СПОСОБ ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО - ИНТЕРФЕРОНА

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для очистки человеческо-го  - интерферона, Цель - повышение производительности процесса. Раствор сырого ин-терферона ропускают через обездвиженный синий агарозный гель, элюируют и элюат дополнительно пропускают через хелатметаллический носитель с остатком хелатирова-ния, включающим по меньшей мере ион одного металла из группы Со+2, Ni+2, Zn+2. pH контактирования с синим агарозным гелем 5-9. 10 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу очистки человеческого ин-терферона, особенно человеческого -интерверона.
Цель изобретения - повышение производительности процесса.
Способ осуществляют следующим образом.
Сырой интерферон, полученный в результате деятельности клеток человека, обра-батывают обездвиженным синим носителем. Интерферон, поглащенный на обездвижен-ном синем носителе, элюируют элюентом. Затем отбираемый раствор интерферона обра-батывают хелатметаллическим носителем с остатком хелатирования, включающим по меньшей мере ион одного металла, выбранный из группы, состоящей из Со2+, Ni2+ и Zn2+. Интерферон, поглощенный на хелатметаллическом носителе, отделяют от носите-ля, получая препарат интерферона большой чистоты и высокой концентрации.
Раствор сырого интерферона сначала приводят в контакт с обездвиживать на любом из разнообразных обычно используемых носителей, способном соединяться с красителем. В число таких носителей входят (А) соединение красителя через амино-группу антрахи-ноновой части с агарозой, активированной бромистым цианом; (В) соединение красителя с гелем поперечно связанной агарозы через эфирную связь; (С) соединение синего декс-трана R (декстран, соединенный с синим красителем, фирма “Фармесиэ”) с агарозой, ак-тивированной бромистым цианом методом триазинового соединения; (Д) соединение синего красителя, связанного с боковой цепью Аффиа-геля 10 (фирмы “Био-Рад лэб”, именуемой ниже “Био-Рад”) через пептидную связь с полисахаридным носителем. Можно также использовать другие носители, например поперечно связанный декстрановый гель, например Сефадекс (фирма “Фармесиэ”), и виниловый полимер с гидроксильными группами, который также можно использовать как носитель для хелатметаллической хроматографии в следующей стадии, предпочтителен гидрофильный гранулированный полимер, например, Тойопёрл (фирма “Тойо сода комп.”).
Предпочтительно использовать синий агарозовый гель, соответствующий (В), так как он весьма эффективно связывается с интерфероном, не вызывает отделения красителя от носителя, поскольку соединение красителя с носителем является весьма стабиьным в условиях рН от 6 до 13, и он легко доступен на рынке. Этот синий агарозовый гель имеет следующую структуру и реализуется под товарным наименованием “Блу сефароз CL-6B” (фирма “Фармесиэ”) “Матрекс гель блу А“ (фирма “Амикон корп.”) и “Аффи-гель блу“ (фирма “Био-Рад”),



Для контактирования обездвиженного синего носителя с раствором сырого интер-ферона можно использовать либо порционный метод, либо колонный способ.
Пример 1. Раствор сырого интерферона был получен путем обработки человече-ских фибробластовых клеток в среде МЕМ Игла, содержавщей 0,4% метилцеллюлозы с поли 1; поли С, с последующей обработкой циклогексимидом и актиномицином Д.
К 30 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 6,2Х х 106 им.ед. было добавлено 21 мг белка и 100 мкг актиномицина Д на 1 л, 30 мл геля синей агарозы (Аффигель блу фирмы “Био-Рад”). После перемешивания в течение 40 ч и выдержива-ния в течение 3 ч надосадочная жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой физиологическим раствором, содержащим фосфатнокислотный буфер, Надосадочная жидкость была извлече-
на снова,, Колонну дважды промывали и элюировалио Использовали следующие промы-вочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (32О мл):
раствор 1,0 М хлористого натрия, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия (рН 7,2)
второй промывочный раствор (280 мл):
25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2)
элюент (4ОО мл):
55%-ный раствор этнленгдиколя, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2).
Получен выход частично очищенного ннтерферона в элюате (300 мл) 81% от исход-ного раствора интерферона, очищение в 33 раза.
В колонну с сопатом Линка (10 мл) элюат (285 мл) и колонны геля синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мл/г. После двойной промывки колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элент:
пердый промывочный раствор (300 мл):
дистиллированную воду и 0,1 М
фосфорнокислого натрия (рН 6,7)
использовали при скорости потока 3О мл/г в течение 1 ч поочередно
второй промывочный раствор (50 мл):
20 мм раствор лимоннокислого натрия (рН 5,0)
элюент:
0,1 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий (рН 4,5).
Выход хелатцинковой хроматографии 87%, а общий выход 70%. Достигнута очист-ка в 33О раз.
Активность и выход интерферона, количество белка н удельная активность каждой стадии показаны в табл 1.
Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакриламидного геля.
Часть конечного элюата подвергли диализу в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) и лиофилировали. После восстановления лиофилированного диализата 2-меркаптоэтанолом восстановленный материал подвергли электрофорезу с использовани-ем полиакриламидного геля в присутствии НДМ согласно способу Лэмли (Нейчэр, 227, 680-685 (1970)) для проведения анализа активности интерферона и красителя с блестящей синью R 200. В результате активность интерферона и темно-синяя полоса были обнару-жены только в положении, соответствовавшем молекулярному весу примерно 23000.
Анализ актиномицина Д.
Анализ актиномицина Д был проведен способом биологической пробы.
Часть конечного элюата обессолили путем гель-хроматографии, используя Сефадекс G-25 после добавления сывороточного альбумина человека (1 мг/мл). Добавляя допол-нительно небольшое количество сывороточного альбумина человека и лактозы обессо-ленный элюат профильтровали через фильтр 2 мкм и лиофилировали. Актиномицин Д был обнаружен в количестве не больше 0,0003 мкг/106 им.ед. активности интерферона.
Элюат из колонны геля синей агарозы содержал: 0,7 мкг/м актиномицина Д. Общее количество актиномицина Д составляло 210 мкг. Кроме того, присутствие актиномицина Д в элюате из колонны геля синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 нм) и путем биопробы.
Часть элюата из колонны геля синей агарозы обессолили способом гельхроматогра-фии с использованием Сефадекс G-25 после добавления человеческого сывороточного альбумина. Удаляя этиленгликоль, обессоленный элюат лиофилировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/106 им. ед. интерферонной активности актиномицина Д.
Пирогенное испытание на кроликах.
Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилированный материал инъектировали внутривенно трем кроликам (2.105 им.ед./кг массы кролика). суммирование пирексии для всех трех кроликов было 0,60С. Интерферон, очищенный по предлагаемому способу, оказался отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах.
Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны геля6 синей агарозы, инъектировали внутривенно трем кроликам (2.105 им.ед./кг массы кролика). Суммирова-нием пирексии для всех трех кроликов было 1,50С. Интерферон, очищенный согласно способу хроматографии синей агарозы, оказался неопределенно отрицательным к пиро-генному испытанию на кроликах.
Пример 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интерферона, подоб-ный использовавшемуся в примере 1.
20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей агарозы объе-мом 20 мл (Матрекс гель блу А, фирмы “Амикон корп”). Колонну трижды промыли и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (200 мл):
1 М хлористый натрий, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия (рН 7,2).
второй промывочный раствор (200 мл):
25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2).
третий промывочный раствор (40 мл):
40%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2).
элюент (200 мл):
55%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия.
Хелатцинковую колонну (5 мл) соединили с выходом колонны синей агарозы после начала элюирования, и элюат из колоны синей агарозы непосредственно пропускали че-рез хелатцинковую колонну. Затем хелатцинковую колонну дважды промыли и элюиро-вали. Промывочные растворы и элюент были следующими:
первый промывочный раствор (200 мл):
дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) поочередно
второй промывочный раствор (20 мл):
20 мм лимоннокислый натрий (рН 5,0):
0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий, содержащий 1 М хлористого натрия.
Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл. 2.
Пример 3. 20 л раствора сырого интерферона с интерферонной активностью 15.106 им. ед. и 60 мг/л общего белка контактировали с 40 мл синеагарозного носителя (Матрекс гель Блу А фирмы “Амикон корп.”). Носитель, на который был адсорбирован интерфе-рон, загрузили на колонну. Затем колонну дважды промыли и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (400 мл):
раствор хлористого натрия 1 М, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия (рН 7,2).
второй промывочный раствор (400 мл):
25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2).
элюент (400 мл).
100 мл раствора интерферона, отобранного из колонны синей агарозы, пропустили через 5 мл хелатникелевую колонну. Использованная колонна хелата никеля была приго-товлена так же, как в примере 1, за исключением того, что вместо раствора хлористого цинка использовали раствор хлористого никеля. Хелатникелевую колонну промыли и элюировали. Использовали следующие промывочный раствор и элюент:
промывочный раствор:
дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали по-очередно
элюент:
0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,5).
Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл. 3.
Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогенных веществ и был от-рицательным относительно испытания Лимулуса. В нем не было обнаружено актиноми-цина Д.
Пример 4. Была повторена процедура примера 3 за тем исключением, что хелатко-бальтовую колонну использовали вместо хелатникелевой колонны, причем хелаткобаль-товую колонну приготовили как в примере 1, но вместе хлористого цинка использовали раствор хлористого кобальта.
Элюат (15 мл) содержал 4,5.106 им. ед. интерферона (выход 60%) и 0,25 мг белка. Удельная активность составляла 1,8.108 им.ед./мг белка. Конечный элюат был отрица-тельным к испытанию Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д.
Пример 5. Культивировали штамм Е. коли, в котором был интегрирован структур-ный ген -интерферона, и культивированный штамм подвергали процедурам сбора бак-терий, измельчения бактерий, удаления нуклеиновой кислоты и осаждения сульфатом аммоний. Белокую фракцию, содержащую -интерферона, полученный из штамма Е. ко-ли, растворяли в 25%-ном растворе этиленгликоля, содержащем 1 М хлористого натрия и 10 мм фосфорнокислого натрия (рН 7,2), с целью получения раствора сырого интерферо-на. Раствор сырого интерферона имел интерферонную активность 5.106 им.ед. и 20 мг белка на 1 мл.
40 мл раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мл синей агарозы (Матрекс гель блу А фирмы “Амикон корп.”), уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натрия, содержащим 1 М хлористого натрия. Колонну дважды промы-ли с целью удаления примерно 95% белка в растворе с фракционированием в каждую фракцию 2 мл. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (10 мл):
25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мм фос-форнокислого натрия
второй промывочный раствор (10 мл)
40%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мм фос-форнокислого натрия
элюент:
60%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мм фос-форнокислого натрия.
Элюат (12 мл) из колонны синей агарозы имел интерферонную активность 1,6.107 им.ед. (выход 80%) и 4,6 мг белка. Средняя удельная активность в каждой фракции была 2,5.107 им.ед./мг белка (макс.:5-10 им.ед./мг белка).
Элюат подвергли анализу так же, как в примере 1. В результате чистота интерфе-ронной активности при молекулярном весе примерно 19000 составляла 10-50% (средняя 25%).
6 мл элюата из колонны синей агарозы пропустили через 1 мл хелатцинковой ко-лонны, уравновешенной 60%-ным раствором этиленгликоля, содержащим 1 М хлористо-го натрия и 1 мм фосфорнокислого натрия. Колонну трижды промыли и элюировали. Ис-пользовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (6 мл):
60%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мм фос-форнокислого натрия
второй промывочный раствор (6 мл):
дистиллированная вода
третий промывочный раствор (6 мл):
220 мм буферный раствор фосфорнокислого натрия, содержащий 2 М хлористого натрия (рН 6,0).
элюент:
0,1 М буферный раствор уксуснокислого натрия, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,0).
Конечный элюат (4 мл) имел интерферонную активность 4,0.107 им.ед. (выход 50%) и 0,4 мг белка. Удельная активность была 1.108 им.ед./мг белка.
Конечный элюат подвергли анализу как и в примере 1 и обнаружили одну полосу в положении молекулярного веса примерно 19000. Чистота была больше 97%.
Пример 6. Была повторена процедура примера 3, за тем исключением, что вместо хелатникелевой колонны использовали хелатцинковую колонну и в качестве элюента использовали 0,2 М раствор L-гистидин, уравновешенный хлористый натрием (рН 7,0).
Элюат (20 мл) имел 50.106 им.ед. интерферона (выход 67%) и 50 г общего белка. Удельная активность была 1,0.108 им.ед./мг белка.
Пример 7. Использовали сырой интерферон, полученный из человеческих фиб-робластовых клеток, аналогичный интерферону, использованному в примере 1.
К 20 л растовра сырого интерферона с активностью интерферона 42.106 им.ед. и концентрацией белка - 70 мг/л добавили 30 мл геля синей агарозы (Маtrex Gel Blue А “Amicon corp”.). После перемешивания смеси в течение 3 сут и выдержки в течение 3 ч удалили надосадочный слой и гель синей агарозы пропустили чрез колонну, промывая 200 мл 1,0 М раствора хлористого натрия, содержащего 10 мм фосфата натрия с рН 7,2 (буфер А).
Затем колонну дважды промыли. Перед элюированием интерферона для улучшения очистки к выходу вышеуказанной колонки подсоединили колонку с 15 мл свежего геля агарозы, уравновешенного буфером А, содержащим 25%-ный раствор этиленгликоля. После третьей промывки интерферон элюировали. Использовали следующие промывоч-ные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (200 мл)
буфер А
второй промывочный раствор (300 мл): буфер А, содержащий 25%-раствор эти-ленгликоля,
третий промывочный раствор (120 мл):
3 М раствор хлористого натрия, содержащий 30 мм фосфорнокислого натрия (рН=7,2) и 30%-ный раствор этиленгликоля,
элюент (600 мл):
буфер А, содержащий 55%-ный раствор этиленгликоля.
Раствор элюата фракционировали. Результаты представлены в табл. 4.
Фракцию второго элюирования подвергли дальнейщей очистке с помощью хелат-цинковой хроматографии.
В колонну с хелатом цинка (15 мл) ввели буфер А, содержащий 50%-ный раствор этиленгликоля. Часть (270 мл) фракции второго элюирования из вышеуказанной колонны синей агарозы развели 27 мл буфера А до получения 50%-ного раствора этиленгликоля и пропустили через колонну с хелатом цинка при скорости потока 30 мл/ч. Все операции проводили при температуре 2-80С. После двойной промывки колонну элюировали. Ис-пользовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (200 мл)
дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфорнокислого натрия (рН=6,7) исполь-зовали при скорости потока 30 мл/ч в течение 1 ч поочередно:
второй промывочный раствор (30 мл):
2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мм фосфорнокислого натрия (рН=7,2)
элюент:
0,1 М уксусной кислоты - уксуснокислого натрия буферный раствор, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН=7,4).
Активность, выход интерферона, количество белка и удельная активность этой про-цедуры очистки представлены в табл. 5.
Интерферон из колонны с хелатом цинка подвергли анализу посредством электро-фореза полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) для опре-деления чистоты. Элюат подвергли пирогенному испытанию с помощью теста Лимулуса, используя обнаруживающий эндотоксин реагент. Чистота интерферона 90%, элюат отри-цательный к испытанию Лимулуса при содержании интерферона 1,6.106 им.ед./мл.
Сравнительный пример 1. Во вторую колонну геля агарозы (Matrex Gel Blue А 4 мл) загрузили 2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мм фосфорнокислого натрия, рН=7,2 (буфер В).
Часть фракции (45 мл) второго элюирования из колонны геля синей агарозы, опи-санной в примере 7, разбавили 5 мл буфера А и 75 мл буфера В и пропустили через вто-рую колонну геля синей агарозы при скорости потока 20 мл/ч. Все операции проводили при 15-250С.
Буфер, содержащий 30, 40 и 50%-ный раствор этиленгликоля соответственно про-пустили через колонну со скоростью потока 20 мл/ч.
Результаты второй хроматографии геля синей агарозы представлены в табл. 6.
Интерферон из элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликоля, из которой колонны геля синей агарозы подвергли такому же анализу, как в примере 7, для опреде-ления его чистоты и проведения пирогенного испытания
Чистота его была 60% и результат испытания Лимулуса положительный.
Сравнительный пример 2. Колонну из хелата цинка (50 мл) уравновешивали при помощи РВS. Неочищенный интерферон фибробласта человека, который имел актив-ность интерферона 30х106 ме/мл и концентрацию протеина 70 мг/л, пропустили через колонну хелата цинка с объемной скоростью 100 мл/ч. После промывки колонну под-вергли эюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор и элюент:
промывочный раствор (400 мл)
дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натрия (рН=6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч в течение 1 ч, с чередованием
элюент:
0,1 М буферный раствор уксусной кислоты - ацетата натрия, содержащий 1,0 М хло-рида натрия (рН=4,7).
Фракцию элюирования на колонне хелата цинка использовали для последующей очистки при помощи хроматографии на голубом агаре.
Колонну из голубого агар (5 мл) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натрия, содержащим 1,0 М хлорида натрия. Фракцию элюирования из выше-упомянутой колонны хелата цинка пропускали через колонну с гоубым агаром с объем-ной скоростью 10 мл/ч. После двухкратной промывки колонну подвергли элюированию. При этом использовали следующие промывочный раствор и элюант:
первый промывочный раствор (50 мл):
1,0 М раствор хлорида натрия, содержащий 10 мм фосфата натрия, рН=7,2 (буфер А);
второй промывочный раствор (50 мл):
буфер А, содержащий 25% этиленгликоля:
элюант:
буфер А, содержащий 55% этиленгликоля.
Раствор элюата подвергли фракционированию. Результаты приведены в табл. 7.
Сравнительный пример 3. В качестве исходного материала использовали неочи-щенный интерферон фибробласта, который имел актвиность интерферона 7,7.106 ме/мл и концентрацию протеина 35 мг/л. Этот исходный раствор 92,0 л) смешивали с 5 г (17 мл) шариков “ЦРГ” (пористыми стеклянными шариками с размером пор 350 Å) и смесь энер-гично перемешивали в течение 13 ч. Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр и шарики ЦРГ упаковывали в колонну (диаметр 0,9 см). Далее колонну промывали 100 мл PBS, а затем 0,01 М раствором глицина-НCl при рН=3,5, и элюировали 0,3 М буфером глицина-НСl при рН=2,0, содержащим 0,1 мг/мл альбумина сыворотки человека.
Элюаты подвергли диализу с использованием 4.1 л 1 М раствора NaCl, буфериро-ванного 0,02 М раствором фосфата (рН=7,4).
Диализированный раствор пропускали через колонну с хелатом цинка с размерами 0,6.7 см, затем колонну промывали 10 мл 1 М раствора хлорида натрия, буферированного 0,02 М раствором фосфата (рН=7,4) и 10 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН=5,9). Затем колонну элюировали 0,1 М буфером ацетата натрия (рН=4).
Полученные результаты приведены в табл. 8.
Сравнительный пример 4. Используют сырой человеческий фибробластный интер-ферон, аналогичный используемому примеру 7.
Расвор сырого интерферона, имеющего активность интерферона 38.106 им.ед./л, концентрацию белка 63 мг/л и удельную активность 6.105 им.ед./мг белка, регулируют до рН=2 путем добавления 6 н НСl и загружают в колонку SP-Сефадекса (20 мл, 2 смх6,4 см). После загрузки 6 л раствора сырого интерферона со скоростью потока 40 мл/ч колон-ку промывают 200 мл дистиллированной воды. Затем колонку элюируют 320 мл 0,1 М буферного раствора фосфорнокислого натрия (рН=8,3). Раствор элюата фракционируют. Результаты приведены в табл.9.
Вторую и третью фракции элюирования используют для последующего способа очистки путем хелатцинковой хроматографии.
Колонну с хелатом цинка (3 мл, 1 смх3,8 см)) уравновешивают 0,1 М буферным рас-твором фосфорнокислого натрия (рН=8,3). Вышеуказанные фракции (300 мл) из колонки SP-Сефадекса пропускают через хелатцинковую колонну со скоростью потока 6 мл/ч. По-сле промывки дважды колонну элюируют. Используют следующие промывочный рас-твор и элюент:
первый промывочный раствор (40 мл):
дистиллированная вода и 0,1 М раствор фосфорнокислого натрия (рН=6,7), исполь-зуемые поочередно со скоростью потока 6 мл/ч в течение 1 ч;
второй промывочный раствор (6 мл):
2 М хлористый натрий, содержащий 20 мм фосфорнокислого натрия (рН=7,2);
элюент:
0,1М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН=4,7).
Результаты этого способа очистки приведены в табл. 10.
Используемый в качестве исходного материала раствор сырого интерферона имеет рН=7,3. После отстаивания в течение 10 дней его интерферонная активность составляет 38.106 им.ед./л и никаких изменений в активности интерферона не обнаружено. Тогда как после отстаивания в течение 10 дней раствора сырого интерферона, имеющего рН=2, пе-ред загрузкой его в колонну SP-Сефадекса, интерферонная активность снижается до 16.106 им.ед./л. Это означает, что раствор сырого интерферона неустойчив при рН=2.
Изобретение имеет следующие существенные признаки и преимущества по сравне-нию с известным техническим решением.
Способ очистки в соответствии с известным техническим решением включает SP-Сефадексовую хроматографию на колонках с последующей хелатметаллической хромато-графией. Сырой интерферон, очищаемый в соответствии с известным способом, имеет низкую концентрацию, например используемый в примере 1 сырой интерферон имеет актвиность интерферона 3,2.106 им.ед./л и концентрацию белка 20 мг/л, а используемый в примере 2 сырой интерферон имеет активность интерферона 5.106 им.ед./л и концентра-цию белка 25 мг/л. Известное техническое решение имеет в виду очистку сырого интер-ферона с относительно низкой концентрацией.
Предлагаемый способ очистки включает хроматографию на обездвиженном синем носителе с последующей хелатметаллической хроматографией. В соответствии с этим способом очистки сырой интерферон с высокой концентрацией (например, сырой интер-ферон, используемый в примере 7, имеет активность интерферона 42.106 им.ед./л и кон-центрацию белка 70 мг/л) может быть удовлетворительно очищен.
Кроме того, как видно из примера 7, в котором использовали сырой интерферон с высокой концентрацией, извлечение продукта по известному способу составило самое большое 47%. Таким образом, известный способ непригоден для очистки сырого интер-ферона с высокой концентрацией. Это становится более очевидным из сравнения резуль-татов примера 7 с результатами сравнительного примера 4 (в обоих примерах материалом для очистки был сырой интерферон с высокой концентрацией).
Извлечение, % Пример 7 Сравнительный пример 4
1-я очистительная стадия 71 36
2-я очистительная стадия 69 20

Применения известного способа ограничивается сырым интерфероном с относи-тельно низкой концентрацией. Предлагаемый способ применим к сырому интерферону как с низкой концентрацией, так и с высокой концентрацией.
Известный способ имеет недостаток, заключающийся в том, что перед загрузкой ко-лонки SP-Сефадекса сырой интерферон обязательно делают сильнокислотным, поскольку интерферонная активность при таком кислотном состоянии заметно теряется, как показа-но в сравнительном примере 4.
Этот недостаток известного способа не обнаруживается в изобретении, поскольку хроматографию на обездвиженном синем носителе осуществляют в условиях почти нейтрального рН.
Пример 8. Используемый раствор неочищенного интерферона получают путем об-работки клеток человеческого фибробласта с использованием методики, аналогичной примеру 1.
К раствору неочищенного интерферона, который имеет активность интерферона, равную 30000 ед./л, белковую концентрацию, равную 0,11 мг/мл и рН 7,2, прибавляют 6 н раствор Нсl или 1 н раствор NaOH с тем, чтобы довести рН до 2,3,4,5,6,7,8,9 или 10.
Устойчивость каждого раствора неочищенного интерферона испытывают путем определения титра, оставшегося после отстаивания каждого раствора неочищенного ин-терферона при температуре 40С в течение 16 ч.
Ниже приведены результаты испытания, выраженные в процентном содержании

рН 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Устойчивость, % 83 69 80 90 97 100 98 94 80

Затем 15 мл каждого раствора неочищенного интерферона помещают в полипропи-леновую центрифужную пробирку, в которую также помещают 0,05 мл синего красителя в качестве носителя (Matrex Gel Blue А) и смесь перемешивают при 40С в течение 16 ч. После удаления надосадочного слоя и промывания дважды 2,5 мл 10 мМ раствора фосфат натрия - 1 н NaCl (pН 7,2) 2 мл 10 мМ фосфата натрия - 1 н NaCl (рН 7,2), содержащего 55%-ный этиленгликоль, прибавляют к носителю. После центрифугирования удаляют надосадочный слой, содержащий частично очищенный интерферон.
Затем определяют количества потерянного интерферона (общее содержание интер-ферона, не абсорбированного на носителе, и интерферона, содержащегося в промывоч-ном растворе) и востановленного интерферона.
Ниже приведены результаты, выраженные в процентном содержании.

рН 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Потеря, % 5 13 20 9 7 7 8 6 6
Восстановление, % 64 50 46 65 70 68 73 67 50

Как видно из вышеприведенных результатов, когда рН раствора неочищенного ин-терферона был доведен до 5-9, раствор неочищенного интерферона оставался устойчивым и восстановление частично очищенного интерферона было высоким.

Положительное решение по заявке № 2838809, кл. А 61 К 45/02, 29.07.85