ова-системе. Сквалан в трехкомпо-нентной композиции заменяли на эйкозан или три-аконтан и сополимерный плуроник в такой же трехкомпонентной системе заменяли на ПЭГ- 1000, плуроник L62LF и тетроники 1501 и 150R1. В каче-стве двухкомпонентных композиций разные анало-ги в разных комбинациях смешивали и испытывали на ова-специфическую индукцию ЦТЛ. Они явля-ются смесью холестерин-твин 80, сквалан-твин 20, пристан-твин 80 или оливковое масло-твин 80. Для изучения стабилизации микрофлюидизированную смесь сквалан-твин 80 смешивали с декстрозой до конечной концентрации 5%. Во всех случаях ком-бинации наполнителей смешивали в микрофлюиди-заторе для получения стабильной эмульсии. В не-которых экспериментах двухкомпонентные компо-зиции смешивали с разными концентрациями МДП для индукции иммунного ЦТЛ-ответа и гумораль-ного иммунного ответа. В таблице 1 приводится исчерпывающий список различных композиций, используемых в этом исследовании.
Композицию адъюванта синтекс (микрофлюи-дизированная; SAFm) использовали в качестве адъювантного контроля, она состоит из двух ча-стей. Часть 1 состоит из забуференного фосфатом солевого раствора, содержащего как конечную концентрацию 5% сквалана, 1,25% плуроника и 0,2% твина 80 (наполнитель или l-SAF). Часть II состоит из N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изо-глутамина (Thr-МДП), производного компонента стенок клеток микобактерий. Для целей иммуниза-ции антиген смешивают с микрофлюидизирован-ным наполнителем (часть 1) для получения гомо-генной эмульсии. В приготовленную микрофлюи-дизированную композицию адъюванта синтекс (SAFm) добавляют МДП и смесь недолго интенсив-но перемешивают. Концентрацию МДП в смеси изменяют для определения, была ли достигнута оптимальная его концентрация для ЦТЛ-индукции. В качестве адъювантного контроля мышей также иммунизировали растворимыми антигенами, сме-шанными с квасцами в соответствии с инструкцией производителя (Pierce Chemical, Rockford, IL) или с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ).
Эту композицию антигена используют для ин-дукции цитотоксического Т-лимфоцитного иммун-ного ответа у мышей. Обычные специалисты в дан-ной области должны признать, что такая мышиная модель является показателем того, что эквивалент-ные эксперименты или способы лечения будут подобным образом индуцировать цитотоксический Т-лимфоцитный иммунный ответ у людей, домаш-них или сельскохозяйственных животных. Количе-ство композиции антигена и антигена, полезное для прoдуцирования желательной клеточного иммун-ного ответа можно определить эмпирически стан-дартными способами, хорошо известными специа-листам в данной области, без дополнительного экспериментирования. Таким образом, если жела-тельно снизить до минимума побочное действие при лечении такой смесью, специалисты в данной области могут определить минимальный уровень такой смеси для введения человеку, домашнему или сельскохозяйственному животному для вызывания иммунного ЦТЛ-ответа и, таким образом, индуци-рования иммунитета к желаемому антигену. При обычном использовании такую смесь нужно инъ-ецировать любым одним из ряда стандартных ме-тодов, но, в частности, предпочтительна локальная внутримышечная инъекция, которая позволит эмульсии оставаться в стабильной форме в течение периода нескольких дней или нескольких недель.

Способы
В представленных ниже примерах использо-вали следующие материалы и способы, если нет других указаний:
Мыши
Самок мышей С57В/6 (Н-2d) и BALB/c (Н-2 d) покупали у Harlen Sprague (San Diego, California).
Антигены
Овальбумин (ова, copт VII, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) использовали в нативной форме, -галактозидазу (-гал, сорт VIII; BRL) использо-вали в нативной форме и после кипячения в 1 М NaOH в течение 2 мин для проведения щелочного гидролиза. Рекомбинантный gp120 покупали у American Biotechnology.

Опухолевые клетки и трансфектанты
Использованные опухолевые клетки были Ia--линиями EL4 (C57BL/6, тимома Н-2 b) и Р815 (DBA/2, мастоцитома Н-2d). Получение производ-ного ова-продуцирующего трансфектанта EL4, EG7-ова, описано ранее Moore et al., 54 Cell 777, 1988.
-Гaл-продуцирующий трансфектант, Р13.1, получали электропорацией 107 P815-клеток в 1 мл забуференного фосфатом соляного раствора с 10 мг линеаризованного при помощи Pstl pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscatway, NJ) и 1 мг линеаризованного при помощи Pvul pSV2 neo (Southern et al. 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982) с последующей селекцией в 400 мкг/мл антибиотика G418. СЗ-4-Трансфектант получали из гибридомы IgM 662 BALB/c трансфекцией плазмидой, коди-рующей ген -гaл, слитый с третьим и четвертым экзоном тяжелой цепи IgM (Rammensee et al., 30 Immunogenetiсs 296. 1989). Фибробласт 3Т3, экс-прессирующий gp160IIIb, 15-12, был получен Dr. Germain NIH (Bethesda. MD). К b-трансфектированная L-клеточная линия была предоставлена Dr. Carbone, Monash University, Australia. Dd и L d-трансфектированные L-клеточные линии были предоставлены Dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis.
Иммунизация
Мышей иммунизировали внутривенно 200 мкл суспензии 25•106 спленоцитов после цитоплазма-тической загрузки, как описано Моoreе et аl., смот-ри выше, и Carbone et al. J. Ехр. Med. 169:603, 1989). Для иммунизации композицией ова-антиген или композицией -гaл-антиген 30 мкг каждого белкового антигена инъецировали каждой мыши подкожно в подушечку лапы и основу хвоста. Каждая инъекция состояла из 67 мкл микрофлюи-дизированной антигенной композиции (приготов-лена в соответствии со стандартными способами) и 30 мкг белкового антигена в конечном объеме 200 мкл. Конечный объем устанавливали при помощи ССРХ (сбалансированный солевой раствор Хенка), смотри руководство Whittaker (Welkersville, MD). МДП вводили в концентрациях от 0 до 300 мкг. Там, где сообщается, мышей иммунизировали рас-творимыми антигенами в ПАФ или квасцах в общем объеме 200 мкл.
Стимуляция in vitro популяций клеток-эффекторов
Клетки селезенки (30•106) нормальных или иммунизированных мышей, которые были прими-рованы по меньшей мере за 14 дней ранее, инкуби-ровали с 1,5•106 EG7-ова (облученные 20000 рад) для ова-иммунных ответов или с 1,5•106 С3-4-клетками (облученные 20000 рад) для иммунного -гaл-ответа в планшетах на 24 лунки при 37°С в среде 7% СО2/воздух. Все культивирования тканей выполняли в полной среде, состоящей из среды Дульбенко, модифицированной по способу Исков (IМDМ), смотри Whittaker Manual (Welkersville, MD), дополненной 10% фетальной телячьей сыво-роткой (FSC), 2 мМ глутамина, гентамицином и 2•10-5 М 2-меркаптоэтанола. Для экспериментов с истощением in vitro праймированные in vivo или стимулированные in vitro клетки селезенки обраба-тывали моноклональными антителами (mAbs) RL. 172 (анти-CD4) или mABs 3,168 (анти-CD8) для удаления CD4+ или СD+-Т-клеток (Sarmiento et al., 125 J. Jmmunol. 2665, 1980, and Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). mAb RL.172 и mAb 3,168 получа-ли от Dr. Jonathan Sprent et Scripps Clinic and Re-search Foundation, La Jolla, CA.
Клетки селезенки (30•106) нормальных или иммунизированных мышей, которые были прайми-рованы по меньшей мере на 21 дней ранее, инкуби-ровали с 1,5•106 клетками 15-12 (обработанные 200 мкг митомицина С в течение 45 минут на 108 клеток) или с
500 мкг пептида 18IIIb, содержащего доми-нантный эпитоп ЦТЛ в мышах Balb/c, в полной IMDM-среде (lrvine Scientific, Santa Ana, СА), со-держащей 10% предварительно подвергнутой скринингу FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 мM глутамина, гентамицина и 2•105 М 2-меркаптоэтанола. Для стимуляции in vitro пептидами клетки селезенки культивировали в полной IMDM-среде, содержащей 5% супернатан-та конканавалина А (СоnА).
Для экспериментов с истощением праймиро-ванные in vitro или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали mAbs RL.172 (анти-CD4) или mAbs 3.168 (анти-CD8) в присутствии малоток-сичного кроличьего комплемента (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canada) для уда-ления CD4+ или СD8+-Т-клеток (22, 23). (mAbs) RL.172 и mABs 3.168 были подарены Dr. Jonathan Sprent et Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA).
Испытания на цитотоксичность
Клетки-мишени (1•106) метили 100 мкКи [51Сr]-хромата натрия в течение 60 мин. Для “обученных” пептидом мишеней (комитированных лимфоцитов) во время мечения мишеней 51Сr добавляли 50 мкл пептидного раствора 1 мг/мл в ССРХ. После про-мывания 10 4 меченых мишеней и продукты серий-ного разведения клеток-эффекторов инкубировали в 200 мкл RP10 в течение 4 ч при 37°C. Собирали 100 мкл супернатанта и специфический лизис определяли следующим образом: Процент специ-фического лизиса = 100 х (выделение посредством ЦТЛ самопроизвольное выделение)/(максимальное выделение самопроизвольное выделение). Само-произвольное выделение в отсутствие цитотокси-ческих Т-лимфоцитов (ЦТЛ) было <25% макси-мального выделения детергентом во всех экспери-ментах.
Определение гуморального иммунного ответа у мышей и обезьян.
Каждую лунку планшетов на 90 лунок с U-образным дном (Costar, Cambridge, МА) покрывали 150 нг ova или gr120 в 50 мкл ССРХ и инкубирова-ли в течение ночи при 4 С. Для определения гумо-ральных иммунных ответов против gp120 и против ova у мышей планшеты блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином ВSА в течение 1 часа. Серийно разведенные сыворотки добавляли в объ-еме 25 мкл на лунку и инкубировали в течение 2 часов. Планшеты промывали и добавляли на лунку 50 мкл разведенного 1:1000 антимышиного козли-ного IgG, конъюгированного с HRPO (SBT, Alabama), в 1% BSA. После 1 часа инкубирования планшеты промывали и на лунку добавляли 100 мкл субстрата. ОD405 проводили через 10-15 минут. Для определения гуморального иммунного ответа как образование обезьяньих антител против gp120 все указанные стадии, за исключением как блоки-рования планшетов, так и разбавления сыворотки, проводили в 5% нормальной козьей сыворотке в сбалансированном солевом растворе Хэнкса.
Синтез пептидов
Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 253-276 (Последовательность 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; где стандарт-ный однобуквенный код используют для обозначе-ния каждой аминокислоты) овальбумина (ova 253-276), аминокислотным последовательностям 84-102 миелинового базового белка (МВР 84-102) (Последовательность 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP) и синтетические пептиды, соответствующие амино-кислотным последовательностям 308-322 (18IIIb-последовательность) gp120IIIb, были “собраны” твердофазным пептидным синтезом с использова-нием синтезатора Applied Biosystems 430А. Амино-кислоты связывали через предварительно образо-ванные симметричные ангидриды, за исключением аспарагина, глутамина и аргинина, которые связы-вали в виде сложных эфиров гидроксибензотриазо-ла. Эффективность связывания контролировали нингидриновой реакцией по методу Kaiser et al., 34 Anal. Biochim. 595, 1970. Пептиды выделяли из подножки при помощи HF после процедуры “низ-кий-высокий”, описанной Tam, et al., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, и экстрагировали из смолы 10% уксусной кислотой. После лиофилизации пеп-тиды обессоливали на колонке с сефадексом G-25 и пробы пептидов затем очищали ЖХВР хромато-графией с обращенной фазой на препаративной колонке С-18 Vydac. Очищенные пептиды (98%) растворяли в ССРХ при конечной концентрации 10 мг/мл и разбавляли до желаемой концентрации в полной среде.
Гидролиз CNBr
Пробы белка (например, -галактозидазы) об-рабатывали 100-кратным молярным избытком бромида циана в растворе 100 мM трифторуксус-ной кислоты. Реакцию проходила в течение 18 часов при комнатной (около 20°C) температуре при перемешивании. После прохождения предписанно-го времени реакции пептидные фрагменты отделя-ли от реагента, используя аппаратуру SEP-PAK С-18 (Waters), элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизовали.
Гидролиз щелочью
Образцы белков
(например, -галактозидазы) обрабатывали 1 н NaOH и кипятили в течение 2 минут и получаемые пептидные фрагменты отделяли от реагентов, ис-пользуя аппаратуру С-18 SEP-PAK (Waters), и элю-ировали 95% ацетонитрилом и лиофилизовали.
Пример 1: Примирование рестриктированных (по классу) I ЦТЛ
Moore et al., 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 and Carbone and Bevan. 171 J. Exp. Medicine 377, 1990, показывают, что мыши, иммунизирован-ные клетками селезенки, заполненными цитоплаз-матически растворимым овальбуцином, были праймированы для ова-специфического иммунного ответа в виде рестриктированных по классу I ЦТЛ. Ова-экспрессирующий EL4-трансфектант EG7-ova использовали для стимуляции in vitro примирован-ных in vivo лимфоцитов селезенки и использовали также в качестве мишени для ова-специфического ЦТЛ-медиированного киллинга. Это исследование показывает также, что CD8 +-эффекторы, индуци-рованные EG7-ова-трансфектантом или клетками селезенки, цитоплазматически загруженными ова, распознают детерминанту, картированную пепти-дом ова 258-276 в контексте Н-2Кb, лизируют EG7-ova и нейтрализуют также клетки EL4, покрытые ова 258-276. Таким образом, чтобы оценить, может ли эндогенный путь по рестриктированным (по классу I) CD8 8-Т-клеткам быть индуцирован рас-творимым антигеном, указанную выше систему использовали для определения, можно ли обычные антигенные композиции использовать для введения растворимого антигена в рестриктированный путь класса I.
a) oвa(ova)
Мышей С57BL иммунизировали один раз раз-личными количествами ova (30 мкг - 1 мг на мышь) с использованием антигенной композиции или без нее. Мышей инъецировали подкожно и в основание хвоста. Клетки селезенки отбирали у иммунизиро-ванных мышей по меньшей мере через две недели после иммунизации и in vitro стимулировали трансфектантами EG7-ova. Концентрация до 30 мкг была так же эффективна, как доза 1 мг. Поэтому исследования ЦТЛ, как обычно, проводили с клет-ками селезенки мышей, примированных от 30 мкг ova. После культивирования с EG7-ova in vitro в течение пяти дней примирование оценивали по присутствию ova-специфических эффекторов, спо-собных лизировать EG7-ova.
Мыши, инъецированные растворимым ova в СCPX вплоть до 1 мг, не продемонстрировали до-казательства примирования ЦТЛ (фиг.1а). Однако мыши, иммунизированные 30 мкг ova в антигенной композиции, описанной выше (на фигурах показана как АК), показали значительный трансфектант-специфический иммунный ЦТЛ-ответ (фиг.1с). Кро-ме того, степень киллинга EG7-ova клетками селе-зенки. иммунизированными ova-AK, была сравнима со степенью киллинга ova-наполненными клетками селезенки иммунизированных мышей (фиг.1b).
То что специфичность ЦТЛ-примирования in vivo была антиген-специфичной, было показано неспособностью клеток селезенки иммунизирован-ных -галактозидазой мышей проявлять вторичный иммунный ЦТЛ-ответ in vitro при стимуляции EG7-ova. Не наблюдали индукцию ова-специфических ЦТЛ.
b) -галактозидаза
Похожие результаты получали с использова-нием другого растворимого белкового антигена, -гaл. Для анализа -гaл-специфичного иммунного ЦТЛ-ответа используемой мишенью был получен-ный из мышей BALB/c -гал-зкспрессирующий С3-4-трансфек-тант. Иммунизация мышей BALB/c растворимым -гaл давал фоновый иммунный ЦТЛ-ответ. Поэтому для определения специфического иммунного ЦТД-ответа сбор был отсрочен по меньшей мере на восемь недель до того, как лимфо-циты селезенки были собраны и культивированы в течение пяти дней в присутствии облученных С3-4-трансфектантов.
Фиг. 2b показывает, что 30 мкг -галактозидазы в АК индуцировали сильный специ-фический иммунный ЦТЛ-ответ против трансфек-танта. При отношении эффектора к мишени (Э:М) 3:1 иммунизированные -гал-АК мыши показали около 80% специфического киллинга С3-4. Тем не менее, только 20% киллинга той же мишени дости-гали эффекторами, выделенными из мышей, имму-низированных -гaл в CCPX, при таком же отноше-нии Э:М (фиг.2а). Поскольку ни EL4, ни Р815 не экспрессируют продукты гена МНС класса II и лизис показывает сингенную рестрикцию, эти ova- и -гал-специфические эффекторы являются ре-стриктированными ГКГ класса I.
Для демонстрации полезности антигенной композиции мышей иммунизировали растворимым ова, капсулированным в два типа липосом, один из которых был рН-чувствительной липосомой. Через одну неделю клетки селезенки стимулировали in vitro, как описано выше, и испытывали по сравне-нию с 51Сr-меченым EG7-ova или EL4. Фиг.3 пока-зывает характерный результат, демонстрирующий, что ova в липасоме не может примировать мышей для заметной индукции иммунного ЦТЛ-ответа. Похожие результаты наблюдали, когда для имму-низации использовали ova в квасцах.

Пример 2: Распознавание эпитопа ЦТЛ
Carbone and Bevan, смотри выше, показали, что ЦТЛ, индуцированные в мышах C57BL/6 трансфектантом EG7-ова и цитоплазматически ова-нагруженными спленоцитами, распознают клетки EL4, покрытые пептидом ова 258-276. Для опреде-ления того, индуцирует ли растворимый овальбу-мин в АК похожие иммунные ЦТЛ-ответы, клетки селезенки получали от иммунизированных мышей и стимулировали in vitro EG7-ова. Эффекторы ис-пытывали против клеток EL4, покрытых пептидом 253-276 ова или контрольным пептидом, получен-ным из базального белка миелина (ББМ 84-102). Результаты показывают, что ова-АК праймировали ЦТЛ со специфичностью, подобной специфичности ЦТЛ, праймированных трансфектантами, или ци-топлазмически наполненных ова (фиг.1а, 1b и 1с). Клетки-эффекторы, праймированные ова-АК, эф-фективно лизировали EG7-ова и нетрансфектиро-ванные EL4-клетки, покрытые 50 мкг/108 клеток ова-пептида, но не лизировали EL4-клетки, покры-тые 50 мкг/108 клеток ББМ-пептида.
Carbone and Bevan, смотри выше, указывали, что в -галактозидазной системе -гал-экспрессирующий трансфектант и спленоциты, цитоплазматически нагруженные растворимой.
-галактозидазой, индуцировали ЦТЛ, кото-рые лизировали -гал-экспрессирующий трансфек-тант и нетрансфектантные клетки Р815, покрытые гидролизованной щелочью -галактозидазой. Рас-творимая -галактозидаза индуцирует ЦТЛ, имею-щие специфичность, схожую со специфичностью ЦТЛ при иммунизации в АК (фиг.2).

Пример 3: Эффекторы ЦТЛ являются CD8 8-Т-клетками.
То что растворимые белковые антигены в АК индуцируют CD8+-эффекторы-Т-клетки, было пока-зано следующим образом. Спленоциты от иммуни-зированных мышей культивировали в течение пяти дней с облученными трансфектантами in vitro. По-сле этого времени клетки собирали и истощали на CD4+- или CD8+-Т-клетки, используя моноклональ-ные антитела против CD4 или CD8 плюс компле-мент. Истощенные популяции испытывали по срав-нению с 51Cr-EG7-oвa в ова-системе или 51Сr-Р13.1 в -гaл-системе. Данные, показанные на фиг.4, ука-зывают, что в ова-системе истощение Т-клеток на CD8 отменяет цитотоксическую активность, при-своенную всей популяцией клеток-эффекторов. Тем не менее, истощение популяции Т-клеток на CD4 + не оказывает действия на лизис EG7-ова.
Аналогично в -гал-системе обеднение Т-клеток на CD8+ отменяет цитолитическую актив-ность клеток селезенки, иммунизированных -гал-антигенной композицией.

Пример 4: Растворимый ова в AF примирует CD8 +-Т-клетки
Для демонстрации того, что система ова-АК примирует популяции CD8 +-Т-клеток in vivo и что она критическая для вторичной иммунной реакции in vitro, селезенки иммунизированных ова-АК мы-шей и нативных мышей истощали на популяции CD4 4 и CD8 8. Эти обработанные популяции затем стимулировали in vitro только EG7-ова или EG7-ова в комбинации с CD4+ и CD8 +-Т-клетками мышей, иммунизированных ова-АК, или с различными комбинациями CD4 + или CD8+-Т-клеток мышей. иммунизированных ова-АК, с CD4+ и CD8 +-клетками нативных мышей. Фиг. 5 показывает, что праймированные CD8 +-клетки важны для проявле-ния вторичного иммунного ЦТЛ-ответа in vitro. Эти данные показывают также, что для эффективного вторичного иммунного ЦТД-ответа in vitro требу-ются CD4 +-Т-клетки. CD4+-Т-клетки не нужны для примирования. Аналогично, CD8 +-Т-клетки были нужны для демонстрации -гaл-специфического вторичного иммунного ЦТЛ-ответа in vitro.
Приведенные выше примеры показывают вли-яние антигенной композиции на индукцию иммун-ного ответа в виде рестриктированных по классу I ЦТЛ против растворимых белковых антигенов. Медиированный антигенной композицией раство-римый антиген индуцировал примирование ЦТЛ и оно сходно по активности с примированием, инду-цированным трансфектантами и спленоцитами, цитоплазматически нагруженными растворимым ова или -гал. В овальбуминовой системе, EG7-ова, цитоплазматически нагруженные ова спленоциты и ова-АК индуцировали: (а) рестриктированные СD8+-ЦТЛ класса I; (b) ЦТЛ, которые распознают мишень, сенсибилизированную синтетическим пептидом ова 253-276, и (с) долгоживущие ЦТЛ только после одной иммунизации. В -галактозидазной системе -гaл-АК индуцировал ЦТЛ, которые распознают -гал-экспрессирующий трансфектант С3-4 и также нетрансфектированные клетки Р815, сенсибилизированные -гaл, гидроли-зованный щелочью. То есть аналогично тому, что наблюдали с ЦТЛ, индуцированными иммунизаци-ей клетками селезенки, цитоплазматически загру-женными -галактозидазой. Индукция ова-специфических ЦТЛ антигенной композицией не-обычна, поскольку ни ова, капсулированный в рН-чувствительную липосому, ни квасцы не могут индуцировать примирование ЦТЛ in vivo.
Эти примеры показывают, что используемая выше антигенная композиция и ее эквиваленты, полезные в терапии человека и в разработке вакци-ны для индукции ЦТЛ в разных видах рака и ви-русных болезнях.

Пример 5
Это специфический пример для показа исполь-зования вышеуказанной АК для продуцирования рестриктированных ЦТЛ класса I, праймируемых растворимым gp120 из ВИЧ.
Экспрессирующая gp120 IIIВ-клеточная ли-ния (15-12) была продуцирована в полученной из фибробластов мышей Balb/c клеточной линии 3Т3. Ее получали от Drs. Ron Germain and Jay Berzofsky, National Institute of Health, Bethesda, M. D. Экс-прессирующую gp160 клеточную линию использо-вали для стимуляции in vitro примированных in vivo лимфоцитов селезенки и использовали также в ка-честве мишени для индукции gp160-специфичных ЦТЛ. Мышей Balb/c иммунизировали один раз 10 мкг gp160 на мышь с АК или без нее. Мышей инъ-ецировали в подушечки лапок и основание хвоста подкожно. Клетки селезенки брали у иммунизиро-ванных мышей через две недели после иммуниза-ции и стимулировали in vitro облученными gpl60-трансфектантами. После пяти дней культивирова-ния in vitro примировали оценивали по присут-ствию специфических эффекторов, способных ли-зировать gp160-трансфектанты, но не нетрансфек-тированные клеточные линии. Результаты приво-дятся на фиг.7, где иммунные ЦТЛ-ответы потенци-ировали АК и gr120.
Следующий пример демонстрирует использо-вание антигенных композиций этого изобретения с использованием только одного или двух компонен-тов. Эти примеры показывают, что иммунные ЦТЛ-ответы можно индуцировать только двумя из ука-занных выше трех компонентов.

Пример 6: Определение критических компо-нентов, необходимых для индукции ЦТЛ
Для определения того, все ли указанные выше компоненты необходимы для индукции антиген-специфичных ЦТЛ, мышей иммунизировали оваль-бумином в микрофлюидизированной композиции различных комбинаций двух из трех компонентов, присутствующих в указанных выше АК. Использу-емые комбинации двух компонентов были следую-щими: сквалан/твин в РВS, сквалан/плуроник в PBS или плуроник/твин в фосфатно-буферном растворе. Включали другую серию групп, где мышей имму-низировали ова в однокомпонентной композиции, т.е. композиции только сквалана в фосфатно-буферном растворе, плуроника в РBS или твина в фосфатно-буферном растворе. Указанную выше трехкомпонентную антигенную композицию моди-фицировали для исключения одного компонента, одновременно заменяя его на фосфатно-буферный раствор.
Указанные выше антигенные композиции со-стоят из:
0,300 г твина 80 (Aldrich. WI). 1.875 г плурони-ка L121 (BASF, NJ) и 7,5 г сквалана (Aldrich, WI), объем композиции доводили до 50 мл добавлением фосфатно-буферного раствора.
Двухкомпонентные композиции были:
Сквалан/твин: 0,300 г твина 80 и 7,5 г сквала-на, объем композиции доводили до 50 мл добавле-нием фосфатно-буферного раствора.
Плуроник/твин: 1,875 r плуроника L121 и 0,300 г твина 80, объем композиции доводили до 50 мл добавлением фосфатно-буферного раствора.
Плуроник/сквалан: 1,875 г плуроника L121 и 7,5 г сквалана, объем композицию доводили до 50 мл добавлением фосфатно-буферного раствора.
Образцы затем пропускали через микрофлюи-дизатор, модель 110Т, Microfluidics сorp., разливали по сосудам и хранили при 4 С до использования.
Овальбумин (Sigma, МО) взвешивали и полу-чали раствор его концентрации 0,3 мг/мл в ССPX (Whittaker, смотри выше). Исходный раствор 0,3 мг/мл комбинировали с двухкомпонентной компо-зицией в следующих количествах: 5 частей раство-ра овальбумина концентрации 0,3 мг/мл, 3,3 части двухкомпонентной композиции и 1,7 части ССРХ.
Композицию интенсивно перемешивали и вы-держивали на льду до инъецирования. Все раство-ры смешивали непосредственно перед инъекцией.
Каждая мышь получала 200 мкл одной компо-зиции, содержащей 30 мкл ова, инъекцией в поду-шечки обеих задних лап и любое оставшееся коли-чество раствора инъецировали подкожно в основа-ние хвоста. Мышей оставляли для отдыха в тече-ние от двух до четырех недель до отбора клеток селезенки.
Через две недели после иммунизации получа-ли клетки селезенки и стимулировали in vitro облу-ченным EG7-ова. Через пять дней после культиви-рования присутствие ова-специфических ЦТЛ из-меряли испытанием по сравнению с 51Cr-EG7-oвa или
51Cr-EL4 в 4-часовом анализе на выделение 51Сr. Результаты, показанные на фиг.8-10, демон-стрируют, что овальбумин в композиции микро-флюидизированной двухкомпонентной системы может примировать ова-специфические ЦТЛ in vivo.
Мы далее оценивали относительный вклад индивидуальных компонентов в их способность индуцировать ЦТЛ при комбинировании с белко-выми антигенами. Для целей иммунизации раство-римый антиген смешивали с микрофлюидизиро-ванными наполнителями для получения стабиль-ной гомогенной эмульсии с пределами размера частиц 250-300 нм. Для дальнейшего определения компонентов композиции сквалан-твин 80-плуроник (СТП), ответственных за индукцию ЦТЛ, иммунизировали мышей ова в смеси сквалан-твин 80 (СТ), смеси плуроник-твин 80 (ПТ) или смеси сквалан-плуроник (СП) и в качестве контроля в сквалане (С), твине 80 (Т) или плуронике (П). Мы-шей также иммунизировали ова-SAFm (содержал 70 мг МДП) или ова-квасцы в качестве адъювант-ного контроля. Для положительного контроля мы-шей иммунизировали клетками селезенки, цито-плазматически наполненными растворимым ова. Использовали также другие комбинации и замеще-ния, результаты приводятся в таблице 1.
Для определения примирования ЦТЛ мышей иммунизировали один раз. Через две недели после иммунизации клетки смешивали с облученными EG7-ова (ова-экспрессирующими EL4-клетками) в течение пяти дней и тестировали по сравнению с 51Сr-ЕG7-ова или 51Сr-ЕL4-клетками. Результаты (фиг.11) показывают, что 30 мкг ова в комбинации с СТП или СТ примируют иммунный ответ рестрик-тированных по классу 1 ЦТЛ в мышах. Примиро-вание ова-специфических ЦТЛ ова в СТП или ова в СТ, по-видимому, лучше, чем примирование, инду-цированное клетками селезенки, цитоплазматиче-ски загруженными растворимым ова. Ова в ПТ или в СП может индуцировать ова-специфичный им-мунный ЦТЛ-ответ у мышей, но ответ нестойкий и недостаточный. Подобно SAFm, добавление МДП в композицию СТ не компрометирует ова-специфическую индукцию ЦТЛ у мышей (таблица 2). Никакой ова-специфической индукции ЦТЛ не было, когда мышей индуцировали ова в смеси с индивидуальными компонентами С, П или Т, ни когда мышей иммунизировали ова-SAFm или ова-квасцы. Мыши, иммунизированные вплоть до 1 мг ова в (а) ССРХ, в (b) SAFm или (с) адсорбированно-го на квасцах, не примировали ова-специфичные ЦТЛ.

Пример 7: Компоненты, необходимые для продуцирования ова-специфических антител
Мыши были иммунизированы три раза с ин-тервалами две недели 30 мкг ова в CCPX, СТП, СТ, ПТ или СП. В качестве положительного контроля мыши были иммунизированы ова-SAFm, так как известно, что SAFm индуцирует сильный гумо-ральный иммунный ответ. Через семь дней после второй и третьей иммунизации мышам делали кро-вопускание и сыворотку испытывали на ова-специфичный гуморальный иммунный ответ. Ре-зультаты приводятся в таблице 3. Они показывают, что мыши, иммунизированные ова в СТП, СР или в SAFm, показывают похожие гуморальные иммун-ные ответы против ова после двух иммунизаций.

Пример 8: Индукция ЦТЛ, специфических для gp120 BИЧ
Gp120 IIIB BИЧ использовали в качестве вто-рой антигенной системы для определения индукции ЦТЛ в СТП, СТ или в МП-Т. Мыши были иммуни-зированы 1 мкг gp120 IIIb в ССРХ, СТП, РТ или в СТ. В качестве контрольных опытов мыши были иммунизированы 1 мкг gp120 IIIb в SAFm или ПАФ (полный адъювант Фрейнда) или в RIBI-адъювантной системе, содержащей МФЛ (моно-фосфориллипид А) и ДМТ (димиколит трегалозы). Через три недели после иммунизации приготовляли клетки селезенки и стимулировали in vitro обрабо-танными митомицином клеткам и-трансфектантам и 15-12 или пептидом 18IIIb. После пятидневного культивирования получаемые клетки-эффекторы испытывали по сравнению с коровьей оспой: gp160 IIIВ или родоначальными инфицированными коро-вьей оспой клетками Р815 в качестве мишеней. Результаты показывают, что композиция gp120-сквалан-твин 80 и композиция не gp120-сквалан-твин 80-плуроник или gp120-ССРХ индуцировали gp120-специфический иммунный ЦТЛ-ответ у мы-шей (таблица 4).

Пример 9: Индукция gr120-специфического гу-морального иммунного ответа у мышей
Для индукции gp12-специфических гумораль-ных иммунных ответов мыши были иммунизирова-ны 1 мкг gp120IIIb три раза с интервалами две недели. Животным пускали кровь и испытывали на присутствие антител IgG, детектирующих gp120IIIb, анализом ELISA. Результаты показыва-ют, что gp120-CT является лучшим иммуногеном, чем gp120-ССРХ, gp120-SAFm (таблица 5) или gp120-СТП.

Пример 10: gp120-специфические гумораль-ные иммунные ответы у обезьян
Обезьяны (две на группу) были иммунизиро-ваны gp120-SAFm, gp120-СПТ, gp120-CT или gp120-CCPX. В качестве контроля группу обезьян иммунизировали рекомбинантной коровьей оспой, содержащей gp160 IIIb. Обезьян иммунизировали с интервалами две недели и кровь отбирали через две недели и три недели после второй иммуниза-ции. Пре- и иммунную сыворотки каждой обезьяны серийно разбавляли и анализировали на актив-ность против gp120 по ELISA, как описано в мате-риалах и способах. Данные (фиг.12) показывают, что обезьяны, иммунизированные gp120-СТП или gp120-SAFm, индуцировали схожие иммунные ответы. Одна обезьяна, иммунизированная зр120-СТ, индуцировала гуморальный иммунный ответ против gpl20, похожий на ответ группы, иммунизи-рованной gp120-SAFm или gp120-СПТ. Одна обезь-яна, иммунизированная gp120-CT, индуцировала сильный гуморальный иммунный ответ против gp120 после двух иммунизаций.

Пример 11: Активность АК in vivo в комбина-ции с белком Е7 16 BИЧ
1. Генерация рекомбинантного белка Е7 16 BИЧ для иммунизации
а) PCR и клонирование гена Е7
Ген Е7 16 BИЧ клонировали из плазмиды, по-лученной от Dr. Raren Vousden (Ludwig Institute), кодирующей ген Е7, полученной из клеточной ли-нии карциномы CaSki. Кодирующие области были амплифицированы PCR с использованием прайме-ров, которые кодируют 5'- и 3'-концы генов, флан-кированных клонирующими сайтами Bam НI и SaI I. Продукт Е7 PCR лигировали в экспрессирующий вектор pGEX - 4T-1 (Pharmacia Biotech), получая экспрессирующую плазмиду pGEX. Е7. Штамм Е. Coli XLI - голубой (стратаген) трансфектировали экспрессирующей плазмидой pGEX. Е7. Последо-вательность Е7 получали из плазмид образующих-ся колоний, она была идентична последовательно-сти Е7, полученной из клеток CaSki.
b) Получение и очистка бактериально экс-прессированного Е7
Бактериальная экспрессирующая плазмида pGEX. Е7 кодирует слитый белок глутатион-S-трансферазы (GST), состоящий из GST у аминокон-ца, сайта расщепления тромбинпротеазы и белка Е7 у карбоксиконца. Белок Е7 получали и очища-ли, как описано в информационной литературе к продукту от производителя вектора pGEX-4T-1 (Pharmacia Biotech). Говоря кратко, бактерии, со-держащие вектор экспрессии pGEX. Е7, индуциро-вали для экспрессии слитого белка добавлением в культуральную среду изопропил--D-тиогалактозидазы. Клетки собирали и лизировали мягкой ультразвуковой обработкой. Лизат вводили в глутатионсефарозу 4В (Pharmacia Biotech). После связывания слитого белка с матрицей смолу про-мывали для удаления неспецифически связанных белков. Связанный слитый белок гидролизовали тромбином для выделения белка Е7 из слитого белка глутатион-S-трансферазы (GST).
Препарат белка Е7 анализировали SDS-PAGE и концентрацию белка Е7 определяли анализом Bradforda (BioRad). На литр бактериальной куль-туры получали 9 мг растворимого белка Е7.
2. Генерация трансфектанта Е7 Х21
Кодирующие последовательности для белка HPV16 Е7 (смотри выше) были встроены в патенто-ванную IDEC эукариотическую экспрессирующую плазмиду INPEP4. В пределах этого вектора экс-прессия Е7 контролировалась промо-тор/энхансерными транскрипциональными эле-ментами цитомегаловируса. Кроме того, первые три нуклеотида кодирующей последовательности Е7 были удалены и заменены лидерной последова-тельностью легкой цепи иммуноглобулина, поме-щенной непосредственно против входа (слева) и в рамки считывания с кодирующим районом Е7. После трансфекции в мышиную клеточную линию Х21 отдельные G418-резистентные клоны испыты-вали при помощи нозерн-блоттингов на образова-ние матрицы Е7. Каждый клон обнаруживал детек-тируемую матрицу Е7. Затем выполняли вестерн-блоттинг клеточных лизатов двух из этих клонов, 4Е7 и 1С7 (HOPE1 и НОРЕ2 соответственно) и по-казали образование белка Е7.
3. Активность in vivо иммунизации раствори-мым антигеном Е7/АК
В этих исследованиях использовали самок мышей фона С3Н (Н2к/к, Harlan Sprague Dawley). Животных содержали в соответствии с “Руковод-ством для наблюдения за лабораторными живот-ными и их использованию” (DHHS Publication No. NIH 86-23, Bethesda, MD:NIH, 1985), они получали корм и воду по потребности. В этих исследованиях использовали трансфекцированную Е7 клеточную линию (НОРЕ2 Н2к/к). Опухолевую клеточную ли-ния сохраняли серийным пассированием in vitro.
Было показано, что эта клеточная линия со-храняет E7-цитоплазматическую антигенную экс-прессию, определяемую анализом вестерн-блоттингом, после повторения пассивировании in vitro. Опухоли инициировали у сингенных мышей С3Н подкожной инъекцией 150000 пассированных in vitro клеток.
Опухоли измеряли в двух перпендикулярных направлениях с интервалами в две недели. Объем опухоли (V) рассчитывали в соответствии со сле-дующей формулой:
V(мм3) = (L х W2), деленная на 2,
где L - длина самой длинной оси, изморенной в мм; W - длина перпендикулярной оси (мм).
Данные в таблице 6 представляют как опухо-левые мыши (число имеющих опухоли животных по сравнению с общим числом инъецированных животных). Данные на фиг.13 и 14 представляют как средний размер опухоли (мм3) каждой обрабо-танной или контрольной группы. Каждую обрабо-танную группу сравнивали с контрольной группой, которая не получала лечения. Терапию начинали через 10 дней после инокуляции клеток НОРЕ2, когда основная часть опухолей была пальпируе-мой (приблизительно 50-75 мм2). Терапию иниции-ровали иммунизацией мышей растворимым белком Е7 в АК или квасцах-адъювантах (подкожно при общем объеме 0,2 мл). Непосредственно перед им-мунизацией АК смешивали в течение 60 секунд с белком Е7 в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (ССРХ), так чтобы каждая мышь получала либо 30 мкг, либо 90 мкг белка Е7 в 0,2 мл. Квасцы (Pierce Chemical Со.) смешивали с белком Е7 в со-ответствии с инструкциями по приготовлению, так чтобы каждое животное получало 90 мкг белка Е7 в 0,2 мл. Животные в группе второй обработки получали вторую иммунизацию через 9 дней (19 дней после инокуляции опухолевых клеток). Бу-стер-иммунизацию проводили непосредственно перед инокуляцией, как описано выше.
В этом примере (таблица 6: Хр #233) через 41 день после инокуляции опухолевых клеток только 4/8 и 5/8 мышей, получивших одну инъекцию рас-творимого Е7 в АК (30 мкг или 90 мкг соответ-ственно), имели измеримые опухоли. Напротив, все из мышей, иммунизированных белком Е7 в квасцах (8/8) имели активно растущие опухоли. Дополни-тельно, как показано на фиг.13, значительное инги-бирование роста опухоли наблюдали только в группах обработки, иммунизированных белком Е7 в АК, по сравнению с контрольными (необработан-ными) или обработанными квасцами группами. Ингибирование роста опухоли (фиг. 13) или повы-шенные скорости регресса опухоли (таблица 6) не наблюдали у мышей, которые получали одну инъ-екцию Е7 в квасцах.
Похожие результаты наблюдали также, ис-пользуя группы обработки, которые получали две иммунизации, на 10 и 19 день после контрольного заражения опухолью (таблица 6 и фиг. 14), хотя некоторое замедление роста опухоли наблюдали у мышей, получивших две инъекции Е7 в квасцах.
Результаты показывают, что значительную противоопухолевую активность, измеряемую по-ниженным числом имеющих опухоли мышей, и ингибирование роста опухоли наблюдали после иммунизации растворимым Е7 в АК. Наоборот, все животные, иммунизированные одной или двумя инъекциями растворимого белка Е7 в квасцах, име-ли растущие опухоли. Говоря кратко, иммунизация растворимым белком Е7 в АК привела к значитель-ному ингибированию роста опухолевых клеток, что не наблюдали при использовании иммунизации растворимым Е7 в квасцах.

1. US 5234683, A 10.08.1993.
2. US 5114708, A, 19.05.1992.
3. Фонталин Л.Н., Певницкий Л.А. Иммунологическая толерантность. - М.: Медицина, 1978, с. 16-22.